一种用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物及其制备方法

1.本发明属于抗肿瘤药物设计、合成领域，具体涉及一种用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物及其制备方法。


背景技术：

2.乳腺癌(breast cancer)是全世界妇女最常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因。在所有不同的乳腺肿瘤亚型中，最常见的是雌激素受体阳性(er )乳腺癌(所有诊断病例的70％)，且此类肿瘤约占绝经前乳腺癌的60％和绝经后乳腺癌的75％。同时，研究表明雌激素对于肿瘤的发展和存活起着关键作用。更重要的是，绝经后女性内源性雌激素可由肾上腺、乳腺组织和脂肪细胞产生的雄激素通过芳香化酶转化。因此，防治绝经后乳腺癌更具挑战性，而芳香化酶已逐渐成为设计药物的靶酶。
3.目前，芳香化酶抑制剂(ais)是临床内分泌治疗乳腺癌的主要疗法之一。通过抑制芳香化酶活性，能够将雌激素水平降低90％以上，而不会干扰其他类固醇的产生。根据芳香化酶抑制剂的化学结构，可将它们分为两种亚型：甾体i型和非甾体ii型。甾体类ais是芳香化酶天然底物雄烯二酮(asd)的类似物，因此可直接与雄激素竞争。这些ais以共价方式结合在芳香化酶的活性位点上，导致其不可逆的失活。因此，甾体类ais也被称为“自杀抑制剂”。另一方面，非甾体类ais具有三唑官能团，可与芳香化酶的血红素部分反向和非共价相互作用，使酶结合位点饱和并阻止雄激素与芳香化酶以及电子转移链的结合。
4.其中，依西美坦是第三代甾体芳香化酶抑制剂，结构上与芳香化酶的自然底物雄烯二酮相似。由于绝经后妇女的雌激素主要是由肾上腺和卵巢的雄激素在外周组织中的芳香化酶作用下转化而产生，而依西美坦通过与芳香化酶的活性位点不可逆性结合而使其失活，从而降低绝经后妇女血循环中的雌激素水平。因此，依西美坦已在临床用于绝经后妇女的激素依赖性乳腺癌治疗。此外，依西美坦是一种中性化合物，不仅具有甾体结构，且具有高亲脂性。然而，尽管依西美坦对绝经后乳腺癌的疗效显著，但由于其不可避免的耐药性以及副作用等问题，限制了其进一步的临床应用。
5.基于此，在小分子靶向光敏剂研究的基础上，本发明将芳香化酶抑制剂与光动力治疗进行结合，以此来解决依西美坦在治疗绝经后乳腺癌时存在的问题以及光动力治疗本身的局限性。目前，芳香化酶抑制剂介导的pdt治疗绝经后乳腺癌的策略尚未见报道。本发明利用两亲性三缩四乙二醇将依西美坦与锌酞菁(znpc)共价连接得到一种新型共轭光敏剂ex-pc，期望能够对芳香化酶过表达的肿瘤细胞具有高度选择性，进而实现光动力靶向治疗乳腺癌的目的。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物的制备方法，其通过将芳香化酶抑制剂依西美坦与三缩四乙二醇链修饰的酞菁光敏剂共价连接，
使光敏剂对乳腺癌细胞具备特异性杀伤，得到了一种具有较高生物相容性，较好靶向性，毒副作用小的新型药物；本发明合成的化合物结构单一，不存在异构体，产品容易提纯；合成方法比较简单，副反应少，产率较高，原料易得，成本低，有利于工业化生产。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案是：
8.一种用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)将硼氢化钠(0.063mg,1.66mmol)加入到冰浴环境下搅拌的三氟乙酸(0.4ml)、冰醋酸(0.4ml)和乙腈(0.4ml)的混合物中，充分搅拌混合均匀。随后，准确称取(0.10mg,0.34mmol，cas:107868-30-4)，然后溶解在无水二氯甲烷(8ml)中并缓慢加入到混合物中。此后，将反应在氮气保护下室温搅拌12h。然后用10％nahco3水溶液中和反应混合物,并用二氯甲烷(3
×
100ml)萃取。将收集的有机层用水(3
×
100ml)洗涤，并用无水mgso4干燥，过滤，浓缩得到白色固体混合物。最后将混合物通过硅胶柱色谱法纯化，得到ex-oh，其化学结构为：
[0010][0011]
(2)将(0.97g,3.27mmol)，dmap(0.04g,0.33mmol)和丁二酸酐(0.37g,3.70mmol)依次加入到100ml双颈瓶中,然后向反应瓶中加入15ml无水dmf，搅拌混合均匀，然后将三乙胺(0.70g,6.90mmol)按照逐滴的方式缓慢地加入到反应体系中。随后，在室温条件和氮气保护下，开始搅拌反应持续48h。反应结束后，将反应体系真空旋转蒸发除去dmf，随后采用柱层析纯化，最后得到淡黄色固体化合物ex-cooh，其化学结构为：
[0012][0013]
(3)将(cas:51762-67-5)0.87g、无水碳酸钾2.75g,溶解于15ml无水乙腈中，反应加热至70℃时，将(cas:112-60-7)0.97g加入到反应体系中，随后升温至85℃回流7h，n2保护；反应完成后，真空旋干溶剂，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水萃取，收集有机层并真空旋干，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离，得到淡白色固体化合物pn-oh，其化学结构为：
[0014]
[0015]
(4)将步骤(3)得到的pn-oh、(cas:91-15-6)按摩尔比1:10加入至10ml无水正戊醇中，升温至100℃搅拌溶解，直到溶液变澄清，然后再加入5当量的无水醋酸锌，升温至130℃，待溶液变为浅绿色时，向反应体系中加入0.8ml dbu(cas号：6674-22-2)，继续反应7h，反应过程中n2保护，反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体化合物znpc-oh，其化学结构为
[0016]
(5)将步骤(2)得到的ex-cooh、edci(cas号：25952-53-8)按摩尔比1:1加入至无水dmf中，反应搅拌20min，随后滴加入dmf溶解的1当量的znpc-oh以及0.01当量的dmap，常温反应24h，反应过程中n2保护，反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体ex-pc，即为用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物。
[0017]
光动力治疗(photodynamic therapy，pdt)是一种新型、微创的肿瘤治疗方法。其基本要素包括光敏剂、一定波长的光和分子氧。光敏剂作为光动力治疗的催化剂，是光动力治疗的核心。理想的光敏剂最好满足以下几条：组分单一，结构明确，性质稳定；特异靶向性强；暗毒性弱而光毒性强；光敏化能力强，单线态氧量子产率高；最长激发波长位于近红外区，在光动力治疗窗口(650-800nm)有较强吸收。酞菁衍生物因具有优良的光物理、光化学性质(较高的摩尔消光系数和荧光量子产率，对化学环境较不敏感等)而成为理想的光敏剂之一。本发明合成了在近红外区具有较强吸收的酞菁类衍生物，通过三缩四乙二醇的修饰增加了其溶解性，从而增强了单线态氧量子产率和光毒性。
[0018]
本发明首先将依西美坦羧基化，然后通过合成三缩四乙二醇和三硝基邻苯二甲腈单体，再到酞菁母体，再通过酯化反应，得到靶向药修饰后的酞菁类衍生物ex-pc。本发明以小分子靶向药与三缩四乙二醇链修饰的酞菁光敏剂为研究对象，以人乳腺癌细胞mcf-7细胞和鼠源乳腺癌细胞4t1细胞为受试细胞株，展开了其体外和体内抗乳腺癌活性的研究。
[0019]
本发明的显著优点在于：
[0020]
(1)三缩四乙二醇链能增强酞菁光敏剂分子的两亲性，当其修饰到酞菁光敏剂上能有效增强癌细胞对酞菁光敏剂的摄取，提高光动力治疗的效果；同时其最大吸收位于红光区，激发光穿透组织能力较强，光动力治疗时不易造成皮肤光毒性，是较为理想的光敏剂。
[0021]
(2)芳香化酶抑制剂修饰后的酞菁衍生物的对乳腺癌细胞的靶向性更强，并对其表现出一定的化疗作用，而对正常组织无明显杀伤。
[0022]
(3)目标化合物结构单一，不存在异构体，产物容易纯化。
[0023]
(4)合成方法简单，副反应少，原料易得，成本低，有利于工业化生产。
附图说明
[0024]
图1中a)无光照条件下不同药物对三种细胞的杀伤作用；b)光照条件下(λ＝670nm,0.48j
·
cm-2
)不同药物对三种细胞的杀伤作用；
[0025]
图2为不同药物组的肿瘤体积变化曲线图。
具体实施方式
[0026]
下面结合对比例和实施例对本发明做进一步的阐述，但不是对本发明的限定。
[0027]
实施例1
[0028]
一种用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0029]
(1)将硼氢化钠(0.063mg,1.66mmol)加入到冰浴环境下搅拌的三氟乙酸(0.4ml)、冰醋酸(0.4ml)和乙腈(0.4ml)的混合物中，充分搅拌混合均匀。随后，准确称取(0.10mg,0.34mmol)，然后溶解在无水二氯甲烷(8ml)中并缓慢加入到混合物中。此后，将反应在氮气保护下室温搅拌12h。然后用10％nahco3水溶液中和反应混合物,并用二氯甲烷(3
×
100ml)萃取。将收集的有机层用水(3
×
100ml)洗涤，并用无水mgso4干燥，过滤，浓缩得到白色固体混合物。最后将混合物通过硅胶柱色谱法纯化，得到ex-oh，产率为39％，其化学结构为：
[0030]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ＝7.25(d,j＝10.2hz,1h),6.15(ddd,j＝10.2,1.9,1.0hz,2h),5.97(dd,j＝1.8,0.9hz,2h),5.05-4.96(m,4h),4.52(d,j＝4.0hz,2h)1.89-1.72(m,4h),1.64(dd,j＝29.0,14.1hz,2h),1.51(s,1h),1.36(d,j＝11.1hz,1h),1.32-1.14(m,2h),1.09(s,3h),1.01(d,j＝11.1hz,3h),0.70(s,4h)。
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ＝185.58,168.35,155.84,146.32,127.29,122.07,112.24,80.15,50.29,50.07,44.02,43.11,36.51,35.79,30.19,23.49,22.45,20.00,11.71。hrms(esi)m/z calcd for c
20h26
o2[m h]

:299.2006,found:299.2005。
[0031]
(2)将(0.97g,3.27mmol)，dmap(0.04g,0.33mmol)和丁二酸酐(0.37g,3.70mmol)依次加入到100ml双颈瓶中,然后向反应瓶中加入15ml无水dmf，搅拌混合均匀，然后将三乙胺(0.70g,6.90mmol)按照逐滴的方式缓慢地加入到反应体系中。随后，在室温条件和氮气保护下，开始搅拌反应持续48h。反应结束后，将反应体系真空旋转蒸发除去dmf，随后采用柱层析纯化，最后得到淡黄色固体化合物ex-cooh，产率为47％，其化学结构为：
[0032]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ＝7.24(d,j＝10.2hz,1h),6.26
–
6.11(m,2h),6.11
–
5.88(m,1h),5.01(s,2h),4.53(t,j＝8.4hz,1h),2.52
–
2.45(m,2h),2.45
–
2.38(m,2h),1.86
–
1.67(m,4h),1.67
–
1.54(m,2h),1.46(d,j＝6.0hz,1h),1.42
–
1.32(m,1h),1.29(s,1h),1.23(s,2h),1.17(s,2h),1.09(s,3h),0.81(s,3h)。
13
c nmr
(151mhz,dmso-d6)δ＝174.39,168.20,155.76,146.13,127.34,122.11,112.42,81.93,49.74,49.63,43.93,42.88,36.31,35.41,31.62,30.29,29.82,27.44,23.50,22.23,19.98,12.32。hrms(esi)m/z calcd for c
24h30
o5[m h]

:399.2166,found:399.2171。
[0033]
(3)将0.87g、无水碳酸钾2.75g,溶解于15ml无水乙腈中，反应加热至70℃时，将0.97g加入到反应体系中，随后升温至85℃回流7h，n2保护；反应完成后，真空旋干溶剂，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水萃取，收集有机层并真空旋干，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离，得到淡白色固体化合物pn-oh，产率为65％，其化学结构为：
[0034]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ＝7.86(t,j＝8.0hz,1h),7.68(t,j＝7.9hz,2h),4.56(s,1h),4.38(s,2h),3.82(s,2h),3.63(s,2h),3.51(dd,j＝15.2,7.7hz,8h),3.41(s,2h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ＝161.47,136.22,126.28,119.33,116.27,115.86,114.12,103.46,72.8,70.58,70.3,70.28,70.23,69.94,68.98,60.69.hrms(esi):m/z calcd for c
16h21
n2o5[m h]

:321.1445；found,321.1447。
[0035]
(4)将步骤(3)得到的pn-oh、按摩尔比1:10加入至10ml无水正戊醇中，升温至100℃搅拌溶解，直到溶液变澄清，然后再加入5当量的无水醋酸锌，升温至130℃，待溶液变为浅绿色时，向反应体系中加入0.8ml dbu，继续反应7h，反应过程中n2保护，反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体化合物znpc-oh，产率为12％，其化学结构为1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ＝9.25(dd,j＝9.8,6.6hz,4h),9.20(d,j＝6.1hz,1h),9.11(d,j＝7.2hz,1h),8.75(d,j＝7.4hz,1h),8.16(dt,j＝16.8,5.8hz,6h),7.97(t,j＝7.6hz,1h),7.58(d,j＝7.9hz,1h),4.82(m,2h),4.53(t,j＝5.5hz,1h),4.37(m,2h),4.07(t,j＝5.0hz,2h),3.76(t,j＝5.0hz,2h),3.59(m,2h),3.49(dd,j＝5.6,4.1hz,2h),3.42(m,2h),3.38(s,2h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ＝174.96,169.25,167.95,156.11,153.38,153.28,153.20,153.14,140.93,138.91,138.61,138.56,138.51,138.48,136.87,131.01,129.61,129.56,129.46,125.57,122.66,120.05,115.45,114.15,72.79,70.99,70.57,70.40,70.22,69.38,69.16,60.65,34.17,31.73,29.42,29.13,24.98,22.53,14.39.hrms(esi):m/z calcd for c
40h33n8 o5zn[m h]

:769.184；found,769.1884。
[0036]
(5)将步骤(2)得到的ex-cooh、edci按摩尔比1:1加入至无水dmf中，反应搅拌20min，随后滴加入dmf溶解的1当量的znpc-oh以及0.01当量的dmap，常温反应24h，反应过程中n2保护，反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色
固体ex-pc，即为用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物，产率为10％，其化学结构为：1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ＝9.42(s,6h),9.07(d,j＝7.4hz,1h),8.23(s,6h),8.16(t,j＝7.5hz,1h),7.81(d,j＝21.1hz,2h),7.43
–
7.33(m,1h),5.90(dd,j＝10.1,1.9hz,1h),5.82(d,j＝2.0hz,1h),4.96
–
4.92(m,2h),4.78(dt,j＝35.0,2.1hz,2h),4.44(t,j＝4.6hz,2h),4.15(t,j＝8.4hz,1h),4.10(t,j＝4.9hz,2h),4.07
–
4.02(m,2h),3.79(t,j＝4.9hz,2h),3.60(dd,j＝5.9,3.7hz,4h),3.50(s,4h),3.40(d,j＝30.1hz,2h),2.44(s,2h),2.36(t,j＝6.9hz,2h),2.18(d,j＝7.5hz,1h),2.07(dd,j＝13.5,4.0hz,1h),1.99(dt,j＝26.6,7.0hz,2h),1.78
–
1.75(m,1h),1.73
–
1.64(m,2h),1.47(q,j＝7.8hz,2h),0.69(s,3h),0.33(s,3h)。
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ＝185.45,172.35,171.73,167.85,156.39,155.33,153.78,153.67,153.61,145.75,141.32,139.18,138.74,138.71,131.26,130.09,129.77,129.69,129.60,127.00,125.99,122.84,122.78,122.69,121.88,115.71,114.50,112.15,81.87,71.02,70.65,70.33,69.65,68.61,63.88,49.20,43.48,42.34,35.78,34.95,34.90,31.74,31.61,30.29,29.46,29.01,27.05,25.57,23.01,22.55,21.74,19.50,14.41,11.71。hrms(esi)m/z calcd for c
64h60
n8o9zn[m h]

:1149.3847,found:1149.3801。
[0037]
对照药物m的制备方法：
[0038]
将化合物(参考文献：chem.commun.,2013,49,9570
‑‑
9572)、按摩尔比1:10加入至10ml无水正戊醇中，升温至100℃搅拌溶解，直到溶液变澄清，然后再加入5当量的无水醋酸锌，升温至130℃，待溶液变为浅绿色时，向反应体系中加入0.8ml dbu，继续反应7h，反应过程中n2保护。反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体化合物m，其化学结构为:
[0039]
应用例1
[0040]
对实施例1制得的用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物的离体光动力活性进行了研究。光敏剂的细胞毒性实验通常包括光毒性和暗毒性两部分，采用mtt法测定。检测原理是mtt化学名称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐唑蓝。该实验方法的检测原理为活细胞线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，这是一种还原性酶，能使外源性
mtt还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞中的线粒体因不含有琥珀酸脱氢酶，无法将mtt还原，所以不会出现蓝紫色结晶的甲瓒。相关实验表明，二甲基亚砜(dmso)有机溶剂能够溶解沉积在细胞中的甲瓒。此时，用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值(od值)。根据测得的od值，来判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
[0041]
mtt实验：
[0042]
a.细胞铺板：选取生长状态良好的mcf-7和4t1细胞，稀释细胞使细胞密度为8
×
104个/ml，使用排枪将细胞均匀加入至96孔板中，每个浓度数据设置6个复孔，每孔加入100l细胞悬液。
[0043]
b.加药：配制药物浓度分别为1mm，0.5mm，0.25mm，0.125mm，0.0625mm，0.03125mm的dmf母液(含5％cel)。量取1l母液稀释至1ml dmem培养基中，最终得对数浓度依次为1m，0.5m，0.25m，0.125m，0.0625m，0.03125m。相对应的药物孔中，加入20l的对应药物浓度，最终使得药物梯度为0.1m，0.05m，0.025m，0.0125m，0.00625m，0.003125m。96孔板放在细胞培养箱中继续培养过夜，使细胞摄取药物。
[0044]
c.光毒暗毒实验：吸出旧的培养基，采用无菌生理盐水清洗三次，加入100l新的培养基。光毒实验中，使用670nm led灯光照2min后放入培养箱过夜。对照组暗毒实验，更换新的培养基后，无需光照，放培养箱培养过夜。
[0045]
d.od值的检测：培养结束后，用移液枪每个孔中加入配制好的mtt溶液10l，并在摇床上震荡5min，随后将96孔板继续放入培养箱中培养4h。
[0046]
e.将96孔板中培养基倒出，每孔加入100l dmso溶液，并在摇床上震荡40min，随后用酶标仪测定溶液在570nm处的od值。
[0047]
我们采用mtt法测定了用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物，在光照和无光照条件下，对乳腺癌细胞mcf-7和4t1以及正常肝细胞lo2的杀伤效果，光照波长为670nm，光照能量密度为0.48j
·
cm-2
。
[0048]
由实验数据可知：如图1所示，在无光照条件下，药物浓度为0.1μm时，用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物对细胞无明显的杀伤作用；而在光照条件下，药物组和对照组在0.1μm时对细胞则均表现出很强的光毒性，其半数抑制浓度(ic
50
值)如表1所示。
[0049]
表1三缩四乙二醇链修饰的酞菁类衍生物以及对照药物的ic
50
值
[0050][0051]
应用例2
[0052]
对实施例1制得的用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物的体内的光动力活性进行研究。光敏剂的体内光动力活性通过药物对小鼠乳腺癌4t1肿瘤模型的抑瘤效果体现。
[0053]
抑瘤率实验：
[0054]
(1)取生长状态良好的4t1细胞，经过离心重悬细胞并将细胞密度调整为1
×
107个/ml。小鼠后肢右侧经75％酒精消毒后，皮下接种细胞悬液200l，待肿瘤的平均尺寸达到100mm3后进行实验。
[0055]
(2)将小鼠分为4组(ex-pc组、m组、exe组(exemestane组)，生理盐水组)，每组5只小鼠。给药前，称量裸鼠体重和测量肿瘤大小，随后每只小鼠按分组分别静脉注射相应药物(75m，200μl)和生理盐水溶液，给药8h后，使用670nm激光器照射肿瘤区域10min，同时每天固定时间点称量体重和测量肿瘤体积。(v＝0.5
×
l
×
w2；l、w分别表示肿瘤的长度与宽度)。
[0056]
我们通过制备的用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物，在光照条件下，对小鼠乳腺癌4t1肿瘤模型的抑制效果进行实验，以此体现药物在体内的光动力活性。
[0057]
由实验数据可知：如图2所示，在光照条件下，ex-pc药物表现出很强的光毒性，肿瘤体积呈现出缓慢性的微弱增长，14天后其肿瘤体积为180mm3。而对照药物m组、对照药物exe组以及空白control组对肿瘤的光动力效果较差，肿瘤体积呈不可控式增长,14天后其肿瘤体积分别为670mm3、1080mm3和1350mm3。该实验结果表明：用于绝经后乳腺癌靶向光动力治疗的酞菁衍生物对小鼠体内肿瘤组织表现出较强光动力效果。
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由于目标药物ex-pc中四乙二醇的-oh被用作连接ex-cooh分子的反应位点，但其三甘醇不参与任何反应，因此含有三甘醇的m化合物能更好地反映其对比效果。因此，我们在本发明中选择了m化合物作为对照药物来进行实验。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。