一种氮锌共掺杂的石墨烯量子点、比率型免疫传感器及其制备方法与应用

1.本发明涉及新型的纳米复合材料与生物传感检测技术领域，特别涉及一种氮锌共掺杂的石墨烯量子点、比率型免疫传感器及其制备方法与应用。


背景技术：

2.近年来，中老年慢性疾病患病率持续上升，严重影响了其健康和生活质量，及加重了社会的经济负担。慢性病主要有以下几种：高血压，糖尿病和心脑血管疾病等。因此，对于上述慢性疾病的早期检测诊断成为当前的研究热点之一。
3.氧化石墨烯(go)是电化学生物传感器的理想材料，用其制成的生物传感器在医学上检测蛋白质、葡萄糖等均具有良好的应用前景；go还具有优良的透光性能，光子透过率高97.4％，更重要的是氧化石墨烯(go)具有较高的比表面积，其二维结构也允许其他物质在其表面存在。由于这些独特的属性，氧化石墨烯在生物方面的应用中成为了一个良好的载体。而以go为原料制备的石墨烯量子点具有优良的物理化学特性使其可以在生物检测方面有巨大的应用潜力。现有的石墨烯量子点的荧光强度和量子产率不高；
4.因此，有必要开发一种荧光强度和量子产率的石墨烯量子点。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种氮锌共掺杂的石墨烯量子点、比率型免疫传感器及其制备方法与应用，该氮锌共掺杂的石墨烯量子点不仅提高了量子点的荧光强度，而且还提高了量子点的量子产率。并且基于氧化石墨烯以及氮锌共掺杂的石墨烯量子点复合材料构建了光电双响应的比率型免疫传感器，将其用于疾病标志物的检测中并取得了良好的结果，检测限较低。相较于电化学传感器和光化学传感器而言，具有较高选择性和强稳定性。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.在本发明的第一方面，提供了一种氮锌共掺杂的石墨烯量子点的制备方法，所述方法包括：
8.将go粉末与l-半胱氨酸于水中超声混匀并将ph值调至8～9，后进行高温加热反应，获得上清液，去除水分，获得淡黄色的固体，经冷冻干燥，获得n掺杂的石墨烯量子点粉末(n-gqds)；
9.将所述n掺杂的石墨烯量子点粉末加热，后在搅拌下逐滴加入含锌离子的溶液避光反应，后离心获得沉淀并洗涤，经过冷冻干燥后用去离子水配成溶液，获得氮锌共掺杂的石墨烯量子点，即n,zn-gqds纳米复合材料。
10.进一步地，所述go粉末与所述l-半胱氨酸的质量比为1：(1～6)。
11.进一步地，所述高温加热反应的温度为190～210℃，所述高温加热反应的时间为3～5h。
12.进一步地，所述n掺杂的石墨烯量子点粉末加热至35～45℃；所述避光反应的温度
为25℃～80℃，所述避光反应的时间为1h～5h。
13.进一步地，所述含锌离子的溶液包括乙酸锌、硫酸锌、氯化锌、硝酸锌、氟硅酸锌、氟硼酸锌和葡萄糖酸锌中的一种；所述的n-gqds与含锌离子的溶液的体积比为1：(1～10)。
14.在本发明的第二方面，提供了一种所述的方法获得的氮锌共掺杂的石墨烯量子点。
15.在本发明的第三方面，提供了一种比率型免疫传感器的制备方法，所述方法包括：
16.向活化后的电极表面滴加go的悬浊液，成膜后，滴加所述的氮锌共掺杂的石墨烯量子点至所述go表面，并烘干后依次结合抗体、封闭剂和抗原，获得比率型免疫传感器。
17.进一步地，所述go的悬浊液为将粉末分散于去离子水中制得；所述go的悬浊液的浓度为0.1～10mg/ml，所述n，zn-gqds的浓度为0.1～20mg/ml；且所述go的悬浊液与所述n,zn-gqds的浓度比为1：(1～10)。
18.进一步地，所述抗体包括心肌肌钙蛋白、aβ蛋白、肌红蛋白、降钙素原、白蛋白、总蛋白、尿β2微球蛋白、丛生蛋白、前列腺特异性抗原所对应的抗体中的一种；所述封闭剂包括牛血清白蛋白(bsa)、血清、酪蛋白、脱脂奶粉和无蛋白化合物中的一种；所述抗原为心肌肌钙蛋白、aβ蛋白、肌红蛋白、降钙素原、白蛋白、总蛋白、尿β2微球蛋白、丛生蛋白、前列腺特异性抗原中的一种。
19.在本发明的第四方面，提供了所述的方法制备得到的比率型免疫传感器。
20.在本发明的第四方面，提供了所述比率型免疫传感器在人血清样本中生物标志物的检测中的应用。
21.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
22.1、本发明提供了一种氮锌共掺杂的石墨烯量子点及其制备方法，以氧化石墨烯为原料，通过高温水热法反应合成了氮掺杂的石墨烯量子点(n-gqds)，然后n-gqds通过与乙酸锌反应合成氮锌共掺杂的石墨烯量子点，不仅提高了量子点的荧光强度，而且将量子点的量子产率提高至31.5％。
23.2、本发明提供了比率型免疫传感器及其制备方法，基于氧化石墨烯以及氮锌共掺杂的石墨烯量子点复合材料，构建了光电双响应的比率型免疫传感器，将其用于疾病标志物的检测中并取得了良好的结果，检测限较低。相较于电化学传感器和光化学传感器而言，具有较高选择性和强稳定性，可以进一步将其应用于各种疾病生物标志物的检测。
24.3、本发明提供了比率型免疫传感器在人血清样本中生物标志物的检测中的应用，采用光电双信号响应的比率型分析方法。通过分析光化学信号和电流信号的比值而不是只根据其中某一种信号来检测疾病生物标志物的含量，这种方法已经逐步被应用在蛋白检测，病毒检测和其他生物活性物质的检测等领域。相比其他分析技术，这种分析方法具有简单、快速、灵敏度高且实用性强等优点，为生物传感器的发展和研究提供了更广阔的应用前景。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的
附图。
26.图1为go的扫描电镜和透射电镜图；其中图1a为扫描电镜，图1b为透射电镜图。
27.图2为n,zn-gqds的扫描电镜图和透射电镜图；其中图2a为扫描电镜，图2b为透射电镜图。
28.图3为n,zn-gqds纳米复合材料的xps图。
29.图4为n-gqds和n,zn-gqds的荧光光谱图和紫外光谱图；其中图4a为荧光光谱图；图4b为紫外光谱图。
30.图5为比率型免疫传感器在不同浓度下的心肌肌钙蛋白i标准溶液浓度的结果，其中图5a为ecl信号图，图5b为dpv信号图，图5c为ecl信号和dpv信号的比值与心肌肌钙蛋白i标准溶液浓度的线性关系图。
31.图6为比率型免疫传感器在不同浓度下的aβ蛋白标准溶液浓度的的结果，其中图6a为ecl信号图，图6b为dpv信号图，图6c为ecl信号和dpv信号的比值与aβ蛋白标准溶液浓度的线性关系图。
具体实施方式
32.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
33.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
34.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。本发明的步骤s1、s2、s3
……
不代表严格的顺序关系，可根据需要适当调整顺序。
35.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
36.根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种氮锌共掺杂的石墨烯量子点的制备方法，所述方法包括：
37.步骤s101、将go粉末与l-半胱氨酸于水中超声混匀并将ph值调至8～9，后进行高温加热反应，获得上清液，去除水分，获得淡黄色的固体，经冷冻干燥，获得n掺杂的石墨烯量子点粉末(n-gqds)；
38.所述步骤s101中，
39.所述go粉末与所述l-半胱氨酸的质量比为1：(1～6)。所述质量比若过小有反应可能不完全等不利影响；所述质量比若过大有对制备的样品稳定性有不利影响；
40.所述go粉末为氧化石墨烯粉末，可直接购买也可采用以下方式制备：准确量取30ml浓硫酸，然后在30ml浓硫酸中加入1g石墨和0.8g硝酸钠，将混合物置于冰浴中连续搅拌4h，随后将4g高锰酸钾缓缓加入上述混合液中，以防止快速发生氧化还原反应导致暴沸，随后在室温条件下搅拌1h，待溶液变成绿色后向溶液中加入100ml去离子水，在37℃加温1h，转移至油浴锅内升温至95℃回流2h，观察上述反应液颜色变成黄色后用25ml 30w/v％过氧化氢终止进一步反应。最后将上述制备的go依次用5％的盐酸和去离子水多次洗涤，洗
涤后的go真空干燥24h。
41.所述高温加热反应的温度为190～210℃，所述高温加热反应的时间为3～5h。所述高温加热反应的温度若过小不利于反应的完全进行，若过大不利于提高量子点的荧光产率，优选为200℃。
42.步骤s102、将所述n掺杂的石墨烯量子点粉末加热，后在搅拌下逐滴加入含锌离子的溶液避光反应，后离心获得沉淀并洗涤，经过冷冻干燥后用去离子水配成溶液，获得氮锌共掺杂的石墨烯量子点，即n,zn-gqds纳米复合材料。
43.所述步骤s102中，
44.所述n掺杂的石墨烯量子点粉末加热至35～45℃；先加热至35～45℃再在强烈搅拌下逐滴加入含锌离子的溶液有利于锌离子的掺杂；优选为40℃。
45.所述避光反应的温度为25℃～80℃，所述避光反应的时间为1h～5h。避光反应的温度若过低不利于氮锌共价键的形成，若过高不利于量子点的荧光稳定性；
46.所述含锌离子的溶液包括乙酸锌、硫酸锌、氯化锌、硝酸锌、氟硅酸锌、氟硼酸锌和葡萄糖酸锌中的一种；所述的n-gqds与含锌离子的溶液的体积比为1：(1～10)。所述体积比若过低不利于锌离子的成功掺杂，若过高不利于量子点的荧光稳定性；
47.根据本发明另一种典型的实施方式，提供了所述的方法获得的氮锌共掺杂的石墨烯量子点。本发明以氧化石墨烯为原料，通过高温水热法反应合成了氮掺杂的石墨烯量子点(n-gqds)，然后n-gqds通过与乙酸锌反应合成氮锌共掺杂的石墨烯量子点，不仅提高了量子点的荧光强度，而且还提高了量子点的量子产率。
48.根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种比率型免疫传感器的制备方法，所述方法包括：
49.向活化后的电极表面滴加go的悬浊液，成膜后，滴加所述的氮锌共掺杂的石墨烯量子点至所述go表面，并烘干后依次结合抗体、封闭剂和抗原，获得比率型免疫传感器。
50.所述go的悬浊液为将粉末分散于去离子水中制得；所述go的悬浊液的浓度为0.1～10mg/ml，该浓度范围下有利于其对于n，zn-gqds的负载。
51.所述n，zn-gqds的浓度为0.1～20mg/ml；该浓度范围下有利于n，zn-gqds对于蛋白质抗体的捕捉。
52.且所述go的悬浊液与所述n,zn-gqds的浓度比为1：(1～10)。该浓度比有利于反应完全；若浓度比过小不利于go表面空间的利用，若浓度比过大不利于n，zn-gqds对蛋白质抗体的捕捉。
53.所述抗体包括心肌肌钙蛋白、aβ蛋白、肌红蛋白、降钙素原、白蛋白、总蛋白、尿β2微球蛋白、丛生蛋白、前列腺特异性抗原所对应的抗体中的一种；所述封闭剂包括牛血清白蛋白(bsa)、血清、酪蛋白、脱脂奶粉和无蛋白化合物中的一种；所述抗原为心肌肌钙蛋白、aβ蛋白、肌红蛋白、降钙素原、白蛋白、总蛋白、尿β2微球蛋白、丛生蛋白、前列腺特异性抗原中的一种。
54.本发明基于氧化石墨烯以及氮锌共掺杂的石墨烯量子点复合材料，构建了光电双响应的比率型免疫传感器，将其用于疾病标志物的检测中并取得了良好的结果，检测限较低。相较于电化学传感器和光化学传感器而言，具有较高选择性和强稳定性，可以进一步将其应用于各种疾病生物标志物的检测。
55.下面将结合实施例、对比例及实验数据对本技术的一种比率型免疫传感器及其制备方法与应用进行详细说明。
56.实施例1
57.本发明实施例提供一种氮锌共掺杂的石墨烯量子点的制备方法，包括：
58.1、氧化石墨烯(go)的制备：准确量取30ml浓硫酸，然后在30ml浓硫酸中加入1g石墨和0.8g硝酸钠，将混合物置于冰浴中连续搅拌4h，随后将4g高锰酸钾缓缓加入上述混合液中，以防止快速发生氧化还原反应导致暴沸，随后在室温条件下搅拌1h，待溶液变成绿色后向溶液中加入100ml去离子水，在37℃加温1h，转移至油浴锅内升温至95℃回流2h，观察上述反应液颜色变成黄色后用25ml 30w/v％过氧化氢终止进一步反应。最后将上述制备的go依次用5％的盐酸和去离子水多次洗涤，洗涤后的go真空干燥24h。得到的go结果的扫描电镜图和透射电镜图见附图1，将制备的氧化石墨烯片用研钵研磨至粉末状备用。
59.2、准确称取15mg go粉末与45mg l-半胱氨酸混合，加入15ml去离子水超声30min使其分散均匀，再加入100μl氨水将上述混合液的ph值调至8-9之间。随后超声清洗机中超声分散10min后，转移到内衬聚四氟乙烯的高压釜中，置于马弗炉内200℃加热反应4h，冷却到室温后，转移至玻璃瓶中避光超声分散30分钟，目的是为了能够将附在未反应完全的氧化石墨烯片层之间的量子点分散到水溶液中，随后过滤掉黑色沉淀并收集上清，由于量子点的荧光特性，因此在整个过程中都需保持避光条件以防止荧光猝灭。将上清液移至圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪在60℃条件下去除水分，得到淡黄色的固体，将得到的淡黄色固体冷冻干燥，得到淡黄色的n掺杂的石墨烯量子点粉末(n-gqds)。
60.3、准确称取1mg步骤(1)中制备的n-gqds于玻璃瓶中，加热至40℃，随后在高速磁力搅拌下逐滴缓慢加入2ml 0.1g/ml的乙酸锌溶液，避光反应3h。反应完成后，将混合液置于4ml离心管中，随后在离心机中10000rpm离心14min，弃去上清，将沉淀用去离子水洗涤三到四次，得到n,zn-gqds。
61.4、n,zn-gqds的复合材料的扫描电镜图和透射电镜图见附图2，将沉淀经过冷冻干燥后用去离子水配成1mg/ml的溶液，所得到的复合材料n,zn-gqds的xps图谱见附图3，其荧光光谱图和紫外光谱图见附图4，并将得到的水溶液避光保存待用。表明成功制备得到n,zn-gqds的复合材料。
62.5、计算量子产率。通过计算可知本发明的量子产率提高至31.5％。计算公式为5、计算量子产率。通过计算可知本发明的量子产率提高至31.5％。计算公式为其中，为量子产率，i和is为n,zn-gqds和参照物质溶液的荧光峰面积，a和as为n,zn-gqds和参照物质溶液的吸光度，η和ηs分别为n,zn-gqds和参照物溶液的折射率(水溶液为1.33)；本实施例中，i＝0.6；is＝0.3；as＝40302.5；a＝1387206.5；η＝1.33；ηs＝1.33。
63.实施例2
64.本发明实施例提供一种心肌肌钙蛋白i比率型免疫传感器的制备方法及应用，其包括以下几个步骤：
65.1、称取4.5mg上述实施例1中制备的n,zn-gqds在高速搅拌下分散于1mg/ml edc的pbs溶液(ph＝7.4)中，搅拌2h以活化n,zn-gqds表面上的羧基。
66.2、使用0.3μm和0.05μm三氧化二铝粉末不断连续打磨玻碳电极，将电极依次浸入水、乙醇中超声清洗，烘干。将洗净的电极采用循环伏安法分别在0.1mol/l pbs溶液和
50mmol/l的铁氰化钾溶液中进行电极的活化直至循环伏安电流稳定。将活化好的电极再次在超纯水和乙醇中进行清洗，烘干备用。
67.3、在步骤2中预处理的电极表面均匀地滴加5ul 1mg/ml go的悬浊液，在常温下干燥，待go在电极表面成膜后，均匀滴加5μl n,zn-gqds至go表面，烘干。待上述材料完全干燥后，向其表面滴加5μl(100μg/ml)心肌肌钙蛋白i抗体(anti-ctni),随后在37℃下孵育3h，使得anti-ctni上的氨基与n,zn-gqds上的羧基能够形成酰胺键。接下来，5μl bsa(1％)在4℃条件下孵育2h以封闭非特异性结合位点，洗去未结合的bsa、晾干，滴加5μl(100μg/ml)心肌肌钙蛋白i(ctni)溶液于4℃下孵育12h待测。
68.4、比率型生物传感器对于心肌肌钙蛋白i(ctni)含量的测定
69.标准曲线的绘制：配制ctni抗原浓度从上到下依次增加(分别为0.001、0.02、0.03、0.05、0.08、0.10ng/ml)，通过ecl光信号与dpv电流信号的比值与ctni浓度绘制标准曲线，根据标准曲线来测定ctni的浓度，具体方法包括：
70.将一系列不同浓度的ctni抗原溶液(5μl)滴加在抗体修饰的玻碳电极表面，反应120min，在已经优化的实验条件下利用差示脉冲伏安检测dpv信号和循环伏安法检测ecl信号。dpv检测条件:扫描范围-0.6-0.8v；电位增量为4m v；脉冲宽度0.1s；脉冲振幅为50m v。ecl检测条件：应用电压:-2～0v(ag/agc1)，扫描速率为100mv/s,光电倍增管设置为800v，放大级数为3级。
71.结果如图5所示，可知所制备的比率型免疫传感器能够实现对ctni的灵敏检测，检测限低至4.59pg/l。
72.实施例3
73.本发明实施例提供一种aβ比率型免疫传感器的制备方法及应用,其特征在于，包括以下几个步骤：
74.1、与实施例2相同的方法预处理工作电极，在预处理后的电极表面均匀地滴涂5ul 1mg/ml go的悬浊液，在常温下干燥，待go在电极表面成膜后，均匀滴加5μl n,zn-gqds至go表面，烘干。待上述材料完全干燥后，向其表面滴加5μl(100μg/ml)aβ淀粉样蛋白抗体(anti-aβ),随后在25℃下孵育3h，使得anti-aβ上的氨基与n,zn-gqds上的羧基能够形成酰胺键。接下来，5μl bsa(1％)4℃条件下孵育2h以封闭非特异性结合位点，洗去未结合的bsa、晾干，滴加5μl(100μg/ml)aβ抗原溶液于37℃下孵育3h待测。
75.2、比率型生物传感器对于β淀粉样蛋白含量(aβ)的测定。
76.标准曲线的绘制：配制抗原浓度从上到下依次增加(1、2、30、50、80、100ng/ml)，绘制标准曲线，根据标准曲线来测定aβ的浓度。
77.将一系列不同浓度的aβ抗原溶液(5μl)滴加在抗体修饰的电极表面，反应120min，在优化的实验条件下检测差示脉冲伏安(dpv)信号和ecl信号强度。dpv检测条件:扫描范围-0.6-0.8v；电位增量为4m v；脉冲宽度0.1s；脉冲振幅为50m v。ecl检测条件：应用电压:-2～0v(ag/agc1)，扫描速率为100mv/s,光电倍增管设置为800v，放大级数为3级。
78.结果如图6所示，可知上述制备的比率型免疫传感器能够实现人血清中aβ蛋白的检测，检测限低至52pg/l。
79.最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且
还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
80.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
81.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。