一株唾液乳杆菌S32及其应用

一株唾液乳杆菌s32及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株唾液乳杆菌s32及其应用。


背景技术：

2.抗生素作为生长促进剂曾被广泛应用于畜禽养殖。然而，抗生素的反复使用及滥用会导致耐药性细菌的产生。在此背景下，抗生素耐药性已成为一个公共的安全问题，积极寻找能够有效降低甚至替代抗生素的技术手段和产品成为了各大企业和机构研究的热点。益生菌是一类能够促进宿主肠道内微生物菌群生态平衡的有益的活性微生物，不存在耐药性或残留问题。乳酸菌作为众多益生菌产品中最常见的种属之一，它能够利用碳水化合物发酵产生乳酸，在动物机体健康和生理功能方面发挥重要作用。
3.动物源乳酸菌具有良好的胃肠道耐受性、定殖率高、饲喂后机体的肠道菌群稳定等特点，且添加到动物饲料中可预防并缓解动物病症，进而达到降低饲养成本并提高收益的目的。因此，为满足我国畜牧养殖业需求，促进畜禽健康生长，开发具有益生菌特性的菌株具有重要意义。


技术实现要素：

4.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一株唾液乳杆菌s32及其应用，用于解决现有技术中的问题。
5.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种唾液乳杆菌s32(lactobacillus salivarius s32)，保藏编号为cctcc no：m 2021658。
6.优选的，所述唾液乳杆菌s32最低耐受ph为3.0。
7.优选的，所述唾液乳杆菌s32的胆盐耐受度为1.5g/l。
8.本发明还提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中包括所述唾液乳杆菌s32。
9.本发明还提供所述唾液乳杆菌s32或所述微生物菌剂在制备或筛选预防、治疗肠道致病菌感染的产品中的用途。
10.本发明还提供一种用于预防、治疗肠道致病菌感染的产品，所述产品包括所述唾液乳杆菌s32或所述微生物菌剂。
11.所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品选自食品、保健品、药物或饲料。
12.优选的，所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品为动物用产品。
13.优选的，所述动物用产品为畜禽用产品。
14.如上所述，本发明的唾液乳杆菌s32，具有以下有益效果：
15.1)具有较强的耐酸耐胆盐能力，能分别在ph 3的培养液和含1.5g/l脱氧胆酸钠的培养液中生长。
16.2)对沙门菌，尤其是德尔卑沙门菌14t有明显的抑制作用，可有效抵抗德尔卑沙门菌14t的感染，对动物体具有有效的保护作用，可用于动物益生菌饲料添加剂的开发。
17.3)具有较高的自凝集能力，且对德尔卑沙门菌14t具有较高的共凝集能力。
18.4)可有效抑制德尔卑沙门菌14t的对mc38细胞的黏附。
附图说明
19.图1显示为本发明的唾液乳杆菌s32菌株菌落形态图(左)及镜检图(右)。
20.图2显示为本发明的唾液乳杆菌s32菌株16s rdna系统进化树。
具体实施方式
21.本发明首先提供一种唾液乳杆菌，所述唾液乳杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，分类命名为唾液乳杆菌s32 lactobacillus salivarius s32，保藏编号为cctcc no：m 2021658，保藏时间为2021年6月2日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
22.所述唾液乳杆菌s32在mrs平板上的菌落为半球形，表面光滑湿润，呈乳白色，直径约为1-2mm。所述唾液乳杆菌s32的16s rdna序列如seq id no.1所示。
23.进一步的，所述唾液乳杆菌s32最低耐受ph为3.0。
24.所述最低耐受ph是指在ph3.0的培养基中培养唾液乳杆菌s32 4小时，唾液乳杆菌s32的存活率达到95％以上。所述存活率是指37℃条件下在mrs培养基中培养4小时后的活菌数与接种的活菌数的百分比。
25.进一步的，所述唾液乳杆菌s32的胆盐耐受度为1.5g/l。
26.所述胆盐可以是钠盐或钾盐。在一种实施方式中，所述胆盐耐受度是指在含1.5g/l脱氧胆酸钠的培养基中培养唾液乳杆菌s32 4小时，唾液乳杆菌s32的存活率达到84％以上；或，培养2小时，唾液乳杆菌s32的存活率达到94％以上。所述存活率是指37℃条件下在mrs培养基(ph6.2)中培养相应时间后的活菌数与接种的活菌数的百分比。
27.本发明中，以培养基的总体积为基准，所述mrs培养基的配方为：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，吐温-80 1ml/l，磷酸氢二钾2g/l，三水乙酸钠5g/l，柠檬酸三铵2g/l，七水硫酸镁0.58g/l，一水硫酸锰0.05g/l。
28.所述唾液乳杆菌s32的自凝集能力为58％以上。所述自凝集能力通过以下方法测得：
29.1)在mrs培养基中接种唾液乳杆菌s32，于37℃培养24h，洗涤培养后的菌液；
30.2)将核酸蛋白测定仪的od600值调零；调整洗涤后的菌液的浓度，使其od600值为0.8，记为a0＝0.8；
31.3)取4ml洗涤后的菌液，充分混匀，室温孵育5h；
32.4)检测步骤4)孵育后的菌悬液的od600值，记为a
t
，通过下述公式计算自凝集能力，自凝集(％)＝1-a
t
/a0×
100％。
33.所述唾液乳杆菌s32的共凝集能力为13％以上。所述共凝集能力通过以下方法测得：
34.1)将德尔卑沙门菌14t在lb液体培养基中37℃培养12h，培养结束后离心弃上清液，洗涤；
35.2)将核酸蛋白测定仪的od600值调零，调整洗涤后的菌液的浓度，使其od600值为0.8，记为a0＝0.8；
36.3)将相同活菌数的唾液乳杆菌s32和德尔卑沙门菌14t等体积混合，在室温下静置
孵育5h。同时，在相同生长条件下培养分别含4ml唾液乳杆菌s32或德尔卑沙门菌14t的单菌悬液作为两个对照组；
37.4)检测步骤3)各组的od600值，并利用下述公式计算共凝集能力：
38.共凝集(％)＝[(ax ay)/2-a(x y)]/(ax ay)
×
100％；其中，ax和ay分别代表唾液乳杆菌s32、德尔卑沙门菌14t单菌悬液的吸光度，a(x y)代表两种细菌的混合悬液的吸光度。
[0039]
本发明还提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中包括所述唾液乳杆菌s32。
[0040]
所述微生物菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂。
[0041]
所述液体菌剂中唾液乳杆菌s32的含量例如为1
×
107cfu/ml以上、1
×
108cfu/ml或1
×
109cfu/ml以上。
[0042]
所述固体菌剂中唾液乳杆菌s32的含量例如为1
×
107cfu/g以上、1
×
108cfu/g或1
×
109cfu/ml以上。
[0043]
本发明还提供所述唾液乳杆菌s32或所述微生物菌剂在制备或筛选预防、治疗肠道致病菌感染的产品中的用途。
[0044]
在一种实施方式中，所述肠道致病菌选自大肠菌群、沙门菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌或李斯特菌。
[0045]
在一种实施方式中，所述沙门菌为德尔卑沙门菌14t。所述唾液乳杆菌s32可有效抵抗德尔卑沙门菌14t的感染，对动物体有效的进行保护。同时，所述唾液乳杆菌s32可抑制沙门菌黏附肠上皮细胞，防止沙门菌定殖肠道并进一步引发感染。
[0046]
所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品选自食品、保健品、药物或饲料。
[0047]
在一种实施方式中，所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品为预防、治疗腹泻的产品或广谱抗菌剂。
[0048]
在一种实施方式中，所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品为动物用产品。
[0049]
在一种实施方式中，所述动物用产品为畜禽用产品。所述畜禽选自猪、鸡、鸭、鹅、牛、羊、马、驴、骆驼、兔、貉、蜂等。
[0050]
所述唾液乳杆菌s32或所述微生物菌剂作为益生菌添加剂添加至所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品中。
[0051]
所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品中唾液乳杆菌s32的活菌数例如为1
×
107cfu/g以上、1
×
108cfu/g以上或1
×
109cfu/g以上。
[0052]
所述唾液乳杆菌s32可通过自凝集形成阻碍致病菌在肠道定殖和感染的屏障，从而可达到预防致病菌感染的目的。
[0053]
根据本领域常识以及本技术的发明人实验，本技术的唾液乳杆菌s32可用于制备或筛选广谱抗菌剂中。所述广谱抗菌剂不仅包括前述的大肠菌群、沙门菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌或李斯特菌，还可以包括产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。
[0054]
本发明还提供一种用于预防、治疗肠道致病菌感染的产品，所述产品包括所述唾液乳杆菌s32或所述微生物菌剂。
[0055]
所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品选自食品、保健品、药物或饲料。
[0056]
在一种实施方式中，所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品为预防、治疗腹泻的产
品或广谱抗菌剂。
[0057]
在一种实施方式中，所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品为动物用产品。
[0058]
在一种实施方式中，所述动物用产品为畜禽用产品。所述畜禽选自猪、鸡、鸭、鹅、牛、羊、马、驴、骆驼、兔、貉、蜂等。
[0059]
所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品中唾液乳杆菌s32的活菌数例如为1
×
107cfu/g以上、1
×
108cfu/g或1
×
109cfu/g以上。
[0060]
所述预防、治疗肠道致病菌感染的产品还包括辅料。
[0061]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0062]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0063]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0064]
实施例1：唾液乳杆菌的分离筛选与鉴定
[0065]
1、唾液乳杆菌s32的分离筛选
[0066]
以野生狗獾粪便为样品，将样品按1：10与mrs肉汤混合，37℃培养24h，稀释涂布，37℃培养24h，挑选特征明显的菌落反复划线分离，纯化至分离出形态、大小一致的菌落。
[0067]
mrs肉汤为培养乳杆菌的通用培养基，以培养基的总体积为基准，其配方为：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，吐温-80 1ml/l，磷酸氢二钾2g/l，三水乙酸钠5g/l，柠檬酸三铵2g/l，七水硫酸镁0.58g/l，一水硫酸锰0.05g/l，ph 6.2。本发明中所使用的mrs培养基可以为液体，即mrs肉汤，也可以为固体培养基。
[0068]
菌株s32在mrs平板上的菌落为半球形，表面光滑湿润，呈乳白色，直径约为1-2mm。
[0069]
2、s32菌株的16s rdna序列鉴定
[0070]
以所述菌株s32的dna为模板，利用16s rdna通用引物进行扩增，并对扩增产物进行序列鉴定；blast比对后显示该菌株序列与genbank基因库中lactobacillus salivarius的16s rdna序列同源性最高，同源率为99.18％。通过mega-x构建菌株s32的系统进化树，如图2结果显示，菌株s32与lactobacillus salivarius同源性最高，判定该菌株s32为唾液乳杆菌。
[0071]
所述唾液乳杆菌s32保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2021658s32，保藏时间为2021年6月2日，保藏地址为中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学。
[0072]
实施例2：唾液乳杆菌s32对酸、胆盐的耐受性测定
[0073]
1、唾液乳杆菌s32酸耐受性测定
[0074]
将唾液乳杆菌s32以5％的接种量分别接种于5ml ph 3.0的mrs肉汤，用移液器吹打混匀后在37℃条件下恒温培养4h。培养前(0h)和培养后(2、4h)分别取1ml细菌悬液进行梯度稀释，稀释至适宜梯度后取0.1ml稀释液涂布于mrs琼脂平板上，琼脂平板在37℃培养24h后计数，每个样品取三个重复。菌株的存活率以培养后活菌数与接种的活菌数的百分比表示。
[0075]
表1唾液乳杆菌s32对酸耐受结果
[0076][0077]
由表1可知，唾液乳杆菌s32在ph 3.0的条件下，2h与4h后菌株存活率约为96％，说明其具有良好的酸耐受性。
[0078]
2、唾液乳杆菌s32胆盐耐受性测定
[0079]
将唾液乳杆菌s32以5％的接种量接种于含1.5g/l脱氧胆酸钠的mrs肉汤，用移液器吹打混匀后在37℃条件下恒温培养4h。培养前(0h)和培养后(2、4h)分别取1ml细菌悬液进行梯度稀释，稀释至适宜梯度后取0.1ml稀释液涂布于mrs琼脂平板上，琼脂平板分别在37℃培养24h后计数，每个样品取三个重复。菌株的耐受性以培养后活菌数与接种的活菌数的百分比表示。
[0080]
表2唾液乳杆菌s32对胆盐耐受结果
[0081][0082]
由表2可知，唾液乳杆菌s32在0.15％(w/v)胆盐条件下2h、4h存活率为94.26％、84.12％，说明其具有良好的胆盐耐受性。
[0083]
实施例3：唾液乳杆菌s32体外抑菌实验
[0084]
体外抑菌试验采用琼脂斑点扩散法进行测定。首先在装有1.5ml mrs肉汤的2ml指形管中接种菌株s32，于37℃恒温培养箱中培养24h。震荡混匀后吸取2μl菌液滴入mrs固体培养基中，并于37℃恒温培养箱中培养24h。用无菌接种环挑取德尔卑沙门菌14t的单一菌落，分别接种至5ml lb液体培养基中，于37℃恒温摇床中培养12h。将培养后的菌液使用pbs洗涤，并使用pbs将od600值调零，将德尔卑沙门菌14t调至108cfu/ml。随后按1:100的比例加入lb半固体培养基中，混匀，倒入已滴过待测菌液的mrs固体培养基中，使其铺面均匀，待其冷却凝固，置于37℃恒温培养箱中，于12h后观察并测定抑菌圈的大小。
[0085]
表3唾液乳杆菌s32对德尔卑沙门菌14t的抑菌结果
[0086][0087]
如表3所示，唾液乳杆菌s32对德尔卑沙门菌14t具有较高的抑菌能力，与德尔卑沙门菌14t的抑菌直径为18
±
0.41mm，以上结果表明菌株s32对德尔卑沙门菌14t具有良好的抑制效果。
[0088]
实施例4：唾液乳杆菌s32自凝集及共凝集实验
[0089]
1、唾液乳杆菌s32自凝集实验
[0090]
首先在装有10ml mrs肉汤的15ml离心管中接种菌株s32，于37℃恒温培养箱中培养24h。将培养后的菌液使用pbs洗涤，调整洗涤后的菌液的浓度，使其用核酸蛋白测定仪检测时od600值为0.800，记为a0＝0.800，检测时使用pbs将od600值调零。取4ml调节浓度后的菌悬液充分混匀，室温孵育5h。以pbs缓冲液的od600值作为对照，吸取室温孵育5h后的1ml菌悬液，将其od600值记为a
t
。实验重复三次并计算，自凝集(％)＝1-a
t
/a0×
100％(注：孵育5h后取菌悬液时应取表面菌液，禁止吹打，保持菌液静止。)
[0091]
表4唾液乳杆菌s32自凝集能力测定结果
[0092][0093]
唾液乳杆菌s32可通过自凝集形成阻碍致病菌在肠道定殖和感染的屏障，由表4可知，唾液乳杆菌s32具有较高的自凝集能力。
[0094]
2、唾液乳杆菌s32共凝集实验
[0095]
将德尔卑沙门菌14t在lb液体培养基中37℃培养12h。以3000g离心10min，弃上清液。将培养后的菌液使用pbs洗涤，调整洗涤后的菌液的浓度，使其用核酸蛋白测定仪检测时od600值为0.800，记为a0＝0.8，检测时使用pbs将od600值调零。将相同活菌数的唾液乳杆菌s32和德尔卑沙门菌14t等体积(各2ml)混合，在室温下静置孵育5h。在相同生长条件下培养含4ml单菌悬液的对照组，在600nm下测定od值。实验重复三次并计算：共凝集(％)＝[(ax ay)/2-a(x y)]/(ax ay)
×
100％；(ax和ay代表两个细菌悬液的吸光度，a(x y)意味着混合细菌悬液的吸光度。)
[0096]
表5唾液乳杆菌s32共凝集能力测定结果
[0097][0098]
细菌的共凝集可通过防止病原体附着在宿主组织上来消除胃肠道病原菌的定殖。由表5可知，唾液乳杆菌s32对德尔卑沙门菌14t的共凝集能力较高，为15.76
±
2.33％。
[0099]
实施例5：唾液乳杆菌s32抗黏附实验(mc38)
[0100]
将培养好的mc 38细胞弃去培养液，用1mm edta浓度为0.25％的胰酶消化细胞瓶
中的mc 38细胞，37℃、30s，加入无抗生素的含南美胎牛血清的dmem，细胞计数后，转移至24孔细胞板(每孔4*105个细胞)于含有5％co2的37℃培养箱中培养18-24h后可形成80％-90％的单层细胞。对细胞进行计数后弃去培养液，先取适量乳杆菌黏附细胞1h，再取适量德尔卑沙门菌14t离心后弃去上清(moi为20)，用dmem重新悬起后，加入到细胞孔中，1000rpm离心10min，随后置于37℃含5％co2的细胞培养箱中培养1h。弃去培养液，用无菌pbs洗涤三次，使用0.1％trixon x-100裂解细胞，取裂解液用pbs进行10倍梯度稀释后，取10-3
和10-4
稀释度的稀释液100μl于预先配置好的无菌lb固体培养基上涂布均匀，置于37℃恒温培养箱中培养12-16h，记录菌落数。乳杆菌对德尔卑沙门菌黏附的抑制率＝(未加乳杆菌孔的黏附于细胞的德尔卑沙门菌菌落数-提前加乳杆菌孔中黏附于细胞的德尔卑沙门菌菌落数)
×
100％/对照组黏附于细胞的德尔卑沙门菌菌落数。
[0101]
表6唾液乳杆菌s32对德尔卑沙门菌14t黏附mc 38细胞抑制能力
[0102][0103]
成功黏附肠上皮细胞是沙门菌定殖肠道并进一步引发感染的关键步骤，因此，控制沙门菌黏附肠上皮细胞的数目对防控其感染具有重要意义。如表6所示，唾液乳杆菌s32抗黏附能力较高，对德尔卑沙门菌14t的黏附能力抑制率能达到33.53
±
3.86％。
[0104]
实施例6：唾液乳杆菌s32药敏试验(k-b法)
[0105]
选择药敏纸片琼脂扩散法(k-b法)进行药敏试验。在无菌环境下，吸取0.1ml浓度为1
×
108cfu/ml唾液乳杆菌菌悬液涂布于mrs琼脂表面，质控菌株atcc25922、atcc25923涂布于mh琼脂表面，后将药敏纸片贴于琼脂表面，每培养皿贴4张药敏纸片，于厌氧环境下培养24h后测量抑菌圈的直径并做好记录，所得结果由表7进行判断。
[0106]
表7唾液乳杆菌s32对4类抗生素敏感性测定
[0107][0108][0109]
由表7可知，唾液乳杆菌s32对糖肽类的万古霉素耐药，与报道一致。同时唾液乳杆
菌s32对β-内酰胺类的氨苄西林、阿莫西林、头孢噻肟敏感，且对四环素，氯霉素敏感。
[0110]
综上，本发明提供的唾液乳杆菌s32耐酸耐胆盐性能好，抑菌能力强，抗黏附能力强，可应用于抑制沙门菌，也可用于动物益生菌饲料添加剂的开发。
[0111]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。