视网膜色素变性疾病动物模型的构建方法和应用与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及视网膜色素变性动物模型的构建方法和应用。


背景技术：

2.视网膜视杆细胞内视蛋白与由维生素a氧化而形成的11-顺视黄醛结合形成rho。在光照下11-顺视黄醛转变为全-反视黄醛，此为视觉形成的第一步。rho突变往往导致常染色体显性遗传的视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，rp)。rp是一种世界范围内常见的遗传性视网膜变性疾病，以视网膜视杆细胞和视锥细胞进行性丧失，并导致严重的视力障碍，最终导致双眼失明为主要表现；其不仅影响患者本身的生活和生存质量，也给家庭成员带来巨大的精神和经济负担。由于rp遗传的异质性，患者的发病年龄、进展速度及遗传方式也各有差异。目前该疾病的病理生理机制尚未完全阐明，正在进行或已完成临床试验的rp疗法以基因治疗为主。但目前没有rho c.374t》g突变位点为基础的rp动物模型建立。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种视网膜色素变性动物模型的构建方法和应用。通过本发明的构建方法首次得到了基于rho基因l125r突变的视网膜色素变性动物模型，该疾病动物模型具有视网膜色素变性的表现或症状，为视网膜色素变性的病理生理机制研究、筛选相关基因治疗药物研究等提供了动物模型基础。
5.本发明是这样实现的：
6.一方面，本发明提供一种基于rho基因突变的视网膜色素变性动物模型的构建方法，利用crispr/cas9技术使目标动物的rho基因发生突变：c.374t》g，进而以使其编码的rho蛋白具有突变：l125r。
7.上述突变位点为点突变，非常适合应用于基因治疗。rho基因为rp致病突变基因，基于此制备的疾病动物模型，对于研究rp的病理生理机制及研发rp有效的治疗方法和药物都非常重要。
8.通过本发明的构建方法首次得到了基于rho基因突变的视网膜色素变性动物模型，该疾病动物模型具有视网膜色素变性的表现或症状，为研究视网膜色素变性的病理生理机制、筛选相关基因治疗药物等提供了模型基础。
9.可选地，在一些实施方案中，所述目标动物为小鼠或大鼠。基于本发明公开的内容，在其他实施例中，本领域技术人员也可以很容易地选用其他哺乳动物构建动物模型，其也属于本发明的保护范围。
10.可选地，在一些实施方案中，利用crispr/cas9技术使所述目标动物的rho基因发生所述突变的方法包括：
11.将cas9 mrna、grna、以及同源重组载体显微注射到供体小鼠的受精卵中以得到转
染受精卵；其中，所述grna如seq id no.1所示。
12.采用crispr/cas9技术编辑目标基因，其grna是基因编辑效果的重要依赖，并非任意grna都能实现基因编辑效果。本发明通过创造性劳动，选用seq id no.1作为grna的靶序列，能够有效地实现在靶位点的断裂，在合适cas9 mrna和合适同源重组载体的存在条件下，实现rho基因的目标突变：c.374t》g，进而得到rho蛋白具有l125r突变的动物模型，并表现出rp疾病的相应症状。
13.可选地，在一些实施方案中，所述cas9 mrna的核酸序列如seq id no.2所示。
14.可选地，在一些实施方案中，所述同源重组载体含有有seq id no.3所示的同源重组片段。所述同源重组片段包括依次串联的5’端同源臂、rho基因突变序列以及3’端同源臂。通过引入人源化的rho基因序列可以使得该动物模型能够更好地模拟人rho蛋白的功能和作用。
15.可选地，在一些实施方案中，利用crispr/cas9技术使所述目标动物的rho基因发生所述突变的方法还包括：将所述转染受精卵卵移植到假孕母鼠的子宫中以获得f0代小鼠；再对f0代小鼠鉴定，以获得同源重组呈现阳性的嵌合体小鼠。
16.可选地，在一些实施方案中，利用crispr/cas9技术使所述目标动物的rho基因发生所述突变的方法还包括：将所述嵌合体小鼠与野生型小鼠交配，对获得的后代小鼠进行鉴定，将同源重组呈现阳性的f1代小鼠相互交配，对获得的f2代小鼠进行鉴定以获得杂合子小鼠或纯合子小鼠，即为视网膜色素变性动物模型。
17.另一方面，本发明提供一种视网膜色素变性动物模型的繁育方法，其包括：将由如上任一项所述的构建方法得到的视网膜变性疾病动物模型相互交配。
18.在通过前述构建方法得到视网膜色素变性动物模型后，本领域技术人员可以基于通过普通的繁殖或繁育方法可以得到大批量的动物模型，这对本领域技术人员而言是容易实现的，因此，采用此类繁育方法也属于本发明的保护范围。
19.另一方面，本发明提供由权利要求如上任一项所述的构建方法得到的视网膜色素变性动物模型在视网膜色素变性研究中的应用，所述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。
20.另一方面，本发明提供由如上任一项所述的构建方法得到的视网膜色素变性动物模型在筛选视网膜色素变性的基因治疗药物中的应用。
21.通过前述构建方法得到视网膜色素变性动物模型，具有典型的rp症状，本领域技术人员可以将其应用至各种领域的研究，例如病理生理机制研究、药物筛选研究，尤其是基因治疗类药物的筛选研究等，基于本发明公开的内容，这些研究对本领域技术人员而言均是容易实现的，因此，无论将本发明的视网膜色素变性动物模型应用于何种领域的研究，其均属于本发明的保护范围。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅展示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1为实施例1中的视网膜色素变性动物模型的构建策略示意图。
24.图2为同源重组载体质粒图谱。
25.图3为同源重组载体酶切鉴定电泳图；1：nhei酶切鉴定结果，理论条带大小为7475bp、3650bp、1240bp；m：1kb dna ladder。
26.图4为f0及f1代小鼠鉴定策略示意图；同源重组阳性小鼠pcr鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.8kb片段，阴性基因组无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.4kb片段，阴性基因组应扩增出7.0kb片段。
27.图5为同源重组阳性f0代小鼠pcr鉴定电泳图；数字45：f0代小鼠编号；wt：野生型对照；m为1kb dna marker。
28.图6为f1代小鼠5’同源臂和3’同源臂pcr鉴定电泳图；数字：f1代小鼠编号；wt：野生型对照；m：1kb dna ladder。
29.图7为同源重组阳性f2代部分小鼠pcr鉴定电泳图；数字：f2代小鼠编号；m:marker,takara dl2000 dna marker 3427a。
30.图8为wt、杂合子和纯合子小鼠的onl检测结果；
31.a：wt、杂合子(l125r/ )和纯合子(l125r/l125r)小鼠的具有代表性的he染色图像(视神经500-1000μm区域内的眼球切片)。与wt相比，杂合子8个月大时is/os和onl层明显变薄，纯合子2个月大时is/os和onl层已明显变薄，3个月大时更薄。比例尺：20μm。
32.b：wt、杂合子和纯合子小鼠的he染色图像中onl层厚度的测量结果。8个月大杂合子及纯合子(2个月和3个月大)小鼠的onl层厚度明显低于wt。
33.c：杂合子(3个月和8个月大)和纯合子(3个月大)小鼠代表性眼底图像及相应oct图像。oct为对应的眼底图像上横线处的图像，8个月大杂合子小鼠onl厚度(oct中的白色直线标注)明显低于3个月大时的厚度，纯合子3个月时onl厚度明显比8个月大杂合子小鼠低，与he结果一致。rpe/cc：视网膜色素上皮细胞/脉络膜毛细血管层(retinal pigment epithelium/choriocapillaris)；is/os：视网膜感光细胞内节/外节(inner segment/outer segment)；onl：感光细胞外核层(outer nuclear layer)；inl：内核层(inner nuclear layer)。比例尺：120μm。
34.图9为wt、杂合子和纯合子小鼠不同时间段的erg结果的统计学分析。wt小鼠6周到32周暗适应和明适应a、b波振幅无明显差异，而杂合子和纯合子小鼠随年龄增长暗适应a、b波振幅下降。纯合子小鼠自6周起有显著变化，而杂合子32周时有统计学差异。杂合子和纯合子小鼠的明适应a、b波振幅也随年龄增长呈下降趋势，但是无统计学意义。暗适应a、b波振幅代表视杆细胞功能，明适应a、b波振幅则代表视锥细胞功能。杂合子和纯合子小鼠都先出现明显的视杆细胞功能损伤，与rp患者临床表现相符。每组3-7只小鼠。*p《0.05；**p《0.005；***p《0.001。
35.图10为3个月大的wt、杂合子和纯合子小鼠的western blot结果。上图左边为三组视网膜中ha的表达，因突变序列含有ha标签，ha的表达结果显示突变蛋白的含量。右边为总rhodopsin的表达，包含突变蛋白和正常的小鼠rhodopsin。下图为gapdh(内参蛋白)的表达。ha的表达结果显示纯合子的突变rhodopsin含量明显高于杂合子，wt不含突变蛋白。对于总rhodopsin的含量，纯合子的表达明显低于同年龄的杂合子和wt。
具体实施方式
36.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
37.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
38.实施例1
39.本实施例提供的构建视网膜色素变性动物模型的方法采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式，在rho基因(转录本：rho-201(ensmust00000032471.8))起始密码子位点定点敲入hrho-ha-wpre-pa表达框，见图1。hrho是人源rho突变基因序列(c.374t》g；p.l125r)，即与参考序列相比在第374个位点的碱基t被碱基g替代；其编码的蛋白第125位氨基酸从亮氨酸(l)变成精氨酸(r)。具体包括如下步骤：
40.(1)通过in-fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含具有3.0kb 5’端同源臂、hrho-ha-wpre-pa和3.0kb 3’端同源臂的同源重组片段，载体图谱见图2，同源重组载体酶切鉴定电泳图见图3。
41.同源重组片段的核苷酸序列(seq id no.3)如下：
42.43.[0044][0045]
其中，5’端同源臂：第1-3000位(带下划线)；
[0046]
kozak序列：第3001-3006位；
[0047]
hrho-ha：第3007-4110位(小写字母)；其中，方框为突变位点(c.374t》g)；
[0048]
wpre：第4111-4698位(大写字母 下划线)；
[0049]
pa(bgh polya)：第4714-4940位(大写字母 斜体)；
[0050]3’
端同源臂：第4987-7986位(带下划线)。
[0051]
(2)通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和grna，将cas9mrna、grna和donor vector显微注射到供体小鼠(c57bl/6j)的受精卵中，得到转染受精卵。所述grna序列为5
’‑
tcgagagccgcagccatgaa-3’(seq id no.1)。
[0052]
cas9 mrna的核苷酸序列(seq id no.2)如下(下划线为编码序列)：
[0053]
gagacaagcuugcuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaacgcucaacuuuggcagaucgguaccgccaccauggacuauaaggaccacgacggagacuacaaggaucaugauauugauuacaaagacgaugacgauaagauggccccaaagaagaagcggaaggucgguauccacggagucccagcagccgacaagaaguacagcaucggccuggacaucggcaccaacucugugggcugggccgugaucaccgacgaguacaaggugcccagcaagaaauucaaggugcugggcaacaccgaccggcacagcaucaagaagaaccugaucggagcccugcuguucgacagcggcgaaacagccgaggccacccggcugaagagaaccgccagaagaagauacaccagacggaagaaccggaucugcuaucugcaagagaucuucagcaacgagauggccaagguggacgacagcuucuuccacagacuggaagaguccuuccugguggaagaggauaagaagcacgagcggcaccccaucuucggcaacaucguggacgagguggccuaccacgagaaguaccccaccaucuaccaccugagaaagaaacugguggacagcaccgacaaggccgaccugcggcugaucuaucuggcccuggcccacaugauc
aaguuccggggccacuuccugaucgagggcgaccugaaccccgacaacagcgacguggacaagcuguucauccagcuggugcagaccuacaaccagcuguucgaggaaaaccccaucaacgccagcggcguggacgccaaggccauccugucugccagacugagcaagagcagacggcuggaaaaucugaucgcccagcugcccggcgagaagaagaauggccuguucggaaaccugauugcccugagccugggccugacccccaacuucaagagcaacuucgaccuggccgaggaugccaaacugcagcugagcaaggacaccuacgacgacgaccuggacaaccugcuggcccagaucggcgaccaguacgccgaccuguuucuggccgccaagaaccuguccgacgccauccugcugagcgacauccugagagugaacaccgagaucaccaaggccccccugagcgccucuaugaucaagagauacgacgagcaccaccaggaccugacccugcugaaagcucucgugcggcagcagcugccugagaaguacaaagagauuuucuucgaccagagcaagaacggcuacgccggcuacauugacggcggagccagccaggaagaguucuacaaguucaucaagcccauccuggaaaagauggacggcaccgaggaacugcucgugaagcugaacagagaggaccugcugcggaagcagcggaccuucgacaacggcagcaucccccaccagauccaccugggagagcugcacgccauucugcggcggcaggaagauuuuuacccauuccugaaggacaaccgggaaaagaucgagaagauccugaccuuccgcauccccuacuacgugggcccucuggccaggggaaacagcagauucgccuggaugaccagaaagagcgaggaaaccaucacccccuggaacuucgaggaagugguggacaagggcgcuuccgcccagagcuucaucgagcggaugaccaacuucgauaagaaccugcccaacgagaaggugcugcccaagcacagccugcuguacgaguacuucaccguguauaacgagcugaccaaagugaaauacgugaccgagggaaugagaaagcccgccuuccugagcggcgagcagaaaaaggccaucguggaccugcuguucaagaccaaccggaaagugaccgugaagcagcugaaagaggacuacuucaagaaaaucgagugcuucgacuccguggaaaucuccggcguggaagaucgguucaacgccucccugggcacauaccacgaucugcugaaaauuaucaaggacaaggacuuccuggacaaugaggaaaacgaggacauucuggaagauaucgugcugacccugacacuguuugaggacagagagaugaucgaggaacggcugaaaaccuaugcccaccuguucgacgacaaagugaugaagcagcugaagcggcggagauacaccggcuggggcaggcugagccggaagcugaucaacggcauccgggacaagcaguccggcaagacaauccuggauuuccugaaguccgacggcuucgccaacagaaacuucaugcagcugauccacgacgacagccugaccuuuaaagaggacauccagaaagcccagguguccggccagggcgauagccugcacgagcacauugccaaucuggccggcagccccgccauuaagaagggcauccugcagacagugaaggugguggacgagcucgugaaagugaugggccggcacaagcccgagaacaucgugaucgaaauggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaaugaagcggaucgaagagggcaucaaagagcugggcagccagauccugaaagaacaccccguggaaaacacccagcugcagaacgagaagcuguaccuguacuaccugcagaaugggcgggauauguacguggaccaggaacuggacaucaaccggcuguccgacuacgauguggaccauaucgugccucagagcuuucugaaggacgacuccaucgacaacaaggugcugaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgugcccuccgaagaggucgugaagaagaugaagaacuacuggcggcagcugcugaacgccaagcugauuacccagagaaaguucgacaaucugaccaaggccgagagaggcggccugagcgaacuggauaaggccggcuucaucaagagacagcugguggaaacccggcagaucacaaagcacguggcacagauccuggacucccggaugaacacuaaguacgacgagaaugacaagcugauccgggaagugaaagugaucacccugaaguccaagcugguguccgauuuccggaaggauuuccaguuuuacaaagugcgcgagaucaacaacuaccaccacgcccacgacgccuaccugaacgccgucgugggaaccgcccugaucaaaaaguacccuaagcuggaaagcgaguucguguacggcgacuacaagguguacgacgugcggaagaugaucgccaagagcgagcaggaaaucggcaaggcuaccgccaaguacuucuucuacagcaacaucaugaacuuuuucaagaccgagauuacccuggccaacggcgagauccggaagcggccucugaucgagacaaacggcgaaaccggggagaucgugugggauaagggccgggauuuugccaccgugcggaaagugcugagcaugccccaagugaauaucgugaaaaagaccgaggugcagacaggcggcuucagcaaagagucuauccugcccaagaggaacagcgauaagcugaucgccagaaagaaggacugggacccuaagaaguacggcggcuucgacagccccaccguggccuauucugugcuggugguggccaaaguggaa
29815sec-36115sec-4683minrepeat steps 2-4for 35cycles5685min-612-hold
[0061]
结果如图5所示：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.8kb片段，阴性基因组应无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.4kb片段，阴性基因组应扩增出7.0kb片段。
[0062]
(4)将嵌合体小鼠与野生型c57bl/6j小鼠交配，获得后代小鼠并进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为f1代小鼠；
[0063]
对f1代鉴定采用pcr鉴定方法，具体方法同f0代小鼠鉴定方法，结果如图6所示。
[0064]
(5)将f1代小鼠相互自交交配，获得f2代小鼠，鉴定其中的杂合子和纯合子小鼠。
[0065]
对f2代鉴定采用pcr鉴定方法，f2代小鼠使用引物对(rho f1，rho r1)及引物对(rho f2，rho r2)分别扩增，具体序列如下表所示：
[0066]
引物序列5'-3'引物类型rho f1ggcagcagtgggattagcgttagtatga上游rho r1gcttacacaccaccacgtacc下游rho f2ccttggtctctgtctacgaagagc上游rho r2gccccagtctctctgctcatac下游
[0067]
pcr鉴定方法的反应体系：
[0068][0069]
pcr鉴定方法的反应条件为：
[0070][0071][0072]
部分f2代小鼠的鉴定结果如图7和图8所示：
[0073]
野生型小鼠只有(rho f2，rho r2)扩增出435bp片段，(rho f1，rho r1)无条带；
[0074]
杂合子：(rho f1，rho r1)扩增出633bp片段，(rho f2，rho r2)扩增出435bp片段；
[0075]
纯合子：(rho f1，rho r1)可扩增出633bp片段，(rho f2，rho r2)无反应。
[0076]
从图7中可以看出，922号和949号为纯合子；728号为f1代，作为阳性对照，971号、781号、以及728号为杂合子。
[0077]
实施例2
[0078]
对实施例1中的杂合子和纯合子小鼠表型鉴定，所用方法如下：
[0079]
(1)眼底照片和光学相干断层扫描(oct)：实验小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，1％托吡卡胺扩瞳(santen制药，大阪，日本)。0.4％盐酸奥布卡因滴眼液(santen pharmaceuticals,osaka,japan)局部麻醉。眼底照片和光学相干断层扫描(oct)使用micron iv系统(phoenix research laboratories，pleasanton,ca,usa)进行。
[0080]
(2)erg：记录全视场视网膜电图(erg)，使用retiport system(roland consult,brandenburg,germany)和super color ganzfeld(q450 sc)刺激器评估视网膜功能。暗适应过夜后，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，1％托吡卡胺、0.4％盐酸奥布卡因滴眼液用于扩瞳和局部麻醉。实验过程中体温保持在37℃，并用电热垫加热。参考电极放置在头皮中心，并在尾皮肤近端放置接地电极。接触镜电极直接应用于角膜表面。老鼠被放置在中心，以确保两只眼睛同时获得相等的光照。所有手术都是在昏暗的红色灯光下进行的。光刺激固定在恒定亮度(3cd
×
s/m2)。将光刺激后的负波定义为a波，随后的正峰定义为b波。
[0081]
(3)he染色：每组3只眼，4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，每张切片厚度5μm。用苏木精和伊红(he)染色。距离视盘每200μm测量3次onl的厚度，取其平均值来评估onl损伤。
[0082]
(4)western blot：用含50mmol/l tris 7.4、150mmol/l nacl、1％triton x-100(sigma-aldrich)、1％去氧胆酸钠、0.1％sds、蛋白酶抑制剂(roche)和磷酸酶抑制剂(sigma-aldrich)的裂解缓冲液均质。样品经过8％～15％的bis-tris凝胶电泳，然后电转移到pvdf膜上。用5％bsa与tris-缓冲盐水和0.02％tween-20(ph7.4；sigma-aldrich)，室温孵育1.5小时。pvdf膜与ha(ah158-1,beyotime,1:1000)、rhodopsin(14825,cst，1:1000)和gapdh(10494-1-ap,proteintech，1:2000)抗体在4℃下过夜。清洗后，将膜与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1小时。使用增强化学发光技术观察蛋白质条带(amersham pharmacia biotech,amersham,uk)。
[0083]
每个实验至少重复三次。数据以平均值
±
sd表示。各组间差异采用独立样本t检验。所有统计分析均使用prism 8.0软件(graphpad software,la jolla,ca,usa)进行。p《0.05被认为有显著性。
[0084]
结果见图8-图10；图8c的oct结果显示，杂合子和纯合子小鼠随年龄变大，感光细胞is/os和onl变薄，纯合子3个月大onl已经非常薄，与图8-a/b的he染色结果一致。
[0085]
图9结果显示：纯合子从6周起表现出明显的视杆细胞功能损伤；杂合子32周表现出视杆细胞功能受损，视锥细胞功能尚无明显异常。
[0086]
图10结果显示：突变序列含有ha标签，因此，ha的结果显示纯合子的突变rhodopsin含量明显高于杂合子，wt不含突变蛋白。杂合子和wt总rhodopsin的表达(包括小鼠正常rhodopsin及突变蛋白)明显高于同年龄的纯合子rhodopsin的表达。
[0087]
综上，可以看出，本发明实施例制备的小鼠模型成功表达携带ha标签的人源rho突变蛋白。纯合子小鼠出生两个月表现出明显rp表型，杂合子出生8个月时也表现出感光细胞损伤。因此，该小鼠模型可用于rho突变导致rp的病理生理机制研究，药物筛选研究，尤其是基因治疗类药物的筛选研究等诸多领域，为这些研究提供了可靠的动物模型基础。
[0088]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。