免疫效应细胞工程化和其用途
1.相关申请
2.本技术要求于2019年7月17日提交的美国临时申请序列第62/875,490号和于2020年5月7日提交的美国临时申请序列第63/021,560号的优先权，所述美国临时申请的公开内容特此通过引用整体并入本文。
3.通过引用并入序列表
4.于2020年7月17日创建的大小为62,025字节的命名为“056932-501001wo_sl_st25.txt”的序列表特此通过引用整体并入本文。
技术领域
5.本公开广泛涉及现成的免疫细胞产物领域。更确切地说，本公开涉及研发能够活体内递送治疗相关特性的多功能效应细胞的策略。根据本公开研发的细胞产物解决了患者来源的细胞疗法的关键限制。
背景技术：
6.过继性细胞疗法领域目前的重点是使用患者来源的细胞和供体来源的细胞，这使得实现癌症免疫疗法的持续制造以及向所有可能受益的患者递送疗法尤其困难。还需要改善过继转移的淋巴细胞的功效和存留，以促进有利的患者结果。淋巴细胞(例如t细胞和自然杀伤(nk)细胞)是有效的抗肿瘤效应子，其在先天性和适应性免疫中起重要作用。然而，将这些免疫细胞用于过继性细胞疗法仍然具有挑战性，并且尚未满足改善的需求。因此，在过继性免疫疗法中，仍有大量机会来利用t细胞和nk细胞或其它淋巴细胞的全部潜能。
技术实现要素：
7.需要功能改善的效应细胞，其解决以下范围内的问题：从反应速率、细胞耗竭、输血细胞损失(存活和/或存留)、肿瘤通过标靶损失或谱系转换逃逸、肿瘤靶向精确度、脱靶毒性、肿瘤外效应到针对实体肿瘤的功效，即肿瘤微环境和相关免疫抑制、募集、运输和浸润。
8.本发明的一个目的是提供用以产生由单一细胞衍生诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell；ipsc)克隆系分化的衍生非多能细胞的方法和组合物，所述ipsc系包含其基因组中的一种或几种基因修饰。所述一种或几种基因修饰包括dna插入、缺失和取代，并且所述修饰在分化、扩增、传代和/或移植后在后续衍生细胞中保留并且保持功能性。
9.本技术的ipsc衍生非多能细胞包括(但不限于)cd34细胞、生血内皮细胞、hsc(造血干细胞和祖细胞)、造血多潜能祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞和b细胞。本技术的ipsc衍生非多能细胞通过由包含相同基因修饰的ipsc分化而在其基因组中包含一种或几种基因修饰。用于获得基因工程化衍生细胞的工程化克隆ipsc分化策略要求ipsc在定向分化中的发育潜能不会受到ipsc中的工程化模式的不利影响，并且也
要求工程化模式如预期一般在衍生细胞中起作用。另外，这一策略克服了工程化原代淋巴细胞(如从外周血获得的t细胞或nk细胞)的现有障碍，因此细胞难以工程化，并且对这类细胞进行工程化通常缺乏再现性和均一性，使得细胞表现出伴随高细胞死亡和低细胞扩增的不良细胞持久性。此外，这种策略避免产生使用起始时为异源的原代细胞源另外获得的异源效应细胞群。
10.本发明的一些方面提供使用包含(i)、(ii)或(iii)的方法获得的基因组工程改造的ipsc，分别反映了在重编程过程之后、同时和之前基因组工程改造的策略：
11.(i)：按任何次序通过(i)和(ii)中的一个或两个对ipsc进行基因工程化：(i)将一个或多个构建体引入到ipsc中以允许在所选择位点进行靶向整合；(ii)(a)使用能够进行所选位点识别的一种或多种核酸内切酶在所选择位点处将一个或多个双链断裂引入到ipsc中；以及(b)培养步骤(i)(ii)(a)中的ipsc以允许进行内源性dna修复，从而在所选择位点处产生靶向插入/缺失；由此获得能够分化成部分或完全分化细胞的基因组工程化ipsc。
12.(ii)：对重编程非多能细胞进行基因工程改造，以获得基因组工程改造的ipsc，所述基因工程改造包含：(i)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选的小分子组合物接触，以起始非多能细胞的重编程，所述小分子组合物包含tgfβ受体/alk抑制剂、mek抑制剂、gsk3抑制剂和/或rock抑制剂；和(ii)按任何次序将(a)和(b)中的一者或两者引入步骤(ii)(i)中的重编程非多能细胞中：(a)一个或多个构建体，以允许在所选位点进行靶向整合；(b)在所选位点使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶的一个或多个双链断裂，然后培养步骤(ii)(ii)(b)中的细胞以允许进行内源性dna修复，从而在所选位点产生靶向插入/缺失；因此所获得的基因组工程改造的ipsc包含至少一种功能性靶向基因组编辑，并且所述基因组工程改造的ipsc能够分化成部分或完全分化细胞。
13.(iii)：对重编程的非多能细胞进行基因工程改造以获得基因组工程改造的ipsc，所述基因工程改造包含(i)和(ii)：(i)按任何次序将(a)和(b)中的一者或两者引入非多能细胞中：(a)一个或多个构建体，以允许在所选位点进行靶向整合；(b)在所选位点使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶的一个或多个双链断裂，其中培养步骤(iii)(i)(b)中的细胞以允许进行内源性dna修复，从而在所选位点产生靶向插入/缺失；和(ii)使步骤(iii)(i)中的细胞与一种或多种重编程因子和任选的小分子组合物接触，以获得在所选位点包含靶向编辑的基因组工程改造的ipsc，所述小分子组合物包含tgfβ受体/alk抑制剂、mek抑制剂、gsk3抑制剂和/或rock抑制剂；由此获得包含至少一种功能性靶向基因组编辑的基因组工程改造的ipsc，并且所述基因组工程改造的ipsc能够分化成部分分化的细胞或完全分化的细胞。
14.在上述方法的一个实施例中，在一个或多个所选择位点处的所述至少一个靶向基因组编辑包括一种或多种外源性多核苷酸的插入，所述外源性多核苷酸编码安全开关蛋白、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性蛋白和肽、药物靶候选物或促进基因组工程化ipsc或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，用于插入的外源性多核苷酸与以下操作性地连接：(1)一个或多个外源性启动子，所述一种或多种外源性启动子包括cmv、ef1α、pgk、cag、ubc或其它组成型特异性启动子、诱导型特异性启动子、时间型特异性启动子、组织型特异性启动子或细胞型特异
性启动子；或(2)一个或多个内源性启动子，所述一个或多个内源性启动子包含在包括以下的所选择位点中：aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、β-2微球蛋白、gapdh、tcr或runx1、或满足基因组安全港标准的其它基因座。在一些实施例中，使用上述方法产生的基因组工程化ipsc包括一种或多种不同的外源性多核苷酸，所述一种或多种不同的外源性多核苷酸编码包括胱天蛋白酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经过修饰的egfr或b细胞cd20的蛋白质，其中当基因组工程化ipsc包括两个或更多个自杀基因时，所述自杀基因整合在不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包括aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、h11、β-2微球蛋白、gapdh、tcr或runx1。在一个实施例中，外源性多核苷酸编码以下的部分或全长肽：il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18、il21和/或其相应受体。在一些实施例中，由外源性多核苷酸编码的il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18、il21和/或其相应受体的部分或全长肽呈融合蛋白的形式。
15.在一些其它实施例中，使用本文所提供的方法产生的基因组工程化ipsc包括位于与以下相关的一个或多个内源性基因处的插入/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物靶候选物、免疫应答调控和调节或抑制ipsc或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，用于破坏的内源性基因包括以下中的至少一者：b2m、tap1、tap2、tapasin、nlrc5、pd1、lag3、tim3、rfxank、ciita、rfx5、rfxap，以及染色体6p21区域中的任何基因。
16.在又一些其它实施例中，使用本文所提供的方法产生的基因组工程改造的ipsc包含位于aavs1基因座的编码胱天蛋白酶的外源性多核苷酸和位于h11基因座的编码胸苷激酶的外源性多核苷酸。
17.在再一些其它实施例中，方法(i)、(ii)和/或(iii)进一步包含：使基因组工程改造的ipsc与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂的小分子组合物接触，以维持基因组工程改造的ipsc的多能性。在一个实施例中，包括至少一个靶向基因组编辑的所获得的基因组工程化ipsc具有功能性、可有效分化并且能够分化成包括同一功能性基因组编辑的非多能细胞。
18.本发明还提供以下实施例。
19.本技术的一个方面提供了对肿瘤细胞表面抗原mica/b具有特异性的嵌合抗原受体(car)。所述mica/b-car的一些实施例是t细胞特异性或nk细胞特异性的。所述mica/b-car的一些实施例与表面mica/b结合，但不与可溶性或脱落的mica/b结合。所述mica/b-car的一些实施例减少了mica/b抗原的肿瘤细胞表面脱落和/或增加了肿瘤细胞表面mica/b密度。所述mica/b-car的一些实施例包括与mica/b的保守α3结构域结合的scfv(单链可变片段)。所述mica/b-car的一些实施例包括重链可变区，所述重链可变区由与seq id no:33具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示。所述mica/b-car的一些实施例包括轻链可变区，所述轻链可变区由与seq id no:34具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示。所述mica/b-car的一些实施例包括scfv，所述scfv由与seq id no:35或36具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示。所述mica/b-car的一些实施例包括结合mica/b的scfv的重链可变区以及结合mica/b的scfv的轻链可变区，所述重链可变区与t细胞受体(tcr)的第一恒定区功能性地连接，所述轻链可变区与t细胞受体(tcr)的第二恒定区功能
b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3和tigit；以及与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：hla-e、41bbl、cd3、cd4、cd8、cd16、cd47、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a
2a
r、抗原特异性tcr、fc受体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体。在细胞或群体的一些实施例中，细胞包括表1中列出的基因型中的至少一种。
22.在一些实施例中，上文包括mica/b-car和/或cd58和cd54中的一者或两者中的敲除以及任选地另外的一个或多个编辑的所述细胞是衍生nk细胞或衍生t细胞，并且与所述细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应物细胞相比，所述衍生细胞具有包括以下的以下特性中的至少一个特性：改善的持久性和/或存活率；增加的对天然免疫细胞的抗性；增加的细胞毒性；改善的肿瘤渗透性；增强的或获取的adcc；增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤部位和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；改善的拯救肿瘤抗原逃逸的能力；稳定肿瘤抗原的能力；以及避免互相杀伤(fratricide)的能力。
23.在包括mica/b car以及任选地另外的一个或多个编辑的所述细胞的一些其它实施例中，细胞进一步包括高亲和力不可切割的cd16(hncd16)或其变体。在一些实施例中，hncd16或其变体包括：cd16的胞外结构域中的f176v和s197p；或来源于cd64的完全或部分胞外结构域；非cd16(非天然)跨膜结构域；非cd16胞内结构域；非cd16信号传导结构域；和/或刺激性结构域；或来源于相同或不同的非cd16多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激性结构域。在一些实施例中，非cd16跨膜结构域源自cd3d、cd3e、cd3g、cd3ζ、cd4、cd8、cd8a、cd8b、cd27、cd28、cd40、cd84、cd166、4-1bb、ox40、icos、icam-1、ctla-4、pd-1、lag-3、2b4、btla、cd16、il7、il12、il15、kir2dl4、kir2ds1、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c、nkg2d或t细胞受体(tcr)多肽。在一些实施例中，非cd16刺激性结构域源自cd27、cd28、4-1bb、ox40、icos、pd-1、lag-3、2b4、btla、dap10、dap12、ctla-4或nkg2d多肽。在一些实施例中，非天然信号传导结构域源自cd3ζ、2b4、dap10、dap12、dnam1、cd137(41bb)、il21、il7、il12、il15、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c或nkg2d多肽。在一些其它实施例中，所述非天然跨膜结构域源自nkg2d，所述非天然刺激性结构域源自2b4，并且所述非天然信号传导结构域源自cd3ζ。
24.在上文包括mica/b-car和/或cd58和cd54中的一者或两者中的敲除以及任选地如所提供的另外的一个或多个编辑的所述细胞的一些实施例中，所述细胞可以进一步包括第二car。在一些实施例中，第二car是t细胞特异性或nk细胞特异性的，或者是结合双特异性抗原的car、可转换的car、二聚化car、分开的car；多链car、诱导型car或重组tcr。或者，在一些其它实施例中，第二car与另一个car共表达；与细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分或全长肽共表达；任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与检查点抑制剂共表达。在一些实施例中，第二car对以下中的至少一者具有特异性：cd19、bcma、cd20、cd22、cd38、cd123、her2、cd52、egfr、gd2、msln、vegf-r2、psma和pdl1。在一些实施例中，第二car对以下中的任一个具有特异性：adgre2、碳酸酐酶ix(caix)、ccri、ccr4、癌胚抗原(cea)、cd3、cd5、cd7、cd8、cd10、cd20、cd22、cd30、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd44v6、cd49f、cd56、cd70、cd74、cd99、cd123、cd133、cd138、cds、clec12a、巨细胞病毒(cmv)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(egp 2)、上皮糖蛋白-40(egp-40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、egfrviii、受体酪氨酸蛋白激酶erb-b2,3,4、egfir、egfr-viii、erbb、叶酸结合蛋白(fbp)、
胎儿型乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体a、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、人表皮生长因子受体2(her-2)、人端粒酶逆转录酶(htert)、icam-1、整合蛋白b7、白介素-13受体亚基α-2(il-13rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(kdr)、lewis a(ca19.9)、lewis y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、lilrb2、黑色素瘤抗原家族a1(mage-a1)、mica/b、粘蛋白1(muc-1)、粘蛋白16(muc-16)、间皮素(msln)、nkcsi、nkg2d配体、c-met、癌症-睾丸抗原ny-eso-1、癌胚抗原(h5t4)、prame、前列腺干细胞抗原(psca)、prame、前列腺特异性膜抗原(psma)、肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)、tim-3、trbci、trbc2、血管内皮生长因子r2(vegf r2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(wilms tumor protein，wt-1)或病原体抗原。第二car的各个实施例可以任选地在trac基因座处插入，和/或由tcr的内源性启动子驱动。在一些实施例中，由于car插入，tcr被敲除。
25.在上文包括mica/b-car和/或cd58和cd54中的一者或两者中的敲除以及任选地如所提供的另外的一个或多个编辑的所述细胞的一些实施例中，所述细胞可以进一步包括细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分或全长肽。在一些实施例中，外源性细胞因子和/或其受体包括以下中的至少一者：il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18、il21和其相应受体。在一些实施例中，外源性细胞因子和/或其受体包括以下中的至少一者：(i)通过使用自切割肽进行il15和il15rα的共表达；(ii)il15和il15rα的融合蛋白；(iii)具有截短的il15rα的胞内结构域的il15/il15rα融合蛋白；(iv)il15以及il15rα的结合膜的sushi结构域的融合蛋白；(v)il15和il15rβ的融合蛋白；(vi)il15和共同受体γc的融合蛋白，其中所述共同受体γc是天然的或经过修饰的；以及il15rβ的同源二聚体；其中(i)-(vii)中的任一项可以在单独构建体中或在双顺反子构建体中与car共表达。可以瞬时表达细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分或完全肽的上述各个实施例。
26.在上文包括mica/b-car和/或cd58和cd54中的一者或两者中的敲除以及任选地如所提供的另外的一个或多个编辑的所述细胞的一些实施例中，所述细胞是衍生nk细胞或衍生t细胞。在所述衍生nk细胞的一些实施例中，nk细胞能够募集t细胞(包含所述衍生nk细胞的接受者的旁观者t细胞)和/或将所述t细胞迁移到肿瘤部位。在所述衍生nk细胞或衍生t细胞的一些实施例中，在存在一种或多种检查点抑制剂的情况下，所述细胞能够降低肿瘤免疫抑制。在检查点抑制剂的一些实施例中，无论是由所述细胞表达还是与所述细胞一起存在，所述检查点抑制剂是一种或多种检查点分子的拮抗剂，所述一种或多种检查点分子包括pd-1、pdl-1、tim-3、tigit、lag-3、ctla-4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39、cd47、cd73、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxpl、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2、rara(视黄酸受体α)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e或抑制性kir。在由所述细胞表达或与所述细胞一起存在的检查点的一些实施例中，所述检查点可以是以下中的一种或多种：阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗(lirimumab)、莫纳利珠单抗(monalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和其衍生物或功能性等效物；或可以是阿特珠单抗、纳武单抗和派姆单抗中的至少一种。
27.在上文包括mica/b-car和/或cd58和cd54中的一者或两者中的敲除以及任选地如
所提供的另外的一个或多个编辑的所述细胞的一些实施例中，所述细胞包括：一个或多个外源性多核苷酸，所述一个或多个外源性多核苷酸整合在一个安全港基因座或所选择的基因座中；或多于两个外源性多核苷酸，所述多于两个外源性多核苷酸整合在不同安全港基因座或两个或更多个所选择的基因座中。在一些实施例中，所述安全港基因座包括以下中的至少一者：aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh或runx1。在一些实施例中，所述所选择的基因座是以下之一：b2m、tap1、tap2、tapasin、nlrc5、ciita、rfxank、rfx5、rfxap、tcr、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit；并且其中所述外源性多核苷酸的所述整合任选地敲除所述基因座中的基因的表达。在一些实施例中，所选择的基因座处的经整合的外源性多核苷酸在基因座处的内源性启动子下表达。在整合部位是tcr基因座的一些其它实施例中，所述部位可以是tcrα或tcrβ的恒定区。
28.本技术的另一方面还提供了一种组合物，所述组合物包括在本文中描绘的所述实施例中的任一个的细胞或其群体。在一些实施例中，所述组合物是用于治疗用途并且包括在本文中描绘的所述实施例中的任一个的衍生细胞以及一种或多种治疗剂。在一些实施例中，所述治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小rna、dsrna(双链rna)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包括一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(imid)。在一些实施例中，所述一种或多种治疗剂是检查点抑制剂，所述检查点抑制剂包括检查点分子的一种或多种拮抗剂，所述检查点分子包括pd-1、pdl-1、tim-3、tigit、lag-3、ctla-4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39、cd47、cd73、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxpl、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2、rara(视黄酸受体α)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e或抑制性kir。在一些实施例中，所述一种或多种治疗剂是检查点抑制剂，所述检查点抑制剂包括以下中的一种或多种：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、派姆单抗和其衍生物或功能性等效物。在一些其它实施例中，所述一种或多种治疗剂是包括阿特珠单抗、纳武单抗和派姆单抗中的至少一种的检查点抑制剂。在又一些其它实施例中，所述一种或多种治疗剂包括维奈托克(venetoclax)、阿扎胞苷(azacitidine)和泊马度胺(pomalidomide)中的一种或多种。
29.在一些实施例中，所述治疗剂包含在包括用于治疗用途的衍生细胞的组合物中，所述治疗剂是包括以下的抗体：抗cd20、抗her2、抗cd52、抗egfr、抗cd123、抗gd2、抗pdl1和/或抗cd38抗体。在一些其它实施例中，用于治疗用途的组合物中的抗体是以下中的一种或多种：利妥昔单抗(rituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、乌布里图昔单抗(ublituximab)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(certuximab)、迪努妥昔单抗(dinutuximab)、阿维鲁单抗、达土木单抗(daratumumab)、艾沙妥昔单抗(isatuximab)、mor202、7g3、csl362、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)以及其人源化或经过fc修饰的变体或片段和其功能性等效物和生物仿制药。在仍一些其它实施例中，用于治疗用途的组合物中的抗体是达土木单抗，并且组合物中的细胞包括如本文所提供的mica/b car、cd38敲除以及任选地hncd16或其变体的表达。在一
些实施例中，包括本文所提供的细胞的组合物的治疗用途包括将所述组合物引入到适于过继性细胞疗法的受试者体内，其中所述受试者患有自身免疫病症；血液系统恶性肿瘤；实体瘤；癌症或病毒感染。
30.本技术的又另一方面提供了一种制备衍生细胞的方法，所述衍生细胞包括编码如由本技术提供的mica/b-car的多核苷酸，并且所述方法包括分化ipsc以获得所述衍生细胞。在所述方法的一些实施例中，在分化之前将编码mica/b-car的多核苷酸引入到ipsc中。在一些其它实施例中，在ipsc分化之后将编码mica/b-car的多核苷酸引入到衍生细胞中。
31.在所述方法的一些实施例中，用于分化的ipsc和/或从ipsc分化获得的衍生细胞包括以下中的一种或多种：(i)cd38敲除；(ii)hla-i缺陷和/或hla-ii缺陷；(iii)与其天然对应物细胞相比，b2m无效或低以及任选地ciita无效或低；(iv)hla-g或不可切割的hla-g的所引入表达或cd58和cd54中的一者或两者中的敲除；(v)高亲和力不可切割的cd16(hncd16)或其变体；(vi)具有除了mica/b之外的靶向特异性的嵌合抗原受体(car)；(vii)细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分或全长肽；(viii)表1中列出的基因型中的至少一种；(ix)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的缺失或减少的表达：tap1、tap2、tapasin、nlrc5、ciita、rfxank、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3和tigit；以及(x)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：hla-e、41bbl、cd3、cd4、cd8、cd16、cd47、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a
2a
r、抗原特异性tcr、fc受体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体。
32.在制备衍生细胞的方法的一个实施例中，所述方法进一步包括对克隆ipsc基因组工程化以敲除cd38；破坏hla-i和/或破坏hla-ii；敲除b2m和ciita或cd58和cd54中的一者或两者；引入hla-g或不可切割的hla-g、高亲和力不可切割的cd16或其变体、第二car和/或细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分或全长肽的表达；与其天然对应物细胞相比，缺失或减少以下中的至少一者中的表达：tap1、tap2、tapasin、nlrc5、ciita、rfxank、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3、和tigit；或与其天然对应物细胞相比，引入或增加以下中的至少一者中的表达：hla-e、41bbl、cd3、cd4、cd8、cd16、cd47、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a
2a
r、抗原特异性tcr、fc受体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体。
33.在制备包括编码如由本技术提供的mica/b-car的多核苷酸的衍生细胞的方法的一些实施例中，所述方法的基因组工程化步骤包括靶向编辑。在一些实施例中，所述靶向编辑包括缺失、插入或插入/缺失。在一些实施例中，所述靶向编辑是通过crispr、zfn、talen、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其它功能变型进行的。
34.本技术还提供了克隆ipsc的crispr介导的编辑，其中所述编辑包括敲入编码如本文所描绘的mica/b car的多核苷酸；或敲除cd58和cd54中的一者或两者。在一些实施例中，crispr编辑的克隆ipsc包括表1中列出的基因型中的至少一种。在一些实施例中，所述克隆ipsc的crispr介导的编辑进一步包括敲除cd38。在一些其它实施例中，所述crispr介导的编辑进一步包括在tcr基因座处插入mica/b car或第二car，和/或其中所述car由tcr的内源性启动子驱动，和/或其中所述tcr通过所述car插入而被敲除。
35.本技术的另外方面提供了一种改善靶向肿瘤细胞表面抗原mica/b的治疗的方法，所述方法包括向处于治疗的受试者施用包括mica/b-car的细胞，所述细胞具有本技术中描绘的细胞和mica/b-car的特征和非限制性实施例。在一些实施例中，包括mica/b-car的细胞包括t细胞、nk细胞、衍生nk细胞或衍生t细胞。在一些实施例中，包括mica/b-car的细胞进一步包括以下中的一种或多种：cd38敲除、高亲和力不可切割的cd16或其变体，并且任选地包括：hla-i缺陷和/或hla-ii缺陷；b2m和ciita敲除；hla-g或不可切割的hla-g的所引入表达或cd58和cd54中的一者或两者中的敲除；第二car的所引入表达和细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分或全长肽的所引入表达。在一些实施例中，在所述方法中使用的细胞包括表1中列出的基因型中的至少一种。
36.与使用不具有本发明的mica/b-car的效应细胞进行的治疗相比，使用包括如所提供的mica/b car的细胞来改善靶向肿瘤细胞表面抗原mica/b的治疗的方法的各个实施例能够进行以下中的一项或多项：减少mica/b抗原的肿瘤细胞表面脱落；增加肿瘤细胞表面mica/b密度；防止肿瘤抗原逃逸；克服肿瘤微环境抑制；增强效应细胞激活和杀伤功能；以及体内肿瘤进展控制、肿瘤细胞负荷降低、肿瘤清除和/或改善存活率。
37.通过结合附图进行的以下描述，如本文所提供的组合物和方法的各个目的和优势将变得显而易见，在所述附图中借助于说明和实例阐述本发明的某些实施例。
附图说明
38.图1是用于ipsc衍生细胞中的细胞表面表达的细胞因子的若干构建体设计的图示。il15用作说明性实例，其可以用其它所期望的细胞因子置换。
39.图2a-d展示了具有一个或多个转基因的靶向cd38的转基因敲入构建体的各种组成(a和b对c和d)，其由外源性启动子或由用于产生cd38-/-转基因
多能干细胞和由其衍生的效应细胞的cd38内源性启动子驱动(b和d对a和c)。
40.图3示出了包含在靶向cd38的il15/il15ra-2a-hncd16敲入构建体中的示例性核酸序列，所述构建体具有由用于产生cd38-/-cd16 il15效应细胞的外源性启动子驱动的转基因，所述效应细胞衍生自使用所述构建体及其变体工程化的多能干细胞。在交替的粗体或下划线文本中的第一行中指示的序列的特征按照出现次序对应于粗体或下划线文本中指示的序列的相应部分。
41.图4示出了包含在靶向cd38的il15/il15ra-2a-hncd16敲入构建体中的示例性核酸序列，所述构建体具有由用于产生cd38-/-cd16
il15
效应细胞的cd38内源性启动子驱动的转基因，所述效应细胞衍生自使用所述构建体及其变体工程化的多能干细胞。在交替的粗体或下划线文本中的第一行中指示的序列的特征按照出现次序对应于粗体或下划线文本中指示的序列的相应部分。
42.图5a-b是在图5a：cd54和图5b：cd58处具有靶向敲除的细胞的图示，其中图5a和5b的左侧图示出了使用对cd54或cd58具有非特异性的抗体的阴性对照。
43.图6是成熟的ipsc衍生nk细胞的流式细胞术的图示，其显示了hncd16表达、b2m敲除(hla-a2表达的丧失)、hla-g表达和il-15/il-15ra(lngfr)构建体表达的逐步工程化。
44.图7a-b示出了将hncd16引入到ipsc衍生nk细胞和具有外源性hncd16和cd38敲除两者的ipsc衍生nk细胞。
45.图8是由流式细胞术测定的端粒长度的图示，并且与成人外周血nk细胞相比，来自ipsc的成熟衍生nk细胞维持较长的端粒。
46.图9a示出了t细胞上的mica/b car表达；图9b示出了mica/b car ink细胞上的mica/b car表达。
47.图10a示出了mica/b car抗原特异性细胞因子产生和t细胞激活；图10b示出了mica/b car t细胞的mica/b car抗原特异性脱粒；图10c示出了mica/b car t细胞的mica/b car抗原特异性细胞毒性。
48.图11a示出了mica/b car抗原特异性细胞因子产生和ink细胞激活；图11b示出了mica/b car ink细胞的mica/b car抗原特异性脱粒；图11c示出了mica/b car ink细胞的mica/b car抗原特异性细胞毒性。
49.图12a和图12b示出了mica/b car ink细胞针对抗性mica/b 肿瘤细胞系具有增强的细胞毒性：1.786-o肿瘤细胞；2.u-2os肿瘤细胞；3.caski肿瘤细胞；以及4.a2058肿瘤细胞。
50.图13示出了含有效应t细胞的mica/b car降低体内肿瘤负荷。
51.图14示出了含有效应ink细胞的mica/b car降低体内肿瘤负荷。
52.图15a和图15b示出了通过胞外结构域重链和轻链定向以及优先的间隔子长度优化mica/b-car体内功效。
具体实施方式
53.ipsc(诱导性多能干细胞)的基因组修饰包括多核苷酸插入、缺失和取代。基因组工程改造的ipsc中的外源基因表达通常遇到问题，例如在初始基因组工程改造的ipsc长期克隆扩增之后、在细胞分化之后和在来自由基因组工程改造的ipsc衍生的细胞的去分化细胞类型中基因沉默或基因表达减少。另一方面，对如t细胞或nk细胞等原代免疫细胞进行直接工程化是具有挑战性的，并且对制备和递送用于过继性细胞疗法的工程化免疫细胞存在障碍。本发明提供了用于将一种或多种外源性基因(包含自杀基因和其它功能性形式)稳定地整合到ipsc衍生细胞(包含但不限于hsc(造血干细胞和祖细胞)、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞)中的有效的、可靠的和靶向的方法，所述一种或多种外源性基因提供与移植、运输、归巢、迁移、细胞毒性、活力、维持、扩增、寿命、自我更新、持久性和/或存活有关的有所改善的治疗性质。
54.定义
55.除非本文中另外定义，否则结合本技术使用的科学和技术术语应具有所属领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
56.应理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，且因此可变化。本文所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的，并且并不意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书界定。
57.如本文中所使用，冠词“一(a/an)”和“所述(the)”在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种))的所述冠词的语法对象。举例来说，“一个要素”意指一个要素或超过一个要素。
58.替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。
59.术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一种或两种。
60.如本文中所使用，术语“约”或“大约”是指相较于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度
±
15％、
±
10％、
±
9％、
±
8％、
±
7％、
±
6％、
±
5％、
±
4％、
±
3％、
±
2％或
±
1％的范围。
61.如本文中所使用，术语“大体上”或“基本上”是指相较于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。在一个实施例中，术语“基本上相同”或“大体上相同”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
62.如本文中所使用，术语“大体上不含”和“基本上不含”可互换使用，且当用于描述组合物(例如细胞群或培养基)时，是指不含所指定物质或其来源的组合物，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含所指定物质或其来源，或检测不到，如通过常规方式所测量。术语组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质也意指(1)所述组合物中不包括任何浓度的这类成分或物质，或(2)所述组合物中包括功能上呈惰性、但处于低浓度的这类成分或物质。类似含义可以应用于术语“不存在”，其中是指不存在组合物的特定物质或其来源。
63.在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise/comprises/comprising)”应理解成暗指包括所陈述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。在特定实施例中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义地使用。
[0064]“由
…
组成”意指包括并且限于短语“由
…
组成”之后的任何事物。因此，短语“由
…
组成”指示所列要素是需要或必需的，并且不能存在其它要素。
[0065]“基本上由
…
组成”意指包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本公开中规定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由
…
组成”指示所列要素为需要或必需的，但其它要素不是任选的且可视其是否影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。
[0066]
贯穿本说明书提及“一个实施例”、“一实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某一实施例”、“额外实施例”或“另一实施例”或其组合意指结合实施例描述的特定特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书中的各处出现的前述短语不一定全部指代同一实施例。此外，特定特征、结构或特性可在一个或多个实施例中以任何合适方式组合。
[0067]
术语“离体”一般是指在生物体外部发生的活动，例如在生物体外部的人工环境中的活组织中或活组织上进行的实验或测量，优选其中天然条件的改变最小。在特定实施例
中，“离体”程序涉及从生物体中获取活细胞或组织并且通常在无菌条件下在实验室设备中培养，并且通常培养几小时或最多约24小时，但包括最多48小时或72小时或更长，这视情况而定。在某些实施例中，可以收集和冷冻这类组织或细胞，并且随后解冻以进行离体处理。持续时间长于几天的使用活细胞或组织的组织培养实验或程序典型地被视为“活体外”，但在某些实施例中，这个术语可与离体互换使用。
[0068]
术语“活体内”一般是指在生物体内部发生的活动。
[0069]
如本文中所使用，术语“重编程”或“去分化”或“提高细胞效能”或“提高发育效能”是指一种提高细胞效能或使细胞去分化成较低分化状态的方法。举例来说，相较于非重编程状态下的相同细胞，细胞效能增加的细胞具有更大的发育可塑性(即，可分化成更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞为与非重编程状态下的相同细胞相比分化状态减少的细胞。
[0070]
如本文中所使用，术语“分化”是未特化(“未专门化”)或弱特化细胞借以获得特化细胞(例如血细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化细胞或分化诱导的细胞是已处在细胞谱系内的更特化(“专门化”)位置的细胞。术语“专门化”在应用于分化过程时是指一种细胞，所述细胞在分化路径中已经行进到在正常情况下其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚群并且在正常情况下其不能分化成不同细胞类型或恢复为更弱分化细胞类型的时刻。如本文中所使用，术语“多能”是指细胞形成身体或胞体(即，胚胎本身)的所有谱系的能力。举例来说，胚胎干细胞是一种类型的多能干细胞，其能够从三种胚层：外胚层、中胚层和内胚层中的每一种形成细胞。多能性是一种连续的发育效能，范围为不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或episc)到能够产生完整生物体的更原始、更多能细胞(例如胚胎干细胞)。
[0071]
如本文所使用的，术语“诱导多能干细胞”或ipsc意指由分化的成人、新生儿或胎儿细胞产生的干细胞，所述干细胞已经被诱导或发生改变，即重编程为能够分化成所有三种胚层或真皮层：中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞。所产生的ipsc并非指如其在自然界中被发现的那样的细胞。
[0072]
如本文中所使用，术语“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚的内部细胞团块中的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的并且在发育期间产生三种原代胚层：外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生细胞。其对胚胎外膜或胎盘没有贡献，即，不是分化全能的。
[0073]
如本文中所使用，术语“多潜能干细胞”是指具有分化成一种或多种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)、但非全部三种胚层的细胞的发育潜能的细胞。因此，多潜能细胞也可以称为“部分分化的细胞”。多潜能细胞为所属领域中熟知的，并且多潜能细胞的实例包括成体干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。“多潜能”指示细胞可以形成既定谱系内的许多类型的细胞，而非其它谱系的细胞。举例来说，多潜能造血细胞可形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但其不能形成神经元。因此，术语“多潜能性”是指一种细胞状态，其发育潜能的程度低于分化全能和多能。
[0074]
可部分地通过评定细胞的多能性特征确定多能性。多能性特征包括(但不限于)：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜能；(iii)多能干细胞标记物的表达，所述标记物包括(但不限于)ssea1(仅小鼠)、ssea3/4、ssea5、tra1-60/81、tra1-85、tra2-54、gctm-2、tg343、tg30、cd9、cd29、cd133/凸素(prominin)、cd140a、cd56、cd73、cd90、cd105、oct4、nanog、sox2、cd30和/或cd50；(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)
的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的类胚胎体的形成。
[0075]
先前已描述两种类型的多能性：“激发”或“亚稳定”的多能性状态等效于后期囊胚的外胚层干细胞(episc)，且“初始”或“基础”的多能性状态等效于早期/植入前囊胚的内部细胞团块。尽管两种多能状态都展现如上文所描述的特征，但所述初始或基础状态进一步展现；(i)雌性细胞中的x染色体的预先失活或再激活；(ii)在单一细胞培养期间，克隆性和存活率改善；(iii)dna甲基化总体减少；(iv)发育调节基因启动子上的h3k27me3抑制性染色质标记沉积减少；以及(v)相对于激发状态的多能细胞，分化标记物的表达减少。通常发现细胞重编程标准方法(其中将外源性多能性基因引入到体细胞中、表达并且然后沉默或从所得多能细胞中去除)具有多能性激发状态的特性。在标准多能细胞培养条件下，除非维持外源性转基因表达(其中观察到基础状态的特征)，否则这类细胞保持激发状态。
[0076]
如本文中所使用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特征。正常胚胎干细胞形态的特征是小圆形形状，细胞核与细胞质比率高，明显存在核仁，和典型的细胞间间距。
[0077]
如本文中所使用，术语“受试者”是指任何动物，优选为人类患者、家畜或其它驯养动物。
[0078]“多能性因子”或“重编程因子”是指能够单独或与其它药剂组合增加细胞的发育效能的药剂。多能性因子包括(但不限于)能够增加细胞的发育效能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多能性因子包括例如转录因子和小分子重编程剂。
[0079]“培养”或“细胞培养”是指细胞在活体外环境中的维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在各种情况下为单数“培养基(medium)”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培养细胞培养物的营养组合物。
[0080]“培养”或“维持”是指细胞在组织或身体外部(例如在无菌塑料(或经涂布的塑料)细胞培养皿或烧瓶中)的维持、繁殖(生长)和/或分化。“培养”或“维持”可以利用培养基作为有助于繁殖和/或维持细胞的营养物、激素和/或其它因子来源。
[0081]
如本文中所使用，术语“中胚层”是指三种胚层中的一种，其出现于早期胚胎发生期间且产生各种特化细胞类型，包括循环系统的血细胞、肌肉、心脏、真皮、骨骼和其它支持和结缔组织。
[0082]
如本文中所使用，术语“永久性生血内皮细胞”(he)或“多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞”(ihe)是指在称为内皮细胞向造血细胞转变的过程中产生造血干细胞和祖细胞的内皮细胞亚群。胚胎中的造血细胞发育依序进行：从侧板中胚层到成血管细胞到永久性生血内皮细胞和造血祖细胞。
[0083]
术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前驱细胞”是指定型为造血谱系，但能够进一步造血分化的细胞，且包括多潜能造血干细胞(血胚细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞(hsc)是多潜能干细胞，其产生所有血细胞类型，包括骨髓(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(t细胞、b细胞、nk细胞)。如本文中所使用的术语“永久性造血干细胞”是指能够产生成熟骨髓细胞类型和淋巴细胞类型两者，包括t细胞、nk细胞和b细胞的cd34 造血细胞。造血细胞还包括原始
造血细胞的多种亚群，其产生原始红细胞、巨核细胞和巨噬细胞。
[0084]
如本文中所使用，术语“t淋巴细胞”和“t细胞”可互换使用并且是指白血细胞的主要类型，其在胸腺中完成成熟并且在免疫系统中具有多种作用，包括鉴别体内的特异性外来抗原和使其它免疫细胞活化和失活。t细胞可以是任何t细胞，例如培养的t细胞，例如原代t细胞，或来自培养的t细胞系的t细胞，例如jurkat、supt1等，或获自哺乳动物的t细胞。t细胞可以是cd3 细胞。t细胞可以是任何类型的t细胞并且可以处于任何发育阶段，包括(但不限于)cd4 /cd8 双阳性t细胞、cd4 辅助t细胞(例如th1和th2细胞)、cd8 t细胞(例如细胞毒性t细胞)、外周血单核细胞(pbmc)、外周血白细胞(pbl)、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、记忆t细胞、初始t细胞、调控t细胞、γδt细胞(gamma delta t cell/γδt cell)等等。其它类型的辅助t细胞包括例如th3(treg)、th17、th9或tfh细胞的细胞。其它类型的记忆t细胞包括例如中枢记忆t细胞(tcm细胞)、效应记忆t细胞(tem细胞和temra细胞)的细胞。t细胞还可以指基因工程改造的t细胞，例如经修饰以表达t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)的t细胞。t细胞也可以由干细胞或祖细胞分化。
[0085]“cd4 t细胞”是指在其表面上表达cd4且与细胞介导的免疫反应相关的t细胞的亚群。其特征在于刺激后的分泌概况，其可包括分泌细胞因子，例如ifn-γ、tnf-α、il2、il4和il10。“cd4”是最初被定义为t淋巴细胞上的分化抗原，但也发现于包括单核细胞/巨噬细胞的其它细胞上的55-kd糖蛋白。cd4抗原为免疫球蛋白超基因家族的成员，且表明为mhc(主要组织相容性复合物)ii类限制的免疫反应中的相关识别元件。在t淋巴细胞上，其界定了辅助/诱导因子亚群。
[0086]“cd8 t细胞”是指在其表面上表达cd8，受限于mhc i类，且充当细胞毒性t细胞的t细胞的亚群。“cd8”分子是在胸腺细胞上和细胞毒性和抑制性t淋巴细胞上发现的分化抗原。cd8抗原为免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是主要组织相容性复合物i类限制的相互作用中的相关识别元件。
[0087]
如本文中所使用，术语“nk细胞”或“自然杀伤细胞”是指由cd56或cd16的表达和t细胞受体(cd3)的不存在定义的外周血淋巴细胞的亚群。如本文中所使用，术语“适应性nk细胞”和“记忆nk细胞”可互换并且是指nk细胞的亚群，其表型为cd3-和cd56 ，表达nkg2c和cd57和任选的cd16中的至少一种，但缺少以下中的一种或多种的表达：plzf、syk、fcerγ和eat-2。在一些实施例中，分离的cd56 nk细胞亚群包含cd16、nkg2c、cd57、nkg2d、ncr配体、nkp30、nkp40、nkp46、活化和抑制性kir、nkg2a和/或dnam-1的表达。cd56 可以是较弱或较强的表达。
[0088]
如本文所使用，术语“nkt细胞”或“自然杀伤t细胞”是指受限于cd1d的t细胞，其表达t细胞受体(tcr)。不同于检测由常规主要组织相容性(mhc)分子呈递的肽抗原的常规t细胞，nkt细胞识别由cd1d(一种非经典mhc分子)呈递的脂质抗原。识别两种类型的nkt细胞。恒定或i型nkt细胞表达非常有限的tcr库：典型α链(在人类中为vα24-jα18)与有限光谱的β链(在人类中为vβ11)的结合。第二nkt细胞群(称为非经典或非恒定ii型nkt细胞)显示更不均匀的tcrαβ利用率。i型nkt细胞被视为适合于免疫疗法。适应性或恒定(i型)nkt细胞可以利用以下标记物中的至少一种或多种的表达来鉴别：tcr va24-ja18、vb11、cd1d、cd3、cd4、cd8、agalcer、cd161和cd56。
[0089]
如本文中所使用，术语“分离”等是指细胞或细胞群，其已从其原始环境中分离，
即，所分离细胞的环境大体上不含如存在“未分离”参考细胞的环境中所发现的至少一种组分。所述术语包括从一些或所有组分去除的细胞，如同其在其自然环境中发现，例如从组织或活检样品分离。所述术语还包括从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞，如同所述细胞在非天然存在的环境中发现，例如从细胞培养物或细胞悬浮液分离。因此，分离的细胞部分地或完全地与至少一种组分(包括其它物质、细胞或细胞群)分离，如同其在自然界中发现或如同其在非天然存在的环境中生长、储存或生存。所分离细胞的特定实例包括部分纯的细胞组合物、大体上纯的细胞组合物和非天然存在的培养基中培养的细胞。可以通过将所期望的细胞或其群体与环境中的其它物质或细胞分离，或通过从环境中去除一个或多个其它细胞群或亚群来获得分离的细胞。
[0090]
如本文中所使用，术语“纯化”等是指增加的纯度。举例来说，纯度可以增加到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
[0091]
如本文中所使用，术语“编码”是指多核苷酸(例如基因、cdna或mrna)中的核苷酸的特异性序列的固有特性，以充当生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，所述其它聚合物和大分子具有所定义的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或所定义的氨基酸序列和由其产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mrna的转录和转译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，那么所述基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列一致且通常提供于序列表中)与非编码链(用作基因或cdna转录的模板)均可以称为编码所述基因或cdna的蛋白质或其它产物。
[0092]“构建体”是指包含待在活体外或活体内递送到宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。如本文所使用的“载体”是指能够引导外来遗传物质递送或转移到靶细胞的任何核酸构建体，在所述靶细胞中，所述核酸构建体能够复制和/或表达。如本文所使用的术语“载体”包含待递送的构建体。载体可以是线性或环状分子。载体可以是整合的或非整合的。载体的主要类型包括(但不限于)质粒、游离型载体、病毒载体、粘性质粒和人工染色体。病毒载体包括(但不限于)腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体(sendai virus vector)等。
[0093]“整合”意指将构建体的一个或多个核苷酸稳定插入细胞基因组中，即，共价连接到细胞染色体dna内的核酸序列。“靶向整合”意指将构建体的核苷酸在预选位点或“整合位点”处插入细胞染色体或线粒体dna中。如本文所使用的术语“整合”进一步是指一种过程，其涉及在内源序列或核苷酸缺失或不缺失的情况下在整合位点处插入构建体的一个或多个外源序列或核苷酸。在插入位点存在缺失的情况下，“整合”可进一步包含用一个或多个所插入核苷酸置换缺失的内源序列或核苷酸。
[0094]
如本文中所使用，术语“外源”欲意指参考分子或参考活性引入宿主细胞中，或对于宿主细胞是非原生的。可以例如通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，例如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质(例如质粒)来引入所述分子。因此，所述术语在关于编码核酸的表达使用时是指编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语“内源”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地，所述术语在关于编码核酸的表达使用时是指细胞内所含而非外源引入的编码核酸的表达。
[0095]
如本文中所使用，“所关注基因”或“所关注多核苷酸序列”是当放置在适当调控序列的控制下时活体内转录成rna且在一些情况下转译成多肽的dna序列。所关注的基因或多
核苷酸可包括(但不限于)原核序列、来自真核mrna的cdna、来自真核(例如哺乳动物)dna的基因组dna序列和合成dna序列。举例来说，所关注基因可以编码mirna、shrna、原生多肽(即，自然界中发现的多肽)或其片段；变异多肽(即，与原生多肽具有小于100％序列同一性的原生多肽突变体)或其片段；经工程改造的多肽或肽片段、治疗肽或多肽、成像标记物、可选标记物等等。
[0096]
如本文中所使用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的序列由四种核苷酸碱基构成：腺嘌呤(a)；胞嘧啶(c)；鸟嘌呤(g)；胸腺嘧啶(t)；和尿嘧啶(u)(当多核苷酸是rna时，尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如，探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核糖核酸酶、cdna、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离dna、任何序列的分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸还指双链和单链分子。
[0097]
如本文中所使用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指具有通过肽键共价连接的氨基酸残基的分子。多肽必须含有至少两种氨基酸，且多肽的氨基酸的最大数目不受限制。如本文中所使用，所述术语是指短链(在所属领域中通常也称为例如肽、寡肽和低聚物)和较长链(在所属领域中通常称为多肽或蛋白质)。“多肽”包括例如生物活性片段、大体上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。
[0098]“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，以使得一者的功能受另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列或功能性rna表达(即，所述编码序列或功能性rna处于启动子的转录控制下)时，所述启动子与所述编码序列或功能性rna可操作地连接。编码序列可以按照有义或反义定向与调控序列可操作地连接。
[0099]
如本文中所使用，术语“遗传印记”是指对源细胞或ipsc的优先治疗属性有贡献，并且可保留于源细胞衍生ipsc和/或ipsc衍生造血谱系细胞中的遗传或表观遗传信息。如本文中所使用，“源细胞”是一种可以用于通过重编程来产生ipsc的非多能细胞，并且源细胞衍生ipsc可以进一步分化成特定细胞类型，包括任何造血谱系细胞。视上下文而定，源细胞衍生ipsc和其分化细胞有时统称为“衍生细胞”或“衍生细胞”。举例来说，如在整个本技术中所使用，衍生效应细胞或衍生nk细胞或衍生t细胞与获自天然/原生来源(例如，外周血、脐带血或其它供体组织)的其原代对应物相比是由ipsc分化的细胞。如本文中所使用，赋予优先治疗属性的遗传印记是通过使对供体、疾病或治疗反应具有特异性的所选源细胞重编程或通过使用基因组编辑将基因修饰模式引入ipsc来并入ipsc中。在从具体所选择的供体、疾病或治疗背景中获得的源细胞的所述方面中，有助于优先治疗属性的基因印记可以包含任何背景特异性基因或表观遗传修饰，其显现可保留的表型，即优先治疗属性，所述表型被传递到所选择的源细胞的衍生细胞，无论潜在分子事件是否得到鉴定。对供体、疾病或治疗反应具有特异性的源细胞可包含可保留于ipsc和衍生造血谱系细胞中的遗传印记，所述遗传印记包括(但不限于)预排列的单特异性tcr，例如来自病毒特异性t细胞或恒定型自然杀伤t(inkt)细胞；能追踪和所期望的遗传多态性，例如对编码所选供体中的高亲和力cd16受体的点突变来说为同型；和预定的hla需求，即，所选的hla匹配供体细胞随着群体增大而展现单倍型。如本文中所使用，优先治疗属性包括衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、
自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性改善。优先治疗属性还可以涉及靶向抗原的受体表达；hla呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；靶上特异性改善，同时肿瘤外效应降低；对例如化学疗法等疗法的抗性。
[0100]
如本文所使用的术语“增强的治疗特性”是指与相同一般细胞类型的典型免疫细胞相比增强的细胞的治疗特性。举例来说，与典型的、未修饰的和/或天然存在的nk细胞相比，具有“增强的治疗特性”的nk细胞将具有增强、改善和/或强化的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可包括(但不限于)细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性也通过以下来体现：靶向抗原的受体表达；hla呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；靶上特异性改善，同时肿瘤外效应降低；对例如化学疗法等治疗的抗性。
[0101]
如本文中所使用，术语“接合体”是指一种分子，例如融合多肽，其能够在免疫细胞(例如，t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)与肿瘤细胞之间形成连接；并且活化所述免疫细胞。接合体的实例包括(但不限于)双特异性t细胞接合体(bite)、双特异性杀伤细胞接合体(bike)、三特异性杀伤细胞接合体或多特异性杀伤细胞接合体，或与多种免疫细胞类型相容的通用接合体。
[0102]
如本文中所使用，术语“表面触发受体”是指能够触发或起始免疫反应(例如细胞毒性反应)的受体。表面触发受体可以加以工程改造，并且可以在效应细胞，例如t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞上表达。在一些实施例中，表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞(例如肿瘤细胞)之间的双特异性或多特异性抗体接合，不依赖于效应细胞的天然受体和细胞类型。使用这种方法，人们可以产生包含通用表面触发受体的ipsc，并且然后使这类ipsc分化成表达通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群体。“通用”意指表面触发受体可表达于任何效应细胞中并且活化任何效应细胞(不论细胞类型)，并且表达通用受体的所有效应细胞可与表面触发受体可识别的具有相同抗原决定基的接合体偶联或连接(不论接合体的肿瘤结合特异性)。在一些实施例中，具有相同肿瘤靶向特异性的接合体用于与通用表面触发受体偶联。在一些实施例中，具有不同肿瘤靶向特异性的接合体用于与通用表面触发受体偶联。因此，可使一种或多种效应细胞类型接合，以在一些情况下杀死一种特定类型的肿瘤细胞并且在一些其它情况下杀死两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包括用于效应细胞激活的共刺激性结构域和对衔接子的表位具有特异性的表位结合区。双特异性衔接子对位于一端上的表面触发受体的表位结合区具有特异性，并且对位于另一端上的肿瘤抗原具有特异性。
[0103]
如本文中所使用，术语“安全开关蛋白质”是指一种工程改造的蛋白质，其经设计以防止细胞疗法的潜在毒性或以其它方式防止副作用。在一些情况下，安全开关蛋白质表达受到有条件的控制，以解决所移植的工程改造的细胞的安全问题，所述细胞已经将编码安全开关蛋白质的基因永久性地并入其基因组中。这种条件性调控可以是可变的并且可能包括通过小分子介导的转译后活化和组织特异性和/或时间转录调控进行控制。安全开关可以介导细胞凋亡的诱导、蛋白质合成的抑制、dna复制、生长阻滞、转录和转录后基因调控，和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，安全开关蛋白质由外源分子(例如前药)活化，其在活化时，触发治疗细胞的细胞凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白的实例包含但不限于自杀基因，如胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、b细胞cd20、经过修
饰的egfr和其任何组合。在这种策略中，在发生不良事件时给予的前药由自杀基因产物活化并且杀死转导的细胞。
[0104]
如本文中所使用，术语“药学活性蛋白质或肽”是指能够对生物体实现生物学和/或医药作用的蛋白质或肽。药学活性蛋白质具有针对疾病的治愈性或姑息性特性，且可以给予以改善、减轻(relieve)、缓解、逆转或减轻(lessen)疾病的严重程度。药学活性蛋白质还具有防治性特性且用于防止疾病发作或减轻这类疾病或病理性病状在其显现时的严重程度。药学活性蛋白质包括完整蛋白质或肽或其药学活性片段。其还包括所述蛋白质或肽的药学活性类似物或所述蛋白质或肽的片段的类似物。术语药学活性蛋白质还指以协作或协同方式起作用以提供治疗效益的多种蛋白质或肽。药学活性蛋白质或肽的实例包括(但不限于)受体、结合蛋白、转录和转译因子、肿瘤生长抑制蛋白质、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
[0105]
如本文中所使用，术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、活化、减少或增加细胞信号转导的任何分子。信号转导是指通过沿着最终触发细胞中的生物化学事件的路径募集蛋白质复合物来以化学修饰的形式传递分子信号。信号转导路径为所属领域中熟知的，且包括(但不限于)g蛋白偶联受体信号传导、酪氨酸激酶受体信号传导、整合素信号传导、tg点信号传导、配体门控离子通道信号传导、erk/mapk信号传导路径、wnt信号传导路径、camp依赖性路径和ip3/dag信号传导路径。
[0106]
如本文中所使用，术语“靶向模式”是指分子(例如多肽)以遗传方式并入细胞中以促进抗原和/或抗原决定基特异性，其包括但不限于i)抗原特异性(当其涉及独特的嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)时)；ii)接合体特异性(当其涉及单克隆抗体或双特异性接合体时)；
ⅲ
)靶向转化细胞；iv)靶向癌症干细胞；和v)在不存在特异性抗原或表面分子的情况下的其它靶向策略。
[0107]
如本文中所使用，与非特异性或非选择性结合相比，术语“特异性(specific/specificity)”可以用于指分子(例如受体或接合体)选择性地结合到靶分子的能力。
[0108]
如本文所使用的术语“过继性细胞疗法”是指基于细胞的免疫疗法，其在本文中使用时涉及自体或同种异体淋巴细胞的输注，所述淋巴细胞鉴别为经基因修饰或未经基因修饰的t细胞或b细胞，其在所述输注之前已离体扩增。
[0109]
如本文中所使用，“治疗上足量”在其含义内包括无毒性、但足够和/或有效量的其所提及的特定治疗和/或医药组合物，以提供所期望的治疗效果。所需的精确量将随各受试者而变化，这取决于例如患者的一般健康状况、患者的年龄和病状的阶段和严重程度等因素。在特定实施例中，治疗上足够的量足以和/或有效减轻、减少和/或改善与所治疗的受试者的疾病或病状相关的至少一种症状。
[0110]
多能干细胞的分化需要改变培养系统，例如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。大部分常规策略利用类胚胎体(eb)的形成作为共同和关键中间物来起始谱系特异性分化。“类胚胎体”是三维团簇，其已显示模拟胚胎发育，因为其在其三维区域内产生多种谱系。通过分化过程，通常为几小时到几天，简单的eb(例如经诱发以分化的聚集多能干细胞)继续成熟并且发育成囊性eb，此时，通常进一步将其处理数日到几周以继续分化。eb形成是通过使多能干细胞在三维多层细胞团簇中彼此紧密接近来起始的，这典型地是通过若干种方法中的一种来实现，包括允许多能细胞在液滴中沉降、使细胞沉降到“u”形底孔板中或通
过机械搅拌。为了促进eb发育，多能干细胞聚集体需要进一步分化提示，因为多能培养维持性培养基中维持的聚集体不形成适当eb。因此，多能干细胞聚集体需要转移到分化培养基中，所述分化培养基向所选谱系提供诱发提示。随着在eb细胞团簇内适度增殖，多能干细胞的基于eb的培养通常会引起分化细胞群(外胚层、中胚层和内胚层胚层)产生。虽然经证实促进细胞分化，但由于三维结构中的细胞不一致地暴露于来自环境的分化提示，eb产生了处于可变分化状态的异质细胞。另外，eb难以形成和维持。此外，通过eb进行的细胞分化伴随适度的细胞扩增，这也导致分化效率降低。
[0111]
相比之下，与“eb形成”不同的“聚集体形成”可以用于扩增多能干细胞衍生细胞群。举例来说，在基于聚集体的多能干细胞扩增期间，选择培养基以维持增殖和多能性。细胞增殖通常增加聚集体的大小，从而形成更大聚集体，这些聚集体可用常规的机械或酶方式解离成较小聚集体，以维持培养物内的细胞增殖并且增加细胞数量。不同于eb培养，维持培养中的聚集体内所培养的细胞维持多能性的标记物。多能干细胞聚集体需要进一步分化提示来诱导分化。
[0112]
如本文中所使用，“单层分化”是关于分化方法的术语，其不同于通过三维多层细胞团簇进行的分化，即，“eb形成”。除本文所公开的其它优势之外，单层分化避免了对用于分化起始的eb形成的需要。由于单层培养不模拟胚胎发育，例如eb形成，因此与eb中的所有三种胚层分化相比，朝向特定谱系的分化被认为是最少的。
[0113]
如本文中所使用，“解离”细胞是指已与其它细胞或表面(例如培养板表面)大体上分离或纯化的细胞。举例来说，可通过机械或酶方法从动物或组织中解离细胞。替代地，活体外聚集的细胞可以彼此解离，例如通过以酶或机械方式解离到团簇、单一细胞或单一细胞与团簇的混合物的悬浮液中。在又一替代实施例中，从培养板或其它表面解离粘附细胞。因此，解离可涉及破坏细胞与胞外基质(ecm)和衬底(例如培养表面)的相互作用，或破坏细胞之间的ecm。
[0114]
如本文中所使用，“饲养细胞”或“饲养层”是描述与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可生长、扩增或分化的环境的一种类型的细胞的术语，因为饲养细胞为支持第二细胞类型提供刺激、生长因子和营养物。饲养细胞任选地来自与其支持的细胞不同的物种。举例来说，某些类型的人类细胞，包括干细胞，可以由小鼠胚胎成纤维细胞和永生化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物支持。在另一实例中，外周血源性细胞或转化的白血病细胞支持自然杀伤细胞的扩增和成熟。当与其它细胞共培养时，饲养细胞可以通常通过辐射或用如丝裂霉素等有丝分裂剂拮抗剂处理来激活，以防止其生长超出其支持的细胞。饲养细胞可以包括内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。不限于前述，一种特定的饲养细胞类型可以是人类饲养层，例如人类皮肤成纤维细胞。另一饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(mef)。一般来说，多种饲养细胞可部分地用于维持多能性、引导朝向某一谱系的分化，增强增殖能力并且促进向特化细胞类型(例如效应细胞)的成熟。
[0115]
如本文中所使用，“无饲养层”(ff)环境是指一种环境，例如培养条件、细胞培养物或培养基，其基本上不含饲养层或基质细胞，和/或其尚未通过培养饲养细胞进行预调节。“预调节”培养基是指饲养细胞已在培养基内培养一段时间(例如至少一天)之后所收集的培养基。预调节培养基含有许多介体物质，包括由培养基中培养的饲养细胞分泌的生长因
子和细胞因子。在一些实施例中，无饲养层环境不含饲养层或基质细胞，并且也不通过培养饲养细胞进行预调节。
[0116]
如在ipsc和由其分化的衍生非多能细胞的基因组编辑或修饰，或非多能细胞和由其重编程的衍生ipsc的基因组编辑或修饰的背景下所使用的“功能”是指(1)在基因水平上
‑‑
成功的基因敲入、基因敲除、降低基因表达、转基因或受控基因表达，例如在所期望的细胞发育阶段的诱导性或瞬时表达，这是通过直接的基因组编辑或修饰或通过“传递”经由最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程来实现；或(2)在细胞水平上-成功的去除、添加或改变细胞功能/特征，这通过以下实现：(i)在所述细胞中通过直接的基因组编辑而获得的基因表达修饰；(ii)在所述细胞中通过“传递”经由最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程而维持的基因表达修饰；(iii)在所述细胞中作为基因表达修饰的结果的下游基因调控，所述基因表达修饰仅出现于所述细胞的较早发育阶段或仅出现于经由分化或重编程而产生所述细胞的起始细胞中；或(iv)成熟细胞产物内所显示的增强的或新获得的细胞功能或属性，所述成熟细胞产物最初通过对祖细胞或脱分化细胞来源的ipsc进行基因组编辑或修饰而获得。
[0117]“hla缺陷”，包括hla-i类缺陷或hla-ii类缺陷，或两者，是指缺少或不再维持包含hla i类蛋白质异二聚体和/或hla ii类异二聚体的完整mhc复合物的表面表达或所述表面表达的水平降低，使得减弱或降低的水平低于由其它细胞或合成方法可自然检测到的水平的细胞。
[0118]
如本文中所使用，“经修饰的hla缺陷型ipsc”是指通过引入基因表达蛋白质进行进一步修饰的hla缺陷型ipsc，所述蛋白质与以下有关但不限于：改善的分化潜能、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、存留、免疫逃避、抑制抗性、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞毒性，例如非经典hla i类蛋白质(例如hla-e和hla-g)、嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)、cd16 fc受体、bcl11b、notch、runx1、il15、41bb、dap10、dap12、cd24、cd3z、41bbl、cd47、cd113和pdl1。“经修饰的hla缺陷型”细胞还包括除ipsc以外的细胞。
[0119]“fc受体”(缩写为fcr)是基于其识别的抗体类型而分类。举例来说，结合最常见类别的抗体igg的受体称为fc-γ受体(fcγr)，结合iga的受体称为fc-α受体(fcαr)并且结合ige的受体称为fc-ε受体(fcεr)。fcr的类别也通过表达其的细胞(巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、t细胞和b细胞)和每种受体的信号传导特性来区分。fc-γ受体(fcγr)包括若干成员：fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b)，它们的抗体亲和力因其分子结构不同而不同。
[0120]“嵌合fc受体”(缩写为cfcr)是用于描述其天然跨膜和/或胞内信号传导结构域被非天然跨膜和/或胞内信号传导结构域修饰或置换的工程化fc受体的术语。在嵌合fc受体的一些实施例中，除非天然的跨膜和信号传导结构域中的一者或两者之外，可将一种或多种刺激性结构域引入工程改造的fc受体的胞内部分中以在触发受体后增强细胞活化、扩增和功能。不同于含有与靶抗原的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(car)，嵌合fc受体结合于fc片段、或抗体的fc区、或包含于接合体或结合分子中并且在使靶细胞接近或不接近附近的情况下活化细胞功能的fc区。举例来说，可工程改造fcγ受体以将所选择的跨膜、刺激和/或信号传导结构域包含于对在胞外结构域结合igg有反应的胞内区域中，从而产生
cfcr。在一个实例中，cfcr由工程改造cd16、fcγ受体通过置换其跨膜结构域和/或胞内结构域来产生。为了进一步提高基于cd16的cfcr的结合亲和力，可并入cd64或cd16的高亲和力变体(例如f176v)的胞外结构域。在涉及高亲和力cd16胞外结构域的cfcr的一些实施例中，在位置197处包含丝氨酸的蛋白水解裂解位点被消除或置换，使得受体的胞外结构域不可裂解，即不经历脱落，从而获得基于hncd16的cfcr。
[0121]
cd16(一种fcγr受体)已鉴别为具有两种同功异构物：fc受体fcγriiia(cd16a)和fcγriiib(cd16b)。cd16a为由nk细胞表达的跨膜蛋白，其结合附接到靶细胞的单体igg以活化nk细胞且促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。如本文中所使用，“高亲和力cd16”、“不可裂解的cd16”或“高亲和力不可裂解的cd16(hncd16)”是指天然或非天然的cd16变体。野生型cd16具有低亲和力并且经受胞外结构域脱落，这是在nk细胞激活时调控白细胞上的各种细胞表面分子的细胞表面密度的蛋白水解切割过程。f176v和f158v是具有高亲和力的示例性cd16多态变体。在接近膜的区域(位置189到212)中改变或消除裂解位点(位置195到198)的cd16变体不经历脱落。裂解位点和接近膜的区域详细地描述于wo2015148926中，其完整公开内容以引入的方式并入本文中。cd16 s197p变体是工程改造的cd16的不可裂解型式。包含f158v和s197p两者的cd16变体具有高亲和力，并且不可裂解。另一示例性高亲和力和不可裂解的cd16(hncd16)变体是包含源自cd64胞外域的3个外显子中的一个或多个的胞外域的工程改造的cd16。
[0122]
i.适用于具有增强特性的过继性细胞疗法的细胞和组合物
[0123]
本文提供一种用于系统地工程化克隆ipsc的调控回路而不影响ipsc的分化效力以及ipsc和其衍生细胞的细胞发育生物学，同时增强衍生细胞的治疗性性质的策略。在ipsc水平上通过基因组工程化引入到细胞中的选择性模式组合之后，衍生细胞在功能上得到改善并且适于过继性细胞疗法。在本发明之前，尚不清楚包含一种或多种所提供的基因编辑的改变的ipsc是否仍具有进入细胞发育和/或使功能分化细胞成熟和产生同时保留调节活性的能力。在ipsc的定向细胞分化期间的意外失败归因于包括(但不限于)以下的方面：发育阶段特定基因表达或缺乏基因表达、hla复合物呈递的需求、所引入表面表达模式的蛋白质脱落和实现细胞中的表型和/或功能变化的分化方案重配置的需要。本技术已显示，如本文所提供的一种或多种所选基因组修饰不会对ipsc分化效能产生负面影响，并且由工程改造的ipsc衍生的功能性效应细胞具有增强的和/或获得的治疗特性，这可归因于在ipsc分化之后保留在效应细胞中的单独的或组合的基因组修饰。
[0124]
1.mica/b-car
[0125]
mica和micb是人类主要组织相容性复合物i类链相关基因(mic)的表达家族成员。mic家族的成员是高度多态性的(多于100个人类等位基因)，但具有结构上保守的基序。适用于基因工程化ipsc及其衍生效应细胞可以是一种或多种car设计。car(一种嵌合抗原受体)为融合蛋白，其一般包括包含抗原识别区的胞外域、跨膜结构域和胞内域。在一些实施例中，胞外结构域可以进一步包含信号肽或前导序列和/或间隔子(也称为铰链)。在一些实施例中，胞内域可进一步包含信号传导肽，其活化表达car的效应细胞。在一些实施例中，抗原识别结构域可特异性结合抗原。在一些实施例中，抗原识别结构域可特异性结合与疾病或病原体相关的抗原。在一些实施例中，疾病相关的抗原是肿瘤抗原，其中肿瘤可以是液体或实体肿瘤。在一些实施例中，car适于激活表达所述car的t细胞、nk细胞或nkt细胞。在一
些实施例中，car为对包含nk特异性信号传导组分具有特异性的nk细胞。在一些实施例中，car是对包括nkt特异性信号传导组分具有特异性的nkt细胞。在某些实施例中，所述t细胞衍生自表达car的ipsc，并且衍生t细胞可包含t辅助细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞、调控t细胞、自然杀伤t细胞、αβt细胞、γδt细胞或其组合。在某些实施例中，所述nk细胞衍生自表达car的ipsc。在某些实施例中，所述nkt细胞衍生自表达car的ipsc。
[0126]
在某些实施例中，所述抗原识别区包含鼠类抗体、人类抗体、人类化抗体、骆驼ig、只有重链的鲨鱼抗体(vnar)、ig nar、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包含fab、fab'、f(ab)'2、f(ab)'3、fv、抗原结合单链可变片段(scfv)、(scfv)2、二硫键稳定的fv(dsfv)、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、单结构域抗原结合片段(sdab、纳米抗体)、重组仅重链抗体(vhh)以及维持完整抗体的结合特异性的其它抗体片段。在一个实例中，本说明书提供了包括靶向肿瘤抗原mica和micb的抗原识别区的car。在靶向car的mica/b的一些实施例中，抗原识别区是与mica和micb的保守α3结构域特异性结合的scfv。在一个实施例中，scfv包括重链的可变区，所述重链的可变区由与seq id no:33具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示；以及轻链的可变区，所述轻链的可变区由与seq id no:34具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示。在mica/b scfv的一个实施例中，scfv由与seq id no:35具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示，其中连接子和/或信号肽是示例性的并且是可置换的。在mica/b scfv的另一个实施例中，scfv由与seq id no:36具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示，其中连接子和/或信号肽是示例性的并且其长度和序列可以有所变化。本说明书的另一方面提供了基因工程化ipsc及其衍生细胞，其中所述细胞包括编码至少mica/b-car的外源性多核苷酸。在一些实施例中，包括编码至少mica/b-car的外源性多核苷酸的ipsc衍生效应细胞是t细胞。在一些实施例中，包括编码至少mica/b-car的外源性多核苷酸的ipsc衍生效应细胞是nk细胞。在一些其它实施例中，包括编码至少mica/b-car的外源性多核苷酸的ipsc衍生效应细胞是nkt细胞。
[0127]
seq id no:33
[0128]
qiqlvqsgpelkkpgetvkvsckasgymftnyamnwvkqapekglkwmgwinthtgdptyaddfkgriafsletsastaylqinnlknedtatyfcvrtygnyamdywgqgtsvtvss
[0129]
(118aa.mica/b scfv重链(hc))
[0130]
seq id no:34
[0131]
diqmtqttsslsaslgdrvtiscsasqdisnylnwyqqkpdgtvklliydtsilhlgvpsrfsgsgsgtdysltisnlepediatyycqqyskfprtfgggttleik
[0132]
(107aa.mica/b scfv轻链(lc))
[0133]
seq id no:35(hc-连接子-lc)
[0134]
mdfqvqifsfllisasvimsrqiqlvqsgpelkkpgetvkvsckasgymftnyamnwvkqapekglkwmgwinthtgdptyaddfkgriafsletsastaylqinnlknedtatyfcvrtygnyamdywgqgtsvtvssggggsggggsggggsdiqmtqttsslsaslgdrvtiscsasqdisnylnwyqqkpdgtvklliydtsilhlgvpsrfsgsgsgtdysltisnlepediatyycqqyskfprtfgggttleik
[0135]
(信号肽
–
其它信号肽也是可能的；连接子
–
其它连接子也是可能的)
[0136]
seq id no:36(lc-连接子-hc)
[0137]
mdfqvqifsfllisasvimsrdiqmtqttsslsaslgdrvtiscsasqdisnylnwyqqkpdgtvklliydtsilhlgvpsrfsgsgsgtdysltisnlepediatyycqqyskfprtfgggttleikggggsggggsggggsqiqlvqsgpelkkpgetvkvsckasgymftnyamnwvkqapekglkwmgwinthtgdptyaddfkgriafsletsastaylqinnlknedtatyfcvrtygnyamdywgqgtsvtvss
[0138]
(信号肽
–
其它信号肽也是可能的；连接子
–
其它连接子也是可能的)
[0139]
mica/b作为肿瘤相关抗原主要在gi上皮、内皮细胞和成纤维细胞中表达，并且其表达由细胞/基因毒性应激诱导，并且在上皮癌和黑色素瘤癌上具有高表达。另一方面，mica/b在肿瘤细胞上的脱落导致可溶性mica/b增加，所述可溶性mica/b不被nk和t细胞亚群上表达的nkg2d识别，可能使肿瘤逃脱/逃逸成为可能并且抑制免疫监视。如本说明书中所示，如所提供的mica/b-car靶向mica/b肿瘤抗原抑制在许多人类和鼠类肿瘤细胞系中观察到的表面mica/b脱落，从而导致mica/b细胞表面密度增加、可溶性脱落的mica/b减少以及nk和/或t细胞介导的肿瘤杀伤增强。如所提供的mica/b-car能够靶向和稳定肿瘤细胞表面mica/b，不干扰nkg2d与肿瘤mica和micb的结合，并且能够通过肿瘤抗原脱落增强免疫监视并且防止或减少肿瘤逃脱，同时激活表达mica/b car的免疫细胞(包含但不限于原代t细胞、nk细胞和ipsc衍生t细胞、nk细胞)以进行mica/b特异性靶向肿瘤细胞杀伤。另外，携带所提供的mica/b-car的免疫细胞能够进行泛mica/b(肿瘤)靶向和杀伤，如由表达各种mica/b等位基因的宽范围肿瘤细胞类型所示。
[0140]
包含包括如所提供的mica/b-car的基因工程化ipsc及其衍生效应细胞的免疫细胞可以进一步包括靶向不同于mica/b的一种或多种肿瘤抗原的一种或多种另外的car。可以由包含在基因工程化ipsc和来自其的衍生效应细胞中的另外的car靶向的抗原的非限制性实例包含adgre2、碳酸酐酶ix(caix)、ccri、ccr4、癌胚抗原(cea)、cd3、cd5、cd7、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd44v6、cd49f、cd56、cd70、cd74、cd99、cd123、cd133、cd138、cd269(bcma)、cds、clec12a、巨细胞病毒(cmv)感染的细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(egp 2)、上皮糖蛋白-40(egp-40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、egfrviii、受体酪氨酸蛋白激酶erbb2,3,4、egfir、egfr-viii、erbb、叶酸结合蛋白(fbp)、胎儿型乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体a、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、人表皮生长因子受体2(her-2)、人端粒酶逆转录酶(htert)、icam-1、整合蛋白b7、白介素-13受体亚基α-2(il-13rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(kdr)、lewis a(ca19.9)、lewis y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、lilrb2、黑色素瘤抗原家族a1(mage-a1)、粘蛋白1(粘蛋白-1)、粘蛋白16(粘蛋白-16)、间皮素(msln)、nkcsi、nkg2d配体、c-met、癌症-睾丸抗原ny-eso-1、癌胎抗原(h5t4)、prame、前列腺干细胞抗原(psca)、prame、前列腺特异性膜抗原(psma)、肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)、tim-3、trbci、trbc2、血管内皮生长因子r2(vegf-r2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(wt-1)和本领域已知的各种病原体抗原。病原体的非限制性实例包括能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原虫。
[0141]
在包括mica/b-car的ipsc及来自其的衍生效应细胞的一个实施例中，所述细胞进一步包括cd19-car。在包括mica/b-car的ipsc及来自其的衍生效应细胞的另一个实施例中，所述细胞进一步包括bcma-car。在包括mica/b-car的ipsc及来自其的衍生效应细胞的
又另一实施例中，所述细胞进一步包括her2-car。在包括mica/b-car的ipsc及来自其的衍生效应细胞的仍另一实施例中，所述细胞进一步包括msln-car。在包括mica/b-car的ipsc及来自其的衍生效应细胞的另外的实施例中，所述细胞还包括psma-car。在包括mica/b-car的ipsc及来自其的衍生效应细胞的仍另一实施例中，所述细胞还包括vegf-r2 car。
[0142]
在mica/b car的一些实施例中，在car的mica/b结合结构域与跨膜结构域之间存在间隔子/铰链。可以包含在car中的示例性间隔子是本领域公知的，所述示例性间隔子包含但不限于igg4间隔子、cd28间隔子、cd8间隔子或多于一种间隔子的组合。间隔子的长度也可以从约25bp变化到约300bp或更多。在本技术中，小于100bp或小于50bp的间隔子被认为是短的；而大于100bp或大于200bp的间隔子被认为是长的。在一些实施例中，car的跨膜结构域包括跨膜蛋白的天然(即，野生型)或经过修饰的跨膜区的全长或至少一部分，所述跨膜蛋白包含但不限于cd3d、cd3e、cd3g、cd3ζ、cd4、cd8、cd8a、cd8b、cd27、cd28、cd40、cd84、cd166、4-1bb、ox40、icos、icam-1、ctla4、pd1、lag3、2b4、btla、cd16、il7、il12、il15、kir2dl4、kir2ds1、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c、nkg2d和t细胞受体多肽。在一个实施例中，mica/b-car和/或另外的car(靶向除了mica/b之外的抗原)包括源自cd28的跨膜结构域。在一个实施例中，mica/b-car和/或另外的car包括源自nkg2d的跨膜结构域。
[0143]
在一些实施例中，内域(或胞内结构域)的信号传导结构域包括信号传导分子的全长或至少一部分，所述信号传导分子包含但不限于cd3ζ、2b4、dap10、dap12、dnam1、cd137(41bb)、il21、il7、il12、il15、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c、nkg2d或t细胞受体(tcr)多肽。在一个实施例中，本文所公开的car的信号传导肽包括与cd3ζ的至少一种基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，itam)具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
[0144]
在某些实施例中，所述胞内域进一步包含至少一个共刺激信号传导区。所述共刺激性信号传导区可以包括信号传导分子的全长或至少一部分，所述信号传导分子包含但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、icos、pd1、lag3、2b4、btla、dap10、dap12、ctla4或nkg2d或其任何组合。
[0145]
在一个实施例中，本技术中提供的mica/b-car包括源自cd28的共刺激性结构域和包括cd3ζ的天然或经过修饰的itam1的信号传导结构域，所述cd3ζ由与seq id no:13具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示。在另外的实施例中，包括源自cd28的共刺激性结构域和cd3ζ的天然或经过修饰的itam1的car还包括铰链结构域和源自cd28的跨膜结构域，其中scfv可以通过铰链连接到跨膜结构域，并且car包括与seq id no:14具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列，其中铰链/间隔子的长度和/或序列可以变化。
[0146]
seq id no:13
[0147]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglfnelqkdkmaeafseigmkgerrrgkghdglfqglstatkdtfdalhmqalppr
[0148]
(153个氨基酸cd28共刺激 cd3ζitam)
[0149]
seq id no:14
[0150]
ievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrsk
no:34)。在一些实施例中，包括mica/b scfv的结合元件的重组tcr适用于tcr基因座插入并且可以与内源性cd3整合进行cd3表面表达。在一些实施例中，利用重组tcr复合物的mica/b-car对肿瘤mica/b抗原更敏感和/或具有特异性。在一些实施例中，trac的氨基酸序列与seq id no:37具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性。在一些实施例中，trbc的氨基酸序列与seq id no:38或39具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性。
[0161]
seq id no:37
[0162]
iqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0163]
seq id no:38
[0164]
dlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg
[0165]
seq id no:39
[0166]
dlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf
[0167]
在上文的替代性实施例中，trac可以用tcrδ(trdc)的恒定区替代，并且其中trbc用tcrγ(trgc)的恒定区替代。在一些实施例中，trdc的氨基酸序列与seq id no:40具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性。在一些实施例中，trbc的氨基酸序列与seq id no:41或42具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性。
[0168]
seq id no:40
[0169]
sqphtkpsvfvmkngtnvaclvkefypkdirinlvsskkitefdpaivispsgkynavklgkyedsnsvtcsvqhdnktvhstdfevktdstdhvkpketentkqpskschkpkaivhtekvnmmsltvlglrmlfaktvavnflltaklffl
[0170]
seq id no:41
[0171]
dkqldadvspkptiflpsiaetklqkagtylcllekffpdvikihwqekksntilgsqegntmktndtymkfswltvpeksldkehrcivrhennkngvdqeiifppiktdvitmdpkdncskdandtlllqltntsayymylllllksvvyfaiitccllrrtafccngeks
[0172]
seq id no:42
[0173]
dkqldadvspkptiflpsiaetklqkagtylcllekffpdiikihwqekksntilgsqegntmktndtymkfswltvpeesldkehrcivrhennkngidqeiifppiktdvttvdpkynyskdandvitmdpkdnwskdandtlllqltntsayytylllllksvvyfaiitccllrrtafccngeks
[0174]
适于mica/b car和/或另外的car(靶向除了mica/b之外的抗原)插入的基因组基因座包含满足如本文所提供的基因组安全港的标准的基因座和期望由于整合而敲低或敲除所选择基因座中的基因的基因座。在一些实施例中，适于mica/b car插入的基因组基因座包含但不限于aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、runx1、b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白(tapasin)、nlrc5、ciita、rfxank、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、
cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3和tigit。
[0175]
在一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在tcr恒定区中的car，引起tcr敲除，并且任选地将car表达置于内源性tcr启动子的控制下。在包括tcr无效和mica/b car的ipsc衍生细胞的一个特定实施例中，所述衍生细胞是t细胞。在另一个实施例中，包括car的ipsc及其衍生细胞具有插入在nkg2a基因座或nkg2d基因座中的car，引起nkg2a或nkg2d敲除，并且任选地将car表达置于内源性nkg2a或nkg2d启动子的控制下。在包括nkg2a或nkg2d无效和mica/b car的ipsc衍生细胞的一个特定实施例中，所述衍生细胞是nk细胞。在又另一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在cd38编码区中的car，引起cd38敲除，并且任选地将car表达置于内源性cd38启动子的控制下。在一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在cd58编码区中的car，引起cd58敲除。在一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在cd54编码区中的car，引起cd54敲除。在一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在cis(细胞因子诱导的含sh2的蛋白质)编码区中的car，引起cis敲除。在一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在cbl-b(e3泛素-蛋白连接酶cbl-b)编码区中的car，引起cbl-b敲除。在一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在socs2(e3泛素-蛋白连接酶cbl-b)编码区中的car，引起socs2敲除。在一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在cd56(ncam1)编码区中的car。在另一个实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在pd1、ctla4、lag3和tim3中的任一个的编码区中的car，引起插入位点处的基因敲除。在另外的实施例中，包括mica/b-car的ipsc及其衍生细胞具有插入在tigit的编码区中的car，引起tigit敲除。
[0176]
因此，本文提供了从分化的基因组工程化ipsc获得的衍生细胞，其中ipsc和衍生细胞两者包括mica/b-car。还提供了ipsc以及包括mica/b-car和一种或多种另外的修饰模式的衍生细胞，所述一种或多种另外的修饰模式包含但不限于对除了mica/b之外的靶标具有特异性的第二car；cd38敲除；hncd16；外源性细胞因子信号传导组分；具有hla-g、cd58和cd54中的至少一个的过表达的hla-i和/或hla-ii缺陷；tcr无效；表面呈递cd3；抗原特异性tcr(重组tcr)；nkg2c；dap10/12；nkg2c-il15-cd33(“2c1533”)，如本说明书中进一步详述的。
[0177]
2.cd38基因敲除
[0178]
细胞表面分子cd38在多种血液恶性病中高度上调，所述血液恶性病源自淋巴和骨髓谱系两者，包括多发性骨髓瘤和cd20阴性b细胞恶性肿瘤，其使用以使癌细胞耗竭的抗体治疗剂成为有吸引力的标靶。抗体介导的癌细胞耗竭通常可归因于免疫效应机制，例如adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)的直接细胞凋亡诱导和活化的组合。除adcc以外，与治疗抗体协同作用的免疫效应机制还可以包括吞噬作用(adcp)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。
[0179]
除在恶性细胞上高度表达外，cd38也在浆细胞上以及nk细胞和活化的t细胞和b细胞上表达。在造血期间，cd38在cd34
干细胞和淋巴、红细胞系和骨髓的谱系专门化祖细胞上并且在持续到浆细胞阶段的成熟的最终阶段期间表达。作为ii型跨膜糖蛋白，cd38既作为受体，又作为参与核苷酸代谢物产生的多功能酶执行细胞功能。作为酶，cd38催化从nad
到adp-核糖的反应的合成和水解，从而产生二级信使cadpr和naadp，其刺激钙从内质网和
溶酶体中释放，这对于过程是钙依赖性的细胞粘附过程至关重要。作为受体，cd38识别cd31并且调控活化nk细胞中的细胞因子释放和细胞毒性。还报道了cd38与脂筏中的细胞表面蛋白缔合，调控细胞质ca
2
通量，并且介导淋巴细胞和骨髓细胞中的信号转导。
[0180]
在恶性肿瘤治疗中，全身性地使用cd38抗原结合受体转导的t细胞已显示裂解cd34 造血祖细胞、单核细胞、nk细胞、t细胞和b细胞的cd38 级分，导致因为接受者免疫效应细胞功能受损而使得治疗反应不完全并且功效降低或消除。另外，在用达雷木单抗、cd38特异性抗体治疗的多发性骨髓瘤患者中，尽管其它免疫细胞类型(例如t细胞和b细胞)不管其cd38表达如何都不受影响，但观测到骨髓和外周血两者中nk细胞减少(casneuf等人,《血液研究进展(blood advances.)》2017；1(23)：2105-2114)。在不受理论限制的情况下，包括如所提供的mica/b-car的cd38无效效应细胞可以克服cd38介导的互相杀伤并且避免特异性抗体和/或cd38抗原结合结构域诱导的效应细胞耗尽或减少。另外，由于cd38在活化的淋巴细胞如t细胞或b细胞上被上调，如达土木单抗等cd38特异性抗体可以用于消除活化的淋巴细胞或抑制这些淋巴细胞在适应性同种异体效应细胞的接受者中的活化，条件是cd38无效，使得可以减少和/或预防宿主淋巴细胞对这些效应细胞的同种异体排斥，并且可以增加这些效应细胞的存活和持久性，尽管存在用于淋巴耗尽的cd38抗体。如此，本技术还提供了通过使用cd38特异性抗体、所分泌的cd38特异性衔接子或cd38 car(嵌合抗原受体)对接受者t细胞和b细胞的激活和/或消除激活的接受者t细胞和b细胞来增强效应细胞持久性和/或存活同时降低或防止同种异体排斥的策略。具体地，所提供的策略包含产生具有mica/b-car和cd38敲除的ipsc系以及通过工程化ipsc系的定向分化获得表达mica/b-car和cd38无效(mica/b-car cd38-/-)的衍生效应细胞。在本技术之前，考虑到cd38在如上所述的细胞发育生物学和细胞功能中发挥许多关键作用，尚不清楚在涉及mica/b-car和/或cd38敲除的ipsc中的编辑是否会扰乱任何方面，所述方面包含ipsc分化、衍生细胞表型和效应细胞功能。
[0181]
在如本文所提供的一个实施例中，ipsc系中的cd38基因敲除是双等位基因基因敲除。如本文所公开的，所提供的cd38无效ipsc系能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞，所述造血细胞包含但不限于具有永久性造血内皮(he)潜能的中胚层细胞、永久性he、cd34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(mpp)、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、髓样细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞、b细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施例中，当使用cd38抗体诱导adcc或使用cd38 car靶向杀伤细胞时，cd38-/-ipsc和/或其衍生效应细胞不被所述cd38抗体或cd38 car消除，由此在存在此类治疗剂的情况下和/或在暴露于此类治疗剂之后，增加ipsc和其效应细胞持久性和/或存活。在一些实施例中，效应细胞在存在此类治疗剂的情况下和/或在暴露于此类治疗剂之后具有增加的体内持久性和/或存活。在一些实施例中，cd38无效效应细胞是衍生自ipsc的nk细胞。在一些实施例中，cd38无效效应细胞是衍生自ipsc的t细胞。在一些实施例中，cd38无效ipsc和衍生细胞包括如本文所述的一种或多种另外的基因组编辑，包含但不限于hncd16表达、car表达、细胞因子/细胞因子受体表达、hla i和/或hlaii敲除以及所提供的另外的模式。
[0182]
在另一个实施例中，在cd38中的所选择位置处插入包含如本文所提供的mica/b-car的一个或多个转基因的同时敲除cd38可以通过例如靶向cd38的敲入/敲除(cd38-ki/
ko)构建体实现(图2a-d)。在所述构建体的一些实施例中，构建体包括一对cd38靶向同源臂，用于cd38基因座内的位置选择性插入。在一些实施例中，预选的靶向位点位于cd38的外显子内。本文所提供的cd38-ki/ko构建体允许转基因在cd38内源性启动子下或在包含在构建体中的外源性启动子下表达。当两个或更多个转基因将被插入在cd38基因座中的所选择位置处时，连接子序列(例如，2a连接子或ires)被置于任何两个转基因之间。2a连接子编码源自fmdv、erav、ptv-i和tav的自切割肽(分别称为“f2a”、“e2a”、“p2a”和“t2a”)，使得从单次翻译产生单独的蛋白质。在一些实施例中，构建体中包括绝缘体以降低转基因和/或外源性启动子沉默的风险。包含在cd38-ki/ko构建体中的外源性启动子可以是cag或其它组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子、组织特异性启动子或细胞类型特异性启动子，包含但不限于cmv、ef1α、pgk和ubc。图3和图4证明了构建体的示例性序列，所述构建体被设计成插入hncd16和il15rf(在这个特定实例中为截短的il15rf)两者在cd38基因座处的所选择位置中，由cag启动子驱动(图3)或由cd38内源性启动子驱动(图4)，同时敲除cd38表达。如附图中所提供的并且如本领域的普通技术人员所理解的，包含在图3和图4中所示的构建体中的组分中的一些组分不是必需的，使得所述组分是任选的，并且一些所包含组分的核酸序列可以变化并且可以与如附图中所提供的每种组分或整个构建体的示例性核酸序列具有小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％但是大于50％的序列同一性。在一个实施例中，将mica/b-car插入在cd38基因座以同时敲除ipsc中的cd38。因此，本发明进一步提供了包括mica/b-car和cd38敲除的ipsc及其衍生细胞。
[0183]
3.hncd16基因敲入
[0184]
cd16已鉴别为两种同功异构物：fc受体fcγriiia(cd16a；nm_000569.6)和fcγriiib(cd16b；nm_000570.4)。cd16a为由nk细胞表达的跨膜蛋白，其结合附接到靶细胞的单体igg以活化nk细胞且促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。cd16b仅由人类嗜中性粒细胞表达。如本文中所使用，“高亲和力cd16”、“不可裂解的cd16”或“高亲和力不可裂解的cd16”是指各种cd16变体。野生型cd16具有低亲和力并且经历胞外域脱落，这是一种蛋白水解裂解过程，其在nk细胞活化后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。f176v(在一些出版物中也称为f158v)是具有高亲和力的示例性cd16多态性变体；而s197p变体是cd16的基因工程化的不可切割版本的实例。包含f176v和s197p两者的工程改造cd16变体具有高亲和力并且不可裂解，其更详细地描述于wo2015/148926中，并且其完整公开内容以引入的方式并入本文中。另外，cd16的胞外域基本上被至少一部分cd64胞外域置换的嵌合cd16受体也可实现能够进行adcc的cd16受体的所期望的高亲和力和不可裂解特征。在一些实施例中，嵌合cd16的置换胞外域包含以下中的一种或多种：cd64的ec1、ec2和ec3外显子(uniprotkb_p12314或其同功异构物或多态变体)。
[0185]
因此，高亲和力不可裂解的cd16受体(hncd16)在一些实施例中包含f176v和s197p两者；并且在一些实施例中包含f176v，其中消除了裂解区域。在一些其它实施例中，hncd16包含在与各自包含至少一部分cd64胞外域的示例性序列seq id no.7、8和9中的任一个比较时，具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间的任何百分比的同一性的序列。seq id no.7、8和9分别由示例性seq id no.10至12编码。如本文和整个本技术中所使用，考虑需要引入以对两个序列进行最佳比对的间隙数目和每个间隙的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共用的相同位置数目的函数(即，
同一性％＝相同位置数/位置总数
×
100)。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用所属领域中公认的数学算法实现。
[0186]
seq id no.7:
[0187]
mwflttlllwvpvdgqvdttkavitlqppwvsvfqeetvtlhcevlhlpgssstqwflngtatqtstpsyritsasvndsgeyrcqrglsgrsdpiqleihrgwlllqvssrvftegeplalrchawkdklvynvlyyrngkafkffhwnsnltilktnishngtyhcsgmgkhrytsagisvtvkelfpapvlnasvtspllegnlvtlscetklllqrpglqlyfsfymgsktlrgrntsseyqiltarredsglywceaatedgnvlkrspelelqvlglqlptpvwfhyqvsfclvmvllfavdtglyfsvktnirsstrdwkdhkfkwrkdpqdk
[0188]
(340个氨基酸基于cd64结构域的构建；cd16tm；cd16icd)
[0189]
seq id no.8
[0190]
mwflttlllwvpvdgqvdttkavitlqppwvsvfqeetvtlhcevlhlpgssstqwflngtatqtstpsyritsasvndsgeyrcqrglsgrsdpiqleihrgwlllqvssrvftegeplalrchawkdklvynvlyyrngkafkffhwnsnltilktnishngtyhcsgmgkhrytsagisvtvkelfpapvlnasvtspllegnlvtlscetklllqrpglqlyfsfymgsktlrgrntsseyqiltarredsglywceaatedgnvlkrspelelqvlglffppgyqvsfclvmvllfavdtglyfsvktnirsstrdwkdhkfkwrkdpqdk
[0191]
(336个氨基酸基于cd64外显子的构建；cd16tm；cd16icd)
[0192]
seq id no.9
[0193]
mwflttlllwvpvdgqvdttkavitlqppwvsvfqeetvtlhcevlhlpgssstqwflngtatqtstpsyritsasvndsgeyrcqrglsgrsdpiqleihrgwlllqvssrvftegeplalrchawkdklvynvlyyrngkafkffhwnsnltilktnishngtyhcsgmgkhrytsagisvtvkelfpapvlnasvtspllegnlvtlscetklllqrpglqlyfsfymgsktlrgrntsseyqiltarredsglywceaatedgnvlkrspelelqvlgffppgyqvsfclvmvllfavdtglyfsvktnirsstrdwkdhkfkwrkdpqdk
[0194]
(335个氨基酸基于cd64外显子的构建；cd16tm；cd16icd)
[0195]
seq id no.10
[0196]
[0197][0198]
seq id no.11
[0199][0200]
seq id no.12
[0201]
[0202][0203]
因此，本文提供克隆ipsc，其经基因工程改造以在如本文所涵盖和描述的其它编辑中包含高亲和力不可裂解的cd16受体(hncd16)，其中基因工程改造的ipsc能够分化成包含引入ipsc中的hncd16的效应细胞。在一些实施例中，包含hncd16的衍生效应细胞为nk细胞。在一些实施例中，包含hncd16的衍生效应细胞为t细胞。在ipsc或其衍生细胞中表达的外源性hncd16在不仅与adcc抗体或其片段结合而且与识别所述hncd16的cd16或cd64胞外结合结构域的双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子结合中具有高亲和力。双特异性、三特异性或多特异性接合体或结合子在以下本技术中进一步描述(参见i.7部分)。如此，本技术提供了衍生效应细胞或其细胞群，其通过与在衍生效应细胞上表达的hncd16的胞外结构域的高亲和力结合，以对于治疗如以下v部分中进一步详述的病状、疾病或感染的治疗用途足够的量预负载有一种或多种预选adcc抗体，其中所述hncd16包括cd64或具有f176v和s197p的cd16的胞外结合结构域。
[0204]
在一些其它实施例中，进一步修饰或置换hncd16的天然cd16跨膜结构域和/或胞内结构域，使得产生嵌合fc受体(cfcr)以包含非天然跨膜结构域、非天然刺激性结构域和/或非天然信号传导结构域。本文所使用的术语“非天然”意指除提供胞外结构域的受体外，跨膜结构域、刺激性结构域或信号传导结构域源自不同受体。在本文的说明中，基于cd16或其变体的cfcr不具有源自cd16的跨膜结构域、刺激性结构域或信号传导结构域。在一些实施例中，基于外源性hncd16的cfcr包括源自以下的非天然跨膜结构域：cd3d、cd3e、cd3g、cd3ζ、cd4、cd8、cd8a、cd8b、cd27、cd28、cd40、cd84、cd166、4-1bb、ox40、icos、icam-1、ctla4、pd1、lag3、2b4、btla、cd16、il7、il12、il15、kir2dl4、kir2ds1、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c、nkg2d、t细胞受体多肽。在一些实施例中，基于外源性hncd16的cfcr包括源自以下的非天然刺激性/抑制性结构域：cd27、cd28、4-1bb、ox40、icos、pd1、lag3、2b4、btla、dap10、dap12、ctla4或nkg2d多肽。在一些实施例中，基于外源hncd16的cfcr包含源自以下的非天然信号传导结构域：cd3ζ、2b4、dap10、dap12、dnam1、cd137(41bb)、il21、il7、il12、il15、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c或nkg2d多肽。在hncd16的一个实施例中，所提供的嵌合受体包含均源自以下中的一种的跨膜结构域和信号传导结构域：il7、il12、il15、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c和nkg2d多肽。基于hncd16的嵌合fc受体的一个特定实施例包含nkg2d的跨膜结构域、2b4的刺激性结构域和cd3ζ的信号传导结构域；其中hncd16的胞外结构域源自cd64或cd16的胞外结构域的全长或部分序列，其中cd16的胞外结构域包含f176v和s197p。基于hncd16的嵌合fc受体的另一实施例包含cd3ζ的跨膜结构域和信号传导结构域；其中hncd16的胞外结构域源自cd64或cd16的胞外结构域的全长或部分序列，其中cd16的胞外结构域包含f176v和s197p。
[0205]
如上文所描述的基于hncd16的嵌合fc受体的各种实施例能够以高亲和力结合到抗体或其片段的fc区；或结合到双特异性、三特异性或多特异性接合体或结合子的fc区。结合后，嵌合受体的刺激性结构域和/或信号传导结构域实现效应细胞的活化和细胞因子分泌，并且杀死由抗体或具有肿瘤抗原结合组分以及fc区的所述双特异性、三特异性或多特
异性接合体或结合子靶向的肿瘤细胞。在不受理论限制的情况下，通过非天然跨膜结构域、刺激性结构域和/或信号传导结构域，或通过与基于hncd16的嵌合fc受体的胞外结构域结合的衔接子，cfcr可以有助于效应细胞的杀伤能力，同时提高效应细胞的增殖和/或扩增潜能。抗体和接合体可使表达抗原的肿瘤细胞和表达cfcr的效应细胞紧密接近，这也有助于增强肿瘤细胞的杀伤。双特异性、三特异性、多特异性接合体或结合子的示例性肿瘤抗原包括(但不限于)b7h3、bcma、cd10、cd19、cd20、cd22、cd24、cd30、cd33、cd34、cd38、cd44、cd79a、cd79b、cd123、cd138、cd179b、cea、clec12a、cs-1、dll3、egfr、egfrviii、epcam、flt-3、folr1、folr3、gd2、gpa33、her2、hm1.24、lgr5、msln、mcsp、mica/b、psma、pama、p-钙粘素和ror1。适合于在攻击肿瘤细胞时接合表达基于hncd16的cfcr的效应细胞的一些非限制性示例性双特异性、三特异性、多特异性接合体或结合子包括cd16(或cd64)-cd30、cd16(或cd64)-bcma、cd16(或cd64)-il15-epcam和cd16(或cd64)-il15-cd33。
[0206]
不同于由在nk细胞活化之后从细胞表面裂解的原代nk细胞表达的内源cd16受体，衍生nk细胞中cd16的各种不可裂解型式避免cd16脱落，并且维持恒定表达。在衍生nk细胞中，不可裂解的cd16增加tnfα和cd107a的表达，指示细胞功能得到改善。不可裂解的cd16还增强了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)以及双特异性、三特异性或多特异性接合体的接合。adcc是通过将cd16结合到抗体涂布的靶细胞的nk细胞介导的裂解的机制。在向需要细胞疗法的受试者给予细胞之前，衍生nk细胞中引入的hncd16的额外高亲和力特征也允许通过hncd16将adcc抗体活体外负载到nk细胞。如所提供，hncd16可在一些实施例中包含f176v和s197p，或可包含源自如由seq id no:7、8或9所例示的cd64的全部或部分胞外域，或可进一步包含非天然跨膜结构域、刺激性结构域和信号传导结构域中的至少一种。如所公开，本技术还提供一种衍生nk细胞或其细胞群，其以对于治疗如以下v部分中进一步详述的病状、疾病或感染的治疗用途足够的量预负载有一种或多种预选adcc抗体。在一些实施例中，包括hncd16的衍生nk细胞进一步包括如本文所提供的mica/b-car。在一些实施例中，包括mica/b-car、hncd16的衍生nk细胞进一步包括cd38敲除。在一些实施例中，包括mica/b-car、hncd16和cd38敲除的衍生nk细胞预加载有cd38抗体。在一些实施例中，预加载的cd38抗体是达土木单抗。
[0207]
不同于原代nk细胞，来自原代来源(即，天然/原生来源，例如外周血、脐带血或其它供体组织)的成熟t细胞不表达cd16。出人意料的是，包含所表达的外源性不可裂解的cd16的ipsc不损害t细胞发育生物学，并且能够分化成功能性衍生t细胞，其不仅表达外源cd16，而且能够通过所获得的adcc机制执行功能。这种在衍生t细胞中获得的adcc可另外用作双靶向和/或拯救通常伴随car-t细胞疗法出现的抗原逃逸的方法，其中肿瘤随着靶向car-t的抗原表达或突变抗原表达减少或损失以避免被car(嵌合抗原受体)识别而复发。当所述衍生t细胞通过外源cd16表达包含获得的adcc时，并且当抗体靶向与car靶向的抗原不同的肿瘤抗原时，抗体可用于挽救car-t抗原逃逸并且减少或防止car-t治疗中常见的靶向肿瘤的复发或再现。减少和/或防止抗原逃逸同时实现双靶向的这种策略同样适用于表达一种或多种car的nk细胞。下文进一步叙述可用于这种抗原逃逸减少和防止策略的各种car。
[0208]
因此，本发明提供一种包含外源cd16的衍生t细胞。在一个实施例中，在本文中获得的衍生t细胞包括mica/b-car和外源性cd16。在另外的所提供的实施例中，除了hncd16和
mica/b-car的表达之外，在本文中获得的衍生t细胞还包括cd38敲除。在一些实施例中，衍生t细胞中包含的hncd16包含f176v和s197p。在一些其它实施例中，衍生t细胞中包含的hncd16包含源自如由seq id no:7、8或9所示例的cd64的全部或部分胞外域；或可进一步包含非天然跨膜结构域、刺激性结构域和信号传导结构域中的至少一种。如所解释，这类衍生t细胞具有获得性机制以用由adcc介导的单克隆抗体靶向肿瘤，从而增强抗体的治疗效果。如所公开，本技术还提供一种衍生t细胞或其细胞群，其以对于治疗如以下v部分中进一步详述的病状、疾病或感染的治疗用途足够的量预负载有一种或多种预选adcc抗体。在一些其它实施例中，表达hncd16和mica/b car的衍生t细胞也是cd38无效，使得细胞可以避免在存在靶向肿瘤抗原cd38的治疗剂的情况下被消除。在一个实施例中，所述靶向肿瘤抗原cd38的治疗剂是cd38抗体。在另一个实施例中，所述靶向肿瘤抗原cd38的治疗剂是包括cd38结合区的car，例如抗cd38 scfv。
[0209]
4.外源引入的细胞因子和/或细胞因子信号传导
[0210]
通过避免全身性高剂量给予临床相关的细胞因子，由于这类实践的剂量限制性毒性的风险降低，同时建立细胞因子介导的细胞自主性。为了实现淋巴细胞自主性而不需要另外给予可溶性细胞因子，将il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18、il21和/或其相应受体中的一种或多种的部分或全长肽引入细胞中以在表达或不表达细胞因子本身的情况下允许细胞因子信号传导，从而维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应功能，并且降低细胞因子毒性的风险。在一些实施例中，在细胞表面上表达用于细胞因子信号传导的所引入细胞因子和/或其相应的天然或修饰受体。在一些实施例中，组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是可诱导的。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。
[0211]
图1呈现了使用il15作为说明性实例的若干种构建体设计。图1中的设计中的任何设计的跨膜(tm)结构域对于il15受体可以是天然的，或可以用任何其它膜结合蛋白的跨膜结构域修饰或替代。
[0212]
设计1：il15和il15rα通过使用自切割肽共表达，模拟il15的反式呈递而不消除il15的顺式呈递。
[0213]
设计2：il15rα通过连接子在c端与il15融合，模拟反式呈递而不消除il15的顺式呈递以及确保il15膜结合。
[0214]
设计3：具有截短的胞内结构域的il15rα通过连接子在c端与il15融合，模拟il15的反式呈递，维持il15膜结合，并且另外消除顺式呈递和/或由正常il15r通过其胞内结构域介导的任何其它潜在信号转导途径。il15rα的胞内结构域已被认为对于在il15响应细胞中表达的受体和对于扩增和起作用的响应细胞至关重要。这种截短构建体包含与seq id no:17至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性氨基酸序列，其可以由seq id no:18表示的示例性核酸序列编码。在截短il15/il15rα的一个实施例中，构建体不包含seq id no:17的最后4个氨基酸“ksrq”，并且包含与seq id no:21至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性氨基酸序列。
[0215]
seq id no:17
[0216]
mdwtwilflvaaatrvhsgihvfilgcfsaglpkteanwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqm
fintssgggsggggsggggsggggsgggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagvtpqpeslspsgkepaasspssnntaattaaivpgsqlmpskspstgtteisshesshgtpsqttaknweltasashqppgvypqghsdttvaiststvllcglsavsllacylksrq
[0217]
(379个氨基酸；信号肽和连接肽加下划线)
[0218]
seq id no:18
[0219]
atggactggacctggattctgttcctggtcgcggctgcaacgcgagtccatagcggtatccatgtttttattcttgggtgtttttctgctgggctgcctaagaccgaggccaactgggtaaatgtcatcagtgacctcaagaaaatagaagaccttatacaaagcatgcacattgatgctactctctacactgagtcagatgtacatccctcatgcaaagtgacggccatgaaatgtttcctcctcgaacttcaagtcatatctctggaaagtggcgacgcgtccatccacgacacggtcgaaaacctgataatactcgctaataatagtctctcttcaaatggtaacgtaaccgagtcaggttgcaaagagtgcgaagagttggaagaaaaaaacataaaggagttcctgcaaagtttcgtgcacattgtgcagatgttcattaatacctctagcggcggaggatcaggtggcggtggaagcggaggtggaggctccggtggaggaggtagtggcggaggttctcttcaaataacttgtcctccaccgatgtccgtagaacatgcggatatttgggtaaaatcctatagcttgtacagccgagagcggtatatctgcaacagcggcttcaagcggaaggccggcacaagcagcctgaccgagtgcgtgctgaacaaggccaccaacgtggcccactggaccacccctagcctgaagtgcatcagagatcccgccctggtgcatcagcggcctgcccctccaagcacagtgacaacagctggcgtgaccccccagcctgagagcctgagcccttctggaaaagagcctgccgccagcagccccagcagcaacaatactgccgccaccacagccgccatcgtgcctggatctcagctgatgcccagcaagagccctagcaccggcaccaccgagatcagcagccacgagtctagccacggcaccccatctcagaccaccgccaagaactgggagctgacagccagcgcctctcaccagcctccaggcgtgtaccctcagggccacagcgataccacagtggccatcagcacctccaccgtgctgctgtgtggactgagcgccgtgtcactgctggcctgctacctgaagtccagacagtga(1140n.a.)
[0220]
seq id no:21
[0221]
mdwtwilflvaaatrvhsgihvfilgcfsaglpkteanwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssgggsggggsggggsggggsgggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagvtpqpeslspsgkepaasspssnntaattaaivpgsqlmpskspstgtteisshesshgtpsqttaknweltasashqppgvypqghsdttvaiststvllcglsavsllacyl
[0222]
(375个氨基酸；信号肽和连接肽加下划线)
[0223]
所属领域的普通技术人员将了解，上述信号肽和连接子序列为说明性的，并且绝不限制其适用作信号肽或连接子的变化形式。存在许多所属领域的技术人员已知且可获得的合适信号肽或连接子序列。所属领域的普通技术人员理解，信号肽和/或连接子序列可以取代另一序列而不改变由信号肽引导或由连接子连接的功能肽的活性。
[0224]
设计4：由于设计3构建体显示出在促进效应细胞存活和扩增方面是具有功能的，这证明il15rα的胞质结构域可以省略而不会对这类设计中配备有il15的效应细胞的自主特征产生负面影响，设计4是提供设计3的另一个工作替代方案的构建体，除了在一端与il15融合的sushi结构域和另一端上的跨膜结构域(mb-sushi)之外，基本上整个il15rα从所述构建体中去除，任选地利用sushi结构域与反式膜域之间的连接子。融合的il15/mb-sushi通过任何膜结合蛋白的跨膜结构域在细胞表面上表达。在例如设计4的构建体的情况
下，在只保留所期望的il15的反式呈递时，消除通过il15rα的不必要的信号传导，包括顺式呈递。在一些实施例中，包含与sushi结构域融合的il15的组分包含与seq id no:19至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性氨基酸序列，其可由seq id no:20表示的示例性核酸序列编码。
[0225]
seq id no:19
[0226]
mdwtwilflvaaatrvhsgihvfilgcfsaglpkteanwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssgggsggggsggggsggggsgggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0227]
(242个氨基酸；信号肽和连接肽加下划线)
[0228]
seq id no:20
[0229]
atggactggacctggattctgttcctggtcgcggctgcaacgcgagtccatagcggtatccatgtttttattcttgggtgtttttctgctgggctgcctaagaccgaggccaactgggtaaatgtcatcagtgacctcaagaaaatagaagaccttatacaaagcatgcacattgatgctactctctacactgagtcagatgtacatccctcatgcaaagtgacggccatgaaatgtttcctcctcgaacttcaagtcatatctctggaaagtggcgacgcgtccatccacgacacggtcgaaaacctgataatactcgctaataatagtctctcttcaaatggtaacgtaaccgagtcaggttgcaaagagtgcgaagagttggaagaaaaaaacataaaggagttcctgcaaagtttcgtgcacattgtgcagatgttcattaatacctctagcggcggaggatcaggtggcggtggaagcggaggtggaggctccggtggaggaggtagtggcggaggttctcttcaaataacttgtcctccaccgatgtccgtagaacatgcggatatttgggtaaaatcctatagcttgtacagccgagagcggtatatctgcaacagcggcttcaagcggaaggccggcacaagcagcctgaccgagtgcgtgctgaacaaggccaccaacgtggcccactggaccacccctagcctgaagtgcatcaga
[0230]
(726个氨基酸)
[0231]
所属领域的普通技术人员将了解，上述信号肽和连接子序列为说明性的，并且绝不限制其适用作信号肽或连接子的变化形式。存在许多所属领域的技术人员已知且可获得的合适信号肽或连接子序列。所属领域的普通技术人员理解，信号肽和/或连接子序列可以取代另一序列而不改变由信号肽引导或由连接子连接的功能肽的活性。
[0232]
设计5：天然或经过修饰的il15rβ通过连接子在c端与il15融合，从而实现组成型信号传导并且维持il15膜结合和反式重呈递。
[0233]
设计6：天然或经过修饰的共同受体γc通过连接子在c端与il15融合，以用于细胞因子的组成型信号传导和膜结合反式呈递。共同受体γc也被称为共同γ链或cd132，也称为il2受体亚基γ或il2rg。γc是许多白介素受体的受体复合体所共有的细胞因子受体亚基，所述白介素受体包含但不限于il2、il4、il7、il9、il15和il21受体。
[0234]
设计7：在缺乏il15的情况下形成同源二聚体的工程化il15rβ对于产生细胞因子的组成型信号传导是有用的。
[0235]
在一些实施例中，可以使用图1中的设计中的一个或多个设计将细胞因子il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18和il21和/或其受体中的一种或多种引入到ipsc中，并且在ipsc分化后引入到其衍生细胞中。在一些实施例中，il2或il15细胞表面表达和信号传导是通过设计1至7中的任一种中所说明的构建体。在一些实施例中，il4、il7、il9或il21细胞表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同
受体或细胞因子特异性受体。在一些实施例中，il7表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体或细胞因子特异性受体，例如il4受体。图1中的设计中的任何设计的跨膜(tm)结构域对于相应细胞因子受体可以是天然的，或可以用任何其它膜结合蛋白的跨膜结构域修饰或替代。
[0236]
在包含car和外源性细胞因子两者和/或细胞因子受体信号传导的ipsc和其衍生细胞中，car和il可在单独构建体中表达，或可在包含car和il两者的双顺反子构建体中共表达。在一些另外的实施例中，呈图1中的构建体设计中的任何构建体设计表示的形式的il15可以通过如例如car-2a-il15或il15-2a-car所示的自切割2a编码序列与car表达构建体的5'末端或3'末端连接。因此，il15和car处于单一开放阅读框(orf)中。在一个实施例中，car-2a-il15或il15-2a-car构建体包括图1的设计3中的il15。在另一个实施例中，car-2a-il15或il15-2a-car构建体包括图1的设计3中的il15。在又另一个实施例中，car-2a-il15或il15-2a-car构建体包括图1的设计7中的il15。当表达car-2a-il15或il15-2a-car时，自切割2a肽允许所表达的car和il15解离，并且然后可在细胞表面呈递解离的il15。car-2a-il15或il15-2a-car双顺反子设计在时间和数量上以及在可选择以并入例如诱导性启动子以表达单一orf的相同控制机制下允许配位的car和il15表达。自切割肽发现于小核糖核酸病毒科(picornaviridae virus family)的成员中，包括口疮病毒属(aphthovirus)，例如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus；fmdv)、马鼻炎a病毒(equine rhinitis a virus；erav)、明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus；tav)和猪捷申病毒-1(porcine tescho virus-1；ptv-i)(donnelly,ml等人,《普通病毒学期刊(j.gen.virol)》,82,1027-101(2001)；ryan,md等人,《普通病毒学期刊》,72,2727-2732(2001))；和心病毒属(cardiovirus)，例如泰勒病毒(theilovirus)(例如，泰勒氏鼠类脑脊髓炎(theiler's murine encephalomyelitis))和脑心肌炎病毒。源自fmdv、erav、ptv-i和tav的2a肽有时也分别称为“f2a”、“e2a”、“p2a”和“t2a”。
[0237]
也涵盖用于il15的如本文所公开的双顺反子car-2a-il15或il15-2a-car实施例以用于表达本文所提供的任何其它细胞因子，例如il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il18和il21。在一些实施例中，il2细胞表面表达和信号传导是通过设计1至7中的任一种中所说明的构建体。在一些其它实施例中，il4、il7、il9或il21细胞表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体和/或细胞因子特异性受体。
[0238]
5.hla-i和hla-ii缺乏
[0239]
必须在同种异体受体中匹配多种hla i类和ii类蛋白质以获得组织相容性，从而避免同种异体排斥反应问题。本文提供一种ipsc细胞系和由其分化的衍生细胞，其中消除或大体上减少hla i类和hla ii类蛋白质的表达。hla i类缺陷可以通过使hla i类基因座(染色体6p21)的任何区域发生功能缺失或使hla i类相关基因(包含不限于β-2微球蛋白(b2m)基因、tap1基因、tap2基因和tap相关蛋白)缺失或表达水平降低来实现。举例来说，b2m基因编码所有hla i类异二聚体的细胞表面表达所必需的共同亚单位。b2m无效细胞是hla-i缺陷的。hla ii类缺陷可以通过使hla-ii相关基因(包含不限于rfxank、ciita、rfx5和rfxap)发生功能缺失或降低来实现。ciita是通过ii类蛋白质表达所需的转录因子rfx5的活化起作用的转录共激活子。ciita无效细胞是hla-ii缺陷的。本文提供一种具有hla-i和hla-ii缺乏两者，例如缺少b2m和ciita表达两者的ipsc系及其衍生细胞，其中所获得的
衍生效应细胞通过消除对mhc(主要组织相容性复合物)匹配的需要实现同种异体细胞疗法，并且避免宿主(同种异体)t细胞的识别和杀伤。
[0240]
然而，对于一些细胞类型，缺乏i类表达导致被nk细胞溶解。为克服这种“自我缺失”反应，hla-g可任选地基因敲入以避免nk细胞识别和杀死由工程改造的ipsc衍生的hla-i缺陷型效应细胞。在一个实施例中，所提供的hla-i缺陷型ipsc及其衍生细胞进一步包括hla-g敲入。可替代地，在一个实施例中，所提供的hla-i缺陷型ipsc及其衍生细胞进一步包括cd58敲除和cd54敲除中的一者或两者。cd58(或lfa-3)和cd54(或icam-1)为起始信号依赖性细胞相互作用并且有助于细胞(包括免疫细胞)迁移的粘附蛋白。在本发明之前，未知的是ipsc中的cd58和/或cd54破坏是否以及如何影响定向ipsc分化为功能性免疫效应细胞(包含t细胞和nk细胞)中的多能细胞和发育生物学。之前未知的还有，cd58和/或cd54敲除是否可以有效地和/或充分地降低hla-i缺陷型ipsc衍生效应细胞对同种异体nk细胞杀伤的易感性。这里表明cd58敲除在减少同种异体nk细胞活化方面具有比cd54敲除更高的效率；而cd58和cd54两者的双敲除对nk细胞活化的减少作用最强。在一些观测中，相比于hla-i缺陷型细胞在克服“自我缺失”作用中的hla-g过表达，cd58和cd54双基因敲除甚至更有效。
[0241]
如上文所提供，在一些实施例中，hla-i和hla-ii缺陷型ipsc和其衍生细胞具有编码hla-g的外源性多核苷酸。在一些实施例中，hla-i和hla-ii缺陷型ipsc和其衍生细胞为cd58剔除型。在一些其它实施例中hla-i和hla-ii缺陷型ipsc和其衍生细胞为cd54剔除型。在又一些其它实施例中，hla-i和hla-ii缺陷型ipsc及其衍生细胞是cd54无效和cd54无效。另外，在包括mica/b car的ipsc及其衍生细胞的一些实施例中，所述细胞是hla-i和hla-ii缺陷的并且具有编码hla-g的外源性多核苷酸。在包括mica/b car的ipsc及其衍生细胞的一些实施例中，所述细胞是hla-i和hla-ii缺陷的并且是cd58无效的。在包括mica/b car的ipsc及其衍生细胞的一些实施例中，所述细胞是hla-i和hla-ii缺陷的并且是cd54无效的。在包括mica/b car的ipsc及其衍生细胞的又一些其它实施例中，所述细胞是hla-i和hla-ii缺陷的，并且两者都是cd58无效和cd54无效的。
[0242]
6.本文提供的基因工程化ipsc系和衍生细胞
[0243]
鉴于上述内容，本技术提供了ipsc、ips细胞系细胞或其群体，以及从分化所述ipsc获得的衍生功能细胞，其中每个细胞包括mica/b-car。在一些实施例中，本技术提供了ipsc、ips细胞系细胞或其群体，以及从分化所述ipsc获得的衍生功能细胞，其中每个细胞包括编码mica/b-car的至少外源性多核苷酸。在一些实施例中，功能性衍生细胞是包含但不限于以下的造血细胞：具有永久性造血内皮(he)潜能的中胚层细胞、永久性he、cd34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(mpp)、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、髓样细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞、b细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施例中，功能性衍生造血细胞包括效应细胞，如t细胞、nk细胞和调节细胞。
[0244]
本文中还提供了cd38-/-(本文中也称为“cd38无效”或cd38敲除)ipsc、ips细胞系细胞或其群体，以及包括从cd38-/-ipsc的分化获得的cd38敲除的衍生功能性衍生细胞。在一些实施例中，cd38-/-ipsc、ips细胞系细胞或其群体以及衍生功能性衍生细胞进一步包括mica/b-car或编码mica/b-car的外源性多核苷酸。在一些实施例中，编码mica/b-car的多
核苷酸位于cd38基因座处。在一些实施例中，包括mica/b-car和cd38敲除的功能性衍生细胞是包含但不限于以下的造血细胞：具有永久性造血内皮(he)潜能的中胚层细胞、永久性he、cd34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(mpp)、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、髓样细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞、b细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施例中，功能性衍生造血细胞包括效应细胞，如t细胞、nk细胞和调节细胞。
[0245]
本文进一步提供了包括编码mica/b-car的多核苷酸和编码高亲和力的不可切割的cd16(hncd16)的多核苷酸的ipsc，其中所述ipsc能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。包括mica/b-car和hncd16两者的细胞适于通过car结合和cd16介导的adcc的双重靶向，由此增加肿瘤靶向精度、增强肿瘤杀伤并且使肿瘤抗原逃逸的影响最小化。另外，在一些实施例中，包括mica/b-car和hncd16的ipsc和/或其衍生效应细胞也是cd38无效的，使得当cd38抗体用于诱导hncd16介导的增强的adcc时，包括cd38敲除、mica/b-car和hncd16的ipsc和/或其衍生效应细胞可以靶向表达cd38的(肿瘤)细胞而不会引起效应细胞消除，即表达cd38的效应细胞减少或耗尽，由此增加ipsc及其效应细胞持久性和/或存活。在一些实施例中，效应细胞包括t细胞。包括mica/b-car的ipsc衍生t细胞、cd38无效和hncd16在存在cd38抗体或cd38 car的情况下经历降低的细胞耗尽；已经获得adcc，从而提供用于肿瘤杀伤的多种机制。在一些实施例中，效应细胞包括nk细胞。包括mica/b-car、cd38无效和hncd16的ipsc衍生nk细胞具有增强的细胞毒性并且在存在cd38抗体或cd38 car的情况下具有减少的nk细胞互相杀伤。
[0246]
本文提供了包括mica/b-car和编码具有除了mica/b之外的靶特异性的第二嵌合抗原受体(car)的多核苷酸的ipsc，其中所述ipsc能够定向分化以产生具有靶向两种不同肿瘤抗原的两种car的功能性衍生效应细胞。在一个实施例中，包含在mica/b-car的ipsc及其衍生效应细胞中的第二car靶向肿瘤细胞表面蛋白cd19、bcma、cd20、cd22、cd38、cd123、her2、cd52、egfr、gd2、msln、vegf-r2、psma和pdl1。在一个实施例中，ipsc和/或其衍生效应细胞具有靶向cd38的第二car，并且所述细胞也是cd38无效的。因此，由于cd38介导的互相杀伤，cd38-car不会导致ipsc和/或其衍生效应细胞的消除。在一些实施例中，包含在包括cd38敲除的ipsc及其衍生效应细胞中的car不靶向cd38。
[0247]
另外提供了包括编码mica/b-car的多核苷酸和编码至少一种外源性细胞因子和/或其受体(il)的多核苷酸的ipsc，以使得能够进行有助于细胞存活、持续和/或扩增的细胞因子信号传导，其中ipsc系能够定向分化以产生具有改善的存活、持久性、扩增和效应细胞功能的功能性衍生造血细胞。外源引入的细胞因子信号传导包括il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18和il21中的任何一种或两种或更多种的信号传导。在一些实施例中，用于细胞因子信号传导的细胞因子和/或其相应受体的所引入部分或全部肽在细胞表面上表达。在一些实施例中，组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是可诱导的。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。在一些实施例中，细胞表面细胞因子/细胞因子受体的瞬时/暂时表达是通过逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、小环或包括mrna的rna。在一些实施例中，包含在mica/b-car ipsc或其衍生细胞中的外源性细胞表面细胞因子和/或受体使得il7信号传导能够进行。在一些实施例中，包含在mica/b-car ipsc或其衍生细胞中的外源性细胞表面细
胞因子和/或受体使得il10信号传导能够进行。在一些实施例中，包含在mica/b-car ipsc或其衍生细胞中的外源性细胞表面细胞因子和/或受体使得il15信号传导能够进行。在所述mica/b-car il ipsc的一些实施例中，il15表达通过图1的构建体3进行。在所述mica/b-car il ipsc的一些实施例中，il15表达通过图1的构建体4进行。上述实施例的所述mica/b-car il ipsc及其衍生细胞能够自主地维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应子功能，而不在体外或体内接触另外提供的可溶性细胞因子。在mica/b-car il ipsc及其衍生效应细胞的一些实施例中，所述细胞是cd38无效的，并且可以与cd38抗体一起使用以诱导adcc而不引起效应细胞消除，由此协同地增加ipsc及其效应细胞的持久性和/或存活。
[0248]
还提供了包括mica/b-car、b2m敲除和ciita敲除以及任选地hla-g过表达、cd58敲除和cd54敲除之一的ipsc，其中所述ipsc能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。所述mica/b-car b2m-/-ciita-/-ipsc及其衍生效应细胞都是hla-i和hla-ii缺陷的。在另外的实施例中，hla-i和hla-ii缺陷型mica/b-car ipsc及其衍生效应细胞也是cd38无效的，并且可以与cd38抗体一起使用以诱导adcc而不引起效应细胞消除，由此增加ipsc及其效应细胞的持久性和/或存活。在一些实施例中，效应细胞在体内具有增加的持久性和/或存活。
[0249]
鉴于上述内容，本文提供了包括mica/b-car以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种的ipsc：cd38敲除、hncd16、第二car、外源性细胞因子/受体和b2m/ciita敲除；其中当b2m被敲除时，任选地引入编码hla-g或cd58和cd54敲除中的至少一种的多核苷酸，并且其中所述ipsc能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。本技术中还包含包括以下的功能性ipsc衍生造血细胞：mica/b-car以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：cd38敲除、hncd16、b2m/ciita敲除、第二car和外源性细胞因子/受体；其中当b2m被敲除时，任选地引入编码hla-g或cd58和cd54敲除中的至少一种的多核苷酸，并且其中衍生造血细胞包含但不限于：具有永久性造血内皮(he)潜能的中胚层细胞、永久性he、cd34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(mpp)、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、髓样细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞、b细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。
[0250]
本文提供的另一方面包含包括il15和il15rα的截短融合蛋白的ipsc或ipsc衍生细胞，其中融合蛋白不包括胞内结构域。在图1中显示为“il15rα(δicd)融合”和“il5/mb-sushi”，这些实施例贯穿本技术进一步统一缩写为il15δ并且是表1中展示的“il”的实施例之一。在“il”的一些实施例中，缺乏胞内结构域的截短的il15/il15rα融合蛋白包括与seq id no:17、19或21具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在“il”的一些实施例中，缺乏胞内结构域的截短的il15/il15rα融合蛋白包括seq id no:17的氨基酸序列。在“il”的一些实施例中，缺乏胞内结构域的截短的il15/il15rα融合蛋白包括seq id no:19的氨基酸序列。在“il”的一些实施例中，缺乏胞内结构域的截短的il15/il15rα融合蛋白包括seq id no:21的氨基酸序列。在包括缺乏胞内结构域的截短的il15/il15rα融合蛋白(il15δ)的ipsc或ipsc衍生细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包括mica/b-car以及任选地以下中的一种或多种：cd38敲除、hncd16、第二car、外源性细胞因子/受体和b2m/ciita敲除；其中当b2m被敲除时，任选地引入编码hla-g或cd58和cd54敲除之一的多核苷酸，并且其中所述ipsc能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞，并且其中所述衍生造血细胞包含但不限于：具有永久性造血内皮(he)潜能的中胚层细胞、永久性he、cd34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(mpp)、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、
髓样细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞、b细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。
[0251]
因此，本技术提供ipsc和其功能性衍生造血细胞，其包含表1中的任一种以下基因型。如在本技术的表1中提供的“car
(2nd)”表示具有不同于mica/b-car的靶向特异性的car，并且非限制性实例包含靶向以下中的至少一者的car：cd19、bcma、cd20、cd22、cd123、her2、cd52、egfr、gd2、msln、vegf-r2、psma和pdl1。如表1中提供的“il”代表以下之一：il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18和il21，这取决于选择哪种特异性细胞因子/受体表达。另外，“il”还涵盖il15δ实施例，所述实施例在上文详述为il15和il15rα的截短的融合蛋白，但没有胞内结构域。另外，当ipsc及其功能性衍生造血细胞具有包括car(mica/b-car或第二car)和il两者的基因型时，在所述细胞的一个实施例中，car和il包含在包括2a序列的双顺反子表达盒中。相比而言，在一些其它实施例中，car和il在包含于ipsc和其功能性衍生造血细胞中的单独表达盒中。在一个特定实施例中，包含在表达car和il两者的ipsc及其功能性衍生效应细胞中的是图1的构建体3或4中的il15，其中il15构建体包含在具有car或与car分开的表达盒中。
[0252]
表1：所提供的细胞的适用的的示例性基因型：
[0253]
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259][0260][0261]
7.额外修饰
[0262]
在一些实施例中，包括表1中的基因型中的任一种的ipsc及其衍生效应细胞可以另外包括tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、pd1、lag3、tim3、rfxank、rfx5、rfxap和染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种的缺失或减少的表达；或以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：hla-e、41bbl、cd3、cd4、cd8、cd47、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a
2a
r、
抗原特异性tcr、fc受体、衔接子和用于与双特异性衔接子、多特异性衔接子或通用衔接子偶联的表面触发受体。
[0263]
双特异性衔接子或多特异性衔接子是由不同抗体的两个或更多个单链可变片段(scfv)组成的融合蛋白，其中至少一个scfv与效应细胞表面分子结合，并且至少另一个通过肿瘤特异性表面分子与肿瘤细胞结合。可以用于双特异性或多特异性衔接子识别或偶联的示例性效应细胞表面分子或表面触发受体包含但不限于cd3、cd28、cd5、cd16、nkg2d、cd64、cd32、cd89、nkg2c和如本文所公开的嵌合fc受体。在一些实施例中，在效应细胞的表面上表达以用于接合体识别的cd16是hncd16，其包含如i.2部分中所描述的cd16(含有f176v和任选的s197p)或cd64胞外结构域以及天然或非天然的跨膜结构域、刺激性结构域和/或信号传导结构域。在一些实施例中，在效应细胞的表面上表达以用于接合体识别的cd16是基于hncd16的嵌合fc受体(cfcr)。在一些实施例中，基于hncd16的cfcr包含nkg2d的跨膜结构域、2b4的刺激性结构域和cd3ζ的信号传导结构域；其中hncd16的胞外结构域源自cd64或cd16的胞外结构域的全长或部分序列；并且其中cd16的胞外结构域包含f176v和任选的s197p。用于双特异性或多特异性衔接子识别的示例性肿瘤细胞表面分子包含但不限于b7h3、bcma、cd10、cd19、cd20、cd22、cd24、cd30、cd33、cd34、cd38、cd44、cd79a、cd79b、cd123、cd138、cd179b、cea、clec12a、cs-1、dll3、egfr、egfrviii、epcam、flt-3、folr1、folr3、gd2、gpa33、her2、hm1.24、lgr5、msln、mcsp、mica/b、psma、pama、p-钙粘蛋白、ror1。在一个实施例中，双特异性抗体是cd3-cd19。在另一个实施例中，双特异性抗体是cd16-cd30或cd64-cd30。在另一实施例中，双特异性抗体为cd16-bcma或cd64-bcma。在再一实施例中，双特异性抗体为cd3-cd33。在又另一个实施例中，双特异性抗体进一步包括位于效应细胞与肿瘤细胞抗原结合结构域之间的连接子，例如，作为效应nk细胞的连接子(在一些出版物中被称为trike或三特异性杀伤衔接子)以促进效应细胞扩增的经过修饰的il15。在一个实施例中，trike为cd16-il15-epcam或cd64-il15-epcam。在另一实施例中，trike为cd16-il15-cd33或cd64-il15-cd33。在又另一个实施例中，trike是nkg2c-il15-cd33(“2c1533”)。
[0264]
在一些实施例中，用于双特异性或多特异性衔接子的表面触发受体对于效应细胞可以是内源性的，有时视细胞类型而定。在一些其它实施例中，可以使用本文所提供的方法和组合物将一种或多种外源性表面触发受体引入到效应细胞中，即通过对包括表1中列出的基因型的ipsc进行另外的工程化，然后指导ipsc的分化成t细胞、nk细胞或包括与源ipsc相同的基因型和表面触发受体作为源ipsc的任何其它效应细胞。
[0265]
8.用于免疫疗法的抗体
[0266]
在一些实施例中，除如本文所提供的基因组工程改造的效应细胞以外，包含靶向与病状、疾病或适应症相关的抗原的抗体或抗体片段的额外治疗剂可在组合疗法中与这些效应细胞一起使用。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体是人类化抗体、人类化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体或抗体片段与病毒抗原特异性结合。在其它实施例中，抗体或抗体片段与肿瘤抗原特异性结合。在一些实施例中，肿瘤或病毒特异性抗原活化所给予的ipsc衍生效应细胞以增强其杀伤能力。在一些实施例中，适于作为所施用的ipsc衍生效应细胞的另外的治疗剂进行组合治疗的抗体包含但不限于cd20抗体(利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布里图昔单抗、奥卡拉珠单抗、奥比珠
单抗)、her2抗体(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、cd52抗体(阿仑单抗)、egfr抗体(西妥昔单抗)、gd2抗体(迪努妥昔单抗)、pdl1抗体(阿维鲁单抗)、cd38抗体(达土木单抗、艾沙妥昔单抗、mor202)、cd123抗体(7g3、csl362)、slamf7抗体(埃罗妥珠单抗)、mica/b抗体(7c6、6f11、1c2)及其人源化或经过fc修饰的变体或片段或其功能等效物和生物仿制药。在一些实施例中，ipsc衍生效应细胞包含造血谱系细胞，其包含表1中所列的基因型。在一些实施例中，ipsc衍生效应细胞包含nk细胞，其包含表1中所列的基因型。在一些实施例中，ipsc衍生效应细胞包括t细胞，所述t细胞包括表1中列出的基因型。
[0267]
在用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施例中，所述组合包括预选的单克隆抗体和包括至少mica/b-car的ipsc衍生nk或t细胞。在用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些其它实施例中，所述组合包括预选的单克隆抗体和包括至少mica/b-car和hncd16的ipsc衍生nk或t细胞。在用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施例中，所述组合包括mica/b单克隆抗体和包括至少mica/b-car的ipsc衍生nk或t细胞。在包括mica/b单克隆抗体和ipsc衍生nk或t细胞(包括至少mica/b-car)的治疗组合的一些实施例中，mica/b单克隆抗体在包括编码所述mica/b单克隆抗体的多核苷酸的nk细胞群体中表达。在一些实施例中，mica/b单克隆抗体是7c6、6f11和1c2之一。在包括mica/b单克隆抗体和ipsc衍生nk或t细胞(包括mica/b-car)的治疗组合的一些实施例中，所述ipsc衍生nk或t细胞进一步包括hncd16。在不受理论限制的情况下，hncd16提供了mica/b单克隆抗体的增强的adcc，而mica/b-car不仅靶向mica/b肿瘤抗原，而且防止单克隆抗体可靶向的肿瘤抗原的脱落。在用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施例中，所述组合包括包含以下的ipsc衍生nk或t细胞：至少mica/b-car、cd38无效和cd38抗体。在一个实施例中，所述组合包括包含以下的ipsc衍生nk细胞：mica/b-car、cd38无效和hncd16；以及cd38抗体、达土木单抗、艾沙妥昔单抗和mor202之一。在一个实施例中，所述组合包括包含以下的ipsc衍生nk细胞：mica/b-car、cd38无效和hncd16以及达土木单抗。在一些另外的实施例中，包含在与达土木单抗的组合中的ipsc衍生nk细胞包括mica/b-car cd38无效、hncd16、il15和靶向cd38的car或以下之一：cd19、bcma、cd20、cd22、cd123、her2、cd52、egfr、gd2、msln、vegf-r2、psma和pdl1之一；其中il15与car共表达或分开表达；并且il15呈图1的构建体1到7中呈现的形式中的任一种形式。在一些特定实施例中，当il15与car共表达或分开表达时，其呈构建体3、4或7的形式。
[0268]
9.检查点抑制剂
[0269]
检查点为在不受抑制时能够抑制或下调免疫反应的细胞分子，通常为细胞表面分子。现在清楚的是，肿瘤选择某些免疫检查点路径作为免疫抗性的主要机制，特别是针对对肿瘤抗原具有特异性的t细胞。检查点抑制剂(ci)是能够减少检查点基因表达或基因产物，或降低检查点分子的活性，从而阻断抑制性检查点，恢复免疫系统功能的拮抗剂。靶向pd1/pdl1或ctla4的检查点抑制剂的研发转变了肿瘤学前景，其中这些试剂提供多种适应症的长期缓解。然而，许多肿瘤亚型对检查点阻断疗法具有抗性，并且复发仍然是一个大问题。本技术的一个方面提供了一种通过包含如在与ci的组合疗法中提供的基因组工程化功能性衍生细胞来克服ci抗性的治疗方法。在组合疗法的一个实施例中，衍生细胞是nk细胞。在组合疗法的另一个实施例中，衍生细胞是t细胞。除了展现直接的抗肿瘤能力外，本文所提供的衍生nk细胞已显示出抵抗pdl1-pd1介导的抑制作用，并且具有增强t细胞迁移、将t细
胞募集到肿瘤微环境并且增强肿瘤部位处的t细胞活化的能力。因此，由功能上有效的基因组工程化衍生nk细胞促进的t细胞的肿瘤浸润表明，所述nk细胞能够与t细胞靶向的免疫疗法(包含检查点抑制剂)协同作用，以缓解局部免疫抑制并且减少肿瘤负荷。
[0270]
在一个实施例中，用于检查点抑制剂组合疗法的衍生nk细胞包括mica/b-car，以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：cd38敲除、hncd16表达、b2m/ciita敲除、第二car和外源性细胞表面细胞因子和/或受体表达；其中当b2m被敲除时，任选地包含编码hla-g或cd58或cd54敲除中的至少一种的多核苷酸。在一些实施例中，衍生nk细胞包含表1中所列的任一种基因型。在一些实施例中，上述衍生nk细胞另外包括：tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、pd1、lag3、tim3、rfxank、rfx5、rfxap以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种的缺失或减少的表达；或以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：hla-e、41bbl、cd3、cd4、cd8、cd47、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a
2a
r、抗原特异性tcr、fc受体、衔接子和用于与双特异性衔接子、多特异性衔接子或通用衔接子偶联的表面触发受体。
[0271]
在另一个实施例中，用于检查点抑制剂组合疗法的衍生t细胞包括mica/b-car，以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：cd38敲除、hncd16表达、b2m/ciita敲除、第二car和外源性细胞表面细胞因子和/或受体表达；其中当b2m被敲除时，任选地包含编码hla-g或cd58或cd54敲除之一的多核苷酸。在一些实施例中，衍生t细胞包含表1中所列的任一种基因型。在一些实施例中，上述衍生t细胞另外包括：tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、pd1、lag3、tim3、rfxank、rfx5、rfxap以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种中的缺失或减少的表达；或以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：hla-e、41bbl、cd3、cd4、cd8、cd47、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a
2a
r、抗原特异性tcr、fc受体、衔接子和用于与双特异性衔接子、多特异性衔接子或通用衔接子偶联的表面触发受体。
[0272]
上文所述的衍生nk或t细胞是从分化ipsc克隆系获得的，所述ipsc克隆系包括mica/b-car，以及任选地以下中的一种、两种、三种或全部四种：cd38敲除、hncd16表达、b2m/ciita敲除、第二car和外源性细胞表面细胞因子表达；其中当b2m被敲除时，任选地引入编码hla-g或cd58和cd54敲除中的至少一种的多核苷酸。在一些实施例中，上文所述ipsc克隆系进一步包括：tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、pd1、lag3、tim3、rfxank、rfx5、rfxap以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种中的缺失或减少的表达；或以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：hla-e、41bbl、cd3、cd4、cd8、cd47、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a
2a
r、抗原特异性tcr、fc受体、衔接子和用于与双特异性衔接子、多特异性衔接子或通用衔接子偶联的表面触发受体。
[0273]
用于与如本文所提供的衍生nk细胞或t细胞的组合疗法的合适的检查点抑制剂包含但不限于pd1(pdcdl、cd279)、pdl-1(cd274)、tim3(havcr2)、tigit(wucam和vstm3)、lag3(lag3、cd223)、ctla4(ctla4、cd152)、2b4(cd244)、4-1bb(cd137)、4-1bbl(cd137l)、a2ar、bate、btla、cd39(entpdl)、cd47、cd73(nt5e)、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxpl、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2(pou2f2)、视黄酸受体α(rara)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e和抑制性kir(例如，2dl1、2dl2、2dl3、3dl1和3dl2)的拮抗剂。
[0274]
在一些实施例中，抑制上述任一种检查点分子的拮抗剂是抗体。在一些实施例中，检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人类抗体、人类化抗体、骆驼ig、只有重链的鲨鱼抗体
(vnar)、ig nar、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包括fab、fab
′
、f(ab)
′
2、f(ab)
′
3、fv、单链抗原结合片段(scfv)、(scfv)2、二硫键稳定的fv(dsfv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合片段(sdab，纳米抗体)、只有重链的重组抗体(vhh)和维持整个抗体的结合特异性的其它抗体片段，其相比于整个抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施例中，所述一种或两种或三种或更多种检查点抑制剂包括以下中的至少一种：阿特珠单抗(pdl1 mab)、阿维鲁单抗(pdl1 mab)、度伐单抗(pdl1 mab)、曲美木单抗(tremelimumab)(ctla4 mab)、伊匹单抗(ctla4 mab)、iph4102(kir抗体)、iph43(mica抗体)、iph33(tlr3抗体)、利瑞木单抗(kir抗体)、莫纳利珠单抗(nkg2a抗体)、纳武单抗(pd1 mab)、派姆单抗(pd1 mab)和其任何衍生物、功能等效物或生物仿制药。
[0275]
在一些实施例中，抑制上述任一种检查点分子的拮抗剂是基于微rna的，因为发现许多mirna作为控制免疫检查点的表达的调控因子(dragomir等人,《癌症生物医学(cancer biol med.)》2018,15(2):103-115)。在一些实施例中，检查点拮抗性mirna包括(但不限于)mir-28、mir-15/16、mir-138、mir-342、mir-20b、mir-21、mir-130b、mir-34a、mir-197、mir-200c、mir-200、mir-17-5p、mir-570、mir-424、mir-155、mir-574-3p、mir-513和mir-29c。
[0276]
与所提供的衍生nk或t细胞的组合治疗的一些实施例包括至少一种检查点抑制剂以靶向至少一种检查点分子；其中衍生细胞具有表1列出的基因型。与所提供的衍生nk细胞或t细胞的组合疗法的一些其它实施例包含两种、三种或更多种检查点抑制剂，使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在包括至少一种检查点抑制剂和具有表1中列出的基因型的衍生细胞的组合疗法的一些实施例中，所述检查点抑制剂是抗体、或人源化或经过fc修饰的变体或片段或其功能等效物或生物仿制药，并且所述检查点抑制剂通过表达编码所述抗体或其片段或变体的外源性多核苷酸序列由衍生细胞产生。在一些实施例中，编码抑制检查点的抗体或其片段或变体的外源性多核苷酸序列在单独构建体中或在双顺反子构建体中与car共表达，所述双顺反子构建体包含car和编码抗体或其片段的序列两者。在一些其它实施例中，编码抗体或其片段的序列可通过自切割2a编码序列连接到car表达构建体的5'端或3'端，示出为例如car-2a-ci或ci-2a-car。因此，检查点抑制剂和car的编码序列在单一开放阅读框(orf)中。当通过能够浸润肿瘤微环境(tme)的衍生效应细胞将检查点抑制剂以有效负载递送、表达和分泌时，其在接合tme后抵消抑制性检查点分子，从而允许利用例如car或活化受体的活化模式活化效应细胞。在一些实施例中，与car共表达的检查点抑制剂抑制以下检查点分子中的至少一种：pd1、pdl-1、tim3、tigit、lag3、ctla4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39(entpdl)、cd47、cd73(nt5e)、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxpl、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2(pou2f2)、视黄酸受体α(rara)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e和抑制性kir。在一些实施例中，在具有表1中所列的基因型的衍生细胞中与car共表达的检查点抑制剂选自包含以下的群组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫那利珠单抗、纳武单抗、派立珠单抗和其人类化或fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。在一些实施例中，与car共表达的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人类化或fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物类似物。在一些其它实施例中，与car共表达的检查点抑制剂是纳武单抗或其人类化或fc修饰的变体、片段或其功能等
效物或生物类似物。在一些其它实施例中，与car共表达的检查点抑制剂是派立珠单抗或其人类化或fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物类似物。
[0277]
在包括本文所提供的衍生细胞和至少一种抑制检查点分子的抗体的组合疗法的一些其它实施例中，所述抗体不由衍生细胞或在衍生细胞中产生，并且在施用具有表1中列出的基因型的衍生细胞之前、同时或之后另外施用。在一些实施例中，在与所提供的衍生nk细胞或t细胞的组合疗法中给予一种、两种、三种或更多种检查点抑制剂是同时或依序的。在包含具有表1中所列的基因型的衍生nk细胞或t细胞的组合治疗的一个实施例中，治疗中包括的检查点抑制剂为以下中的一种或多种：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫那利珠单抗、纳武单抗、派立珠单抗和其人类化或fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。在包含具有表1中所列的基因型的衍生nk细胞或t细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包括的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人类化或fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似药。在包含具有表1中所列的基因型的衍生nk细胞或t细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包括的检查点抑制剂是纳武单抗或其人类化或fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物类似物。在包含具有表1中所列的基因型的衍生nk细胞或t细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包括的检查点抑制剂是派立珠单抗或其人类化或fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。
[0278]
ii.在ipsc中所选基因座处进行靶向基因组编辑的方法
[0279]
如本文中可互换使用的基因组编辑(genome editing/genomic editing)是一种类型的基因工程改造，其中在靶细胞的基因组中插入、缺失和/或置换dna。靶向基因组编辑(可与“靶向基因组编辑”或“靶向基因编辑”互换)能够在基因组中的预选位点实现插入、缺失和/或取代。当在靶向编辑期间使内源序列在插入位点缺失时，可因序列缺失而基因敲除或基因敲减包含受影响序列的内源基因。因此，靶向编辑还可以用于精确地破坏内源基因表达。本文中类似地使用术语“靶向整合”，其是指一种涉及在使内源序列在插入位点缺失或不缺失的情况下插入一个或多个外源序列的过程。相比之下，随机整合的基因经历位置效应和沉默，使其表达不可靠且不可预测。举例来说，着丝点和亚端粒区域特别容易发生转基因沉默。相反，新整合的基因可影响周围的内源基因和染色质，从而潜在地改变细胞行为或有利于细胞转化。因此，将外源dna插入预选基因座(例如安全港基因座或基因组安全港(gsh))对于安全、效率、拷贝数控制以及可靠的基因反应控制非常重要。可替代地，可以将外源性dna插入在预选的基因座中，其中预期破坏基因座处的基因表达，包含敲低和敲除。
[0280]
可以通过核酸酶非依赖性方法或通过核酸酶依赖性方法实现靶向编辑。在核酸酶非依赖性靶向编辑方法中，同源重组是通过宿主细胞的酶机制，由侧接所插入的外源性多核苷酸的同源序列引导。
[0281]
替代地，可以通过利用特异性稀有切割核酸内切酶，特异性引入双链断裂(dsb)来以更高的频率实现靶向编辑。这类核酸酶依赖性靶向编辑是利用dna修复机制，包括非同源末端连接(nhej)，其响应于dsb而发生。在不具有含有外源遗传物质的供体载体的情况下，nhej通常引起少量的内源核苷酸的随机插入或缺失(插入/缺失)。相比之下，当存在含有侧接一对同源臂的外源性基因物质的供体载体时，可以在同源指导修复(hdr)期间通过同源重组将外源性基因物质引入到基因组中，从而导致“靶向整合”。在一些情况下，靶向整合位
点旨在位于所选择基因的编码区内，并且因此靶向整合可能破坏基因表达，从而导致在一个单一编辑步骤中同时敲入和敲除(ki/ko)。
[0282]
在所关注基因座(goi)的所选择位置处插入一个或多个转基因以同时敲除基因可以通过在图2a-d中例示的构建体设计来实现，所述构建体设计使用cd38基因座用于说明。适于同时敲入和敲除(ki/ko)的其它基因座包含但不限于b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3和tigit。由于用于位置选择性插入的相应cd38靶向同源臂，本文提供的构建体允许转基因在cd38内源性启动子下或在包含在构建体中的外源性启动子下表达(比较图2a与b以及c与d)。cd38基因座内的选择性插入/敲除位置与包含在构建体中的侧翼左同源臂和右同源臂(lha/cd38和rha/cd38)的序列相容。根据cd38基因座内的预选的靶向位点，lha/cd38和rha/cd38可以具有可变的长度和序列。在一些实施例中，预选的靶向位点位于cd38的外显子内。当两个或更多个转基因将被插入在cd38基因座中的所选择位置处时，连接子序列(例如，2a连接子或ires)被置于任何两个转基因之间。2a连接子编码源自fmdv、erav、ptv-i和tav的自切割肽(分别称为“f2a”、“e2a”、“p2a”和“t2a”)，使得从单次翻译产生单独的蛋白质。在一些实施例中，构建体中包括绝缘体以降低转基因和/或外源性启动子沉默的风险。外源性启动子可以是cag，或其它组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性和/或细胞类型特异性的启动子，包括但不限于cmv、ef1α、pgk和ubc。
[0283]
能够引入特定和靶向dsb的可用核酸内切酶包括(但不限于)锌指核酸酶(zfn)、转录活化因子样效应物核酸酶(talen)、rna引导的crispr(簇聚的规则间隔的短回文重复序列)系统。另外，利用phic31和bxb1整合酶的dice(双整合酶盒交换)系统也是一种用于靶向整合的有前景的工具。
[0284]
zfn是靶向核酸酶，其包含与锌指dna结合结构域融合的核酸酶。“锌指dna结合结构域”或“zfbd”意指通过一个或多个锌指，以序列特异性方式结合dna的多肽结构域。锌指是锌指结合结构域内具有约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位而稳定。锌指的实例包括(但不限于)c2h2锌指、c3h锌指和c4锌指。“设计”的锌指结构域是一种不存在于自然界中的结构域，其设计/组成主要来源于合理准则，例如应用取代规则和计算机化算法来处理储存现有zfp设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如美国专利第6,140,081号；第6,453,242号；和第6,534,261号；还参见wo 98/53058；wo 98/53059；wo 98/53060；wo 02/016536和wo 03/016496。“所选择的”锌指结构域是一种在自然界中未发现的结构域，其产生主要来源于经验方法，例如噬菌体呈现、相互作用截留或杂交选择。zfn更详细地描述于美国专利第7,888,121号和美国专利第7,972,854号中，其完整公开内容以引入的方式并入本文中。zfn在所属领域中的最公认实例是foki核酸酶与锌指dna结合结构域的融合物。
[0285]
talen为靶向核酸酶，其包含与tal效应物dna结合结构域融合的核酸酶。“转录活化因子样效应物dna结合结构域”、“tal效应物dna结合结构域”或“tale dna结合结构域”意指负责tal效应蛋白与dna结合的tal效应蛋白的多肽结构域。tal效应蛋白是由黄单胞菌属(xanthomonas)植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白质进入植物细胞的核，经由其dna结合结构域结合效应子特异性dna序列，并且经由其转录活化结构域在这些序列处激活基因
转录。tal效应物dna结合结构域特异性取决于不完全的34个氨基酸重复序列的效应子可变数目，其包含所选重复位置处的多态性，称为重复可变双残基(rvd)。talen更详细地描述于美国专利申请第2011/0145940号，所述申请以引用的方式并入本文中。talen在所属领域中的最公认实例是foki核酸酶与tal效应物dna结合结构域的融合多肽。
[0286]
用于本发明方法中的靶向核酸酶的另一实例为靶向spo11核酸酶，其为一种包含spo11多肽的多肽，所述多肽具有与dna结合结构域，例如对所关注dna序列具有特异性的锌指dna结合结构域、tal效应物dna结合结构域等融合的核酸酶活性。参见例如美国申请第61/555,857号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
[0287]
适合于本发明的靶向核酸酶的其它实例包括(但不限于)bxb1、phic31、r4、phibt1和wβ/spbc/tp901-1,不论单独地或组合地使用。
[0288]
靶向核酸酶的其它非限制性实例包括天然存在的核酸酶和重组核酸酶；来自包括以下的家族的crispr相关核酸酶：cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm和cmr；限制性核酸内切酶；大范围核酸酶；归巢核酸内切酶等。
[0289]
使用cas9作为实例，crispr/cas9需要两种主要组分：(1)cas9核酸内切酶；以及(2)crrna-tracrrna复合物。当共表达时，所述两种组分形成募集到标靶dna序列的复合物，所述序列包含pam和靠近pam的接种区域。crrna和tracrrna可以组合形成嵌合向导rna(grna)以引导cas9靶向所选序列。这两种组分然后可以经由转染或转导递送到哺乳动物细胞。另外的crispr核酸酶包含但不限于cpf1和mad7。
[0290]
dice介导的插入是利用一对重组酶(例如phic31和bxb1)来提供外源dna的单向整合，其严格局限于每种酶自身的小attb和attp识别位点。由于这些att靶点并非天然存在于哺乳动物基因组中，因此必须首先将其引入基因组中的所期望整合位点。参见例如美国申请公开案第2015/0140665号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
[0291]
本发明的一个方面提供一种构建体，其包含一种或多种用于靶向基因组整合的外源性多核苷酸。在一个实施例中，所述构建体进一步包括对所期望的整合位点具有特异性的一对同源臂，并且所述靶向整合的方法包括将所述构建体引入到细胞中以允许细胞宿主酶机制实现位点特异性同源重组。在另一实施例中，细胞中的靶向整合的方法包含向细胞中引入包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体，以及向细胞中引入包含对所期望的整合位点具有特异性的dna结合结构域的zfn表达盒以实现zfn介导的插入。在又一实施例中，细胞中的靶向整合的方法包含向细胞中引入包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体，以及向细胞中引入包含对所期望的整合位点具有特异性的dna结合结构域的talen表达盒以实现talen介导的插入。在另一实施例中，细胞中的靶向整合的方法包含向细胞中引入包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体，向细胞中引入cas9表达盒和包含对所期望的整合位点具有特异性的向导序列的grna以实现cas9介导的插入。在再一实施例中，细胞中的靶向整合的方法包含将包含一对dice重组酶的一个或多个att位点的构建体引入细胞中的所期望的整合位点、向细胞中引入包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体，和引入dice重组酶的表达盒以实现dice介导的靶向整合。
[0292]
有望用于靶向整合的位点包括(但不限于)安全港基因座或基因组安全港(gsh)，其是人类基因组的基因内或基因外区域，在理论上，所述区域能够容纳新整合的dna的可预测表达而不会对宿主细胞或生物体产生副作用。适用的安全港必须准许足够的转基因表达
以产生所期望水平的载体编码的蛋白质或非编码rna。安全港还不得使细胞容易发生恶性转化，也不得改变细胞功能。如果整合位点是潜在的安全港基因座，那么理想的是需要满足包括(但不限于)以下的准则：如通过序列注释所判断，调控元件或基因没有中断；是基因密集区域中的基因间区域，或沿相反方向转录的两种基因之间的汇聚位置；保持距离以使载体编码的转录活化因子与相邻基因(特别是癌症相关基因和微rna基因)的启动子之间的长程相互作用的可能性最小化；并且具有明显普遍存在的转录活性，如通过按较宽空间和时间表达的序列标签(est)表达谱所反映，其指示普遍存在的转录活性。这个后一特征在干细胞中尤其重要，其中在分化期间，染色质重塑通常引起一些基因座的沉默和其它基因座的潜在激活。在适合于外源插入的区域内，选择用于插入的确切基因座应该不含重复元件和保守序列且可以针对其容易地设计出用于扩增同源臂的引物。
[0293]
适用于人类基因组编辑或具体地说靶向整合的位点包括(但不限于)腺相关病毒位点1(aavs1)、趋化因子(cc基序)受体5(ccr5)基因座和小鼠rosa26基因座的人类直系同源物。另外，小鼠h11基因座的人类直系同源物也可以是使用本文所公开的靶向整合组合物和方法进行插入的合适位点。另外，也可以使用胶原蛋白和htrp基因座作为靶向整合的安全港。然而，每个所选位点的验证已显示为必需的，特别是在特异性整合事件的干细胞中，并且通常需要优化插入策略，包括启动子选择、外源基因序列和排列，以及构建体设计。
[0294]
对于靶向插入/缺失，编辑位点通常包含于旨在破坏其表达和/或功能的内源基因中。在一个实施例中，包括靶向插入/缺失的内源性基因与免疫应答调控和调节相关。在一些其它实施例中，包含靶向插入/缺失的内源基因与以下相关：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节，或抑制干细胞和/或祖细胞和其衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
[0295]
如此，本发明的一个方面提供了在所选择基因座中的靶向整合的方法，所述所选择基因座包含基因组安全港或已知或证明是安全的并且针对连续或时间基因表达调控良好的预选的基因座，如aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh或runx1，或满足基因组安全港标准的其它基因座。在一些实施例中，靶向整合位于期望作为整合的结果的基因敲低或敲除的基因座之一，其中此类基因座包含但不限于b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3和tigit。
[0296]
在一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及将包括对期望整合位点具有特异性的一对同源臂和一个或多个同源序列的构建体引入到细胞中，以使得能够通过细胞宿主酶机制进行位点特异性同源重组，其中所述期望整合位点包括aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、runx1、b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit。
[0297]
在另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及将包括对期望整合位点具有特异性的dna结合结构域的zfn表达盒引入到细胞中，以使得能够进行zfn介导的插入，其中所述期望整合位点包括aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、runx1、b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、
nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit。在又另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及将包括对期望整合位点具有特异性的dna结合结构域的talen表达盒引入到细胞中，以使得能够进行talen介导的插入，其中所述期望整合位点包括aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、runx1、b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit。在另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中、将cas9表达盒以及包括对期望整合位点具有特异性的引导序列的grna引入到细胞中，以使得能够进行cas9介导的插入，其中所述期望整合位点包括aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、runx1、b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit。在仍另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一对dice重组酶的一个或多个att位点的构建体引入到细胞中的期望整合位点中、将包括一个或多个外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中以及将用于dice重组酶的表达盒引入到细胞中，以使得能够进行dice介导的靶向整合，其中所述期望整合位点包括aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、runx1、b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit。
[0298]
此外，如本文所提供，用于在安全港中进行靶向整合的上述方法用于插入所关注的任何多核苷酸，例如编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，和促进干细胞和/或祖细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些其它实施例中，包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体进一步包含一个或多个标记物基因。在一个实施例中，本发明的构建体中的外源性多核苷酸是编码安全开关蛋白质的自杀基因。适用于诱导细胞死亡的自杀基因系统包括(但不限于)胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)和ap1903；胸苷激酶(tk)和苷昔洛韦(ganciclovir)(gcv)；胞嘧啶脱氨酶(cd)和5-氟胞嘧啶(5-fc)。另外，一些自杀基因系统对细胞类型具有特异性，例如使用b细胞分子cd20对t淋巴细胞进行基因修饰允许其在给予mab利妥昔单抗后消除。此外，当基因工程改造的细胞暴露于西妥昔单抗时，含有由西妥昔单抗识别的抗原决定基的经修饰egfr可以用于耗尽所述细胞。因此，本发明的一个方面提供一种靶向整合一个或多个编码安全开关蛋白质的自杀基因的方法，所述安全开关蛋白质选自胱天蛋白酶9(胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰egfr和b细胞cd20。
[0299]
在一些实施例中，通过本文中的方法整合的一种或多种外源性多核苷酸是由包含于用于靶向整合的构建体中的可操作连接的外源性启动子驱动。所述启动子可以是诱导性的或构造性的，且可以是时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的。适用于本发明方法的构建性启动子包括(但不限于)巨细胞病毒(cmv)、延伸因子1α(ef1α)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、杂交cmv增强子/鸡β-肌动蛋白(cag)和泛素c(ubc)启动子。在一个实施例中，外源性
启动子是cag。
[0300]
通过本文中的方法整合的外源性多核苷酸可以由宿主基因组中的内源性启动子在整合位点处驱动。在一个实施例中，本发明的方法是用于使一种或多种外源性多核苷酸靶向整合于细胞基因组中的aavs1基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性aavs1启动子驱动。在另一实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的rosa26基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性rosa26启动子驱动。在再一实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的h11基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性h11启动子驱动。在另一实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的胶原蛋白基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性胶原蛋白启动子驱动。在再一实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的htrp基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性htrp启动子驱动。理论上，只有正确插入所期望位置才能实现由内源性启动子驱动的外源基因的基因表达。
[0301]
在一些实施例中，用于靶向整合方法的包含于构建体中的一种或多种外源性多核苷酸是由一个启动子驱动。在一些实施例中，构建体包含一个或多个位于由相同启动子驱动的两个相邻多核苷酸之间的连接子序列，以使得各部分之间的物理间距更大并且使酶机制的可行性最大化。连接子序列的连接肽可以由为了使各部分(外源性多核苷酸，和/或由其编码的蛋白质或肽)之间产生物理间距而选择的氨基酸组成，视相关功能而定，其较柔软或较硬。连接子序列可以通过蛋白酶裂解或以化学方式裂解以产生单独的部分。连接子中的酶裂解位点的实例包括蛋白水解酶，例如肠激酶、因子xa、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和凝血酶的裂解位点。在一些实施例中，所述蛋白酶为由宿主天然产生的蛋白酶或其通过外源引入。替代地，连接子中的裂解位点可以是在暴露于所选化学物质(例如溴化氰、羟胺或低ph)后能够裂解的位点。任选的连接子序列可以服务于除提供裂解位点以外的目的。连接子序列应允许所述部分相对于另一相邻部分的有效定位，以便所述部分正确地发挥作用。连接子还可以是长度足以防止部分之间的任何空间位阻的简单氨基酸序列。另外，连接子序列可以实现转译后修饰，包括(但不限于)例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸化位点、γ-羧基化位点等。在一些实施例中，连接子序列是柔软的，以便使生物活性肽不能保持单一非所要的构形。连接子可以主要包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。在一些实施例中，约80％或90％或更多的连接子序列包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸残基。在若干实施例中，g4s连接肽将融合蛋白的末端处理结构域和核酸内切酶结构域分开。在其它实施例中，2a连接子序列允许单次转译产生两种单独的蛋白质。可以容易地凭经验鉴别合适的连接子序列。另外，连接子序列的合适大小和序列也可以通过常规计算机建模技术确定。在一个实施例中，连接子序列编码自切割肽。在一个实施例中，自切割肽为2a。在一些其它实施例中，连接子序列提供内部核糖体入口序列(ires)。在一些实施例中，任何两个连续连接子序列是不同的。
[0302]
将包含用于靶向整合的外源性多核苷酸的构建体引入细胞中的方法可以使用本身已知的将基因转移到细胞的方法实现。在一个实施例中，构建体包含病毒载体的骨架，所述病毒载体例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体。在一些实施例中，质粒载体用于将外源性多核苷酸递送到靶细胞和/或使外源性多核苷
酸在靶细胞(例如pal-11、pxtl、prc/cmv、prc/rsv、pcdnai/neo)等等中表达。在一些其它实施例中，游离型载体用于将外源性多核苷酸递送到靶细胞。在一些实施例中，重组腺相关病毒(raav)可以用于基因工程化以通过同源重组来引入插入、缺失或取代。不同于慢病毒，raav不会整合到宿主基因组中。另外，相较于常规靶向质粒的转染，游离型raav载体以高得多的速率介导同源定向的基因靶向。在一些实施例中，aav6或aav2载体用于在ipsc的基因组中的标靶位点处引入插入、缺失或取代。在一些实施例中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的ipsc和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
[0303]
iii.获得和维持基因组工程改造的ipsc的方法
[0304]
本发明提供一种获得和维持基因组工程改造的ipsc的方法，其包含在一个或多个所期望的位点处的一个或多个靶向编辑，其中所述靶向编辑在扩增的基因组工程改造的ipsc或ipsc衍生非多能细胞中在相应的所选编辑位点处保持完整和功能。所述靶向编辑将插入、缺失和/或取代引入基因组ipsc和其衍生细胞中，即，在所选位点引入靶向整合和/或插入/缺失。与直接工程化患者源的外周血起源原代效应细胞相比，通过编辑和分化如本文所提供的ipsc获得基因组工程化衍生细胞的许多益处包含但不限于：工程化效应细胞的来源不受限制；无需重复操纵效应细胞，尤其在涉及多种工程化模式时；所获得的效应细胞因具有伸长端粒和经历较少耗尽而再生；效应细胞群关于编辑位点、拷贝数和缺乏等位基因变异、随机突变和表达杂色是同质的，这主要是由于如本文所提供的工程化ipsc中能够进行的克隆选择。
[0305]
在特定实施例中，包含在一个或多个所选位点处的一个或多个靶向编辑的基因组工程改造的ipsc作为单一细胞在表2中所示的作为命运维持培养基(fate maintenance medium；fmm)的细胞培养基中维持、传代和扩增持续延长的时段，其中所述ipsc在所选位点处保留靶向编辑和功能修饰。培养基的组分可以表2中所示的最优范围内的量存在于培养基中。fmm中培养的ipsc已显示继续维持其未分化和基础或初始概况；基因组稳定性，而不需要培养物清洗或选择；并且通过活体外类胚胎体或单层分化(不形成类胚胎体)；和活体内畸胎瘤形成的分化容易产生所有三种体细胞谱系。参见例如美国申请第61/947,979号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
[0306]
表2：用于ipsc重编程和维持的示例性培养基
[0307]
[0308][0309]
在一些实施例中，包含一种或多种靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造的ipsc在包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂并且不含或基本上不含tgfβ受体/alk5抑制剂的培养基中维持、传代和扩增，其中所述ipsc在所选位点保留完整和功能性靶向编辑。
[0310]
本发明的另一方面提供一种产生基因组工程改造的ipsc的方法，其通过ipsc的靶向编辑；或通过首先利用靶向编辑产生基因组工程改造的非多能细胞，并且然后将所选/分离的基因组工程改造的非多能细胞重编程，以获得包含与非多能细胞相同的靶向编辑的ipsc。本发明的另一方面提供基因组工程改造的非多能细胞，其通过将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入细胞中而同时经历重编程，其中所接触的非多能细胞处于足以用于重编程的条件下，并且其中重编程的条件包含使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触。在同时进行基因组工程改造和重编程的方法的各种实施例中，可以在起始重编程之前或基本上同时，通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入非多能细胞中。
[0311]
在一些实施例中，为了对非多能细胞同时进行基因组工程改造和重编程，还可以在通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而起始多日重编程工艺之后，将靶向整合和/或插入/缺失引入非多能细胞中，并且其中携带构建体的载体是在重编程细胞呈现一种或多种内源多能基因(包括但不限于ssea4、tra181和cd30)的稳定表达之前引入。
[0312]
在一些实施例中，通过使非多能细胞与至少一种重编程因子和任选的tgfβ受体/alk抑制剂、mek抑制剂、gsk3抑制剂与rock抑制剂的组合(frm；表2)接触来起始重编程。在一些实施例中，通过上述任何方法进行的基因组工程改造的ipsc进一步使用包含mek抑制剂、gsk3抑制剂与rock抑制剂的组合(fmm；表2)的混合物来维持和扩增。
[0313]
在产生基因组工程改造的ipsc的方法的一些实施例中，所述方法包含：通过将一种或多种靶向整合和/或插入/缺失引入ipsc中来基因组工程改造ipsc，以获得具有至少一种表1中所列的基因型的基因组工程改造的ipsc。替代地，产生基因组工程改造的ipsc的方法包含：(a)将一个或多个靶向编辑引入非多能细胞中，以获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造的非多能细胞，和(b)使基因组工程改造的非多能细
胞与一种或多种重编程因子和任选的小分子组合物接触，以获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的基因组工程改造的ipsc，所述小分子组合物包含tgfβ受体/alk抑制剂、mek抑制剂、gsk3抑制剂和/或rock抑制剂。可替代地，产生基因组工程化ipsc的方法包括：(a)使非多能细胞与一种或多种重编程因子以及任选地小分子组合物接触，以启动非多能细胞的重编程，所述小分子组合物包括tgfβ受体/alk抑制剂、mek抑制剂、gsk3抑制剂和/或rock抑制剂；(b)将一种或多种靶向整合和/或插入/缺失引入到用于基因组工程化的重编程非多能细胞中；以及(c)获得包括位于所选择位点处的靶向整合和/或插入/缺失的克隆基因组工程化ipsc。
[0314]
重编程因子选自由以下组成的群组：oct4、sox2、nanog、klf4、lin28、c-myc、ecat1、utf1、esrrb、sv40lt、hesrg、cdh1、tdgf1、dppa4、dnmt3b、zic3、l1td1和其任何组合，如pct/us2015/018801和pct/us16/57136中所公开，其公开内容以引入的方式并入本文中。一种或多种重编程因子可以呈多肽形式。重编程因子也可以呈多核苷酸形式，并且因此通过载体(例如，逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、质粒和小环)引入非多能细胞中。在特定实施例中，通过慢病毒载体引入编码至少一种重编程因子的一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，通过游离型载体引入一种或多种多核苷酸。在各种其它实施例中，通过仙台病毒载体引入一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，所述一种或多种多核苷酸是通过质粒与所考虑的各种重编程因子的化学计量的组合来引入的。参见例如美国申请第62/571,105号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
[0315]
在一些实施例中，非多能细胞是利用包含不同外源性多核苷酸和/或不同启动子的多个构建体，通过用于在相同或不同的所选位点进行靶向整合的多种载体转移。这些外源性多核苷酸可以包括自杀基因或编码靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白和肽、药物靶标候选物的基因或编码蛋白质的基因，所述蛋白质促进ipsc或其衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活。在一些实施例中，外源性多核苷酸编码rna，包括但不限于sirna、shrna、mirna和反义核酸。这些外源性多核苷酸可以由一个或多个启动子驱动，所述启动子选自由以下组成的群组：组成性启动子、诱导性启动子、时间特异性启动子和组织或细胞类型特异性启动子。因此，当在例如在诱导剂的存在下或在特定分化细胞类型中激活启动子的条件下时，多核苷酸是可表达的。在一些实施例中，多核苷酸在ipsc和/或在由ipsc分化的细胞中表达。在一个实施例中，一个或多个自杀基因是由组成性启动子驱动，例如胱天蛋白酶-9由cag驱动。可以同时或连续将包含不同外源性多核苷酸和/或不同启动子的这些构建体转移到非多能细胞中。经历多个构建体的靶向整合的非多能细胞可同时接触一种或多种重编程因子以与基因工程改造同时起始重编程，从而获得在同一细胞池中包含多个靶向整合的基因组工程改造的ipsc。因此，这种稳固方法实现同时重编程和工程改造策略，以衍生具有整合到一个或多个所选的标靶位点的多种模式的克隆的基因组工程改造的hipsc。在一些实施例中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的ipsc和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
[0316]
iv.通过分化基因组工程改造的ipsc获得基因工程改造的效应细胞的方法
[0317]
本发明的另一方面提供一种通过畸胎瘤形成活体内分化基因组工程改造的ipsc的方法，其中由基因组工程改造的ipsc活体内衍生的分化细胞保留完整和功能性靶向编辑，包括在所期望的位点处的靶向整合和/或插入/缺失。在一些实施例中，由基因组工程化
ipsc通过畸胎瘤体内衍生的分化细胞包括在一个或多个期望位点整合的一个或多个诱导型自杀基因，所述一个或多个期望位点包括aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp h11、β-2微球蛋白、gapdh、tcr或runx1，或满足基因组安全港标准的其它基因座。在一些其它实施例中，基因组工程改造的ipsc经由畸胎瘤体内衍生的分化细胞包含编码靶向模式或编码促进干细胞和/或祖细胞的运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，包含一个或多个诱导性自杀基因的基因组工程改造的ipsc经由畸胎瘤体内衍生的分化细胞，在与免疫反应调控和介导相关的内源基因中进一步包含一个或多个插入/缺失。在一些实施例中，插入/缺失包含于一个或多个内源检查点基因中。在一些实施例中，插入/缺失包含于一个或多个内源t细胞受体基因中。在一些实施例中，插入/缺失包含于一个或多个内源mhc i类抑制基因中。在一些实施例中，插入/缺失包含于与主要组织相容性复合物相关的一个或多个内源基因中。在一些实施例中，插入/缺失包含在一种或多种内源性基因中，所述一种或多种内源性基因包含但不限于b2m、pd1、tap1、tap2、tap相关基因、tcr基因。在一个实施例中，在所选位点处包含一种或多种外源性多核苷酸的基因组工程改造的ipsc在b2m(β-2微球蛋白)编码基因中进一步包含靶向编辑。
[0318]
在特定实施例中，包含如本文所提供的一种或多种基因修饰的基因组工程改造的ipsc用于衍生出活体外源性造血细胞谱系或任何其它特定细胞类型，其中衍生非多能细胞保留功能性基因修饰，包括在所选位点处的靶向编辑。在一个实施例中，基因组工程改造的ipsc衍生细胞包括(但不限于)具有永久性生血内皮细胞(he)潜能的中胚层细胞、永久性he、cd34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞(mpp)、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞、b细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞，其中由基因组工程改造的ipsc衍生的这些细胞保留功能性基因修饰，包括在所期望的位点处的靶向编辑。
[0319]
用于获得ipsc衍生造血细胞谱系的适用分化方法和组合物包括例如国际申请第pct/us2016/044122号中描绘的那些分化方法和组合物，所述申请的公开内容以引入的方式并入本文中。如所提供，用于产生造血细胞谱系的方法和组合物是在无血清、无饲养层和/或无基质的条件下并且在可扩展和单层培养平台中在无需eb形成的情况下通过衍生自多能干细胞(包括hipsc)的永久性生血内皮细胞(he)进行的。可以根据所提供的方法分化的细胞的范围是从多能干细胞到专门化为特定末端分化细胞和转分化细胞的祖细胞、和到直接转向造血命运而不经历多能中间体的多种谱系细胞。类似地，通过分化干细胞而产生的细胞的范围是从多潜能干细胞或祖细胞到末端分化细胞，以及到所有中间造血细胞谱系。
[0320]
用于在单层培养中分化和扩增来自多能干细胞的造血谱系细胞的方法包含使多能干细胞与bmp路径活化剂和任选的bfgf接触。如所提供，无需由多能干细胞形成类胚胎体便获得并且扩增多能干细胞衍生中胚层细胞。然后使中胚层细胞与bmp路径活化剂、bfgf和wnt路径活化剂接触，以获得具有永久性生血内皮细胞(he)潜能的扩增中胚层细胞，而不会由多能干细胞形成类胚胎体。通过随后与bfgf和任选的rock抑制剂和/或wnt路径活化剂接触，将具有永久性he潜能的中胚层细胞分化成永久性he细胞，其在分化期间还得到扩增。
[0321]
本文所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于eb介导的多能干细胞分化，原因在于：eb形成产生了适度到最低限度的细胞扩增；不允许单层培养，而单层培养对于需要所
述细胞在群体中均匀扩增和均匀分化的许多应用至关重要；并且费力且效率低。
[0322]
所提供的单层分化平台促进向永久性生血内皮细胞分化，从而使得衍生出造血干细胞和分化后代，例如t细胞、b细胞、nkt细胞和nk细胞。单层分化策略将增强的分化效率与大规模扩增组合，实现了在不同治疗应用中递送治疗相关数目个多能干细胞衍生造血细胞。此外，使用本文所提供的方法进行的单层培养产生功能性造血谱系细胞，其实现了全范围的活体外分化、离体调节，和活体内长期造血自我更新、重建和移植。如所提供，ipsc衍生造血谱系细胞包括(但不限于)永久性生血内皮细胞、造血多潜能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
[0323]
用于引导多能干细胞分化成永久性造血谱系细胞的方法，其中所述方法包含：(i)使多能干细胞与包含bmp活化剂和任选的bfgf的组合物接触，以起始多能干细胞分化成和扩增中胚层细胞；(ii)使所述中胚层细胞与包含bmp活化剂、bfgf和gsk3抑制剂的组合物接触，以起始中胚层细胞分化成和扩增具有永久性he潜能的中胚层细胞，其中所述组合物任选地不含tgfβ受体/alk抑制剂；(iii)使具有永久性he潜能的中胚层细胞与组合物接触，以起始具有永久性生血内皮细胞潜能的多能干细胞衍生中胚层细胞分化成和扩增永久性生血内皮细胞，所述组合物包含rock抑制剂；一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：bfgf、vegf、scf、igf、epo、il6和il11；和任选的wnt路径活化剂，其中所述组合物任选地不含tgfβ受体/alk抑制剂。
[0324]
在一些实施例中，所述方法进一步包含使多能干细胞与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂的组合物接触，以接种和扩增多能干细胞，其中所述组合物不含tgfβ受体/alk抑制剂。在一些实施例中，多能干细胞为ipsc、或初始ipsc、或包含一种或多种遗传印记的ipsc；并且ipsc中所包含的一种或多种遗传印记保留于由其分化的造血细胞中。在用于引导多能干细胞分化成造血谱系细胞的方法的一些实施例中，多能干细胞分化成造血谱系细胞缺乏产生类胚胎体，并且呈单层培养形式。
[0325]
在上述方法的一些实施例中，所获得的多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞是cd34 。在一些实施例中，所获得的永久性生血内皮细胞为cd34 cd43-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞为cd34 cd43-cxcr4-cd73-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞为cd34 cxcr4-cd73-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞为cd34 cd43-cd93-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞为cd34 cd93-。
[0326]
在上述方法的一些实施例中，所述方法进一步包含(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触，以起始永久性生血内皮细胞分化成前t细胞祖细胞，所述组合物包含rock抑制剂；一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：vegf、bfgf、scf、flt3l、tpo和il7；和任选的bmp活化剂；和任选地，(ii)使前t细胞祖细胞与组合物接触，以起始前t细胞祖细胞分化成t细胞祖细胞或t细胞，所述组合物包含一种或多种选自由scf、flt3l和il7组成的群组的生长因子和细胞因子，但不含vegf、bfgf、tpo、bmp活化剂和rock抑制剂中的一种或多种。在所述方法的一些实施例中，多能干细胞衍生t细胞祖细胞为cd34 cd45 cd7 。在所述方法的一些实施例中，多能干细胞衍生t细胞祖细胞为cd45 cd7 。
[0327]
在用于指导多能干细胞分化成造血谱系细胞中的上述方法的又一些实施例中，所
述方法进一步包括：(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触，以启动所述永久性生血内皮细胞分化成前nk细胞祖细胞，所述组合物包括rock抑制剂；选自由以下组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子：vegf、bfgf、scf、flt3l、tpo、il3、il7和il15；以及任选地(ii)使多能干细胞衍生前nk细胞祖细胞与包括选自由以下组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子的组合物接触：scf、flt3l、il3、il7和il15，以启动所述前nk祖细胞分化成nk细胞祖细胞或nk细胞，其中培养基不含vegf、bfgf、tpo、bmp活化剂和rock抑制剂中的一种或多种。在一些实施例中，多能干细胞衍生nk祖细胞为cd3-cd45 cd56 cd7 。在一些实施例中，多能干细胞衍生nk细胞为cd3-cd45 cd56 ，并且任选地进一步由nkp46 、cd57 和cd16 定义。
[0328]
因此，使用上述分化方法，人们可以获得一种或多种ipsc衍生造血细胞群：(i)cd34 he细胞(icd34)，使用一种或多种选自impp-a、itc-a2、itc-b2、ink-a2和ink-b2的培养基；(ii)永久性生血内皮细胞(ihe)，使用一种或多种选自impp-a、itc-a2、itc-b2、ink-a2和ink-b2的培养基；(iii)永久性hsc，使用一种或多种选自impp-a、itc-a2、itc-b2、ink-a2和ink-b2的培养基；(iv)多潜能祖细胞(impp)，使用impp-a；(v)t细胞祖细胞(ipro-t)，使用一种或多种选自itc-a2和itc-b2的培养基；(vi)t细胞(itc)，使用itc-b2；(vii)nk细胞祖细胞(ipro-nk)，使用一种或多种选自ink-a2和ink-b2的培养基；和/或(viii)nk细胞(ink)，和ink-b2。在一些实施例中，培养基：
[0329]
a.icd34-c包含rock抑制剂、一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：bfgf、vegf、scf、il6、il11、igf和epo，和任选的wnt路径活化剂；并且不含tgfβ受体/alk抑制剂；
[0330]
b.impp-a包含bmp活化剂、rock抑制剂以及一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：tpo、il3、gmcsf、epo、bfgf、vegf、scf、il6、flt3l和il11；
[0331]
c.itc-a2包含rock抑制剂；一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：scf、flt3l、tpo和il7；和任选的bmp活化剂；
[0332]
d.itc-b2包含一种或多种选自由scf、flt3l和il7组成的群组的生长因子和细胞因子；
[0333]
e.ink-a2包括rock抑制剂以及选自由以下组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子：scf、flt3l、tpo、il3、il7和il15；并且
[0334]
f.ink-b2包括一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：scf、flt3l、il7和il15。
[0335]
在一些实施例中，由上述方法获得的基因组工程化ipsc衍生细胞包括在一个或多个期望整合位点处整合的一个或多个诱导型自杀基因，所述一个或多个期望整合位点包括：aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、runx1、b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit。在一些其它实施例中，基因组工程改造的ipsc衍生细胞包含编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物或促进干细胞和/或祖细胞的运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，包含一个或多个自杀基因的基因组工程改造的ipsc衍生细胞进一步包含一个或多个内源基因中所包含
的一种或多种插入/缺失，所述内源基因与免疫反应调控和介导相关，包括(但不限于)检查点基因、内源t细胞受体基因和mhc i类抑制基因。在一个实施例中，包含一个或多个自杀基因的基因组工程改造的ipsc衍生细胞进一步包含b2m基因中的插入/缺失，其中基因敲除b2m。
[0336]
另外，用于获得第一命运的基因组工程改造的造血细胞到第二命运的基因组工程改造的造血细胞的适用去分化方法和组合物包括例如国际公开案第wo2011/159726号中所描绘的那些方法和组合物，所述申请的公开内容以引入的方式并入本文中。其中提供的方法和组合物允许部分地将初始非多能细胞重编程为非多能中间细胞，这是通过在重编程期间限制内源nanog基因的表达；并且使所述非多能中间细胞经历用于使中间细胞分化成所期望的细胞类型的条件来进行。在一些实施例中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的ipsc和其衍生细胞包含表1中所列的至少一种基因型。
[0337]
v.具有从基因工程化ipsc分化的外源性功能模式的衍生免疫细胞的治疗用途
[0338]
在一些实施例中，本发明提供一种组合物，其包含功能增强的衍生免疫细胞的分离群体或亚群，所述免疫细胞使用如所公开的方法和组合物由基因组工程改造的ipsc分化。在一些实施例中，ipsc包括一种或多种靶向基因编辑，所述一种或多种靶向基因编辑能在ipsc衍生免疫细胞中保留，其中基因工程化ipsc和其衍生细胞适于基于细胞的过继性疗法。在一个实施例中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含ipsc衍生cd34细胞。在一个实施例中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含ipsc衍生hsc细胞。在一个实施例中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含ipsc衍生prot细胞或t细胞。在一个实施例中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含ipsc衍生pronk细胞或nk细胞。在一个实施例中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含ipsc衍生免疫调控细胞或骨髓衍生抑制细胞(mdsc)。在一些实施例中，进一步离体调节ipsc衍生基因工程改造的免疫细胞以改善治疗潜能。在一个实施例中，已源自ipsc的基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比例增加的初始t细胞、干细胞记忆t细胞和/或中枢记忆t细胞。在一个实施例中，已源自ipsc的基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比例增加的i型nkt细胞。在另一实施例中，已源自ipsc的基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比例增加的适应性nk细胞。在一些实施例中，源自ipsc的基因工程改造的cd34细胞、hsc细胞、t细胞、nk细胞或骨髓衍生抑制细胞的分离群体或亚群是同种异体的。在一些其它实施例中，衍生自ipsc的基因工程化cd34细胞、hsc细胞、t细胞、nk细胞、nkt细胞或mdsc的分离群体或亚群是自体的。
[0339]
在一些实施例中，用于分化的ipsc包含经选择以在效应细胞中传达所期望的治疗属性的遗传印记，其限制条件为不破坏分化期间的细胞发育生物学，并且其限制条件为遗传印记在源自所述ipsc的分化的造血细胞中保留并且起作用。
[0340]
在一些实施例中，多能干细胞中的遗传印记包含(i)在将非多能细胞重编程为ipsc期间或之后通过在多能细胞的基因组中进行基因组插入、缺失或取代而获得的一种或多种基因修饰模式；或(ii)对供者、疾病或治疗反应具有特异性的来源特异性免疫细胞的一种或多种可保留治疗属性，且其中多能细胞是由来源特异性免疫细胞重编程，其中ipsc保留来源治疗属性，ipsc衍生造血谱系细胞中也包含所述来源治疗属性。
[0341]
在一些实施例中，经过基因修饰的模式包括以下中的一种或多种：安全开关蛋白、
sarcoma)相关疱疹病毒)、rsv(呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus))、ebv(埃-巴二氏病毒(epstein-barr virus))、cmv(巨细胞病毒)、vzv(水痘带状疱疹病毒)、腺病毒、慢病毒、bk多瘤病毒相关病症。
[0345]
使用本文所公开的实施例的衍生造血谱系细胞的治疗可在症状后进行，或用于复发预防。术语“治疗(treatment/treating)”等在本文中一般用于意指获得所期望的药理学和/或生理学作用。对于疾病和/或可归因于所述疾病的不良作用，所述作用就完全或部分预防疾病来说，可以是防治性的，和/或就部分或完全治愈来说，可以是治疗性的。如本文所使用的“治疗”涵盖对受试者的疾病的任何干预，并且包括：防止在可能易患所述疾病但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中出现所述疾病；抑制所述疾病，即，遏制其发展；或缓解所述疾病，即，引起所述疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后给予治疗剂或组合物。发展中的疾病的治疗也是备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的非所要临床症状。在特定实施例中，需要治疗的受试者患有可以通过细胞疗法使至少一种相关症状得以含有、缓解和/或改善的疾病、病状和/或损伤。某些实施例预期需要细胞疗法的受试者包括(但不限于)骨髓或干细胞移植的候选者、已接受化学疗法或照射疗法的受试者、患有过度增殖病症或癌症(例如过度增殖病症或造血系统癌症)或处于患有其的风险下的受试者、患有肿瘤(例如实体肿瘤)或处于罹患所述肿瘤的风险下的受试者、患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病或处于患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病的风险下的受试者。
[0346]
在评估对包括本文所公开的实施例的衍生造血谱系细胞的治疗的反应性时，应答可以由包括以下中的至少一种的标准来测量：临床受益率、直到死亡的存活期、病理学完全应答、病理学应答的半定量量度、临床完全缓解、临床部分缓解、临床稳定疾病、无复发存活、无转移存活、无疾病存活、循环肿瘤细胞减少、循环标志物应答和实体瘤应答评估标准(recist，response evaluation criteria in solid tumors)。
[0347]
可以在其它治疗之前、期间和/或之后在受试者中给予包含如所公开的衍生造血谱系细胞的治疗组合物。因此，组合疗法的方法可涉及在使用额外治疗剂之前、期间和/或之后给予或制备ipsc衍生免疫细胞。如上文所提供，一种或多种额外治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小rna、dsrna(双链rna)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分，或免疫调节药物(imid)。给予ipsc衍生免疫细胞与给予额外治疗剂可以在时间上间隔几小时、几天或甚至几周。另外地或可替代地，给予可与其它生物活性剂或模式组合，所述生物活性剂或模式例如但不限于抗肿瘤剂、非药物疗法，例如手术。
[0348]
在组合细胞疗法的一些实施例中，治疗组合包含本文所提供的ipsc衍生造血谱系细胞和额外治疗剂，所述额外治疗剂是抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体可以是人类化抗体、人类化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体或抗体片段与病毒抗原特异性结合。在其它实施例中，抗体或抗体片段与肿瘤抗原特异性结合。在一些实施例中，肿瘤或病毒特异性抗原活化所给予的ipsc衍生造血谱系细胞以增强其杀伤能力。在一些实施例中，适于作为所施用的ipsc衍生造血谱系细胞的另外的治疗剂进行组合治疗的抗体包含但不限于cd20抗体(例如，利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布里图昔单抗、奥卡拉珠单抗、奥比珠单抗)、her2抗体(例如，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、cd52抗体(例如，阿仑单抗)、egfr抗体(例如，西妥昔单抗)、gd2抗体(例如，迪
努妥昔单抗)、pdl1抗体(例如，阿维鲁单抗)、cd38抗体(例如，达土木单抗、艾沙妥昔单抗、mor202)、cd123抗体(例如，7g3、csl362)、slamf7抗体(埃罗妥珠单抗)、mica/b抗体(7c6、6f11、1c2)及其人源化或经过fc修饰的变体或片段或其功能等效物和生物仿制药。
[0349]
在一些实施例中，额外治疗剂包含一种或多种检查点抑制剂。检查点是指在不受抑制时能够抑制或下调免疫反应的细胞分子，通常为细胞表面分子。检查点抑制剂是能够减少检查点基因表达或基因产物，或降低检查点分子活性的拮抗剂。用于与如本文所提供的衍生效应细胞(包含nk细胞或t细胞)的组合疗法的合适的检查点抑制剂包含但不限于pd1(pdcdl、cd279)、pdl-1(cd274)、tim3(havcr2)、tigit(wucam和vstm3)、lag3(lag3、cd223)、ctla4(ctla4、cd152)、2b4(cd244)、4-1bb(cd137)、4-1bbl(cd137l)、a2ar、bate、btla、cd39(entpdl)、cd47、cd73(nt5e)、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxpl、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2(pou2f2)、视黄酸受体α(rara)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e和抑制性kir(例如，2dl1、2dl2、2dl3、3dl1和3dl2)的拮抗剂。
[0350]
包含所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些实施例进一步包含至少一种靶向检查点分子的抑制剂。与所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些其它实施例包含两种、三种或更多种检查点抑制剂，使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在一些实施例中，用于如本文所描述的组合疗法的效应细胞为如所提供的衍生nk细胞。在一些实施例中，用于如本文所描述的组合疗法的效应细胞为衍生t细胞。在一些实施例中，如本文所提供，用于组合疗法的衍生nk细胞或t细胞在功能上得到增强。在一些实施例中，两种、三种或更多种检查点抑制剂可以在组合疗法中在给予衍生效应细胞同时、之前或之后给予。在一些实施例中，两种或更多种检查点抑制剂是同时或一次一个地(依序)给予。
[0351]
在一些实施例中，抑制上述任一种检查点分子的拮抗剂是抗体。在一些实施例中，检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人类抗体、人类化抗体、骆驼ig、只有重链的鲨鱼抗体(vnar)、ig nar、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包括fab、fab
′
、f(ab)
′
2、f(ab)
′
3、fv、单链抗原结合片段(scfv)、(scfv)2、二硫键稳定的fv(dsfv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合片段(sdab，纳米抗体)、只有重链的重组抗体(vhh)和维持整个抗体的结合特异性的其它抗体片段，其相比于整个抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施例中，一种、或两种、或三种、或更多种检查点抑制剂包含以下中的至少一种：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫那利珠单抗、纳武单抗、派立珠单抗和其衍生物或功能等效物。
[0352]
包含衍生效应细胞和一种或多种检查抑制剂的组合疗法适用于治疗液体和实体癌症，包括(但不限于)皮肤t细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、蕈样真菌病(mycosis fungoide)、佩吉特样网状细胞增生症(pagetoid reticulosis)、塞氏综合症(sezary syndrome)、肉芽肿性皮肤松弛、淋巴瘤样丘疹病、慢性苔癣样糠疹(pityriasis lichenoides chronica)、急性苔癣痘疹样糠疹(pityriasis lichenoides et varioliformis acuta)、cd30 皮肤t细胞淋巴瘤、继发性皮肤cd30 大细胞淋巴瘤、非蕈样真菌病cd30皮肤大t细胞淋巴瘤、多形性t细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤(lennert lymphoma)、皮下t细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤(angiocentric lymphoma)、母细胞性nk细胞淋巴瘤
(blastic nk-cell lymphoma)、b细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(hl)、头颈部肿瘤、鳞状细胞癌、横纹肌肉瘤(rhabdomyocarcoma)、路易斯肺癌(lewis lung carcinoma；llc)、非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、食道腺癌、肾细胞癌(rcc)、结肠直肠癌(crc)、急性骨髓白血病(aml)、乳腺癌、胃癌、前列腺小细胞神经内分泌癌瘤(scnc)、肝癌、神经胶母细胞瘤、肝癌、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌瘤、骨癌、癌转移和鼻咽癌。
[0353]
在一些实施例中，除如本文所提供的衍生效应细胞以外，用于治疗用途的组合包含一种或多种额外治疗剂，其包含化学治疗剂或放射性部分。化学治疗剂是指细胞毒性抗肿瘤剂，即优先杀死赘生性细胞或中断快速增殖细胞的细胞循环，或发现其根除癌症干细胞并且在治疗上用于防止或减少赘生性细胞生长的化学试剂。化学治疗剂有时也被称作抗瘤形成或细胞毒性药物或药剂，并且为所属领域中熟知的。
[0354]
在一些实施例中，化学治疗剂包含蒽环霉素(anthracycline)、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、含铂剂、干扰素和白介素。示例性化学治疗剂包括(但不限于)烷基化剂(环磷酰胺、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、马法兰(mephalin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、六甲基三聚氰胺(heamethylmelamine)、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))、抗代谢物(甲氨蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷(cytarabine)、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine))、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(依托泊苷(etoposide)、依托泊苷邻苯醌(etoposide orthoquinone)和替尼泊苷(teniposide))、抗生素(道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、双蒽(bisanthrene)、放线菌素d、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素(puromycin)和短杆菌肽d(gramicidine d))、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、秋水仙碱(colchicine)、细胞松弛素b(cytochalasin b)、吐根素(emetine)、美登素(maytansine)和安吖啶(amsacrine)。额外药剂包括氨苯乙哌啶酮(gminoglutethimide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、丝裂霉素、六甲蜜胺(altretamine)、环磷酰胺、洛莫司汀(ccnu)、卡莫司汀(bcnu)、伊立替康(irinotecan)(cpt-11)、阿仑单抗、六甲蜜胺、阿那曲唑(anastrozole)、l-天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝瑟罗汀(bexarotene)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安、二甲睾酮calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、塞内昔布(celecoxib)、西妥昔单抗、克拉屈滨(cladribine)、氯呋拉滨(clofurabine)、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、地尼白介素(denileukin diftitox)、己烯雌酚(diethlstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、甲雄烷醇酮(dromostanolone)、表柔比星(epirubicin)、埃罗替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、乙炔基雌二醇、依西美坦(exemestane)、氟尿苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲、替伊莫单抗、艾达霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素α(2a、2b)、伊立替康、来曲唑(letrozole)、甲
酰四氢叶酸(leucovorin)、亮丙立德(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、氮芥(meclorethamine)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalin)、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧呋豆素(methoxsalen)、丝裂霉素c、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、诺龙(nandrolone)、诺非单抗(nofetumomab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegasparagase)、喷司他汀、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、聚苯丙生(polifeprosan)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、利妥昔单抗、沙格司亭(sargramostim)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康(topetecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗、维甲酸(tretinoin)、尿嘧啶芥(uracil mustard)、伐柔比星(valrubicin)、长春瑞宾(vinorelbine)和唑来膦酸盐(zoledronate)。其它合适药剂是批准用于人类用途的那些药剂，包括将批准作为化学治疗剂或放射治疗剂并且所属领域中已知的那些药剂。这类药剂可由多个标准医师和肿瘤学家的参考文献(例如《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(goodman&gilman's the pharmacological basis of therapeutics)》,第九版,mcgraw-hill,n.y.,1995)中的任一种或由国家癌症研究所网站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)引用，两者都会不时更新。
[0355]
例如沙立度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)的免疫调节药物(imid)刺激nk细胞和t细胞两者。如本文所提供，imid可与ipsc衍生治疗性免疫细胞一起使用以供癌症治疗。
[0356]
除治疗性组合物中包括的ipsc衍生造血谱系细胞的分离群体以外，适合于向患者给予的组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂(例如，药学上可接受的培养基，例如细胞培养基)或其它药学上可接受的组分。药学上可接受的载剂和/或稀释剂部分地由所给予的特定组合物以及用于给予治疗组合物的特定方法决定。因此，本发明的治疗组合物存在多种合适的调配物(参见例如《雷明顿氏医药科学(remington's pharmaceutical sciences)》,第17版1985，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
[0357]
在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生t细胞。在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生nk细胞。在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生cd34 he细胞。在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生hsc。在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生mdsc。可以通过静脉内、腹膜内、经肠或气管给药方法分开给予或与其它合适的化合物组合给予包含如本文所公开的ipsc衍生造血谱系细胞的群体的治疗组合物，以实现所期望的治疗目标。
[0358]
这些药学上可接受的载剂和/或稀释剂可以足以使治疗组合物的ph维持在约3与约10之间的量存在。因此，基于总组合物的重量比(weight to weight)，缓冲剂可以高达约5％。治疗组合物中还可以包括电解质，例如(但不限于)氯化钠和氯化钾。在一个方面中，治疗组合物的ph在约4到约10的范围内。替代地，治疗组合物的ph在约5到约9、约6到约9或约
6.5到约8的范围内。在另一实施例中，治疗组合物包括ph在所述ph范围中的一种的缓冲液。在另一实施例中，治疗组合物的ph为约7。替代地，治疗组合物的ph在约6.8到约7.4的范围内。在再一实施例中，治疗组合物的ph为约7.4。
[0359]
本发明还部分地提供药学上可接受的细胞培养基在本发明的特定组合物和/或培养物中的用途。这类组合物适合于向人类受试者给予。一般来说，支持根据本发明的实施例的ipsc衍生免疫细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基适用作药学细胞培养基。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清和/或无饲养层的培养基。在各种实施例中，无血清培养基是无动物成分(animal-free)的，且可任选为无蛋白质的。任选地，所述培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。无动物成分培养基是指其中所述组分源自非动物来源的培养基。重组蛋白置换无动物成分培养基中的天然动物蛋白，且营养物是从合成、植物或微生物来源获得。相比之下，无蛋白质培养基定义为大体上不含蛋白质。所属领域的普通技术人员将了解，上述培养基实例为说明性的并且决不限制适用于本发明的培养基调配物，并且存在所属领域的技术人员已知且可使用的许多合适培养基。
[0360]
分离的多能干细胞衍生造血谱系细胞可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的t细胞、nk细胞、nkt细胞、prot细胞、pronk细胞、cd34 he细胞、hsc、b细胞、骨髓衍生抑制细胞(mdsc)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施例中，分离的多能干细胞衍生造血谱系细胞具有约95％到约100％的t细胞、nk细胞、prot细胞、pronk细胞、cd34 he细胞或骨髓衍生抑制细胞(mdsc)。在一些实施例中，本发明提供具有纯化的t细胞或nk细胞的治疗组合物，例如具有约95％的t细胞、nk细胞、prot细胞、pronk细胞、cd34 he细胞或骨髓衍生抑制细胞(mdsc)的分离群体的组合物，以治疗需要细胞疗法的受试者。
[0361]
在一个实施例中，组合细胞疗法包括治疗性蛋白质或肽和由包括表1中列出的基因型的基因组工程化ipsc衍生的nk细胞群体，其中衍生nk细胞包括mica/b-car。在另一个实施例中，组合细胞疗法包括cd38特异性治疗蛋白或肽和由包括在表1中列出的基因型的基因组工程化ipsc衍生的t细胞群体，其中衍生t细胞包括mica/b-car和cd38无效。在一些实施例中，组合细胞疗法包括达土木单抗、艾沙妥昔单抗或mor202和由包括表1中列出的基因型的基因组工程化ipsc衍生的nk或t细胞群体，其中衍生nk或t细胞包括mica/b-car、cd38 null和hncd16。在又一些其它实施例中，组合细胞疗法包括达土木单抗和由包括表1中列出的基因型的基因组工程化ipsc衍生的nk或t细胞群体，其中衍生nk或t细胞包括mica/b-car、cd38无效、hncd16以及靶向以下中的至少一者的第二car：cd19、bcma、cd20、cd22、cd38、cd123、her2、cd52、egfr、gd2、msln、vegf-r2、psma和pdl1。在仍一些另外的实施例中，组合细胞疗法包括达土木单抗、艾沙妥昔单抗或mor202和由包括表1中列出的基因型的基因组工程化ipsc衍生的nk或t细胞群体，其中衍生nk或t细胞包括mica/b-car、cd38无效、hncd16、car和一种或多种外源性细胞因子。在又另一个实施例中，组合细胞疗法包括治疗性蛋白质或肽和由包括表1中列出的基因型的基因组工程化ipsc的nk细胞群体，其中衍生nk细胞包括mica/b-car、cd38无效、hncd16、car、一种或多种外源性细胞因子和具有hla-g过表达或具有cd58敲除和cd54敲除中的至少一种的b2m-/-ciita-/-。
[0362]
如所属领域的普通技术人员将理解，基于本文中的方法和组合物的衍生自ipsc的自体和同种异体造血谱系细胞两者均可用于如上文所描述的细胞疗法中。对于自体移植，
衍生造血谱系细胞的分离群体相对于患者是完全或部分hla匹配的。在另一个实施例中，衍生造血谱系细胞与受试者不是hla匹配的，其中衍生造血谱系细胞是hla-i和hla-ii无效的nk细胞或t细胞。
[0363]
在一些实施例中，治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是每剂量至少0.1
×
105个细胞、至少1
×
105个细胞、至少5
×
105个细胞、至少1
×
106个细胞、至少5
×
106个细胞、至少1
×
107个细胞、至少5
×
107个细胞、至少1
×
108个细胞、至少5
×
108个细胞、至少1
×
109个细胞或至少5
×
109个细胞。在一些实施例中，治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是每剂量约0.1
×
105个细胞到约1
×
106个细胞；每剂量约0.5
×
106个细胞到约1
×
107个细胞；每剂量约0.5
×
107个细胞到约1
×
108个细胞；每剂量约0.5
×
108个细胞到约1
×
109个细胞；每剂量约1
×
109个细胞到约5
×
109个细胞；每剂量约0.5
×
109个细胞到约8
×
109个细胞；每剂量约3
×
109个细胞到约3
×
10
10
个细胞，或其间的任何范围。一般来说，对于60kg患者，1
×
108个细胞/剂量转化为1.67
×
106个细胞/千克。
[0364]
在一个实施例中，治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是部分或单一脐带血中的免疫细胞数目，或为至少0.1
×
105个细胞/千克体重、至少0.5
×
105个细胞/千克体重、至少1
×
105个细胞/千克体重、至少5
×
105个细胞/千克体重、至少10
×
105个细胞/千克体重、至少0.75
×
106个细胞/千克体重、至少1.25
×
106个细胞/千克体重、至少1.5
×
106个细胞/千克体重、至少1.75
×
106个细胞/千克体重、至少2
×
106个细胞/千克体重、至少2.5
×
106个细胞/千克体重、至少3
×
106个细胞/千克体重、至少4
×
106个细胞/千克体重、至少5
×
106个细胞/千克体重、至少10
×
106个细胞/千克体重、至少15
×
106个细胞/千克体重、至少20
×
106个细胞/千克体重、至少25
×
106个细胞/千克体重、至少30
×
106个细胞/千克体重、1
×
108个细胞/千克体重、5
×
108个细胞/千克体重或1
×
109个细胞/千克体重。
[0365]
在一个实施例中，向受试者递送一定剂量的衍生造血谱系细胞。在一个说明性实施例中，向受试者提供的细胞的有效量为至少2
×
106个细胞/千克、至少3
×
106个细胞/千克、至少4
×
106个细胞/千克、至少5
×
106个细胞/千克、至少6
×
106个细胞/千克、至少7
×
106个细胞/千克、至少8
×
106个细胞/千克、至少9
×
106个细胞/千克或至少10
×
106个细胞/千克或更多个细胞/千克，包含所有介于中间的细胞剂量。
[0366]
在另一个说明性实施例中，向受试者提供的细胞的有效量是约2
×
106个细胞/千克、约3
×
106个细胞/千克、约4
×
106个细胞/千克、约5
×
106个细胞/千克、约6
×
106个细胞/千克、约7
×
106个细胞/千克、约8
×
106个细胞/千克、约9
×
106个细胞/千克或约10
×
106个细胞/千克或更多个细胞/千克，包含所有介于中间的细胞剂量。
[0367]
在另一个说明性实施例中，向受试者提供的有效量的细胞为约2
×
106个细胞/千克到约10
×
106个细胞/千克、约3
×
106个细胞/千克到约10
×
106个细胞/千克、约4
×
106个细胞/千克到约10
×
106个细胞/千克、约5
×
106个细胞/千克到约10
×
106个细胞/千克、2
×
106个细胞/千克到约6
×
106个细胞/千克、2
×
106个细胞/千克到约7
×
106个细胞/千克、2
×
106个细胞/千克到约8
×
106个细胞/千克、3
×
106个细胞/千克到约6
×
106个细胞/千克、3
×
106个细胞/千克到约7
×
106个细胞/千克、3
×
106个细胞/千克到约8
×
106个细胞/千克、4
×
106个细胞/千克到约6
×
106个细胞/千克、4
×
106个细胞/千克到约7
×
106个细胞/千克、4
×
106个细胞/千克到约8
×
106个细胞/千克、5
×
106个细胞/千克到约6
×
106个细胞/千克、5
×
106个细胞/千克到约7
×
106个细胞/千克、5
×
106个细胞/千克到约8
×
106个细胞/千克或6
×
106个细胞/千克到约8
×
106个细胞/千克，包含所有中间的细胞剂量。
[0368]
在一些实施例中，衍生造血谱系细胞的治疗用途是单剂量治疗。在一些实施例中，衍生造血谱系细胞的治疗用途是多剂量治疗。在一些实施例中，多剂量治疗是每天、每3天、每7天、每10天、每15天、每20天、每25天、每30天、每35天、每40天、每45天或每50天或其间的任何天数一次剂量。
[0369]
包含本发明的衍生造血谱系细胞群的组合物可以是无菌的，且可以适合于和准备好向人类患者给予(即，可以在不进行任何进一步处理的情况下给予)。准备好给予的基于细胞的组合物意指所述组合物在移植或给予给受试者之前不需要任何进一步处理或操纵。在其它实施例中，本发明提供在与一种或多种药剂一起给予之前扩增和/或调节的衍生造血谱系细胞的分离群体。对于经基因工程改造以表达重组tcr或car的衍生造血谱系细胞，可使用如例如美国专利6,352,694中所描述的方法活化和扩增细胞。
[0370]
在某些实施例中，可以利用不同方案向衍生造血谱系细胞提供初级刺激信号和共刺激信号。举例来说，提供每种信号的试剂可以处于溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，所述试剂可与相同表面(即，“顺式”形式)或个别表面(即，“反式”形式)偶联。替代地，一种试剂可以与表面偶联并且另一种试剂处于溶液中。在一个实施例中，提供共刺激信号的试剂可以结合到细胞表面并且提供初级活化信号的试剂处于溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种试剂都可以在溶液中。在另一实施例中，试剂可呈可溶形式，并且然后交联到表面，例如表达fc受体的细胞或抗体或其它结合剂，其将结合于例如美国专利申请公开案第20040101519号和第20060034810号中所公开的试剂以用于人工抗原呈递细胞(aapc)，所述人工抗原呈递细胞预期在本发明的实施例中用于活化和扩增t淋巴细胞。
[0371]
视所治疗的受试者的病状而定，将必然会出现剂量、频率和方案的一些变化。负责给药的人员将在任何情况下确定个别受试者的适当剂量、频率和方案。
[0372]
实例
[0373]
以下实例是以说明性方式而不是以限制性方式提供。
[0374]
实例1-材料和方法
[0375]
为了在与不同安全港基因座整合策略组合的各种启动子的控制下有效选择和测试自杀系统，使用本技术人的一种专有hipsc平台，其能够实现单细胞传代和高通量的基于96孔板的流式细胞测量术分选，以允许衍生具有单一或多种基因调节的克隆hipsc。
[0376]
hipsc在小分子培养物中的维持：一旦培养的融合度达到75％-90％，hipsc就作为单一细胞常规地传代。对于单一细胞解离，hipsc用pbs(mediatech)洗涤一次且在37℃用阿库酶(accutase)(密理博(millipore))处理3到5分钟(min)，随后移液以确保单一细胞解离。然后将单一细胞悬浮液与常规培养基等体积混合，在225
×
g下离心4min，再悬浮于fmm中且接种于经基质胶涂布的表面上。传代数典型为1:6-1:8，在37℃下转移预先涂布有基质胶的组织培养板持续2-4小时且每2-3天用fmm饲养。将细胞培养物在设定为37℃和5％co2的含湿气培育箱中维持。
[0377]
用zfn、crispr进行人类ipsc工程改造以靶向编辑所关注模式：使用rosa26靶向插入作为一实例，对于zfn介导的基因组编辑，用2.5ug zfn-l(ftv893)、2.5ug zfn-r(ftv894)和5ug供体构建体的混合物转染两百万个ipsc，以进行aavs1靶向插入。对于crispr介导的基因组编辑，用5ug rosa26-grna/cas9(ftv922)和5ug供体构建体的混合物
转染两百万个ipsc，以进行rosa26靶向插入。使用neon转染系统(生命技术公司(life technologies))，使用参数1500v、10毫秒、3个脉冲进行转染。在转染后第2天或第3天，如果质粒含有人工启动子驱动gfp和/或rfp表达盒，那么使用流式细胞测量术测量转染效率。在转染后第4天，将嘌呤霉素以开始7天0.1ug/ml和随后7天0.2ug/ml的浓度添加到培养基中以选择靶向细胞。在嘌呤霉素选择期间，在第10天将细胞传代到新鲜基质胶涂布的孔上。在嘌呤霉素选择的第16天或更晚，通过流式细胞测量术分析存活细胞的gfp ips细胞百分比。
[0378]
基因组编辑的ipsc的批量分选和克隆分选：在嘌呤霉素选择20天后，对使用zfn或crispr-cas9进行基因组靶向编辑的ipsc进行gfp ssea4 tra181 ipsc的批量分选和克隆分选。将单一细胞解离的靶向ipsc池再悬浮于冷却的染色缓冲液中，所述缓冲液含有汉克氏平衡盐溶液(hanks'balanced salt solution)(mediatech)、4％胎牛血清(invitrogen)、1
×
青霉素/链霉素(mediatech)和10mm hepes(mediatech)；新鲜制备以达到最优效能。将所结合的一级抗体，包括ssea4-pe、tra181-alexa fluor-647(bd biosciences)添加到细胞溶液中，并且在冰上培育15分钟。所有抗体均以每百万细胞7μl/100μl染色缓冲液使用。将溶液在染色缓冲液中洗涤一次，在225g下旋转离心4分钟并且重悬于含有10μm噻唑维(thiazovivin)的染色缓冲液中并且在冰上维持以进行流式细胞术分选。在facs aria ii(bd biosciences)上进行流式细胞测量术分选。对于批量分选，将gfp ssea4 tra181 细胞门控且分选到填充有7ml fmm的15ml标准管中。对于克隆分选，使用100μm喷嘴，以每孔3个事件的浓度，将分选出的细胞直接喷射到96孔板中。每个孔预填充有200μl fmm，所述fmm补充有5μg/ml纤维结合蛋白和1x青霉素/链霉素(mediatech)且预先用5x基质胶涂布过夜。5x基质胶预涂布包括将一个基质胶等分试样添加到5ml dmem/f12中，然后在4℃下培育过夜以允许适当再悬浮并且最终以每孔50μl添加到96孔板中，随后在37℃下培育过夜。在将培养基添加到各孔之前立即抽吸5x基质胶。在完成分选后，在培育之前，将96孔板在225g下离心1-2min。将各板保持不受干扰七天。在第七天，从每个孔中去除150μl培养基并且用100μl fmm置换。在分选后第10天，向孔中再馈送另外100μl fmm。早在第2天就检测出群落形成且大部分群落在分选后第7天到第10天之间扩增。在第一次传代中，各孔用pbs洗涤且在37℃下用30μl阿库酶解离大约10分钟。需要延长阿库酶处理反映了已在培养物中闲置较长时间的群落的紧密性。在发现细胞解离之后，将200μl fmm添加到每个孔中且移液若干次以使群落破碎。将解离的菌落转移到预先涂布有5x基质胶的96孔板的另一孔，并且然后在培育之前在225g下离心2min。在扩增之前，进行这种1:1传代以扩展早期群落。后续传代常规地用阿库酶处理3-5min且在达到75-90％融合度后按1:4-1:8扩增到fmm中的预先涂布有1
×
基质胶的较大孔中。分析每种克隆细胞系的gfp荧光水平和tra1-81表达量。选择具有接近100％gfp 和tra1-81 的克隆系用于另外的pcr筛选和分析。在guava easycyte 8ht(密理博)上进行流式细胞测量术分析并且使用flowjo(flowjo,llc)进行分析。
[0379]
实例2
–
使用crispr/cas9介导的基因组编辑在ipsc中敲除cd58和/或cd54
[0380]
购买spyfi
tm
cas9和crispr-cas9 tracrrna(美国北达科他州的aldevron公司(aldevron,nd,usa))并且用于ipsc靶向编辑。为了使用cas9在ipsc中进行cd58和/或cd54的双等位基因敲除，用于gna(即，gd/rna或指导多核苷酸)设计的经过筛选和鉴定的靶向序列列于表3中：
[0381]
表3：用于crispr/cas9基因组编辑的对cd58和/或cd54基因座具有特异性的靶向序列：
[0382] 外显子靶向序列pamseq id no:cd58-gna-11gaccacgctgaggacccccaggg1cd58-gna-21tggttgctgggagcgacgcgggg2cd58-gna-31catggttgctgggagcgacgcgg3cd54-gna-11cccgagcaggaccaggagtgcgg4cd54-gna-21cgcactcctggtcctgctcgggg5cd54-gna-31ctgggaacagagccccgagcagg6
[0383]
包括使用所提供的指导多核苷酸的cd58或cd54敲除的细胞分别在图5a和5b中例示，其中左侧图示出了使用非特异性抗体的阴性对照。随后对基因组工程化ipsc进行表征，并且证实ipsc中cd58和cd54的单敲除或双敲除。
[0384]
除了mica/b-car插入或cd58和/或cd54敲除之外，还对诱导的多能干细胞进行连续地工程化以获得cd38敲除、高亲和力的不可切割的cd16表达、通过敲除b2m基因丢失hla-i、通过敲除ciita丢失hla-ii以及连接的il15/il15受体α构建体的表达中的一种或多种。在每个工程改造步骤之后，在下一个工程改造步骤之前对ipsc进行分选以获得所期望的表型。工程改造的ipsc然后可以维持在活体外或用于衍生细胞产生。图6示出了在ipsc衍生nk细胞中的hncd16表达、b2m敲除、hla-g表达和il15/il15rα表达。图7a-b示出了在ipsc衍生nk细胞中hncd16与cd38敲除的组合的引入。这些数据表明，在造血分化期间维持这些基因工程改造模式，而不会干扰细胞活体外定向发育为所期望的细胞命运。
[0385]
端粒缩短随着细胞老化而出现，并且与干细胞功能障碍和细胞衰老相关。本文显示出，成熟ink细胞维持相较于成体外周血nk细胞更长的端粒。在针对g
0/1
细胞的dna指数进行校正的情况下，使用1301t细胞白血病系作为对照(100％)，通过流式细胞测量术测定ipsc、成体外周血nk细胞和ipsc衍生nk细胞的端粒长度。如图8中所示，当与成人外周血nk细胞(p＝.105，anova)相比，ipsc衍生nk细胞维持显著更长的端粒长度，这表示ipsc衍生nk细胞中更大的增殖率、存活率和持久性潜能。
[0386]
实例3-cd58-/-和/或cd54-/-hla-i缺陷型ipsc和衍生细胞的验证
[0387]
为了确定经过修饰的hla i缺陷型ipsc是否具有增加的体内持久性，在畸胎瘤测定中将荧光化b2m-/-ipsc和b2m-/-cd58-/-,b2m-/-cd54-/-或b2m-/-cd58-/-cd54-/-ipsc皮下注射到完全免疫活性c57bl/6受体的相对胁腹上。每天通过ivis成像结合荧光素注射以使正在发育的畸胎瘤可视化来分析小鼠。在注射后72-144小时，与b2m-/-ipsc相比，敲除cd58和cd54中的一者或两者的b2m-/-ipsc显示出增加的定量持久性。还通过比较b2m-/-cd58-/-cd54-/-ipsc与b2m-/-cd58-/-or b2m-/-cd54-/-ipsc之间的持久性改善来进行观察。
[0388]
为了确定在野生型受体小鼠中宿主免疫应答的何种组分参与增强的经过修饰的hla i缺陷型ipsc的排斥，通过注射抗cd4、抗cd8a和抗nk1.1抗体分别单独地耗尽cd4 t细胞、cd8 t细胞和nk细胞。在抗体注射后三天，观察到不存在cd4 t细胞、cd8 t细胞和nk细胞。在抗体介导的耗尽后三天，将荧光化b2m-/-、b2m-/-cd58-/-、b2m-/-cd54-/-或b2m-/-cd58-/-cd54-/-ipsc皮下注射到免疫活性c57bl/6小鼠的胁腹上以形成畸胎瘤。每天通过ivis成像结合荧光素注射以使正在发育的畸胎瘤可视化来分析小鼠。在ipsc注射后120小时，与经过
igg对照处理的动物相比，确定对肿瘤排斥的最高抗性。
[0389]
实例4
–
表达mica/b-car的衍生免疫细胞的功能特征
[0390]
为了测试包括源自所选择的mica/b抗体的scfv的mica/b-car对细胞表面mica/b的稳定，使用含有表达所述mica/b-car的ipsc衍生nk细胞(mica/b-car ink)和表达mica/b的肿瘤细胞系细胞(靶细胞)的共培养系统。还使用此共培养系统测试mica/b-car ink激活和功能的随后增强。使用elisa，针对释放到培养物上清液中的可溶性mica/b的水平检查mica/b阳性肿瘤与mica/b-car ink的共培养。与和未经修饰的nk细胞共培养相比，当靶细胞与mica/b-car ink共培养时，释放到培养物上清液中的可溶性mica/b的减少支持了肿瘤细胞表面mica/b稳定化的发现。这项测试的阳性对照使用靶细胞与mab7c6的共培养。
[0391]
在相同的共培养条件下，mica/b-car ink细胞激活是通过细胞因子ifnγ和tnfα的产生、通过评估表面cd107a脱粒以及使用基于胱天蛋白酶的流动测定直接杀伤靶细胞系来检查的。与mica/b阴性靶标共培养时未观察到的活性差异相比，响应于mica/b阳性靶标细胞，细胞因子和脱粒水平的增加以及mica/b-car ink细胞相对于未经修饰的nk细胞的直接杀伤的增加证明了mica/b-car ink细胞在存在mica/b细胞表面抗原的情况下的激活。
[0392]
为了检查mica/b-car表达是否增加靶细胞系上的mica/b的表面密度，mica/b-car在不能杀伤靶细胞的非nk细胞系中表达，并且将所得细胞与mica/b阳性靶标共培养。在共温育之后，通过流式细胞术评估靶细胞上的mica/b水平。与和未经修饰的nk细胞共培养相比，与表达mica/b-car的非nk细胞共培养后，靶细胞上的mica/b水平的增加证明了所提供的mica/b-car对靶细胞系上的mica/b的表面密度具有积极影响。
[0393]
通过对源自mica/b阳性靶细胞与mica/b-car ink细胞的体外共培养或源自来自体内实验、球状体、类器官或3d共培养实验的组织样品的样品nk细胞进行单细胞rna测序来测试与响应于增加的表面mica/b水平的nk细胞活性相关的增加的基因表达水平。在源自所述共培养或组织的样品中，穿孔素、颗粒酶a和b的上调以及如cd62l等不成熟标志物的下调证明了与细胞的mica/b-car表达相关的nk细胞活性增加。
[0394]
使用表达人mica的小鼠黑色素瘤细胞作为肿瘤细胞靶标或使用表达内源性mica/b的人细胞系评估mica/b-car的体内功能。对于体内评估，将小鼠或人t细胞用mica/b-car进行转导，并且除了mica/b-car ipsc衍生nk细胞(mica/b-car ink)之外，还用作效应子。
[0395]
在小鼠黑色素瘤模型中评估mica/b-car的功效。将小鼠黑色素瘤细胞系b16f10用人mica(b16f10-mica)进行转导，并且将这些细胞静脉内(iv)或皮下(sc)移植到免疫活性c57bl/6或免疫功能不全的nsg小鼠中。静脉内注射b16f10-mica肿瘤细胞在c57bl/6中产生肺转移并且在nsg小鼠中产生肺和肝转移，并且皮下移植在两种小鼠品系中产生单一实体瘤。在c57bl/6小鼠中，在b16f10-mica细胞的iv移植后对肺肿瘤结节(转移)进行计数。肿瘤移植后进行mica/b-car-t细胞的过继转移以评估这些细胞减少在这些动物中发展的肿瘤结节数量的能力。肿瘤结节是通过总体形态学和组织切片的显微镜检查来进行进一步评估。在皮下b16-f10-mica模型中，肿瘤进展通过肿瘤大小的卡尺测量来监测。与用模拟经过转导的t细胞处理的小鼠相比，肺中的肿瘤结节数量和/或大小减少反映了使用小鼠mica/b-car-t细胞对iv移植有b16f10-mica细胞的c57bl/6小鼠进行处理的有效性减少了存在的肿瘤结节的数量。类似地，在b16-f10-mica肿瘤生长的sc模型中，延迟肿瘤进展、延长存活、诱导肿瘤消退或以上的组合也指示mica/b-car-t细胞治疗的有效性。
[0396]
在nsg小鼠中，对肺和肝肿瘤结节两者进行计数，并且将用模拟经过转导的t细胞处理的小鼠与经过mica/b-car转导的t细胞进行比较，以便了解其减少每个器官中的结节数量的能力。评估小鼠和人mica/b-car t细胞两者在nsg小鼠中控制肿瘤生长的能力。iv移植有来自人或小鼠来源的mica/b car-t细胞的nsg小鼠的肺和肝中的肿瘤结节的数量和大小的减少反映了治疗的有效性，并且与小鼠的延长的存活相关。预期在用mica/b-car ink细胞处理b16-f10-携带mica肿瘤的nsg小鼠中也有类似结果。
[0397]
还评估了mica/b-car针对人肿瘤细胞系的功能。将表达mica和/或micb的人细胞系(包含a2058、u266和a375)移植到免疫功能不全的nsg小鼠中。使用人mica/b-car-t细胞或mica/b-ink细胞，在携带任何这些肿瘤类型的nsg小鼠的治疗中评估延迟的肿瘤进展、诱导的肿瘤消退和延长的存活。
[0398]
使用抗cd3/cd28微珠粒体外活化成人cd3 t细胞，并且用含有具有选择标志物的构建体的mica/b car进行转导。将来自同一供体的t细胞用作非转导对照。图9a示出了t细胞上的mica/b表达。mica/b car ink细胞是通过转导cd38阴性并且表达hncd16和il15r/f蛋白的先前工程化的主克隆ink细胞系(car阴性ink细胞)而产生的。图9b示出了在含有ink细胞的多肿瘤模式上的mica/b car的表达。
[0399]
将含有cd19对照car或mica/b car(版本1-h/l短间隔子或版本2-l/h长间隔子)的1
×
105个t细胞与mica阴性的p815鼠类肥大细胞瘤野生型和过表达mica的p815细胞(工程化高人mica表达子)、a2058人黑色素瘤细胞(中等mica内源性表达子)和k562人慢性骨髓性白血病细胞(中等/低mica内源性表达子)在存在golgistop
tm
的情况下在37℃下以相等的比率进行温育。4小时刺激后，将细胞染色用于胞内ifnγ和tnfα。如图10a所示，mica/b car t细胞表现出抗原特异性细胞因子产生。在单独的实验中，在存在抗cd107a的情况下，用相等数量的野生型、cd19敲除(cd19ko)和过表达mica(mica )nalm6人白血病细胞刺激三种car t细胞系4小时，并且结果表明mica nalm6细胞表现出由cd107a表达标记的mica/b car特异性脱粒(图10b)。为了测量抗原特异性细胞毒性，将mica/b car 效应t细胞系细胞以不同的效应子与靶标比率(e:t比率)与用荧光染料标记的野生型和mica 靶标nalm6细胞在37℃下温育4小时。在图10c中，将mica/b car特异性细胞毒性测量为胱天蛋白酶3/7 靶细胞的％相对于基线(仅靶标)胱天蛋白酶3/7 量的％，并且约1.9的ec50证明了有效的抗原特异性杀伤mica nalm6细胞。
[0400]
还发现，mica/b car的胞外结构域中的重链和轻链取向与体内功效的差异相关。例如，h/l取向的胞外结构域表现出相对于其l/h等效物优异的体内功效(图15a)。此外，令人惊讶地，car的mica/b结合结构域与跨膜结构域之间的约25-60bp的较短间隔子比约200-300bp的较长间隔子在体内作用更好。使用具有短间隔子的car 1h/l和car 5h/l长间隔子进行体内nalm6 mica 肿瘤清除测试。如前所述，第0天，将nsg小鼠用1e5 nalm6 mica 细胞加载，并且在肿瘤后第3天，i.v.施用2e6效应子。每周进行bli测量，并且在三个独立的t细胞供体中重复测试，并且如图15b所示，两种car都是有效的，然而，在整个供体的体内肿瘤对照中，具有短间隔子的car 1h/l被证明优于具有长间隔子的car 5h/l。
[0401]
对于mica/b car ink功能特征，将1
×
105个car阴性对照和含有mica/b car 的ink细胞与p815鼠类肥大细胞瘤野生型和过表达mica的p815细胞(工程化高人mica表达子)、caski人宫颈表皮样癌细胞(高mica内源性表达子)和a2058人黑色素瘤细胞(中等mica
内源性表达子)以2:1效应子/靶标比率在存在golgistop
tm
的情况下在37℃下进行温育。4小时刺激后，将细胞染色用于胞内ifnγ和tnf表达，以显示mica/b car抗原特异性细胞因子产生(图11a)。在单独的实验中，在存在抗cd107a的情况下，使用在图11a中利用的相同的靶肿瘤细胞系以2:1效应子/靶标比率刺激两种ink细胞系4小时，以显示mica/b car触发的抗原特异性脱粒(图11b)。为了测量抗原特异性细胞毒性，将用荧光染料标记的p815 mica 细胞以不同的效应子与靶标比率(e:t比率)与car阴性或mica/b car ink细胞系在37℃下温育4小时。如图11c所示，将mica/b car抗原特异性细胞毒性测量为胱天蛋白酶3/7 靶细胞的％相对于基线(仅靶标)胱天蛋白酶3/7 量的％，其中mica/b car ink细胞具有约5.2的低得多的ec50。
[0402]
在另外的实验中，将car阴性ink对照和含有mica/b car 的ink细胞以5:1效应子/靶标比率与786-0肾细胞腺癌细胞或u-2os骨肉瘤细胞温育3天。在添加ink效应细胞之前24小时，将靶肿瘤细胞以2
×
103个细胞/孔铺板。将car阴性ink对照和含mica/b car 的ink细胞以10:1的效应子/靶标比率与caski宫颈癌细胞或a2058黑色素瘤细胞温育3天。如图12a和12b所示，将数据绘制为相对于仅用肿瘤细胞作为对照的孔归一化的每时间点剩余的靶细胞的频率，并且mica/b car ink细胞显示对宽范围的抗性mica/b 肿瘤细胞系的细胞毒性增强(1：786-o；2：u-2os；3：caski；4：a2058)。
[0403]
为了验证mica/b car t和ink细胞的体内功能，将经工程化以表达荧光素酶和表面可检测的人mica蛋白的1
×
105个nalm6白血病b细胞静脉内(i.v.)注射到nsg小鼠中。48小时后，除了未接受mica/b car t细胞的nalm5 mica 肿瘤单独组(仅肿瘤)之外，静脉内施用用抗cd19(阳性对照)或抗mica/b car转导的2
×
106个原代人cd3 t细胞。跟踪小鼠的临床疾病迹象并且在28天内的指定时间点评估生物发光通量(肿瘤负荷)，并且如图13所示，mica/b car t细胞减轻体内肿瘤负荷。
[0404]
在单独的研究中，将b16/f10黑色素瘤细胞工程化以表达表面可检测的人mica蛋白并且以每只nsg小鼠2.5
×
104个细胞的剂量进行i.v.注射。在肿瘤植入后第3天，将经工程化以表达抗mica/b car的2
×
106个合并的原代t细胞或1
×
107个ink细胞i.v.注射到含有野生型b16/f10(mica-)或b16/f10 mica阳性(mica )转移性肿瘤的小鼠中。在14天后，使用低放大率显微镜对肺b16/f10转移性(met)肿瘤的数量进行计算，并且如图14中所见，含有mica/b car的t细胞和ink细胞两者均减少了体内肿瘤负荷。
[0405]
所属领域的技术人员将容易地了解，本文所描述的方法、组合物和产物代表示例性实施例，且不意欲为对本发明的范围的限制。所属领域的技术人员显而易见的是，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对本文所公开的本公开进行各种取代和修改。
[0406]
本说明书中提及的所有专利和公开案均指示本公开涉及的所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开案均以引用的方式并入本文中，其程度如同每一个别公开案专门地且单独地指示为以引用的方式并入。
[0407]
本文说明性描述的本公开可以在不存在本文未专门公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，举例来说，在本文中的每一种情况下，任一个术语“包含”、“基本上由
……
组成”和“由
……
组成”可以用其它两个术语中的任一个置换。已采用的术语和表述是作为描述而非限制的术语使用，且使用这类术语和表述时，不希望排除所示和所描述的特征的任何等效物或其部分，但应认识到，在所要求的本公开的范围
内可以存在各种修改。因此，应理解，虽然已通过优选实施例和任选的特征具体地公开了本公开，但所属领域的技术人员可以对本文中所公开的概念进行修饰和变化，且这类修饰和变化被视为属于如所附权利要求书限定的本发明范围内。
再多了解一些
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