鱼皮微生物组的制作方法

鱼皮微生物组


背景技术：

1.增加的鱼类消费、人口增长以及鱼类对食物安全和社会发展的巨大贡献；已使得鱼类养殖显示为全球增长最快的食品部门，在过去30年内具有每年增加8％的平均值。这种生产增加已伴随着已知疾病的增加和新疾病的发展，这是鱼类在密集生长条件下面临的胁迫条件增加和免疫下降的结果。
2.鱼中的胁迫可以广泛地定义为这样的状态，其中一系列适应性应答在暴露于胁迫源之后重新建立稳态。在鱼中，胁迫应答包括下丘脑-垂体-肾上腺(hpi)轴的激活，最终达到来自定位于头肾中的内部细胞的糖皮质激素释放。在集约化水产养殖中，养殖的鱼经常暴露于胁迫源如拥挤和处理，其可以影响健康和福利，并且威胁到水产养殖的持续性。在野外同样地，天然鱼种群越来越多地经受多重人为胁迫源，所述人为胁迫源威胁到其持续性。特别地，胁迫介导的免疫功能损害已在养殖的鱼和野生的鱼中得到广泛描述，并且与对疾病的易感性增加相关。
3.在鱼中，粘膜免疫应答在感染的过程中起关键作用，并且包括健康和动态的微生物群落。在这个背景下，最近的研究已发现在感染、胁迫条件和抗生素应用期间，鱼皮微生物组对鱼的健康起重要作用。
4.在鱼类商业养殖领域，仍然需要监控、预防、改善且治疗病理性微生物感染的产品和方法，所述感染对养殖者具有毁灭性的商业影响。


技术实现要素：

5.本公开内容基于先进方法学的结果，所述方法学鉴定了健康鱼的皮肤中存在的微生物群落的变化与疾病和恢复的不同阶段之间的联系。
6.在一个方面，本公开内容提供了预测鱼在胁迫后的存活的方法，其包括测试鱼中包含16s核糖体rna基因的细菌的存在，所述基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
7.在另一个方面，本公开内容提供了增加鱼在胁迫后的存活的方法，其包括向鱼施用包含16s核糖体rna基因的细菌，所述基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
8.在再一个方面，本公开内容提供了组合物，其包括包含16s核糖体rna基因的细菌，所述基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
9.在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法包括测试鱼
中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
10.在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
11.在某些实施方案中，鱼属于辐鳍鱼纲(actinopterygii)。在某些实施方案中，鱼属于鲈形目(perciformes)。
12.在某些实施方案中，鱼属于鲷科(sparidae)。在某些实施方案中，鱼属于鲷属(sparus)。在某些实施方案中，鱼是金头鲷(sparus aurata)。
13.在某些实施方案中，鱼属于尖吻鲈科(latidae)。在某些实施方案中，鱼属于尖吻鲈属(lates)。在某些实施方案中，鱼是尖吻鲈(lates calcarifer)。
14.在某些实施方案中，胁迫选自致病细菌感染、网捕胁迫、物理性损伤及其任何组合。
15.在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染。在某些实施方案中，该胁迫是网捕胁迫。在某些实施方案中，胁迫是物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是轻度物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是局部物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是轻度的局部物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是划伤。在某些实施方案中，胁迫是局部划伤。在某些实施方案中，胁迫是轻度划伤。在某些实施方案中，胁迫是针刺划伤。在某些实施方案中，胁迫是除鳞。在某些实施方案中，胁迫是局部除鳞。在某些实施方案中，胁迫是轻度除鳞。
16.在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染、网捕胁迫和物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染、网捕胁迫和划伤。在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染、网捕胁迫和除鳞。
17.在某些实施方案中，致病细菌是革兰氏阴性细菌。
18.在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌选自弧菌属(vibrio)、假单胞菌属(pseudomonas)、爱德华氏菌属(edwardsiella)和分枝杆菌属(mycobacterium)。
19.在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌属于弧菌属。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌属于假单胞菌属。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌属于爱德华氏菌属。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌属于分枝杆菌属。
20.在某些实施方案中，致病细菌是哈维氏弧菌(vibrio harveyi)。
21.在某些实施方案中，致病细菌是革兰氏阳性细菌。
22.在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌选自链球菌属(streptococcus)和乳球菌属(lactococcus)。
23.在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌属于链球菌属。在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌属于乳球菌属。
24.在某些实施方案中，致病细菌是鱼型链球菌(streptococcus iniae)。
25.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
26.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存
在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
27.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
28.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
29.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
30.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
31.在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
32.在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
33.在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
34.在某些实施方案中，增加鱼在胁迫后的存活的方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
35.在某些实施方案中，组合物包括包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
36.在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
37.在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
38.在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
39.本公开内容的这些及其它方面和实施方案公开于下述详细描述、所附权利要求和附图中。
附图说明
40.图1.y轴显示了(a)在冬季(水温19℃至23℃)在uv处理的水中；(b)在冬季在uv未处理的水中，以及(c)在夏季(水温24℃至28℃)实验中在uv未处理的水中，所发现的鱼皮微生物群落的细菌门的相对丰度。x轴显示了在t0、t1、t2和t3的取样点的不同时间间隔，所述取样点分别对应于在哈维氏弧菌感染前的对照条件(t0)、在胁迫和疾病条件下的感染后72小时(t1)、感染后一周(恢复阶段)(t2)和感染后三周(晚期恢复阶段)(t3)。
41.图2.在实验过程自始至终，主要的两个otu各自的丰度。
42.图3.未知otu1的系统发育分析，其显示了与密切相关的菌株(stains)97.1％的序列相似性。
43.图4.未知otu2的系统发育分析，其显示了与密切相关的未培养菌株100％的序列相似性。
44.图5.通过用革兰氏阳性鱼型链球菌浸泡的感染后至多14天，尖吻鲈和金头鲷鱼种两者在uv处理的水和uv未处理的水中的存活率。
45.图6.在不同的时间点，对于两个鱼种，对于uv处理的水和uv未处理的水两者，在不同的个别鱼中，不同物种门(颜色)以及以红色的鱼型链球菌(革兰氏阳性病原体)和以深蓝色的弧菌科物种(vibrionaceae spp.)的突出显示物种的总相对丰度。
46.图7.对于尖吻鲈(图7a)和金头鲷(图7b)，在不同时间点的链球菌科(streptococcaceae)的相对丰度。每个条之上的字母表示统计学显著性》0.05。
id no:9中所示的核苷酸序列。
60.在一个方面，本公开内容提供了预测鱼在胁迫后的存活的方法，其包括测试鱼中包含16s核糖体rna基因的细菌的存在，所述基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
61.在另一个方面，本公开内容提供了增加鱼在胁迫后的存活的方法，其包括向鱼施用包含16s核糖体rna基因的细菌，所述基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
62.在再一个方面，本公开内容提供了组合物，其包括包含16s核糖体rna基因的细菌，所述基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
63.本领域的技术人员将理解，如本文例举的，就某种细菌或一般而言的细菌的存在测试鱼包括从例如鱼的皮肤外表面获取细菌样品，并且检查细菌的16s核糖体rna基因的核苷酸序列。用于这两个步骤的方法均为本领域众所周知的。
64.本领域的技术人员将进一步知道，16s核糖体rna(或16s rrna)是原核生物核糖体的30s小亚基的组分，并且由于该基因区域的缓慢进化速率，编码其的基因用于重建系统发育。
65.应该理解，测试一条鱼包括测试多条鱼，检查一个基因包括测试多个基因，寻找一个核苷酸序列包括寻找多个核苷酸序列。应该进一步理解，不同的步骤可以同时或序贯进行。
66.如本文使用的，术语“方法”指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于通过化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知，或者从已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
67.本领域的技术人员将理解，向鱼施用细菌可以以各种方法和步骤完成，如本领域长久已知的。例如，可以将细菌直接施用于鱼的外部皮肤表面，或者可替代地，可以通过将细菌加入鱼周围的水中，将细菌间接地施用于鱼。另外，可以例如通过用此类细菌饲喂鱼，将细菌施用于鱼的内表面。
68.在某些实施方案中，在24℃至28℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在25℃至27℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在24℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在25℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在26℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在27℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在28℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。
69.在某些实施方案中，在19℃至23℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在20℃至21℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案
中，在19℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在20℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在21℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在22℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在23℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。
70.在某些实施方案中，在24℃至28℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列，并且在19℃至23℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，在25℃至27℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列，并且在20℃至22℃的水温中施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。
71.在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
72.在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少两个中所示的核苷酸序列。
73.在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少三个中所示的核苷酸序列。
74.在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少四个中所示的核苷酸序列。
75.在某些实施方案中，该方法包括测试鱼中包含16s基因的细菌的存在，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
76.在某些实施方案中，鱼属于辐鳍鱼纲。在某些实施方案中，鱼属于鲈形目。
77.在某些实施方案中，鱼属于鲷科。在某些实施方案中，鱼属于鲷属。在某些实施方案中，鱼是金头鲷。
78.在某些实施方案中，鱼属于尖吻鲈科。在某些实施方案中，鱼属于尖吻鲈属。在某些实施方案中，鱼是尖吻鲈。
79.在某些实施方案中，鱼属于软骨硬鳞亚纲(chondrostei)。在某些实施方案中，鱼属于新鳍亚纲(neopterygii)。在某些实施方案中，鱼属于腕鳍鱼亚纲(cladistia)。
80.本领域的技术人员将了解，物理、化学和感知胁迫源可以分别诱发鱼中的应答，其被视为适应性的，以致使鱼能够应对干扰并维持其稳态状态。在某些实施方案中，胁迫诱发鱼中的应答。在某些实施方案中，胁迫包含下丘脑-垂体-肾上腺(hpi)轴的激活。在某些实施方案中，胁迫包含来自定位于头肾中的内部细胞的糖皮质激素释放。在某些实施方案中，胁迫包含下丘脑-垂体-内脏(hpi)轴的激活、以及来自定位于头肾中的内部细胞的糖皮质激素释放。
81.在某些实施方案中，胁迫选自致病细菌感染、网捕胁迫、物理性损伤及其任何组合。在某些实施方案中，胁迫选自致病细菌感染、网捕胁迫和物理性损伤。
82.在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染。在某些实施方案中，该胁迫是网捕胁迫。在某些实施方案中，胁迫是物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是轻度物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是局部物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是轻度的局部物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是划伤。在某些实施方案中，胁迫是局部划伤。在某些实施方案中，胁迫是轻度划伤。在某些实施方案中，胁迫是针刺划伤。在某些实施方案中，胁迫是除鳞。在某些实施方案中，胁迫是局部除鳞。在某些实施方案中，胁迫是轻度除鳞。
83.在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染、网捕胁迫和物理性损伤中的至少两种。
84.如本文使用的，术语“致病细菌”指任何致病的细菌。在某些实施方案中，致病细菌引起鱼中的疾病。在某些实施方案中，致病细菌引起金头鲷鱼中的疾病。在某些实施方案中，致病细菌引起尖吻鲈鱼中的疾病。
85.在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染、网捕胁迫和物理性损伤。在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染、网捕胁迫和划伤。在某些实施方案中，胁迫是致病细菌感染、网捕胁迫和除鳞。
86.本领域的技术人员将理解，网捕胁迫是一种物理处理形式，其对鱼造成胁迫，因为它们不能自由移动和/或不能正常呼吸，并且物理性损伤对鱼造成胁迫，因为它们不再是物理上完整的。
87.在某些实施方案中，致病细菌是革兰氏阴性细菌。
88.在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌选自弧菌属、假单胞菌属、爱德华氏菌属和分枝杆菌属。
89.在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌属于弧菌属。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌属于假单胞菌属。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌属于爱德华氏菌属。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌属于分枝杆菌属。
90.在某些实施方案中，致病细菌是哈维氏弧菌。
91.在某些实施方案中，致病细菌是革兰氏阳性细菌。
92.在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌选自链球菌属和乳球菌属。
93.在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌属于链球菌属。在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌属于乳球菌属。
94.在某些实施方案中，致病细菌是鱼型链球菌。
95.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
96.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
97.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
98.在某些实施方案中，存活是在24℃至28℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在25℃至27℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在24℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在25℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在26℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在27℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在28℃的水温中。
99.在某些实施方案中，存活是在19℃至23℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在20℃至22℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在19℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在20℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在21℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在22℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在23℃的水温中。
100.在某些实施方案中，包括包含seq id no:1中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌、以及包括包含seq id no:2中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌的存在预测鱼在胁迫后的存活。在某些实施方案中，存活是在19℃至28℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在20℃至27℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在21℃至26℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在22℃至25℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在23℃至24℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在19℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在20℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在21℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在22℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在23℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在24℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在25℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在26℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在27℃的水温中。在某些实施方案中，存活是在28℃的水温中。
101.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
102.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:9中所示
的核苷酸序列。
103.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后在24℃至28℃的水温中的死亡，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后在25℃至27℃的水温中的死亡，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后在26℃的水温中的死亡，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。
104.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后在19℃至23℃的水温中的死亡，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后在20℃至22℃的水温中的死亡，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后在21℃的水温中的死亡，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。
105.在某些实施方案中，包括包含seq id no:1中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌的不存在、以及包括包含seq id no:2中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡。在某些实施方案中，死亡是在19℃至28℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在20℃至27℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在21℃至26℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在22℃至25℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在23℃至24℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在19℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在20℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在21℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在22℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在23℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在24℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在25℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在26℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在27℃的水温中。在某些实施方案中，死亡是在28℃的水温中。
106.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中的至少两个中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中的至少三个中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中的至少四个中所示的核苷酸序列。
107.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
108.在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后在24℃至28℃的水温中的死亡，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后在19℃至23℃的水温中的死亡，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包括包含seq id no:1中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌的不存在、以及包括包含seq id no:2中所示的核苷酸序列
的16s基因的细菌的不存在预测鱼在胁迫后的死亡。在某些实施方案中，死亡是在19℃至28℃的水温中。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌在24℃至28℃的水温中施用，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含16s基因的细菌在19℃至23℃的水温中施用，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，包括包含seq id no:1中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌在24℃至28℃的水温中施用，并且包括包含seq id no:2中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌在19℃至23℃的水温中施用。
109.在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
110.在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
111.在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中的至少两个中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中的至少三个中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中的至少四个中所示的核苷酸序列。
112.在某些实施方案中，该方法进一步包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
113.在某些实施方案中，增加鱼在胁迫后的存活的方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少两个中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，增加鱼在胁迫后的存活的方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少三个中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，增加鱼在胁迫后的存活的方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少四个中所示的核苷酸序列。
114.在某些实施方案中，增加鱼在胁迫后的存活的方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
115.在某些实施方案中，组合物包括包含16s核糖体rna基因的多种细菌，所述16s基因
包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
116.在某些实施方案中，包含16s核糖体rna基因的多种细菌为按组合物总重量的重量计至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％，所述基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
117.在某些实施方案中，组合物进一步包含水。在某些实施方案中，组合物基本上不含水。在某些实施方案中，组合物进一步包含盐。在某些实施方案中，组合物进一步包含按重量计至少5％的盐。在某些实施方案中，组合物进一步包含按重量计3.5％至4.5％的盐。在某些实施方案中，组合物包含按重量计少于3％的盐。在某些实施方案中，组合物包含按重量计少于2％的盐。在某些实施方案中，组合物包含按重量计少于1％的盐。在某些实施方案中，组合物基本上不含盐。
118.在某些实施方案中，组合物进一步包含载体。在某些实施方案中，组合物进一步包含合成载体。如本文使用的，术语“合成的”包括“非天然的”、“自然界中未发现的”、“人造的”和“机器制造的”。
119.在某些实施方案中，组合物是兽医学组合物。在某些实施方案中，组合物进一步包含兽医学赋形剂。在某些实施方案中，组合物是药物组合物。在某些实施方案中，组合物进一步包含药物赋形剂。本领域技术人员将理解术语“兽医学组合物”、“兽医学赋形剂”、“药物组合物”和“药物赋形剂”具有高纯度和商业标准。
120.如本文使用的，术语“药物赋形剂”指用于药物、食物或兽医学产品中的任何赋形剂。它可以是具有稀释剂、粘合剂、包衣、不粘性、崩解、流化、增溶、润滑剂、稳定剂、防结块、防潮、掩味或负载、改变释放概况(延长释放、延迟释放等)等功能的赋形剂。该术语进一步预期意指用作药物的活性成分的载体的任何治疗上无活性物质。术语“药物赋形剂”在本文中按其常见的技术含义使用，并且指包括在即用型药物制剂中的除活性成分外的所有物质。
121.在某些实施方案中，组合物包括包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少两个中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物包括包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少三个中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物包括包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中的至少四个中所示的核苷酸序列。
122.在某些实施方案中，组合物包括包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
123.在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列，或其任何组合。
124.在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1中所示的核苷酸序列。在某些
实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:2中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:7中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:8中所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:9中所示的核苷酸序列。
125.在某些实施方案中，组合物用于增加鱼在胁迫后的存活的方法中，所述方法包括向鱼施用包含16s基因的细菌，所述16s基因包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中所示的核苷酸序列。
126.在某些实施方案中，短语“增加鱼在胁迫后的存活”意指与未施用本文提供的一种或多种细菌在相同胁迫后的相同鱼相比，更多的鱼在施用本文提供的一种或多种细菌后将存活过胁迫。
127.在某些实施方案中，包括包含seq id no:1中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌属于β-变形菌纲，或属于伯克氏菌目，或属于丛毛单胞菌科，或属于戴尔福特菌属。
128.在某些实施方案中，包括包含seq id no:2中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌属于γ-变形菌纲，或属于海洋螺菌目，或属于海洋螺菌科，或属于profundimonas属。
129.在某些实施方案中，包括包含seq id no:7中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌属于γ-变形菌纲，或属于弧菌目，或属于弧菌科，或属于链状球菌属。
130.在某些实施方案中，包括包含seq id no:8中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌属于γ-变形菌纲，或属于弧菌目，或属于弧菌科，或属于链状球菌属。
131.在某些实施方案中，包括包含seq id no:9中所示的核苷酸序列的16s基因的细菌属于γ-变形菌纲，或属于海洋螺菌目，或属于海洋螺菌科，或属于profundimonas属。
132.实施例
133.实施例1.
134.下述实验设计为检查微生物组在鱼的免疫和存活中的作用，在冬季和夏季期间，在(i)uv处理的水和(ii)uv未处理的水中比较鱼皮微生物组。(i)在控制条件下、(ii)在胁迫条件和疾病条件下、(iii)在恢复期、以及(iv)在恢复后三周，在不同的定位包括金头鲷(sparus aurata)(金头鲷(gilt-head bream)，也称为“dennis”)的腹部、侧线、鳃和肛门处，对鱼皮微生物组进行取样。
135.在每个实验(夏季和冬季)中，在生长设施的稳定环境中，两个50l的鱼水箱紧靠彼此放置。每个鱼水箱含有用p标签标记的10条金头鲷鱼。两个水箱均处于(i)uv处理的海水和(ii)uv未处理的海水的连续流动下，两个水箱中的鱼均每天饲喂一次。在开始每个实验之前，鱼饲养在每个分开的水箱中，以适应环境。
136.如下对两个水箱中的鱼引入胁迫条件和疾病条件两者：首先，当鱼置于在水外面的网中7分钟时，使鱼经受网捕胁迫。在网捕胁迫之后，使鱼经受在其尾部处的轻度的物理性损伤(局部针刺划伤和/或局部除鳞)，并且放回其相应的水箱中。同时，将水箱水体积减少到20l，并停止水流。接下来，将哈维氏弧菌以250,000个细菌/ml加入鱼水箱中，并且通过
使水箱体积保持至20l共1小时，允许致病性哈维氏弧菌的浸泡期。之后，使每个水箱中的水流恢复到其初始状态，并且在实验自始至终对鱼进行监控。
137.如下使用无菌棉签从每个个体中收集鱼皮微生物群落：来自每个水箱的鱼从其水箱中取出，并且置于无菌托盘(20
×
50cm)上。然后，将棉签在其侧线的区域处的鱼皮上的～1cm2面积上轻拍，并且置于冰上。同时读取所插入的p标签，并且在拭子样品上进行标记。在拭子收集后，将鱼放回中间水箱中，直到对水箱中的所有鱼进行取样，并且在样品收集后立即放回其原始鱼水箱中。
138.在冬季(1月)和夏季(9月)进行两次等同的实验。在每个实验中，(i)在对照的初始条件(t0)下、以及在(ii)感染后24小时的胁迫条件和疾病条件(t1)下，在两个水箱中收集鱼拭子样品。对于存活的那些鱼，(iii)在恢复期(t2)和(iv)恢复后三周(t3)收集另外的样品，如表1中所示。
139.表1.在实验自始至终的拭子样品收集。
140.季节水箱时间点取样的鱼总数日期冬季uv处理的对照(t0)7条中的7条1月11日冬季uv处理的生病(t1)7条中的7条1月14日冬季uv未处理的对照(t0)8条中的8条1月11日冬季uv未处理的生病(t1)8条中的8条1月14日冬季uv未处理的恢复(t2)存活的2条中的2条1月18日冬季uv未处理的恢复(t3)存活的2条中的2条1月27日夏季uv处理的对照(t0)10条中的10条9月4日(未分析)夏季uv处理的生病(t1)10条中的10条9月7日(未分析)夏季uv未处理的对照(t0)10条中的10条9月4日夏季uv未处理的生病(t1)10条中的10条9月7日夏季uv未处理的恢复(t2)存活的4条中的4条9月13日夏季uv未处理的恢复(t3)存活的4条中的4条9月27日
141.dna提取：在无菌条件下，将取自不同处理和时间点的拭子样品个别地剪下，并且放置用于遵循制造商的方案，使用mobio 96孔板污损dna提取试剂盒的dna提取。dna提取的所有步骤都在无菌的uv罩中进行，以减少外部污染。在每一个dna提取96孔板中，通过放置200μl不含rna酶的水来添加dna提取阴性对照，并且所有样品都随机放置在dna提取板中，以排除任何偏差。
142.pcr和文库制备：使用修饰的16s rdna基因的pcr用于扩增16s rdna基因(表2)。所有的pcr反应都一式三份进行，其中每个重复在分开的96孔板中进行。pcr反应通过如下将10μl预拌kapa hifi、0.4μl等v/v的混合引物、7.6μl无rna酶的水和2μl dna模板混合进行制备：98℃；2分钟，以下的35个循环；98℃；10秒，61℃；15秒，72℃；35秒和72℃；5分钟用于延伸，然后保持在4℃下。
143.表2.第一pcr方案中使用的每种引物的位置、序列和每个16s dna扩增子的长度。
[0144][0145]
在第一pcr后，样品在1.5％琼脂糖凝胶上运行，以确认所需的条带被成功扩增，而阴性对照中没有扩增，然后将所有pcr一式三份合并在一起。在合并后，通过将36μlxp beckman coulter珠溶液与45μl每种合并的dna混合(基于制造商方案，对于小于200bp片段排除的推荐比率)，对所有样品进行pcr清洁步骤，以去掉所有引物和核苷酸。在加入珠溶液后，样品通过移液几次进行充分混合，并且在室温下温育5分钟。在温育后，将样品置于磁力架上2分钟，以去除具有所需片段(多于200bp)的珠，并且弃去上清液。然后，用新鲜制备的200μl 80％乙醇和在两次洗涤之间30秒的温育时间，将磁珠洗涤两次，然后静置10分钟用于风干。在干燥后，将43μl具有10mm tris(ph＝8.5)的ddw加入每个样品中，伴随10次移液器混合，在室温下温育2分钟，允许上清液澄清，并且将42μl上清液等分到不同的pcr无菌管中，并且贮存于-80℃下，用于第二pcr和文库制备。
[0146]
文库制备使用第二pcr进行，以将illumina接头、衔接子和独特的8碱基对条形码连接到每个样品(表3)。第二pcr反应通过将21μl预拌kapa hifi、2μl混合的正向引物、12.6μl无rna酶的水与来自第一pcr产物的4μl每个样品和2μl加条形码的反向引物混合进行制备，并且置于以下述条件的热循环仪中：98℃；2分钟，以下的8个循环；98℃；10秒，64℃；15秒，72℃；25秒和72℃；5分钟用于延伸，然后保持在4℃下。在完成后，将所有的pcr产物合并在一起，并且经受如先前在第一pcr清洁中提到的清洁，然而50μl合并的第二pcr产物使用与珠溶液的1:1比率进行清洁，用于小于200bp片段的更保守的尺寸排除，并且在最后一步，将50μl具有10mm tris(ph＝8.5)的ddw加入每个样品中，并且将48μl上清液等分到无菌pcr管中，保存在-80℃下，并且将15μl最终产物送往pe 300miseq illumina测序，使得每个泳道由96个样品组成。
[0147]
表3.第二pcr、文库制备方案中使用的每个引物的位置、序列和每个16s dna扩增子的长度。n
8-不同的核苷酸序列在文库制备的过程中用作给不同样品加上标签的条形码。
[0148][0149]
序列分析和质量控制：首先，如下对分析进行一系列的序列检查和质量控制：(i)使用pear软件对两个配对端进行合并，然后使用在qiime2软件下的“qiime dada2denoise-paired”，就低质量评分、模糊碱基、嵌合序列和pcr错误，对序列进行清洗。然后，使用“vsearch cluster-features-open-reference”，以0.99序列相似性对所有序列进行聚类，并且使用基于silva v13.8数据库的“feature-classifier classify-sklearn”开放参考16srrna进行分类。然后，对于分类为d_0__线粒体、d_0__古细菌、未分配的、d_4__线粒体、d_3_叶绿体和d_0__真核生物的序列，对所获得的操作分类单元(otu)表进行清洁。
[0150]
群落组成的评价：根据所获得的qiime2分类的otu表，使用r统计和分析软件来生成微生物群落的相对丰度。首先，从otu表中去除稀有丰度的otu，去除对于单个out所有样品行总和的截断5,000。测试了许多截断，包括500、1000、2000和5000的截断，并且注意到在较低的截断下，微生物群落的组成没有显著变化。选择5,000总序列数/out作为截断。之后，通过每个样品的总和将otu表标准化，并且生成条形图。在条形图中，每种颜色分配给在同一门下分类的那些otu，具有对于在任何取样阶段都显示总数的多于25％的高丰度的那些out的一个例外，因此对于这些otu分配不同的颜色，并且在同一条形图下示出。
[0151]
对于uv处理和uv未处理的海水鱼皮微生物群落两者，收集了总共62个样品，具有36,304个序列的平均行序列数，并且获得32,252个清洁的非嵌合序列/数据集的平均值。然后对这些序列进行分类，并且图1中呈现了每个分类单元的相对丰度的条形图。
[0152]
如图1中呈现的，在用哈维氏弧菌的控制感染之后，与在uv处理的水中饲养的那些鱼(在t2和t3中呈现的)相比，在uv未处理的海水中饲养的那些鱼显示了40％的存活率。每个图的条形图按鱼标签的同步次序放置，意味着t2和t3中的那些存活的鱼对应于t0和t1中的最后一个条。在图1b和1c两者中，将那些存活的鱼与那些没有存活的鱼相比较，不存在明确或显著丰富的任何otu或细菌门。然而，当将在uv未处理的海水中生长的鱼(图1b和图1c)与在uv处理的海水中生长的鱼中的鱼皮微生物群落相比较时，存在两个主要otu的明确和显著的丰度。
[0153]
有趣的是，这些out之一，未知的otu2(tagatataggaaggaacatcagtggcgaaggcggccacctggactgatactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctactagccgttgggggtcttgtacctttagtggcgcagctaacgcactaagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagattaa)[seq id no:2]在t0下在夏季和冬季实验两者中均是丰富的，但在t1的疾病条件下，仅对于在冬季生长的那些鱼显示了较高的丰度(图2)。
[0154]
另一方面。未知的otu1(tagatatgcggaggaacaccgatggcgaaggcaatcccctggacctgtactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactggttgttgggaattagttttctcagtaacgaagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttg)[seq id no:1]显示在夏季实验过程中具有在t1下的最高丰度。有趣的是，对于夏季实验，存在未知otu1在t0下的轻度丰度，其在冬季实验中不存在(图2和表4)。
[0155]
表4.两个主要out各自在每个实验和时间点的丰度百分比。
[0156][0157]
这两个主要otu在所利用的16s silva数据库中的种或属水平下是未知的。在绿色基因和rdp数据库中也检查了这两个otu的序列，并且在属和种水平两者下对于其分类学均没有获得分类。关于这两个otu的更高级分类：(i)发现未知的otu1分类为β-变形菌纲，伯克氏菌目，丛毛单胞菌科，戴尔福特菌属；并且(ii)发现未知的otu2分类为γ-变形菌纲，海洋螺菌目，海洋螺菌科，profundimonas属。
[0158]
进一步进行这两个主要otu的系统发育分析(图3和图4)。未知的otu1显示与戴尔福特菌属的未培养细菌的100％序列相似性。然而，由于16s至219bp的短序列长度，另一个100％的序列相似性可能是误导性的，并且它也可能指示新的物种。未知的otu2与其最接近的profundimonas属或未培养的γ变形杆菌的物种序列显示97.1％的序列相似性，这2.9的不同性在位置706、807、822、837、845、868和874处的碱基取代中注意到。
[0159]
从上文提供的数据可以得出某些结论。显示了在疾病阶段中的细菌群落(其与引起疾病的病原体哈维氏弧菌相关)的很大一部分是相关物种，其在uv未处理的水中显示针对致病性物种的竞争性生长，并且与在uv处理的水中生长的鱼相比，引起40％的存活增加。这些相关的细菌物种仅在使用99％序列相似性的类似时才呈现。在此之后，与在uv处理的水中生长的鱼相比，使用99％的序列相似性，将细菌分类成在uv未处理的水中发现的三个主要的细菌家族。这些细菌家族对鱼的存活和免受病原体的保护具有显著作用。
[0160]
实施例2.
[0161]
下述实验设计为检查在用革兰氏阳性细菌鱼型链球菌的控制感染之前、期间和之后，在dennis(金头鲷)的皮肤上的细菌群落的范围和变化，以便察看微生物组和致病细菌之间的相互作用，并且与来自先前实验(使用革兰氏阴性细菌哈维氏弧菌)的结果进行比较。
[0162]
该实验进一步设计为测试在另一个鱼种澳洲肺鱼(尖吻鲈)上的更广泛范围的微生物组，所述澳洲肺鱼对鱼型链球菌是高度敏感的，以便以与上文实施例1相同的方式检查其皮肤微生物组，以察看与对该细菌较不敏感的金头鲷相比，是否存在涉及更敏感鱼的恢复的差异、变种和/或新的细菌物种。
[0163]
简言之，将1克澳洲肺鱼幼鱼饲养直到60克。对于实验，使用未接种疫苗的鱼(该物种通常在2克时针对鱼型链球菌接种疫苗)。还需要至少50克的鱼，使得它们可以在实验过程中进行标记且处理(取样、感染)。
[0164]
在鱼达到55克的重量后，对于通过浸泡的控制感染校准鱼型链球菌的浓度(ld50)。在使鱼经受在水之外的5分钟网捕的处理胁迫，以便增加鱼对控制感染的敏感性后，发现ld50对于一小时浸泡为5x10
7 cfu/ml。
[0165]
所有的鱼都在第一天时加上标签，并且来自每组的每条鱼在试验自始至终取样几次，在不同的时间(在具有ld50的控制感染后的时间0、24、48、72小时，5天，一周和一个月)总共8个样品。另外，在同一时间从每个容器中获取水样品，使水通过0.2微米的过滤器，并且保留滤液用于分析。所有样品都转移用于分子和生物信息学分析。
[0166]
不同组中的鱼在用ld50剂量的鱼型链球菌感染后的死亡率分析显示于图5中。
[0167]
遵循实验设置，对于尖吻鲈和金头鲷鱼种两者，从每个水箱处理(uv处理的水和uv未处理的水)中接受总共257个样品，每个水箱含有10条加上标签的鱼。获取来自鱼皮的侧线的拭子样品用于微生物群落分析。在样品收集后，将样品贮存于-80℃下，并且转移到使用mobio dna提取试剂盒的dna提取。在dna提取之后，使用通用引物515f-806r扩增16s rrna的v3-v4区，并且使用nextera文库制备试剂盒进行illumina测序文库制备和样品条形码。在文库制备之后，将等摩尔的样品混合并在illumina iseq100机器上进行测序。在测序之后，使用qiime软件，就质量控制、序列长度、嵌合体和测序错误，对文件(fastq)进行精选，并且使用dada2算法对序列进行聚类，并且使用silva v123数据库在99％的序列相似性
下进行分类。分析每个样品中产生的扩增子序列变体(asv)表，包括不同分类群的丰度，并且对于每个处理产生条形图(图6)。
[0168]
微生物组分析明确地显示了，鱼型链球菌病原体能够以比金头鲷鱼更高的比率感染尖吻鲈，并且引起更高的疾病严重性，其也导致更高的死亡率(图5、图6)。微生物分析还显示了，对于尖吻鲈，在感染后的24小时和48小时，与uv未处理的水箱相比，鱼型链球菌能够以显著更高的比率感染uv处理的水箱中的鱼(图7a)，而对于金头鲷，不存在显著差异(图7b)。
[0169]
有趣的是，在t0后的感染过程中，存在弧菌科丰度的增加，这种丰度的增加在时间点t1、t2和t3(分别为感染后12、24和72小时)下对于两个鱼种均注意到，具有在t2下的峰值丰度，与uv处理的水相比，所述丰度的增加在来自uv未处理的水箱的鱼中也是更高的(图8)。
[0170]
发现该弧菌科由两个序列组成，一个属于弧菌科链状球菌属(otu3)，而另一个序列属于未分类的属(otu4)，具有相等的代表性。
[0171]
这些序列是：
[0172]
弧菌科链状球菌属(otu3)ggtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcatgcaggtggtttgttaagtcagatgtgaaagcccggggctcaacctcggaatagcatttgaaactggcagactagagtactgtagaggggggtagaatttcaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgaaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacagatactgacactcagatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagaaacccctgtagtcc[seq id no:7]。
[0173]
弧菌科未分类的属(otu4)ggtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcatgcaggtggtttgttaagtcagatgtgaaagcccggggctcaacctcggaatagcatttgaaactggcagactagagtactgtagaggggggtagaatttcaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgaaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacagatactgacactcagatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagatacccctgtagtcc[seq id no:8]。
[0174]
有趣的是，存在额外的序列(otu5)，其与来自先前实验的属于海洋螺菌科profundimonas未培养物种的otu2密切相关。这个otu5也被注意到在感染期间是显著丰富的，代表总细菌群落的约20％。
[0175]
海洋螺菌科profundimonas(otu5)ggtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggcggccaagtcagtcagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaactgcacctgatactgcttggctagagtacagaagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacatcagtggcgaaggcggccacctggtctgatactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagaaacccctgtagtcc[seq id no:9]。
[0176]
otu3和otu4之间的唯一区别是在腺嘌呤和胸腺嘧啶之间的一个取代。当使用raxml软件，将otu3、otu4和otu5连同先前的序列otu2和otu1一起比较时，与系统发育树中示出的密切相关物种分别获得99.32、98.30、97.10和100％(图9)。
[0177]
otu3和otu4仅在一个核苷酸中不同，然而，必须提到的是，这些分析基于总16srrna亚基的200个核苷酸碱基的小片段。
[0178]
虽然这一结论对于相关益生菌的开发很重要，但结果显示了相关的弧菌属物种，即魔鬼弧菌(vibrio diabolicus)、vibrio catenococcus和海洋螺菌科profundimonas，在
尖吻鲈和金头鲷鱼种两者中的鱼型链球菌感染期间的鱼存活中起重要作用。
[0179]
密切相关的海洋螺菌科profundimonas和丛毛单胞菌科戴尔福特菌属在金头鲷中的哈维氏弧菌感染期间起重要作用。有趣的是，在两个不同的实验中，在鱼型链球菌和哈维氏弧菌的两次感染下，海洋螺菌科profundiomnas细菌在感染期间是丰富的，并且因此认为它对鱼存活具有一定作用。图10概括了在本文中鉴定的otu。
[0180]
虽然本公开内容已通过各个实施方案的描述进行说明，并且虽然这些实施方案已相当详细地进行描述，但并不预期将本公开内容的范围限制或以任何方式局限于此类细节。另外的优点和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，在其更广泛的方面，本公开内容并不局限于所显示且描述的具体细节和说明性实例。相应地，可以偏离这些细节，而不背离本公开内容的精神或范围。