一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法与流程

1.本发明属于化合物生物合成技术领域，具体涉及一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法。


背景技术：

2.麦角硫因和它的前体组氨酸三甲基内盐(hercynine)在真菌、黏菌和放线菌中可以生物合成。然而,酵母作为一种真菌和所有类酵母物子囊菌(ascomycetes)、原酵母(少数除外)一样都不能合成麦角硫因和它的前体。
3.解脂耶氏酵母是一种产油酵母，能够积累大量的储存脂质。在一些野生型菌株中，脂质含量可以达到干重的20-40％，而在工程菌株中，脂质含量可以超过90％。脂质生产需要胞质乙酰辅酶a、丙二酰辅酶a和nadph。由于这些前体也需要类异戊二烯，聚酮化合物，以及其它代谢物，解脂耶氏酵母也是用于生产这样的代谢物的一个发酵菌种，我们将可以产生麦角硫因的粗糙脉孢菌的生物合成酶egt1基因和来自麦角菌的egt2基因表达在解脂耶氏酵母上，利用解脂耶氏酵母发酵、合成获得麦角硫因。解脂耶氏酵母在糖过量的情况下仍可控，因此更容易大规模发酵合成。
4.解脂耶氏酵母目前已被设计用于生产β-胡萝卜素、β-法呢烯、柠檬烯、瓦伦烯、角鲨烯、2,3-氧化角鲨烯、芳香族氨基酸和白藜芦醇。此外，解脂耶氏酵母用于生产脂肪酶、β-甘露糖酶、漆酶、淀粉酶和蛋白酶。
5.近年来,麦角硫因已经成为国外研究的热点之一。麦角硫因是自然界中一种稀有天然氨基酸,在机体内具有重要的生理活性,麦角硫因是一种天然存在的抗氧化剂，已显示出改善神经退行性疾病和心血管疾病的潜力。并且在某些方面具有比谷胱甘肽等天然抗氧化剂更优越的生理功能。麦角硫因在维持生物体系氧化-还原平衡、外源物质解毒、抗氧化损伤及预防癌症等医学、保健食品以及化妆品等方面具有重要的应用价值。
6.目前麦角硫因主要是通过提取、酶解、合成等方法制得。由于麦角硫因天然含量少、合成前体不易制备等因素，麦角硫因难以大规模制备，价格居高不下，影响麦角硫因的应用推广。
7.因此，现目前需要一种成本低、制取率高的麦角硫因合成方法。


技术实现要素：

8.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法，应用基因克隆表达技术，改造解脂耶氏酵母，创新发明了在生物反应器中连续发酵合成麦角硫因的新技术。
9.为了达到解决上述技术问题的目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.s1、敲除粗糙脉孢菌的生物合成酶egt1基因和麦角菌的egt2基因；
11.s2、构建同时过表达egt1基因和egt2基因的高效解脂耶氏酵母菌株；
12.s3、通过菌落pcr检查s2中菌株的正确遗传修饰；
13.s4、配置预培养基；
14.s5、将通过正确遗传修饰的菌株在预培养基上培养；
15.s6、将培养物离心，倒出上清液，将沉淀物重新悬浮在无菌超纯水中；
16.s7、配置矿物培养基；
17.s8、将预培养的细胞接种于液体培养基质中；
18.s9、配置补料培养液；
19.s10、分批补料培养，每隔一段时间添加一次上述培养液；
20.s11、于s10中培养的物质中提取麦角硫因；
21.进一步的，所述s4中配置预培养基，10～25g/l葡萄糖 4～10g/l(nh4)2so4 10～20g/lkh2po4 0.1～0.8g/lmgso4，使用naoh调节至ph5～6之间；
22.进一步的，所述s5中将通过正确遗传修饰的菌落在预培养基上培养，在30℃和250rpm下孵育48h；
23.进一步的，所述s6中培养物以3000rpm离心5分钟后，倒出上清液，将沉淀物重新悬浮在50ml无菌超纯水中；
24.进一步的，所述s7配置矿物培养基，预培养基 1～2ml/l的金属溶液 1～2ml/l的维生素溶液，使用naoh调节至ph5～6；
25.进一步的，所述金属溶液包含：cacl2.2h2o、znso4.7h2o、feso4.7h2o、h3bo3、mncl2.4h2o、na2mo4.2h2o、cocl2.6h2o、cuso4.5h2o、ki、edta；维生素溶液包含：生物素、氨基苯甲酸、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、肌醇；
26.进一步的，所述s9配置补料培养液包括：50～90g/l的葡萄糖 80～120g/l的(nh4)2so4 10～25g/l的mes水合物 0.1～0.5g/l的kh2po4 8～26g/lmgso4.7h2o 25～45mg/l盐酸吡哆醇 10～35ml/l金属溶液和5～16ml/l维生素溶液，使用naoh调节至ph5～6之间；
27.进一步的，所述发酵培养条件为：25～35℃和150～450rpm，通气0.5
–
1.0l/min；
28.本发明的有益效果是：
29.1、本发明提供的麦角硫因合成方法制备麦角硫因相较于传统的麦角硫因制备方法，成本低，制得率高，且质量稳定，有益于大规模生产制备；
30.2、该生物发酵合成法制取麦角硫因，能避免大量提取废渣的产生和有毒试剂的使用，清洁环保，有益于环境保护。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1是一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法的操作流程图；
33.图2是一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法中的组氨酸被甲基化作用步骤图。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1
36.参阅图1所示，一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法的具体实施形式，包括以下步骤：
37.1、敲除粗糙脉孢菌的生物合成酶egt1基因和麦角菌的egt2基因；
38.2、构建同时过表达egt1基因和egt2基因的高效解脂耶氏酵母菌株；
39.3、通过菌落pcr检查菌株的正确遗传修饰；
40.4、所述s4中配置预培养基，23g/l葡萄糖 6.5g/l(nh4)2so4 16.5g/lkh2po4 0.6g/lmgso4，使用naoh调节至ph5.5之间；
41.5、将通过正确遗传修饰的菌落在预培养基上培养，在30℃和250rpm下孵育48h；
42.6、培养物以3000rpm离心5分钟后，倒出上清液，将沉淀物重新悬浮在50ml无菌超纯水中；
43.8、配置矿物培养基，预培养基 2ml/l的金属溶液 1ml/l的维生素溶液，使用naoh调节至ph5.8；
44.其中金属溶液包括：4g/l的cacl2.2h2o 5.5g/l的znso4.7h2o 3.6g/l的feso4.7h2o 1.1g/l的h3bo3 1.2g/l的mncl2.4h2o 0.6g/l的na2mo4.2h2o 0.4g/l的cocl2.6h2o 0.16g/l的cuso4.5h2o 0.16g/l的ki 12g/l的edta。维生素溶液45mg/l生物素 185mg/l的氨基苯甲酸 1.2g/l烟酸 0.8g/l泛酸钙 0.9g/l盐酸吡哆醇 0.8g/l盐酸硫胺素 22g/l肌醇；
45.9、然后将预培养的细胞接种于液体培养基质中；
46.10、配置补料培养液：75g/l的葡萄糖 90g/l的(nh4)2so4 18g/l的mes水合物 0.45g/l的kh2po4 17g/lmgso4.7h2o 38mg/l盐酸吡哆醇 18ml/l金属溶液和9ml/l维生素溶液，使用naoh调节至ph5.3之间；
47.11、分批补料培养，每40小时添加一次上述培养液5g/l，共培养200小时；
48.12、发酵培养条件为：30℃和300rpm，通气0.5
–
1.0l/min。
49.实施例2
50.本实施例为一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法的进一步限定；
51.麦角硫因由前体组氨酸、半胱氨酸和s-腺苷甲硫氨酸生物合成。参阅附图2所示，在真菌途径中，组氨酸被egt1甲基化3次以形成海西氨酸，然后相同的酶连接半胱氨酸生成海西半胱氨酸亚砜，然后β-裂解酶egt2将丙酮酸铵与中间体分离，随后硫的还原产生erg。
52.实施例3
53.本实施例为运用一种利用解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的方法的麦角硫因合成实验；
54.1、将通过正确遗传修饰的菌落在预培养基上培养，在30℃和250rpm下孵育48h；
55.2、培养物以3000rpm离心5分钟后，倒出上清液，将沉淀物重新悬浮在50ml无菌超
纯水中；
56.3、配置液体培养基，23g/l葡萄糖 6.5g/l(nh4)2so4 16.5g/lkh2po4 0.6g/lmgso4 2ml/l的金属溶液 1ml/l的维生素溶液，使用naoh调节至ph5.8。
57.4、然后将预培养的细胞接种于液体培养基质中。
58.5、发酵培养条件为：30℃和300rpm，通气0.5
–
1.0l/min。共培养200小时。
59.结论：将解脂耶氏酵母直接在液体培养基中培养，不定期补充培养液，液体培养基中部分成分如葡萄糖、氨基酸、金属离子等成分会随着解脂耶氏酵母发酵合成麦角硫因的过程大量被消耗，成为抑制麦角硫因发酵合成的因素。
60.综上所述，1、本发明提供的麦角硫因合成方法制备麦角硫因相较于传统的麦角硫因制备方法，成本低，制得率高，且质量稳定，有益于大规模生产制备；
61.2、该生物发酵合成法制取麦角硫因，能避免大量提取废渣的产生和有毒试剂的使用，清洁环保，有益于环境保护。
62.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
63.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。