浓缩灌注培养基的制作方法

1.本发明涉及一种无血清细胞培养灌注培养基，所述无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中所述无血清细胞培养灌注培养基在混合后将ph调节至中性ph。还提供了一种制备所述无血清细胞培养灌注培养基的方法。本发明进一步涉及使用所述无血清细胞培养灌注培养基来在灌注培养中培养哺乳动物细胞或产生所关注蛋白质的方法，所述方法在低细胞比(specific)灌注速率下实现高生产率。本发明进一步涉及新的和改进的无血清细胞培养灌注培养基控制灌注细胞培养物的渗透压的用途，其中通过在细胞培养期间，例如在灌注细胞培养的生产阶段期间，抑制细胞生长，增加渗透压导致总生产率和/或细胞比生产率(cell specific productivity)增加。抑制细胞生长特别减少或消除了对浪费的细胞排出的需要。


背景技术：

2.通常在通过哺乳动物细胞培养产生重组蛋白质的商业化过程中使用以下三种方法：分批培养、补料分批培养和灌注培养。
3.基于灌注的方法提供了优于分批和补料分批方法的潜在改进，其包括改进的产物质量和稳定性、改进的可扩展性和增加的细胞比生产率。与分批和补料分批生物反应器不同，灌注系统涉及连续去除用过的培养基。通过连续去除用过的培养基并将其用新培养基替换，可以更好地维持营养物水平，同时优化生长条件并去除细胞废物。减少的废物降低了对细胞和表达产物的毒性。因此，灌注生物反应器通常会显著减少蛋白质降解，并因此获得更高质量的产物。产物也可以更快、更连续地收获和纯化，这在产生不稳定的产物时特别有效。
4.灌注生物反应器也可更容易扩展。与传统的分批或补料分批系统相比，灌注生物反应器在可扩展性和/或不断增长的需求方面具有若干优势。一方面，灌注生物反应器尺寸更小，并且可以以更小的体积产生相同的生产率(即，产物产率)。一般认为，与补料分批生物反应器相比，灌注生物反应器可以在5至20倍的浓度下发挥作用。例如，100升灌注生物反应器可以产生与1,000升补料分批生物反应器相同的产物产率。因此，可以想象，1,000升灌注生物反应器的使用可以替代典型的10,000升传统补料分批生物反应器，并且不会对整体生产率产生负面影响。在扩大生产时，这种显著优势转化为更小的空间需求。这也可以转化为与较低的运营公用事业、较少的基础设施、较少的劳动力、降低的设备复杂性、连续收获以及提高的产物产率有关的一系列优势。
5.实现高细胞培养密度部分地说明了灌注系统更高生产率的原因。在典型的大规模补料分批商业化细胞培养过程中，可以实现10-50x106个细胞/ml的细胞密度。然而，使用基于灌注的生物反应器，已经实现》1x108个细胞/ml的极端细胞密度。另外，在灌注模式下，通过连续补充用过的培养基，高细胞数目可以维持更长时间。在灌注生物反应器中，随着时间的增加，细胞密度越高，这部分地说明了灌注生物反应器的性能更有效的原因。
6.典型的灌注培养开始于分批培养启动，持续一天或更长时间，以实现快速的初始
细胞生长和生物量累积，随后连续、逐步和/或间歇地向培养物中添加新鲜的灌注培养基，并且同时去除用过的培养基，其中在整个培养生长和产生阶段都会保留细胞。在维持细胞的同时，可以使用如沉降、离心或过滤等各种方法来去除用过的培养基。已经采用的灌注流速为每天一小部分工作体积直至每天许多个工作体积。
7.虽然与传统的补料分批系统和分批系统相比，连续灌注系统具有众多优势，但在灌注生物反应器在生物制剂制造行业中得到更广泛的接受和利用之前，仍然存在许多挑战。例如，由于培养基的去除和补充的连续循环，因此灌注生物反应器比传统的补料分批系统消耗显著更大体积的培养基。具体而言，如果有可能的话，在中试规模(～100l生物反应器)之上，维持每天1-3个容器体积(vvd)的灌注速率所需的培养基的体积变得在逻辑上具有挑战性。
8.wo 92/22637配制了基于物理化学性质分开的浓缩培养基亚组。然而，该浓缩培养基亚组在混合后不会调节ph，并且因此不适合于直接添加到细胞培养物中。此外，wo 92/22637中所公开的培养基，如基本培养基rpmi-1640、dmem和ham's f-12，不如现代细胞培养基丰富，其氨基酸浓度在mm工作浓度范围内而不是在μm工作浓度范围内。
9.连续灌注细胞培养系统面临的另一问题是维持恒定的活细胞密度以及因此更健康、更多产的细胞培养的挑战。这通常通过允许“细胞排出”来解决。在细胞排出期间，以足以允许稳态灌注细胞培养的速率去除细胞并将其作为废物丢弃。反过来，这使活细胞密度保持恒定。由于细胞排出技术，大部分培养基和产物可能会丢失，该技术虹吸出增殖细胞和培养基，以便在生物反应器内维持恒定的、可持续的活细胞密度。由于细胞排出技术，多达三分之一的可收获材料可能会丢失。因此，使用细胞排出会降低每次运行的产物产率，因为通过细胞排出去除的部分内的产物没有被收获。因此，任何量的细胞排出都会对过程效率、产物回收产生负面影响，并且最重要的是会导致产物损失。细胞排出速率通过细胞生长速率来确定。更快的倍增时间也需要更高的细胞排出以维持恒定的细胞密度，因此会产生更多的浪费。
10.作为细胞排出的替代方法，其他人尝试使用化学添加剂来减缓细胞生长速率。减少的细胞生长通常也会增加细胞比生产率。例如，du et al.(biotechnology and bioengineering,vol.112,no.1,january 2015)报道了使用小分子细胞周期抑制剂以控制生长和提高细胞培养生产率。相似的公开见于wo 2014/109858，其公开了cdk4抑制剂在如分批、补料分批和灌注培养等细胞培养中的用途。du et al.进一步教导，cdk4/6抑制剂特异性地抑制细胞周期且不会影响其他细胞目标。然而，要避免添加细胞生长和/或细胞维持不需要的抑制剂和化合物。因此，有效抑制灌注状态下的细胞生长并避免对细胞排出的需要的额外方法将显著帮助推进本领域。
11.渗透压是影响细胞生长的已知杠杆。使用渗透压影响细胞生长的现有技术在文献(zhu,et al(2005)biotechnology progress 21,70-77；han,koo and lee(2009)biotechnology progress 25,1440-1447；hu and aunins(1997)current opinion in biotechnology,148-153)中是已知的。然而，特别是在灌注培养中，从未建立过将细胞培养过程控制到目标渗透压的能力。此外，化学添加剂影响培养基组成和/或需要在后续纯化步骤中清除，从而增加过程复杂性。包括盐在内的化学添加剂也可能影响产物质量。
12.鉴于灌注细胞培养面临的挑战，如制备培养基消耗以及进一步提高生产率的期
望，改进逻辑问题的培养基以及有效抑制灌注状态下的细胞生长并避免对细胞排出的需要且无需进一步添加剂的方法将显著帮助推进本领域。


技术实现要素：

13.本发明部分地涉及以下发现：可以通过经分隔开的来以更浓缩的形式开发进料(feed)培养基，以降低细胞比灌注速率和所消耗的制备培养基的体积。这些浓缩进料在生物反应器容器中稀释。其有利地与作为稀释剂的灭菌去离子水一起使用，所述稀释剂除过滤之外不需要制备。此外，本发明中所设计的3种培养基浓缩物(酸性、碱性和近中性)的独特组合允许使用更高倍数的浓缩物，从而进一步减少总培养基体积。通过减少培养基的制备体积，已经开发出一种灌注过程，所述灌注过程消除了培养基体积瓶颈，因此可以证明将灌注细胞培养过程放大到1000l规模以及可能更大的规模是合理的。
14.使用单独的浓缩进料以及稀释剂还允许通过培养物渗透压来控制细胞生长。使用质量平衡的概念，用每种浓缩进料的已知渗透压、进料速率、计算出的每日细胞比渗透压消耗速率推导出渗透压平衡，以预测作为输出的培养物残留渗透压。使用这种方法，细胞培养物的生长可以通过将残留渗透压提高到生理应激水平(约350-400mosm或更高)并同时保持低于细胞毒性水平(约400mosm或更高)来控制。生理应激水平以及细胞毒性水平可以是细胞系特异性的。然而，这可以容易地通过在培养期间测量不同渗透压水平下的活细胞浓度和活力来确定，可以在小规模(如3ml工作体积)中进行确定。在目前的发明中，培养物渗透压经由渗透压平衡来控制，所述渗透压平衡包括培养基浓缩物进料速率相对于在固定的每天容器体积(vvd)下的每日基准的变化或者vvd进料速率相对于在固定的培养基浓缩物进料速率下的每日基准的变化。渗透压平衡能够通过调节浓缩物和稀释速率来针对更高或更低的残留渗透压，而其他人使用的化学添加剂方案只能在增加的方向上调节渗透压。已发现，如本文所描述的渗透压平衡在抑制细胞生长方面是有效的，并且这种生长抑制导致细胞比生产率增加并有助于在细胞培养中维持高活力。
15.通过本文描述的渗透压平衡而引起的细胞生长抑制不仅导致增加的细胞比生产率和持续的高细胞活力，而且在灌注细胞培养中，这种抑制还减少或消除了在灌注状态期间使用细胞排出技术来以其他方式维持细胞处于稳定生长状态的需要。这减少或消除了由于浪费和不期望的细胞排出技术而造成的产物损失。
16.本文提供的三分高浓缩进料培养基理论上可以与任何类型的细胞培养系统结合使用，但在连续灌注细胞培养系统中特别有利。因此，根据本发明的无血清细胞培养灌注培养基特别适用于连续灌注细胞培养系统。此外，渗透压平衡理论上可以与任何类型的细胞培养系统结合使用。然而，其当细胞培养系统是连续灌注细胞培养系统时特别有利。
17.在一个方面，本发明涉及一种经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中第一浓缩进料是碱性浓缩进料，第二浓缩进料是酸性浓缩进料，并且第三浓缩进料是近中性浓缩进料；其中在将所得无血清细胞培养灌注培养基中的所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基将ph调节至中性ph。在优选的实施方案中，所述至少三种单独的水性浓缩进料在添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前没有被预混合。所述稀释剂优选地是无菌水。在
一个实施方案中，在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所得无血清细胞培养灌注培养基的ph介于6.7至7.5之间、介于6.9至7.4之间，优选地介于6.9至7.2之间。根据本发明的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基适合于将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中；将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料直接添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，无需之前的预混合；和/或将所述至少三种单独的水性浓缩进料在细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中直接混合。
18.在某些实施方案中，所述碱性浓缩进料是2x至80x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是2x至40x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是2x至50x浓缩进料。所述近中性浓缩进料的ph为约6.5至约8.5。优选地，所述碱性浓缩进料的ph为约9或更高，所述酸性浓缩进料的ph为约5或更低，并且所述近中性浓缩进料的ph为约7至约8.5。此外，所述碱性浓缩进料与所述酸性浓缩进料与所述近中性浓缩进料的比率(v/v/v)是固定比率，以提供将ph调节至中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基；并且将ph调节至中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基中所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)确定所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压。
19.所述酸性浓缩进料可以包含微量元素、微量金属、无机盐、螯合剂、聚胺和调控激素。所述酸性浓缩进料和/或所述近中性浓缩进料可以包含表面活性剂、抗氧化剂和碳源。进一步地，所述碱性浓缩进料包含在碱性ph为9或更高时具有最大溶解度的氨基酸，优选地至少包含天冬氨酸、组氨酸和酪氨酸，并且任选地包含半胱氨酸和/或胱氨酸和/或叶酸。剩余的氨基酸在所述酸性和/或近中性浓缩进料中，优选地在所述酸性浓缩进料中。优选地维生素和金属在单独的进料中，优选地维生素在所述近中性进料中并且金属在所述酸性进料中。难溶于水溶液的维生素，如氯化胆碱，存在于所述中性进料和所述酸性进料中。
20.本发明还涉及一种碱性水性浓缩进料，所述碱性水性浓缩进料用于与酸性水性浓缩进料、近中性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所述无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。在另一实施方案中，本发明涉及一种酸性水性浓缩进料，所述酸性水性浓缩进料用于与碱性水性浓缩进料、近中性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。在又另一方面，本发明涉及一种近中性水性浓缩进料，所述近中性水性浓缩进料用于与碱性水性浓缩进料、酸性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。
21.在又另一方面，本发明涉及一种制备无血清细胞培养灌注培养基的方法，所述方法包含：(a)基于在碱性、酸性和中性ph下的溶解度，以组分的至少三种亚组提供细胞培养基组分，(b)(i)于碱性水溶液溶解在碱性ph下可溶的亚组组分以形成碱性浓缩进料；(ii)于酸性水溶液溶解在酸性ph下可溶的亚组组分以形成酸性浓缩进料；以及(iii)于中性水溶液溶解在中性ph下可溶的亚组组分以形成近中性浓缩进料；(c)任选地将所制备的碱性浓缩进料、酸性浓缩进料和近中性浓缩进料储存在单独的容器中；以及(d)将所制备的碱性浓缩进料、酸性浓缩进料和近中性浓缩进料以及稀释剂添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，其中(i)将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中；并且(ii)将所述稀释剂单独添加
到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，或者在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种预混合；其中在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至约中性ph。所述稀释剂优选地是无菌水。在一个实施方案中，在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，通过所述方法制备的所得无血清细胞培养灌注培养基的ph介于6.7至7.5之间、介于6.9至7.4之间，优选地介于6.9至7.2之间。
22.在某些实施方案中，将所述至少三种浓缩进料通过单独的端口逐滴添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中。与在添加到生物反应器之前混合和稀释的无血清细胞培养灌注培养基相比，容器内混合和稀释所述至少三种单独的水性浓缩进料允许在14天的培养期内使制备培养基消耗降低50-90％，优选60-90％。通常，细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含哺乳动物细胞。此外，所述方法进一步包含在储存和/或添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前对所述浓缩进料进行灭菌的步骤。
23.在某些实施方案中，所述碱性浓缩进料是2x至80x浓缩进料，其中所述酸性浓缩进料是2x至40x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是2x至50x浓缩进料。所述近中性浓缩进料的ph为6.5-8.5。优选地，所述碱性浓缩进料的ph为9或更高，所述酸性浓缩进料的ph为5或更低，并且所述近中性浓缩进料的ph为7至8.5。此外，所述碱性浓缩进料与所述酸性浓缩进料与所述近中性浓缩进料的比率(v/v/v)是固定比率，以提供在细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中将ph调节至中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基；并且所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)确定细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压，所述至少三种单独的水性浓缩进料添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中以提供将ph调节至近中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基。在某些实施方案中，细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含至少约100l无血清细胞培养灌注培养基，优选至少约1000l无血清细胞培养灌注培养基。优选地，细胞培养物的体积为至少约100l和/或生物反应器的体积为至少约100l。更优选地，细胞培养物的体积为至少约1000l和/或生物反应器的体积为至少约1000l。
24.还提供了一种能通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养灌注培养基。
25.在另一方面，本发明涉及一种在灌注培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，所述方法包含：(a)在无血清细胞培养基中用表达异源蛋白质的哺乳动物细胞接种生物反应器；(b)通过用无血清细胞培养灌注培养基进料连续喂养所述哺乳动物细胞并去除用过的培养基并同时将所述细胞保持在培养中来在灌注培养中培养所述哺乳动物细胞，其中所述无血清细胞培养灌注培养基进料是(i)经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中第一浓缩进料是碱性浓缩进料，第二浓缩进料是酸性浓缩进料，并且第三浓缩料是近中性浓缩料；并且其中在将所得无血清细胞培养灌注培养基中的所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基将ph调节至中性ph；和/或(ii)能通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养灌注培养基，并且其中将所述无血清细胞培养灌注培养基进料的所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容
器中，并且其中将所述稀释剂单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，或者在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种预混合。所述方法通常进一步包含从细胞培养物中收获所述异源蛋白质。
26.在灌注培养开始之前所述哺乳动物细胞最初可以以分批培养方式进行培养和/或灌注培养从分批培养的第0天至第3天(即接种后)开始。通常，灌注开始后灌注速率增加，直到达到目标活细胞密度。在某些实施方案中，灌注速率从每天小于或等于0.5个容器体积增加至每天约5个容器体积，或者从每天小于或等于0.5个容器体积增加至每天约2个容器体积。
27.在某些实施方案中，将所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压增加至高于最佳的生长渗透压水平，从而导致目标活细胞密度下的生长抑制，优选地其中从约一半的目标活细胞密度开始逐渐或逐步地增加所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压水平。目标活细胞密度为约30x106个细胞/ml或更高、约60x106个细胞/ml或更高、约80x106个细胞/ml，优选约100x106个细胞/ml或更高。渗透压可以使用以下各项来控制：(a)恒定的浓缩进料灌注速率和不同的稀释剂灌注速率，其导致不同的总灌注速率；或者(b)恒定的总灌注速率和不同的浓缩进料灌注速率；其中所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维持1x无血清细胞培养灌注培养基中培养基组分的相对比例。因此，渗透压可以使用以下各项来增加：(a)恒定的浓缩进料灌注速率和降低的稀释剂灌注速率，其导致降低的总灌注速率；或者(b)恒定的总灌注速率和增加的浓缩进料灌注速率以及降低的稀释剂灌注速率；其中所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维持1x无血清细胞培养灌注培养基中培养基组分的相对比例。优选地，不将进一步添加剂添加到培养物中以增加渗透压。
28.本领域技术人员将知道如何确定所述哺乳动物细胞的最佳生长渗透压水平。在一个实施方案中，哺乳动物细胞的最佳生长渗透压水平为约280至小于350mosm。将渗透压维持在最适合于生长的水平，直到达到约一半的目标活细胞密度。优选地，从约一半的目标活细胞密度开始逐渐或逐步地增加渗透压，优选地增加至最佳生长渗透压水平的约10-50％。将渗透压增加至并维持在抑制约目标活细胞密度下的细胞生长的渗透压水平，其中在一个实施方案中，抑制哺乳动物细胞的细胞生长的渗透压水平为约350mosm或更高，优选约380mosm或更高。增加渗透压减少或消除了生产阶段期间对细胞排出的需要。
29.当增加渗透压时，抑制细胞生长以维持可持续的活细胞密度且没有细胞排出。细胞培养物中所产生的异源蛋白质的产率相对于对照细胞培养物的产率增加了至少5-50％，其中渗透压没有增加。
30.通常，使用本发明的方法，细胞比灌注速率(pl/细胞/天)相对于1x无血清细胞培养基的细胞比灌注速率降低了至少50％。
31.在某些实施方案中，细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含至少约100l无血清细胞培养灌注培养基，优选至少约1000l无血清细胞培养灌注培养基。优选地，细胞培养物的体积为至少约100l和/或生物反应器的体积为至少约100l。更优选地，细胞培养物的体积为至少约1000l和/或生物反应器的体积为至少约1000l。
32.异源蛋白质可以是治疗性蛋白质、抗体或其治疗有效片段。所述哺乳动物细胞可
以是如选自下组的任何细胞系，所述组由以下各项组成：中国仓鼠卵巢(cho)细胞、jurkat细胞、293细胞、hela细胞、cv-1细胞或3t3细胞或这些细胞中任一种的衍生物。所述cho细胞可以进一步选自下组，所述组由以下各项组成：cho-dg44细胞、cho-k1细胞、cho dxb11细胞、cho-s细胞和cho gs缺陷细胞或其突变体。
33.根据本发明的方法，进一步可以将选自由消泡剂、碱、谷氨酰胺和葡萄糖构成的列表中的一种或多种补充物单独(即另外)添加到细胞培养物中。
34.还提供了一种使用根据本发明的方法产生治疗性蛋白质的方法。
35.还提供了根据本发明的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基或能通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养灌注培养基用于培养哺乳动物细胞，特别是用于在灌注培养中培养哺乳动物细胞的用途。在某些实施方案中，细胞比灌注速率(pl/细胞/天)相对于1x无血清细胞培养基的细胞比灌注速率降低了至少30％。还提供了根据本发明的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基用于将所述至少三种单独的水性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中的用途。
36.此外，本发明提供了使用根据本发明的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基或能通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养灌注培养基以在灌注细胞培养中控制渗透压。增加细胞培养物的渗透压抑制细胞生长并增加异源蛋白质产生。细胞培养物中所产生的异源蛋白质的产率相对于对照细胞培养物的产率增加了至少5-50％，其中渗透压没有增加。在一个实施方案中，生长抑制足以维持可持续的活细胞密度且没有细胞排出。
附图说明
37.图1.生物反应器和进料设置，其绘示了以下各项的单独入口添加：酸性、碱性和中性进料以及稀释剂。
38.图2.随时间的反应器体积交换或灌注速率，以每升生物反应器(l
br
)的培养基升数(l
培养基
)和天为单位给出，例如具有补料策略的灌注培养的典型操作灌注速率(上虚线；vvd意指“每天的容器体积”)，所述补料策略使用三种培养基浓缩物的组合：三种培养基浓缩物(mc；下虚线)的组合、与稀释剂组合的mc(实线)以及组合进料的潜在最大灌注速率。
39.图3.使用浓缩培养基进料 稀释剂补料方案进行的三次100l生物反应器运行的活细胞密度( /-3标准偏差；实线)和活力( /-3sd；虚线)。该细胞系的固有峰值vcd(即没有对生长的高渗透压抑制)》200e6c/ml。通过增加前峰渗透压，培养生长受到抑制，并且峰值vcd受到抑制。
40.图4.三次100l生物反应器运行的渗透压(mosm)，其示出了渗透压逐渐增加直到大约第6天，此时达到目标活细胞密度。从峰值vcd开始，将渗透压保持在》380mosm以抑制细胞增殖。
41.图5.用不同的稀释剂体积、使用固定在每天0.5个容器体积(vvd)的浓缩培养基进料进行的三次100l生物反应器运行的反应器体积交换(亦称灌注速率)。不同的稀释剂体积控制培养容器中的残留渗透压。
42.图6.用不同的稀释剂体积(总灌注速率不同)、使用固定在每天0.5个容器体积(vvd)的浓缩培养基进料进行的三次100l生物反应器运行的渗透物生产率(g/l
生物反应器
/天)。渗透物生产率通过将如由cedex生物分析仪所测量的渗透物每日瞬时滴度(g/l
培养基
)乘以每
日灌注速率(l
培养基
/l
生物反应器
/天)来计算。
43.图7.用不同的稀释剂体积(总灌注速率不同)、使用固定在每天0.5个容器体积(vvd)的浓缩培养基进料进行的三次100l生物反应器运行的表达重组igg的cho细胞培养的每日比生产率(qp，pg/细胞/天)。每日qp通过将生物反应器系统的总生产率(即，通过渗透物回收的产物和保留在生物反应器内的产物)相加并除以每日活细胞密度(vcd)来估计。
44.图8.用不同的稀释剂体积(总灌注速率不同)、使用固定在每天0.5个容器体积(vvd)的浓缩培养基进料进行的三次100l生物反应器运行中cho细胞的细胞比灌注速率(nl/细胞/天)。
45.图9.表达不同重组igg分子的三种bi cho细胞系a(
◇
)、b(
□
)和c(δ)的活细胞密度(vcd，e5c/ml；实线)和活力(％；虚线)。数据来自2l生物反应器规模，其使用三种浓缩培养基进料和不同比例的无菌水稀释剂以保持目标残留渗透压，采用每天两个容器体积(vvd)的恒定灌注速率。
46.图10.表达不同重组igg分子的三种bi cho细胞系a(
◇
)、b(
□
)和c(δ)的残留渗透压(mosm)。数据来自2l生物反应器规模，其使用三种浓缩培养基进料和不同比例的无菌水稀释剂以保持目标残留渗透压，采用每天两个容器体积(vvd)的恒定灌注速率。
47.图11.表达不同重组igg分子的三种bi cho细胞系a(
◇
)、b(
□
)和c(δ)的反应器体积交换(亦称灌注速率；l培养基/l生物反应器/天)。数据来自2l生物反应器规模，其使用三种浓缩培养基进料和不同比例的无菌水稀释剂以保持目标残留渗透压，采用每天两个容器体积(vvd)的恒定灌注速率。
48.图12.表达不同重组igg分子的三种bi cho细胞系a(
◇
)、b(
□
)和c(δ)的渗透物生产率(g/l
生物反应器
/天)。渗透物生产率通过将如由cedex生物分析仪所测量的渗透物每日瞬时滴度(g/l
培养基
)乘以每日灌注速率(l
培养基
/l
生物反应器
/天)来计算。数据来自2l生物反应器规模，其使用三种浓缩培养基进料和不同比例的无菌水稀释剂以保持目标残留渗透压，采用每天两个容器体积(vvd)的恒定灌注速率。
49.图13.表达不同重组igg分子的三种bi cho细胞系a(
◇
)、b(
□
)和c(δ)的每日比生产率(qp，pg/细胞/天)。每日qp通过将生物反应器系统的总生产率(即，通过渗透物回收的产物和保留在生物反应器内的产物)相加并除以每日活细胞密度(vcd)来估计。数据来自2l生物反应器规模，其使用三种浓缩培养基进料和不同比例的无菌水稀释剂以保持目标残留渗透压，采用每天两个容器体积(vvd)的恒定灌注速率。
50.图14.表达不同重组igg分子的三种bi cho细胞系a(
◇
)、b(
□
)和c(δ)的细胞比灌注速率(cell-specific perfusion rate，cspr；nl/细胞/天)。数据来自2l生物反应器规模，其使用三种浓缩培养基进料和不同比例的无菌水稀释剂以保持目标残留渗透压，采用大约每天两个容器体积(vvd)的恒定灌注速率。细胞系之间cspr的不同是由于活细胞密度(vcd)的差异而导致的(对于vcd和活力，参见图9)。进料相对于彼此的比例保持恒定，而进料与稀释剂的总比率根据渗透压计算的质量平衡按照以下等式进行调整：渗透压输入＝渗透压输出 渗透压消耗，其中渗透压输入是灌注到生物反应器中的培养基浓缩进料和稀释剂的渗透压，渗透压输出是生物反应器上清液的残留渗透压，并且渗透压消耗是输入和输出之间的渗透压差。渗透压消耗用于计算给定期望渗透压输出所必需的渗透压输入。然后计算各自的浓缩进料和稀释剂灌注速率，以在2vvd的总灌注速率下实现必需的渗透压输
入。
51.图15.用不同的稀释剂体积，使用固定在每天总计0.5个容器体积(vvd)的三种浓缩培养基进料，在2l生物反应器中培养cho dg44细胞系(细胞系a，δ)和以一式两份运行的两种不同cho-k1细胞系(细胞系b
□
，
◇
；细胞系c x，x)，所述cho dg44细胞系在二氢叶酸还原酶(dhfr)选择系统中表达，并且所述两种不同cho-k1细胞系在谷氨酰胺合成酶(gs)选择系统中表达。所有细胞系都表达不同的重组igg分子。示出的是(a)活细胞密度(vcd；e5c/ml)；(b)活力(％)；(c)渗透物生产率(g/l/天)，所述渗透物生产率通过将如由cedex生物分析仪所测量的渗透物每日瞬时滴度(g/l
培养基
)乘以每日灌注速率(l
培养基
/l
生物反应器
/天)来计算；以及(d)以反应器体积交换(l
培养基
/l
生物反应器
/天)表示的灌注速率。
52.图16.在2l生物反应器中培养在谷氨酰胺合成酶(gs)选择系统中表达重组igg的cho-k1细胞系。以“mc不同，总vvd固定”(
◇
)或“mc固定，总vvd不同”(
□
)灌注控制模式进行运行。“mc不同，总vvd固定”是指恒定的每日总容器体积(vvd)灌注速率，其通过改变组合培养基浓缩物(mc)的灌注速率并同时改变稀释剂速率以维持2vvd来实现。“mc固定，总vvd不同”是指就整体波动的灌注速率而言，mc在0.5vvd下的恒定灌注速率以及不同的稀释剂灌注速率。示出的是(a)活细胞密度(vcd，e5c/ml；主坐标轴)和活力(％；次坐标轴)，(b)渗透压(mosm)，(c)经调整的生产率(g/l
生物反应器
/天)以及(d)反应器体积交换(l
培养基
/l
生物反应器
/天)。
具体实施方式
53.某些术语的定义提供如下。一般而言，除非另有声明或定义，否则本公开中所呈现的任何术语都应给予其在本领域中的普通含义。
54.一般实施方案“包含(comprising)”或“包含(comprised)”涵盖更具体的实施方案“由......组成”。此外，不以限制方式使用单数和复数形式。如本文所用，除非明确声明仅表示单数，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”表示单数和复数二者。
55.如本文所用，术语“灌注”是指维持细胞培养生物反应器，其中同时添加并从反应器中去除等效体积的培养基，同时将细胞保留在反应器中。灌注培养还可以被称为连续培养。这提供了稳定的新鲜营养物来源和细胞废物的不断去除。灌注常用于获得比常规生物反应器分批或补料分批条件高得多的细胞密度，并且因此获得更高的体积生产率。可以连续收获分泌型蛋白质产物，同时将细胞保留在反应器中，，例如通过过滤、交替切向流(atf)、细胞沉降、超声分离、水力旋流或者本领域技术人员已知的任何其他方法或如kompala和ozturk所描述的(cell culture technology for pharmaceutical and cell-based therapies,(2006),taylor&francis group,llc,pages 387-416)。哺乳动物细胞可以在悬浮培养中生长(同质培养)或附着在表面上或包埋在不同的装置中(异质培养)。为了使生物反应器中的工作体积保持恒定，收获速率和细胞排出(流体去除)应等于预定灌注速率。培养通常通过分批培养发起，并且在接种后第2-3天开始灌注，此时细胞仍处于指数生长阶段并且在营养物限制发生之前。以高接种密度(5x106个细胞/ml或更高)接种可能需要更早或甚至立即开始灌注。因此，可以从接种后第0天至第4天开始灌注，优选从接种后第0天至第3天。
56.通过添加新鲜培养基并同时去除用过的培养基，基于灌注的方法提供了优于分批和补料分批方法的潜在改进。大规模商业化细胞培养策略可以达到60-90x106个细胞/ml的
高细胞密度，此时反应器体积的约三分之一至一半以上可能是生物量。使用基于灌注的培养，已经实现》1x108个细胞/ml的极端细胞密度。典型的灌注培养开始于分批培养启动，持续一天或更长时间，以实现快速的初始细胞生长和生物量累积，随后连续、逐步和/或间歇地向培养中添加新鲜的进料培养基，并且同时去除用过的培养基，其中贯穿培养的生长和产生阶段都会保留细胞。在维持细胞的同时，可以使用如沉降、离心或过滤等各种方法来去除用过的培养基。已经采用的灌注流速为每天一小部分容器体积(vvd)直至每天许多个容器体积。
57.如本文所用，术语“灌注速率”是所添加和去除的体积，并且通常每天都进行测量。灌注速率取决于细胞密度和培养基。在确保足够的营养物添加速率和副产物去除速率的同时，应将灌注速率最小化以减少所关注产物的稀释，即收获滴度。灌注通常在接种后第0-3天开始，此时细胞仍处于指数生长阶段，并且因此灌注速率可能会在培养期间增加。灌注速率的增加可以是递增的或连续不断的，即基于细胞密度或营养物消耗。其通常以每天0.5或1个容器体积(vvd)开始，并且可以上升到约5vvd。优选地，灌注速率介于0.5至2vvd之间。增加可以达到每天0.5至1vvd。对于灌注的连续增加，可以基于期望的细胞比灌注速率(cspr)，将生物量探针与收获泵相连接，使得灌注速率作为由生物量探针确定的细胞密度的线性函数增加。cspr等于每细胞密度的灌注速率，并且理想的cspr取决于细胞系和细胞培养基。理想的cspr应导致最佳的生长速率和生产率。每天50至100pl/细胞的cspr可能是合理的起动范围，可以对其进行调整以找到用于特定细胞系的最佳速率。使用至少三种单独的水性浓缩进料，营养物的供应与整体vvd和cspr分离开来，从而允许非常低的cspr，如5至20pl/细胞/天，优选甚至5至10pl/细胞/天。与添加到生物反应器之前混合和稀释的无血清细胞培养灌注培养基相比，或者与常规1x无血清细胞培养灌注培养基相比，这显著减少了如在14天培养期内的培养基消耗，特别是制备培养基消耗。
58.如本文所用，术语“稳态”是指其中细胞密度和生物反应器环境保持相对恒定的状态。这可以通过细胞排出、营养物限制和/或温度降低来实现。在大多数灌注培养中，营养物供应和废物去除将允许恒定的细胞生长和生产率，并且需要细胞排出来维持恒定的活细胞密度或将细胞维持在稳态。稳态下的典型活细胞密度为10至50x106个细胞/ml。活细胞密度可以根据灌注速率而有所不同。可以通过增加灌注速率或通过优化用于灌注的培养基来达到更高的细胞密度。在非常高的活细胞密度下，灌注培养在生物反应器内变得难以控制。
59.术语“细胞排出(cell bleed)”和“细胞排出(cell bleeding)”在本文中可互换地使用，并且是指从生物反应器中去除细胞和培养基以便在生物反应器内维持恒定、可持续的活细胞密度。所述恒定、可持续的活细胞密度还可以被称为目标细胞密度。可以使用汲取管和蠕动泵以限定的流速进行这种细胞排出。管路的尺寸应该合适，因为管太窄容易导致细胞聚集和堵塞，而如果太大，则细胞可能会沉降。细胞排出可以基于生长速率来确定，因此可以以连续的方式将活细胞密度限制在期望体积内。替代地，可以以特定频率(例如，每天一次)去除细胞并用培养基替换，以将细胞密度维持在可预测的范围内。理想地，细胞排出速率等于生长速率，以维持稳定的细胞密度。
60.通常，随细胞排出去除的所关注产物被丢弃，因此在收获时被丢失。与渗透物相反，细胞排出含有细胞，这使得纯化之前的产物储存变得更加困难，并且可能会对产物质量产生不利影响。因此，在储存和产物纯化之前必须连续地去除细胞，这将是费时费力的且成
本效率低下的。对于生长缓慢的细胞，细胞排出可能为被去除流体的约10％，并且对于生长迅速的细胞，细胞排出可能为被去除流体的约30％。因此，通过细胞排出而造成的产物丢失可能为所产生总产物的约30％。如本文所用，“渗透物”是指已从其中分离出要保留在培养容器中的细胞的收获物。
61.术语“培养物”或“细胞培养物”可互换地使用，并且是指在适合于允许细胞群体存活和/或生长的条件下维持在培养基中的细胞群体。本发明仅涉及哺乳动物细胞培养物，并且特别涉及哺乳动物灌注细胞培养物。哺乳动物细胞可以悬浮培养或同时附着在固体支持物上。如对本领域技术人员来说将清楚的是，细胞培养物是指包含细胞群体和其中悬浮所述群体的培养基的组合物。细胞培养物的特定类型没有特别限制，并且可以涵盖细胞培养物的所有形式和技术，包括但不限于灌注、连续、有限、悬浮、贴壁或单层、贴壁依赖性和3d培养物。如本文所用，术语细胞培养物是指无血清细胞培养物。
62.如本文所用，术语“培养”是指哺乳动物细胞在受控条件下和在支持细胞生长和/或存活的条件下生长或维持的过程。如本文所用，术语“维持细胞”与“培养细胞”可互换地使用。培养还可以是指在培养基中接种细胞的步骤。
63.如本文所用，术语“分批培养”是一种不连续方法，其中细胞在固定体积的培养基中生长一小段时间，随后完全收获。使用分批方法生长的培养物的细胞密度会增加，直到达到最大细胞密度，随后随着培养基组分的消耗和代谢副产物(如乳酸和氨)水平的累积，活细胞密度会下降。收获通常发生在实现最大细胞密度(通常为5-10x106个细胞/ml，取决于培养基配制剂、细胞系等)时或之后不久，通常大约3至7天。
64.如本文所用，术语“补料分批培养”通过提供推注或连续培养基进料以补充已经消耗的那些培养基组分来改进分批过程。由于补料分批培养在整个培养过程中都会接受额外的营养物，因此当与分批方法相比时，补料分批培养有可能实现更高的细胞密度(》10至30x106个细胞/ml，取决于培养基配制剂、细胞系等)和增加的产物滴度。与分批过程不同，可以通过操纵补料策略和培养基配制剂来创建并维持双相培养，以将实现期望细胞密度的细胞增殖期(生长阶段)与悬浮或缓慢细胞生长期(生产阶段)进行区分。因此，与分批培养相比，补料分批培养有可能实现更高的产物滴度。与分批方法一样，随着时间的推移，代谢副产物累积将导致细胞活力下降，因为这些副产物会在细胞培养基内逐步累积，这会将生产阶段的持续时间限制在约1.5至3周。补料分批培养是不连续的，并且通常在代谢副产物水平或培养活力达到预定水平时进行收获。
65.术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可与“氨基酸残基序列”互换地使用，并且是指氨基酸的聚合物。这些术语还包括通过包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化或蛋白质加工的反应进行翻译后修饰的蛋白质。在分子维持其生物功能活性的同时，可以在多肽的结构中进行修饰和改变，例如与其他蛋白质的融合、氨基酸序列取代、缺失或插入。例如，某些氨基酸序列取代可以在多肽或其基础核酸编码序列中进行，并且可以获得具有相同特性的蛋白质。这些术语也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物。术语“多肽”通常是指具有多于10个氨基酸的序列，并且术语“肽”是指长度为至多10个氨基酸的序列。
66.如本文所用，术语“异源蛋白质”是指衍生自与宿主细胞不同的生物体或物种的多肽。异源蛋白质由异源多核苷酸编码，所述异源多核苷酸被实验性地放入到不天然表达所
述蛋白质的宿主细胞中。异源多核苷酸还可以被称为转基因。因此，其可能是编码异源蛋白质的基因或开放阅读框架(orf)。当参考蛋白质使用时，术语“异源”还可以指示所述蛋白质包含自然界中彼此关系不相同或长度不相同的氨基酸序列。因此，其也涵盖重组蛋白质。异源还可以是指多核苷酸序列，如基因或转基因、或其一部分，所述多核苷酸序列被插入到其通常不存在的位置中的哺乳动物细胞基因组中。在本发明中，异源蛋白质优选地是治疗性蛋白质。
67.术语“培养基(medium)”、“细胞培养基(cell culture medium)”和“培养基(culture medium)”在本文中可互换地使用，并且是指滋养细胞(特别是哺乳动物细胞)的营养物溶液。细胞培养基配制剂是本领域众所周知的。通常，细胞培养基提供细胞最小生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和微量元素，以及缓冲液和盐。培养基还可以含有在最低速率以上增强生长和/或存活的补充组分，包括但不限于激素和/或其他生长因子(如胰岛素或胰岛素样生长因子)、特定离子(如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、包括微量金属的微量元素(通常以非常低的最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸(包括非蛋白原氨基酸)、脂类、抗氧化剂、葡萄糖和/或其他能源，如有机酸；如本文所描述的。此外，表面活性剂可以包括在培养基中。在某些实施方案中，有利地将培养基配制成最适合于细胞存活和增殖的ph和盐浓度。“细胞培养灌注培养基”或“灌注培养基”是用于连续灌注的培养基。本领域技术人员将理解，在培养期间可以将不属于所述细胞培养基的一部分的进一步组分添加到细胞培养物中。例如，可以单独添加消泡剂。此外，可以仅仅单独添加葡萄糖和/或谷氨酰胺，或除与所述细胞培养基一起提供的葡萄糖之外还单独添加葡萄糖和/或谷氨酰胺。最后，可以将碱(例如，碳酸钠或氢氧化钠)添加到细胞培养物中以在培养期间控制ph。
68.细胞培养基中氨基酸的实例是但不限于蛋白原氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸及其盐或衍生物，以及非蛋白原氨基酸，如羟脯氨酸、鸟氨酸、α-氨基正丁酸及其盐或衍生物。其衍生物包括例如胱氨酸、半胱氨酸的氧化二聚体或二肽，优选氨基酸的丙氨酰或甘氨酰二肽，如谷氨酰胺、酪氨酸或半胱氨酸。无机盐的实例是但不限于氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸钠、偏硅酸钠、微量金属盐等及其水合物。微量金属的实例是但不限于锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼和锰及其盐，如钼酸铵、硫酸铜、亚硒酸钠、氯化锰、硫酸锰、氯化锌、硫酸锌等及其水合物。铁源的实例是但不限于柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸亚铁、氯化亚铁、氯化铁、磷酸亚铁。维生素的实例是但不限于生物素、氯化胆碱、胆碱、泛酸盐、d-钙、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素、生育酚、维生素b12、视黄醇(维生素a)、抗坏血酸盐等及其盐。聚胺的实例是但不限于腐胺、亚精胺和精胺，有机酸可以是牛磺酸或替代碳源，如琥珀酸、丙酮酸、柠檬酸，脂肪酸可以是亚油酸、亚麻酸、棕榈酸和油酸，表面活性剂可以是普朗尼克f68(pluronic f68)，缓冲液可以是例如磷酸盐缓冲液(磷酸二氢盐和磷酸氢二盐)，抗氧化剂可以是例如还原型谷胱甘肽或硫辛酸，并且螯合剂的实例是不限于柠檬酸盐或乙二胺四乙酸(edta)。能源可以是丙酮酸或右旋糖等。可以存在于培养基中的其他化合物是乙醇胺、牛磺酸、异肌醇(i-inositol)和蛋白质，如胰岛素或胰岛素样生长因子。还可以添加化合物以用于配制干粉培养基，如可以添加右旋糖以仅用于研磨目的而不是作
为培养基组分。
69.根据本发明的培养基是在接种后0至4天添加的无血清灌注培养基(或无血清细胞培养灌注培养基)，即灌注培养从细胞培养的第0天至第4天开始。因此，其还可以被称为细胞培养灌注培养基进料，因为其通常在接种后添加。灌注细胞培养可以具有不同的培养阶段，包括生长阶段和生产阶段。在生长阶段(生长培养基)和生产阶段(生产培养基)期间使用的特定培养基可以被特别设计成用于在所述特定阶段实施。通常，在用生产培养基开始灌注之前将细胞接种在生长培养基中。此外，在用生产培养基替换生长培养基之前，可能已经开始灌注。在某些实施方案中，根据本发明的细胞培养基是生产培养基。然而，两种培养基(生长培养基和生产培养基)都是完全培养基并且允许细胞培养物的维持和/或生长(即，不需要与进一步培养基混合)。这与用于补料分批培养的进料培养基或补料分批培养基形成对照，所述进料培养基或补料分批培养基通常是补充所消耗营养物的不完全培养基，但通常会减少如盐和缓冲液等组分以降低培养基的渗透压并允许进料培养基的进一步浓缩。在不与基础培养基或接种培养基混合的情况下，培养基通常不足以支持细胞培养维持。
70.术语“灌注培养基”是指滋养细胞(特别是哺乳动物细胞)的营养物溶液，并且用于灌注培养。其可以是生长培养基和/或生产培养基。其通常被设计成在生产阶段期间支持灌注培养。由于灌注培养基提供稳定的新鲜营养物来源并不断从生物反应器中去除，因此其是允许细胞培养物的维持和/或生长的完全培养基。术语“完全培养基”是指含有旨在存在于细胞培养物中的培养基的所有组分的营养物溶液。
71.根据本发明的无血清细胞培养灌注培养基是完全培养基，并且可以以包含至少三种单独的水性浓缩进料以及稀释剂的经分隔开的形式存在，其中第一浓缩进料是碱性浓缩进料，第二浓缩进料是酸性浓缩进料，并且第三浓缩进料是中性浓缩进料，或在混合后作为所得无血清细胞培养灌注培养基存在。没有明确表征培养基被分隔开的术语“无血清细胞培养灌注培养基”是指在混合后形成的所得无血清细胞培养灌注培养基。由于经分隔开的培养基用于直接添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，因此所得无血清细胞培养基通常不以纯的或分离的形式存在，但而是与已经存在的细胞培养物(即培养基和细胞)的混合物。因此，经分隔开的培养基在混合后调节ph是很重要的。然而，由于在细胞培养期间培养物的ph可能会发生改变，因此在培养期间使用碱调节ph可能仍然是维持恒定ph所必需的。
72.如本文所用，术语“无血清”是指不含有动物或人血清(如胎牛血清)的细胞培养基。优选地，无血清培养基不含从任何动物或人衍生的血清中分离的蛋白质。包括限定培养基在内的各种组织培养基是可商购的，例如，可以使用以下细胞培养基中的任一种或组合：rpmi-1640培养基、rpmi-1641培养基、dulbecco's改良eagle's培养基(dmem)、eagle最小必需培养基、f-12k培养基、ham's f12培养基、iscove's改良dulbecco's培养基、mccoy's 5a培养基、leibovitz's l-15培养基和无血清培养基如ex-cell
tm 300系列(jrh biosciences，lenexa，kansas)等等。还可获得此类培养基的无血清版本。取决于待培养细胞的要求和/或期望的细胞培养参数，细胞培养基可以补充有额外或浓度增加的组分，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素等等。
73.如本文所用，术语“无蛋白质”是指不含有任何蛋白质的细胞培养基。因此，其缺乏从动物或人中分离的蛋白质，缺乏衍生自血清的蛋白质或重组产生的蛋白质，如在哺乳动
物、细菌、昆虫或酵母细胞中产生的重组蛋白质。无蛋白质培养基可以含有单一重组蛋白质，如胰岛素或胰岛素样生长因子，但仅在明确陈述这种添加时才如此。
74.如本文所用，术语“化学限定”是指无血清的并且不含有任何水解产物(如衍生自酵母、植物或动物的蛋白质水解产物)的培养基。优选地，化学限定培养基也是无蛋白质的或仅含有所选的重组产生的(非动物衍生的)蛋白质，如胰岛素或胰岛素样生长因子。化学限定培养基由表征且纯化的物质的混合物组成。化学限定培养基的实例是例如来自invitrogen(carlsbad,ca,us)的cd-cho培养基。
75.如本文所用，术语“悬浮细胞”或“非贴壁细胞”涉及在液体培养基中悬浮培养的细胞。粘附细胞(如cho细胞)可以适于在悬浮液中生长，并且从而丧失其附着于容器或组织培养皿的表面的能力。
76.如本文所用，术语“生物反应器”意指可用于细胞培养物生长的任何容器。生物反应器可以具有任何尺寸，只要其可用于培养细胞；通常，生物反应器被定尺寸成适于在其内部生长的细胞培养物的体积。通常，生物反应器将为至少1升，并且可以为2或更多、5或更多、10或更多、50或更多、100或更多、200或更多、250或更多、500或更多、1,000或更多、1,500或更多、2,000或更多、2,500或更多、5,000或更多、8,000或更多、10,000或更多、12,000或更多升。优选地生物反应器将为至少100升，更优选地至少1,000升。可以在培养期期间控制生物反应器的内部条件，包括但不限于ph和温度。基于相关考虑，本领域普通技术人员将意识到并且将能够选择合适的生物反应器，用于在实践本发明中使用。用于本发明方法的细胞培养物可以在适合于灌注培养的任何生物反应器中生长。生物反应器的特定类型没有特别限制，并且可以涵盖适合于灌注细胞培养的生物反应器的所有类型。
77.如本文所用，“细胞密度”是指给定体积的培养基中的细胞数目。“活细胞密度”是指给定体积的培养基中的活细胞数目，如通过标准活力测定(如台盼蓝染料排除法)所确定的。
78.如本文所用，术语“细胞活力”意指培养中的细胞在给定的一组培养条件或实验变化下存活的能力。如本文所用，所述术语还是指相对于在那时在培养中的活着和死亡细胞总数目，在特定时间活着的细胞部分。
79.如本文所用，术语“滴度”意指在给定量的培养基体积中，通过细胞培养物产生的所关注多肽或蛋白质(其可以是天然存在的或重组的所关注蛋白质)的总量。滴度可以以毫克或微克多肽或蛋白质/毫升(或其他体积量度)培养基为单位表示。
80.如本文所用，术语“产率”是指在特定的时段内在灌注培养中产生的异源蛋白质的量。“总产率”是指在整个运行过程中在灌注培养中产生的异源蛋白质的量。
81.如本文所用，术语“减少(reduction)”、“减少(reduced)”或“下降”一般意指与参考水平相比至少5％的降低，例如与参考水平相比至少10％的降低，或与对照哺乳动物细胞培养物相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约90％、或至多并包括100％的降低、或介于10-100％之间的任何整数降低，所述对照哺乳动物细胞培养物在相同条件下使用相同的无血清细胞培养基培养，如其中渗透压在培养期间，特别是在灌注培养期间不增加。
82.如本文所用，术语“增强(enhancement)”、“增强(enhanced)”、“增强(enhanced)”、“增加(increase)”或“增加(increased)”一般意指与对照细胞相比至少5％的增加，例如与
对照哺乳动物细胞培养物相比至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约200％、或至少300％的降低、或介于10-300％之间的任何整数降低，所述对照哺乳动物细胞培养物在相同条件下使用相同的无血清细胞培养基培养，如其中渗透压在培养期间，特别是在灌注培养期间不增加。
83.如本文所用，“对照细胞培养物”或“对照哺乳动物细胞培养物”是与同其比较的细胞培养物相同的细胞培养物，其使用相同的根据本发明的无血清细胞培养基，不同之处在于渗透压在培养期间，特别是在灌注培养期间不增加，所述无血清细胞培养基包含分组成至少三种水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂。
84.如本文所用，术语“哺乳动物细胞”是适合于产生异源蛋白质，优选治疗性蛋白质，更优选分泌型重组治疗性蛋白质的细胞系。根据本发明的优选哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞，如仓鼠细胞。哺乳动物细胞是分离的细胞或细胞系。哺乳动物细胞优选地是转化和/或永生化的细胞系。它们适于细胞培养中的连续传代，并且不包括原代非转化的细胞或作为器官结构的一部分的细胞。优选的哺乳动物细胞是bhk21、bhk tk-、cho、cho-k1、cho-s细胞、cho-dxb11(也被称为cho-dukx或duxb11)和cho-dg44细胞或此种细胞系中任一种的衍生物/后代。特别优选的是cho-dg44、cho-k1和bhk21，并且甚至更优选的是cho-dg44和cho-k1细胞。最优选的是cho-dg44细胞。还涵盖的是哺乳动物细胞，特别是cho-dg44和cho-k1细胞的谷氨酰胺合成酶(gs)缺陷衍生物。哺乳动物细胞可以进一步包含编码异源蛋白质，优选重组分泌型治疗性蛋白质的一个或多个表达盒。哺乳动物细胞还可以是鼠源性细胞，如鼠源性骨髓瘤细胞，如ns0和sp2/0细胞或此种细胞系中任一种的衍生物/后代。然而，这些细胞、其他哺乳动物细胞(包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿类动物细胞系)的衍生物/后代也可以用于本发明，特别是用于产生生物药物蛋白。
85.如本文所用，术语“生长阶段”是指细胞培养的阶段，其中细胞以指数方式增殖，并且生物反应器中的活细胞密度增加。培养中的细胞通常遵循标准生长模式增殖。培养物接种后可以是滞后阶段，其为当细胞适应培养环境并为快速生长做准备时的缓慢生长时期。生长阶段(也被称为对数生长期或对数期)是其中细胞以指数方式增殖并消耗生长培养基的营养物的时期。其随后是生产阶段。
86.术语“生产阶段”是指一旦开始收获就开始的细胞培养阶段，其可以是在达到目标活细胞密度时或之前。当异源蛋白质在渗透物中达到约0.2克/l
生物反应器
/天时，通常开始收获。典型的目标细胞密度在10x106个细胞/ml至约120x106个细胞/ml的范围内，但可以甚至更高。因此，根据本发明的目标细胞密度为至少30x106个细胞/ml、至少40x106个细胞/ml、至少50x106个细胞/ml、至少60x106个细胞/ml、至少80x106个细胞/ml或至少100x106个细胞/ml。目标细胞密度可以甚至高达100x106个细胞/ml至200x106个细胞/ml，优选120x106个细胞/ml至150x106个细胞/ml。
87.在本文的某些实施方案中，在生产阶段开始时，将细胞培养物的渗透压增加至导致生长抑制的水平。优选地，渗透压从最适合于生长的水平逐渐或逐步地增加。因此，在达到目标活细胞密度之前，需要增加渗透压。优选地，从约一半的目标活细胞密度开始，将渗透压从最适合于生长的水平逐渐或逐步地增加至导致生长抑制的水平。这允许一旦达到目标活细胞密度时，就达到导致生长抑制的渗透压水平。重要的是，维持高渗透压(即，导致生
长抑制的渗透压水平)直到培养结束。本领域技术人员将理解，去除渗透压将去除生长抑制。
88.术语“生长停滞”、“生长抑制(growth inhibition)”和“生长抑制(growth suppression)”在本文中同义使用，并且是指停止数目增加(即，停止细胞分裂)的细胞。细胞周期包含间期和分裂期。间期由三个阶段组成：dna复制限制在s期；g1是m期与s期之间的间隙，而g2是s期与m期之间的间隙。在m期，核分裂，并且然后细胞质分裂。在不存在有丝分裂信号以增殖的情况下或在存在诱导生长停滞的化合物的情况下，细胞周期停滞。细胞可以部分地拆解其细胞周期控制系统，并且从周期中退出到被称为g0的特殊化非分裂状态。通过确定随时间的活细胞密度可以容易地评估生长抑制。优选地，将细胞维持在具有≤30％，更优选≤20％的变化的活细胞密度下。更优选地，将细胞维持在具有≤30％，更优选≤20％的变化的目标活细胞密度下。
89.细胞培养灌注培养基
90.在本公开的一个方面，公开了一种经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中第一浓缩进料是碱性浓缩进料，第二浓缩进料是酸性浓缩进料，并且第三浓缩进料是近中性浓缩进料；其中在将所得无血清细胞培养灌注培养基中的所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基将ph调节至中性ph。在优选的实施方案中，所述至少三种单独的水性浓缩进料在添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前没有被预混合。两种或更多种进料的预混合并不理想，因为在混合后可能会产生沉淀。因此，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基适合于将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中；将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料直接添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，无需之前的预混合；和/或将所述至少三种单独的水性浓缩进料在细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中直接混合。在优选的实施方案中，所述无血清细胞培养灌注培养基包含分组成如所描述的至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂。这包括由所述至少三种单独的水性浓缩进料以及稀释剂组成的无血清细胞培养灌注培养基。培养基组分主要根据其固有特性分布，如在中性ph下的溶解度和/或在碱性或酸性ph下的改进溶解度。在优选的实施方案中，所述无血清细胞培养灌注培养基是生产培养基。本领域技术人员将理解，灌注培养通常使用哺乳动物细胞来进行，因此所述灌注培养基是用于哺乳动物细胞的灌注培养基。
91.本领域技术人员还将理解，在培养期间可以将不属于所述细胞培养基的一部分的进一步组分添加到细胞培养物中。例如，可以单独添加消泡剂。此外，可以仅仅单独添加葡萄糖和/或谷氨酰胺进料，或除与所述细胞培养基一起提供的葡萄糖和/或谷氨酰胺之外还单独添加葡萄糖和/或谷氨酰胺。最后，可以将碱(例如，碳酸钠或氢氧化钠)添加到细胞培养物中以在培养期间控制ph。
92.在一个实施方案中，所述无血清细胞培养灌注培养基可以是化学限定的和/或无水解产物的。无水解产物意指所述培养基不含有来自动物、植物(大豆、马铃薯、米)、酵母或其他来源的蛋白质水解产物。通常，化学限定培养基是无水解产物的。在任何情况下，所述无血清灌注培养基应不含衍生自动物来源的化合物，特别是衍生自动物和从其分离出的蛋
白质或肽(这不包括由细胞培养物产生的重组蛋白质)。优选地，所述无血清细胞培养灌注培养基是无蛋白质的或无除重组胰岛素和/或胰岛素样生长因子之外的蛋白质的。因此，所述无血清细胞培养基可以是无蛋白质培养基或包含重组胰岛素和/或重组胰岛素样生长因子的无蛋白质培养基。本领域技术人员将理解，无蛋白质培养基通常是化学限定的和/或无水解产物的。更优选地，所述无血清细胞培养灌注培养基是化学限定的和无蛋白质的或无除重组胰岛素和/或胰岛素样生长因子之外的蛋白质的。这也适用于所述方法中所使用的或根据本发明的方法制备的无血清培养灌注培养基。如果使用初始生长培养基和生产培养基，则这适用于这两种培养基。
93.为了将所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基调节至期望的“工作”浓度，将所述至少三种单独的水性浓缩进料中的每一种的适当体积以一定的比率进行混合以提供所述无血清细胞培养灌注培养基，即在工作浓度下的所述无血清细胞培养灌注培养基，所述比率由所述至少三种单独的水性浓缩进料相对于彼此的倍数浓度来确定，并且所述至少三种单独的水性浓缩进料用所述稀释剂稀释。尽管用于根据本发明的无血清细胞培养灌注培养基的稀释剂理论上也可以是水性盐溶液和/或水性缓冲液，但其优选地是无菌水。无菌水是有利的，因为其不需要制备或混合，并且因此无需为预制组分提供额外的储存空间。所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)确定细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中所述无血清细胞培养灌注培养基的倍数浓度，所述至少三种单独的水性浓缩进料添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中以提供将ph调节至近中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基。因此，使用所述至少三种单独的水性浓缩进料的优势在于所述培养基的倍数浓度可以适应活细胞密度和营养需要(维持营养平衡)。渗透压可以用作估计系统内外营养平衡的替代指标。因此，渗透压平衡可以用于计算浓缩进料累积体积(以它们相对于彼此的固定比率)和稀释剂进料速率的调整，以实现期望的残留渗透压和营养水平。
94.在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所得无血清细胞培养灌注培养基将ph调节至中性ph。这意指在混合后ph被自动调节，而无需添加滴定剂，如naoh或hcl。在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所述培养基的ph应为中性ph，其介于约6.7至约7.5之间，优选地介于约6.9至约7.4之间，并且更优选地介于约6.9至约7.2之间。
95.所述碱性浓缩进料可以是2x至80x浓缩进料，优选20x至40x浓缩进料，更优选20x至30x浓缩进料，并且最优选25x进料。通常优选较高浓缩的进料。然而，为了获得最佳结果，例如所述碱性浓缩进料可以被制备为未最大程度浓缩的浓缩进料，以更好地匹配所述近中性和/或酸性进料。这也会使所述浓缩进料(如所述碱性浓缩进料)中的滴定剂安全。所述近中性浓缩进料可以是2x至50x浓缩进料，优选10x至40x浓缩进料，更优选20x至30x浓缩进料，并且最优选25x浓缩进料。所述酸性浓缩进料可以是2x至40x浓缩进料、4x至20x浓缩进料、5x至12x浓缩进料或6x至10x浓缩进料。通常，优选较高浓缩的进料(碱性、酸性和中性，组合的和单个的)。然而，为了获得最佳结果，例如所述碱性浓缩进料可以被制备为未最大程度浓缩的浓缩进料(例如，小于80x)，以更好地匹配所述近中性和/或酸性进料。这也会使所述浓缩进料(如所述碱性浓缩进料)中的滴定剂安全。
96.在一个实施方案中，所述碱性浓缩进料是2x至80x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是
2x至40x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是2x至50x浓缩进料，优选地所述碱性浓缩进料是20x至40x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是4x至20x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是10x至40x浓缩进料，更优选地碱性浓缩进料是20x至30x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是5x至12x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是20x至30x浓缩进料，并且最优选地所述碱性浓缩进料是25x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是6x至10x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是25x浓缩进料。在特定的实施方案中，所述碱性浓缩进料和所述近中性浓缩进料被大致相似地浓缩。因此，例如所述碱性浓缩进料是20x至30x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是20x至30x浓缩进料，或所述碱性浓缩进料是25x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是25x浓缩进料，并且所述酸性浓缩进料被最大程度地浓缩。
97.在所述无血清细胞培养灌注培养基中，所述碱性浓缩进料与所述酸性浓缩进料与所述近中性浓缩进料的比率(v/v/v)为固定比率，以提供将ph调节至中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基。因此，其中所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维持1x无血清细胞培养灌注培养基(1x配制剂)中培养基组分的相对比例。换句话说，进料彼此之间的比率应使得1x配制剂的原始比率被维持。例如，如果所述碱性浓缩进料是25x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是6x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是25x浓缩进料，则浓缩进料以1:4.2:1的比率添加，或如果所述碱性浓缩进料是30x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是10x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是30x浓缩进料，则浓缩进料以1:3:1的比率添加。此外，将ph调节至中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基中所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)确定所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压。将ph调节至中性ph的所述无血清细胞培养灌注培养基中所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)还确定所述无血清细胞培养灌注培养基的倍数浓度。倍数浓度可以是从0.1x至最大倍数浓度的任何值，但通常介于0.5x至2x之间，优选地介于1x至2x之间。所述三种单独的水性浓缩进料混合后的最大倍数浓度(n
最大
x)可以如下计算出来：
98.n
最大
x＝(n
碱性
x*n
酸性
x*n
中性
x)/((n
碱性
x*n
酸性
x) (n
碱性
x*n
中性
x) (n
酸性
x*n
中性
x))，
99.其中
100.n
最大
x是所述三种单独的水性浓缩进料混合后的最大倍数浓度；
101.n
碱性
x是所述碱性浓缩进料的n倍浓度；
102.n
酸性
x是所述酸性浓缩进料的n倍浓度；
103.n
中性
x是所述近中性浓缩进料的n倍浓度；并且
104.*
表示数学运算乘法。
105.例如，如果所述碱性浓缩进料是25x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是6x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是25x浓缩进料，则所述三种单独的水性浓缩进料混合后的最大倍数浓度为4.1x。因此，制备培养基消耗减少约75％。如果所述碱性浓缩进料是30x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是10x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是30x浓缩进料，则所述三种单独的水性浓缩进料混合后的最大倍数浓度为6x。因此，制备培养基消耗减少80％以上。此外，使用浓缩进料允许调整细胞培养物和/或生物反应器中所述无血清细胞培养基的倍数浓度，并且因此允许以相似或仅适度增加的灌注速率并从而以降低的细胞比灌注速率来维持较高的活细胞密度。
106.所述无血清细胞培养灌注培养基包含碱性浓缩料、酸性浓缩料和近中性浓缩料。近中性浓缩进料是指ph为7.5
±
1.0。因此，所述近中性浓缩进料的ph为约6.5至约8.5。所述近中性浓缩进料优选地不含有任何额外的滴定剂。避免使用滴定剂节省所得无血清细胞培养灌注培养基中的渗透压空间。因此，所述近中性浓缩进料的ph在高达约8.5的ph下可能是略微碱性的。优选地近中性ph的ph为约7至约8.5，更优选地为约7.5至约8.5。
107.所述碱性浓缩进料的ph可以为约9或更高，如ph为约9至约11，优选地ph为约9.8至约10.8，更优选地ph为约9.8至约10.5。所述酸性浓缩进料的ph可以为约5或更低，如ph为约2至约5，优选地ph为约3.6至约4.8，并且更优选地ph为约3.8至约4.5。尽管可以相当精确地调节ph，但典型的ph变化是0.5的变化。
108.在一个实施方案中，所述碱性浓缩进料的ph为约9或更高，所述酸性浓缩进料的ph为约5或更低，并且所述近中性浓缩进料的ph为约7至约8.5。优选地，所述碱性浓缩进料的ph为约9至约11，所述酸性浓缩进料的ph为约2至约5，并且所述近中性浓缩进料的ph为约7至约8.5；更优选地，所述碱性浓缩进料的ph为约9.8至约10.8，所述酸性浓缩进料的ph为约3.6至约4.8，并且所述近中性浓缩进料的ph为约7至约8.5；并且最优选地，所述碱性浓缩进料的ph为约9.8至约10.5，所述酸性浓缩进料的ph为约3.8至约4.5，并且所述近中性浓缩进料的ph为约7.5至约8.5。
109.培养基组分主要根据其固有特性分布，如在中性ph下的溶解度和/或在碱性或酸性ph下的改进溶解度。此外，可以将特别不溶于水溶液的培养基组分分成单独的进料。例如，氯化胆碱可以与所述近中性浓缩进料和所述酸性浓缩进料一起提供，以便在最终无血清细胞培养基中实现所需的浓度。
110.所述近中性浓缩进料优选地包含在中性ph下可溶的所有维生素。进一步地，所述近中性浓缩进料优选地不含有任何金属。由于金属可能与某些维生素相互作用，因此维生素优选地保持与金属分离。因此，优选地在所述近中性浓缩进料中并替代地在所述酸性浓缩进料中提供维生素。一个例外是叶酸，其也可以与所述碱性进料一起提供。因此，在一个实施方案中，将维生素和金属提供在单独的进料中，优选地维生素在所述近中性进料中并且金属在所述酸性进料中。然而，在中性ph的水溶液中难溶的维生素也可以在所述酸性进料中。例如，还可以将如泛酸盐、硫胺素、氯化胆碱和/或吡哆醇等维生素提供在所述酸性进料中。此外，通常难溶于水溶液的维生素，如氯化胆碱，可以存在于所述中性进料和所述酸性进料中。所述中性浓缩进料还可以包含化合物，如l-α-氨基-正丁酸、异肌醇和/或脂肪酸亚油酸。此外，碳酸氢盐优选地与所述中性浓缩进料一起提供。在一个实施方案中，所述中性浓缩进料不含有用于ph调节的任何额外滴定剂。
111.将盐和金属优选地提供在所述酸性浓缩进料中。例如但不限于，所述酸性浓缩进料可以包含微量元素、微量金属、无机盐、铁源螯合剂、聚胺和/或调控激素，如胰岛素或胰岛素样生长因子。选自下组的氨基酸优选地在所述酸性浓缩进料中，所述组由以下各项组成：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。此外，可以将表面活性剂、抗氧化剂和碳源以及任选的乙醇胺和/或脂肪酸提供在所述酸性浓缩进料和/或所述近中性浓缩进料中。
112.所述碱性浓缩进料主要包含在约9或更高的碱性ph下具有最大溶解度的氨基酸。
优选地，所述碱性浓缩进料至少包含天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸是水溶性的，但在中性ph下容易氧化成水溶性差的胱氨酸。因此，半胱氨酸和/或胱氨酸优选在所述碱性浓缩进料中。在约9或更高的碱性ph下可溶的另一化合物是叶酸。因此，叶酸也可以与所述碱性进料一起提供。不与所述碱性浓缩进料一起提供的氨基酸优选地与所述酸性浓缩进料一起提供。因此，在一个实施方案中，可以将剩余的氨基酸(即，在约9或更高的碱性ph下不具有最大溶解度的氨基酸和/或不与所述碱性进料一起提供的氨基酸)提供在所述酸性和/或近中性浓缩进料中，优选地在所述酸性浓缩进料中。
113.本领域技术人员将理解，与例如用于补料分批培养培养的进料培养基相比，完全培养基更难作为浓缩物提供，因为其包含更多组分，特别是增加渗透压并因此限制渗透压空间的盐和缓冲液。此外，与现有技术培养基(如rpmi 1640和dmem/f12等)相比，现代营养丰富的培养基更难作为浓缩物提供。这些更现代的营养丰富的培养基特别富含氨基酸，其通常包含mm范围而不是μm范围内的氨基酸。因此，根据本发明的无血清细胞培养灌注培养基是包含氨基酸的培养基，所述氨基酸在1x无血清细胞培养灌注培养基中的浓度超过50mm，优选超过70mm，更优选超过100mm，甚至更优选超过120mm。由于有时单独添加谷氨酰胺，因此所述无血清细胞培养灌注培养基优选地包含除谷氨酰胺之外的天然氨基酸，其在所得无血清细胞培养灌注培养基中的浓度超过50mm，优选超过70mm，更优选超过100mm，甚至更优选超过120mm。除谷氨酰胺之外的天然氨基酸是指丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。然而，并非所有天然氨基酸都需要存在于所述无血清细胞培养灌注培养基中，如例如丙氨酸和甘氨酸。天然氨基酸还包括天然氨基酸的衍生物，如二肽或胱氨酸。
114.本领域技术人员对关于细胞培养基组成以及用于其他过程特征和培养性能的各个过程进行优化。例如，并且特别是在细胞密度不是很高的材料的情况下，它们可以在摇瓶中进行测试。在需要更高氧合速率的情况下，可以使用旋转管(如例如在strnad et al.,biotechnol.prog.,2010,vol.26,no.3,pages 653-663中所公开的)，其以更高的每分钟转数(rpm)搅动。旋转管生物反应器可以有利地用作小规模模型，其用于评价培养基、各种过程参数以及高密度(》20e6c/ml)下的生长特征。它们还可以通过减轻对大型培养基制备和实验室规模生物反应器操作的需要来减少过程开发所需的时间和精力。离心多个旋转管以进行培养基交换的能力使得能够以小规模(工作体积15ml)进行灌注细胞培养。
115.所述至少三种单独的水性浓缩进料在储存之前和在混合之前优选地是无菌的。在一个实施方案中，将所述至少三种单独的水性浓缩进料过滤灭菌。另外，关于组分的混合，所述至少三种单独的水性浓缩进料在添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前没有被预混合。因此，优选地将所述水性浓缩进料直接添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，优选地通过单独的入口点添加。
116.所述入口点可以是生物反应器中的阀或端口。优选地，逐滴添加所述至少三种单独的水性浓缩进料。有利的是，所述至少三种单独的水性浓缩进料以预定的灌注速率连续添加，并且因此同时添加。它们可以从底部、从顶部或从生物反应器的侧面添加，并且彼此相邻或在不同的侧面，只要培养物连续混合即可。
117.可以将所述稀释剂(例如，无菌水)单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反
应容器中。因此，优选地将所述稀释剂直接添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，优选地通过与所述至少三种单独的水性浓缩进料的入口点分开的入口点添加。所述入口点可以是生物反应器中的阀或端口。有利的是，所述稀释剂以预定的灌注速率连续添加，并且因此与所述至少三种单独的水性浓缩进料同时添加。其可以从底部、顶部或从生物反应器的侧面添加，并且与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种或全部相邻或在不同的侧面，只要培养物连续混合即可。替代地，可以在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种预混合。因此，可以将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种一起添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，优选地通过与所述至少两种其他单独的水性浓缩进料分开的入口点添加。在一个实施方案中，在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述碱性浓缩进料预混合。
118.在另一方面，本发明还涉及根据本发明的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基用于优选地在灌注培养中培养哺乳动物细胞的用途。在一个实施方案中，根据本发明的细胞培养基用于控制细胞培养物，优选灌注细胞培养物的渗透压。特别地，在灌注细胞培养中增加渗透压。增加细胞培养物的渗透压抑制细胞生长并增加异源蛋白质产生。通过增加细胞培养物的渗透压，可以抑制细胞生长以维持可持续的活细胞密度且没有细胞排出，这也可以被称为动态灌注培养。
119.通过增加细胞培养物的渗透压，细胞培养物中所产生的异源蛋白质的产率相对于对照细胞培养物的产率可以增加至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％或约5-50％，优选约10-100％，其中渗透压未增加。优选地，确定部分或整个培养期的产率。
120.通过使用根据本发明的无血清细胞培养基或通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养基并且任选地进一步增加细胞培养物的渗透压，细胞比灌注速率(pl/细胞/天)相对于1x无血清细胞培养基的细胞比灌注速率降低至少约25％、至少30％或至少约50％。根据本发明的无血清细胞培养灌注培养基或通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养基的细胞比灌注速率(pl/细胞/天)在部分或整个培养期内优选地是恒定的。
121.本发明还涉及一种碱性水性浓缩进料，所述碱性水性浓缩进料用于与酸性水性浓缩进料、近中性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所述无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。在另一实施方案中，本发明涉及一种酸性水性浓缩进料，所述酸性水性浓缩进料用于与碱性水性浓缩进料、近中性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。在又另一方面，本发明涉及一种近中性水性浓缩进料，所述近中性水性浓缩进料用于与碱性水性浓缩进料、酸性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。其中可以如上文所公开的来进一步表征所述碱性水性浓缩进料、所述酸性水性浓缩进料、所述近中性水性浓缩进料、所述稀释剂和所述无血清细胞培养灌注培养基。
122.制备无血清细胞培养灌注培养基的方法。
123.在又另一方面，本发明涉及一种制备无血清细胞培养灌注培养基的方法，所述方法包含：(a)基于在碱性、酸性和中性ph下的溶解度，以组分的至少三种亚组提供细胞培养
基组分，(b)(i)于碱性水溶液提供在碱性ph下可溶的亚组组分以形成碱性浓缩进料；(ii)于酸性水溶液提供在酸性ph下可溶的亚组组分以形成酸性浓缩进料；以及(iii)于中性水溶液在中性ph下可溶的亚组组分以形成近中性浓缩进料；(c)任选地将所制备的碱性浓缩进料、酸性浓缩进料和近中性浓缩进料储存在单独的容器中；以及(d)将所制备的碱性浓缩进料、酸性浓缩进料和近中性浓缩进料以及稀释剂添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，其中(i)将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中；并且(ii)将所述稀释剂单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，或者在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种预混合；其中在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至近中性ph。因此，根据所述方法制备的无血清细胞培养灌注培养基包含如所公开的用于根据本发明的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基的培养基组分和稀释剂，所述培养基组分分组成至少三种单独的水性浓缩进料。通常，在添加所述至少三种单独的水性浓缩进料以及所述稀释剂后，细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含哺乳动物细胞。
124.所述方法可以包含在储存和/或添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前优选地通过过滤灭菌对所述浓缩进料进行灭菌的步骤。细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含至少约100l无血清细胞培养灌注培养基，优选至少约1000l无血清细胞培养灌注培养基。
125.优选地，将所述三种浓缩进料通过单独的端口逐滴添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中。与在添加到生物反应器之前混合和稀释的无血清细胞培养灌注培养基相比，容器内混合和稀释所述至少三种单独的水性浓缩进料允许在14天的培养期内使制备培养基消耗降低50-90％，优选60-90％。可以使用上文提供用于计算所述至少三种单独的水性浓缩进料混合后的最大倍数浓度(n
最大
x)的公式来计算制备培养基消耗的减少，并且计算所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积相对于进一步包含所述稀释剂的1x无血清细胞培养灌注培养基的体积百分比。
126.将所述至少三种单独的浓缩进料和所述稀释剂单独添加使得能够控制生物反应器中所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压。如果在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种预混合，则也可以控制生物反应器中所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压。
127.可以使用恒定的浓缩进料灌注速率和不同的稀释剂灌注速率(其导致不同的总灌注速率)来控制细胞培养物的渗透压。恒定的浓缩进料灌注速率涉及所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积灌注速率，所述至少三种单独的水性浓缩进料更具体地是所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料。总灌注速率是所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂的累积灌注速率。替代地，可以使用恒定的总灌注速率和不同的浓缩进料灌注速率来控制细胞培养物的渗透压。这自然地导致不同的稀释剂灌注速率。在另一替代方案中，可以使用恒定的稀释剂灌注速率和不同的浓缩进料灌注速率(其导致不同的总灌注速率)来控制细胞培养物的渗透压。
128.所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维
持1x无血清细胞培养灌注培养基中培养基组分的相对比例。在一个实施方案中，所述碱性浓缩进料与所述酸性浓缩进料与所述近中性浓缩进料的比率(v/v/v)是固定比率，以提供在细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中将ph调节至中性ph的所述无血清细胞培养灌注培养基；并且所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)确定细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压和/或倍数浓度，所述至少三种单独的水性浓缩进料添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中以提供将ph调节至近中性ph的所述无血清细胞培养灌注培养基。
129.细胞培养物的渗透压可以使用以下各项来增加：恒定的浓缩进料灌注速率和降低的稀释剂灌注速率，其导致降低的总灌注速率；或恒定的总灌注速率和增加的浓缩进料灌注速率以及降低的稀释剂灌注速率；或恒定的稀释剂灌注速率和增加的浓缩进料灌注速率，其导致增加的总灌注速率；其中所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维持1x无血清细胞培养灌注培养基中培养基组分的相对比例。在一个实施方案中。优选地，不将进一步添加剂添加到培养物中以增加渗透压。
130.在又另一方面，本发明涉及一种能通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养灌注培养基。
131.细胞培养方法
132.出于理解的目的，熟练从业人员将理解的是，用于蛋白质生产的细胞培养和培养运行可以包括至少三种一般类型；即，灌注培养、分批培养和补料分批培养。在灌注培养中，例如，在培养期间向细胞提供新鲜培养基补充物，同时每天去除旧培养基并且例如每天或连续地收获产物。在灌注培养中，灌注培养基可以每天添加，并且可以连续添加，即作为滴注或输注。对于灌注培养，只要细胞保持存活并且环境和培养条件得到维持，细胞就可以在培养中保持期望长的时间。由于细胞连续地生长，因此通常需要在运行期间去除细胞以便维持恒定的活细胞密度，这被称为细胞排出。细胞排出含有与细胞一起去除的培养基中的产物，其通常被丢弃并因此被浪费。因此，在没有或仅具有最低限度细胞排出的生产阶段期间维持活细胞密度是有利的，并且增加每次运行的总产率。
133.在分批培养中，细胞最初在培养基中培养，并且该培养基不被去除、替换或补充，即，在培养运行期间或结束之前，没有用新培养基“喂养”细胞。在培养运行结束时收获期望的产物。分批培养还可以是指补料分批或灌注培养的初始阶段。对于灌注培养，在开始灌注培养之前，哺乳动物细胞可以例如最初以分批培养方式进行培养。
134.对于补料分批培养，通过在运行期间每天(或连续地)用新鲜培养基补充培养基一次或更多次来增加培养运行时间，即，在培养期过程中用新培养基(“补料培养基”)“喂养”细胞。补料分批培养可以包括如上文所描述的各种补料方案和时间，例如，每天、每隔一天、每两天等、每天多于一次、或每天少于一次，等等。进一步地，补料分批培养可以用补料培养基连续补料。然后在培养/生产运行结束时收获期望的产物。
135.哺乳动物细胞可以在灌注培养中培养。在异源蛋白质生产期间，期望具有受控系统，其中将细胞生长至期望的活细胞密度，然后将细胞转换至生长停滞的高生产率状态，其中细胞使用能量和底物来产生所关注异源蛋白质，而不是细胞生长和细胞分裂。用于完成该目的的方法，如温度变动和氨基酸饥饿，并非总是成功的，并且可能对产物质量具有不期望的作用。如本文所描述，通过进行常规细胞排出，可以将在生产阶段期间的活细胞密度维
持在期望的水平下。然而，这导致将所关注异源蛋白质丢弃。在生产阶段期间细胞生长停滞导致对细胞排出的需要减少，并且甚至可以将细胞维持在更生产性的状态下。
136.在一个方面，提供了一种在灌注培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，所述方法包含：(a)在无血清细胞培养基中用表达异源蛋白质的哺乳动物细胞接种生物反应器；(b)通过用无血清细胞培养灌注培养基进料连续喂养所述哺乳动物细胞并去除用过的培养基并同时将所述细胞保持在培养中来在灌注培养中培养所述哺乳动物细胞，其中所述无血清细胞培养灌注培养基进料是(i)经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中第一浓缩进料是碱性浓缩进料，第二浓缩进料是酸性浓缩进料，并且第三浓缩料是近中性浓缩料；并且其中在将所得无血清细胞培养灌注培养基中的所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基将ph调节至中性ph；和/或(ii)一种通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养灌注培养基，并且其中将所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基进料的所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，并且其中将所述稀释剂单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，或者在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种预混合。
137.在一个实施方案中，在开始灌注培养之前，哺乳动物细胞最初以分批培养方式进行培养。通常，在步骤(a)中，所述无血清细胞培养基是生长培养基。步骤(a)可以进一步包含在生长培养基中培养哺乳动物细胞并使用所述生长培养基开始灌注培养。在步骤(b)中，在灌注培养中培养哺乳动物细胞包含：在生产阶段期间通过用根据本发明的无血清细胞培养基或通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养基灌注来培养哺乳动物细胞，直到达到目标细胞密度；以及通过用本发明的无血清细胞培养基或通过本发明的方法获得的无血清细胞培养基灌注来进一步在生产阶段期间将哺乳动物细胞维持在目标细胞密度下。用于灌注培养的所述无血清细胞培养灌注培养基可以是生产培养基，所述灌注培养通过根据步骤(b)的连续喂养哺乳动物细胞并去除用过的培养基并同时将所述细胞保持在培养中来进行。所述方法进一步包含从细胞培养物中收获所述异源蛋白质的步骤。
138.生产阶段通常在达到目标细胞密度之前开始。目标细胞密度取决于细胞系和细胞系的最大活细胞密度，并且通常为最大活细胞密度的约15-45％。生产阶段可以从10x106个细胞/ml至约120x106个细胞/ml或甚至更高的细胞密度开始。优选地，生产阶段起始于至少10x106个细胞/ml、至少20x106个细胞/ml、至少30x106个细胞/ml、至少40x106个细胞/ml或至少50x106个细胞/ml的细胞密度。通常，当培养在渗透物中达到0.2
±
0.1g/l
生物反应器
/天或更高的异源蛋白质时开始生产阶段，此时是开始纯化异源蛋白质的时间。
139.根据本发明的方法，在步骤(a)中，培养哺乳动物细胞可以限于在无血清培养基中接种表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，并且因此不需要但可以包括在灌注开始之前的培养步骤，并且进一步不需要但可以包括开始灌注培养。通常在步骤(a)中使用生长培养基，其被根据本发明的培养基替换或在步骤(b)中根据本发明的方法获得，也被称为生产培养基。进一步根据本发明的方法，在生产阶段期间通过灌注来维持哺乳动物细胞包括在生产阶段期间通过以约目标活细胞密度的基本恒定的活细胞密度灌注来培养哺乳动物细胞，其中基
本恒定的活细胞密度意指在活细胞密度的30％，优选20％，更优选10％内的变化。
140.本发明还涉及一种产生异源蛋白质的方法，所述方法包含使用根据本发明的在灌注培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法。本领域技术人员将理解，根据本发明的方法是体外培养方法。
141.在一个实施方案中，所述无血清细胞培养灌注培养基可以是化学限定的和/或无水解产物的。优选地，所述无血清细胞培养灌注培养基是无蛋白质的或无除重组胰岛素和/或胰岛素样生长因子之外的蛋白质的。因此，所述无血清细胞培养灌注培养基可以是无蛋白质培养基或包含重组胰岛素和/或重组胰岛素样生长因子的无蛋白质培养基。更优选地，所述无血清灌注培养基是化学限定的和无蛋白质的或无除重组胰岛素和/或胰岛素样生长因子之外的蛋白质的。这也适用于根据本发明方法的步骤(a)中所使用的无血清培养基。
142.在开始灌注培养之前，哺乳动物细胞最初可以以分批培养方式进行培养。通常，灌注培养从分批培养的第0天至第5天，优选从第0天至第4天，更优选从第0天至第3天开始。灌注开始后灌注速率增加，直到达到目标活细胞密度。灌注速率可以例如从每天小于或等于0.5个容器体积增加至每天约5个容器体积，优选地从每天小于或等于0.5个容器体积增加至每天约2个容器体积。
143.如上文已解释的，本发明的方法可以进一步包含通过稳态下的细胞排出来维持细胞密度的步骤。该背景下所提及的细胞密度是活细胞密度，其可以通过本领域已知的任何方法来确定。例如，控制细胞排出速率的计算可以基于维持与目标vcd相对应的incyte
tm
活细胞密度探针(company)或futura
tm
生物量电容探针值(instruments)，或者每日细胞和活力计数可以经由任何细胞计数装置离线进行，如血球计、vi-cell xr
tm
(beckman)、cedex hi-res
tm
或viacount
tm
测定(emdguava)。与对照灌注细胞培养相比，使用本发明的方法，可以通过增加渗透压来消除或减少细胞排出，其中对照灌注细胞培养是在相同条件下使用相同的无血清灌注培养基且不增加根据本发明的细胞培养物的渗透压的灌注细胞培养。更具体地，与对照灌注细胞培养相比，可以减少细胞排出，其中对照灌注细胞培养是在相同条件下使用相同的无血清灌注培养基且不增加渗透压的灌注细胞培养。没有细胞排出的灌注细胞培养也可以被称为“动态灌注培养”或“动态灌注过程”。优选地，动态灌注培养还包含高活细胞密度，例如，高于80x106个细胞/ml、高于100x106个细胞/ml、高于120x106个细胞/ml或甚至高于140x106个细胞/ml和/或小于30天，优选14-16天的相对短培养时间。
144.在一个实施方案中，可以将所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压增加至高于最佳的生长渗透压水平，从而导致在目标活细胞密度下的哺乳动物细胞生长抑制，优选地其中从约一半的目标活细胞密度开始逐渐或逐步地增加所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压水平。目标活细胞密度可以为约30x106个细胞/ml或更高、约60x106个细胞/ml或更高、约80x106个细胞/ml，优选约100x106个细胞/ml或更高。目标活细胞密度可以甚至高达约100x106个细胞/ml至200x106个细胞/ml，优选约120x106个细胞/ml至150x106个细胞/ml。对于固有最大活细胞密度大于150x106个细胞/ml的细胞系，通常需要抑制细胞生长以确保充足的氧气供应，避免过度的细胞凝结(所述细胞凝结可能会阻塞细胞保留装置)，最大限度地减少废物代谢物积累的影响等，尽管已实现200x106个细胞/ml的目标活细胞密度。
145.可以使用恒定的浓缩进料灌注速率和不同的稀释剂灌注速率(其导致不同的总灌
注速率)来控制细胞培养物的渗透压。恒定的浓缩进料灌注速率涉及至少三种单独的水性浓缩进料的累积或总灌注速率，所述至少三种单独的水性浓缩进料更具体地是所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料。可以例如以0.5vvd的恒定总灌注速率补料所述浓缩进料(例如，以0.33vvd的6x酸性进料，各自以0.08vvd的25x碱性和近中性进料)。总灌注速率是所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂的累积灌注速率。替代地，可以使用恒定的总灌注速率和不同的浓缩进料灌注速率来控制细胞培养物的渗透压。这自然地导致不同的稀释剂灌注速率。在另一替代方案中，可以使用恒定的稀释剂灌注速率和不同的浓缩进料灌注速率(其导致不同的总灌注速率)来控制细胞培养物的渗透压。所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维持1x无血清细胞培养灌注培养基中培养基组分的相对比例。换句话说，所述碱性浓缩进料与所述酸性浓缩进料与所述近中性浓缩进料的比率(v/v/v)为固定比率(对于每种培养基)，以提供在细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中将ph调节至中性ph的所述无血清细胞培养灌注培养基。优选地，使用恒定的浓缩进料灌注速率和不同的稀释剂灌注速率(其导致不同的总灌注速率)来控制细胞培养物的渗透压。
146.细胞培养物的渗透压(和所述无血清细胞培养灌注培养基的倍数浓度)可以使用以下各项来增加：恒定的浓缩进料灌注速率和降低的稀释剂灌注速率，其导致降低的总灌注速率；或恒定的总灌注速率和增加的浓缩进料灌注速率以及降低的稀释剂灌注速率；或恒定的稀释剂灌注速率和增加的浓缩进料灌注速率，其导致增加的总灌注速率；其中所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维持1x无血清细胞培养灌注培养基中培养基组分的相对比例。优选地，不将用于增加渗透压的进一步添加剂(如nacl)添加到培养物中。优选地，使用恒定的浓缩进料灌注速率和降低的稀释剂灌注速率(其导致降低的总灌注速率)来增加细胞培养物的渗透压。在优选的实施方案中，不将用于增加渗透压的进一步添加剂添加到培养物中。
147.增加所述稀释剂与所述至少三种的单独水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)确定细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压以及倍数浓度，所述至少三种单独的水性浓缩进料添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中以提供将ph调节至近中性ph的所述无血清细胞培养灌注培养基。所述无血清细胞培养基的倍数浓度可以为从0.1x至最大倍数浓度的任何值，其可以如上文所解释的进行计算。使用浓缩进料允许调整细胞培养物和/或生物反应器中所述无血清细胞培养基的倍数浓度，并且因此除通过增加渗透压来调控生长抑制之外，其还允许通过增加所述无血清细胞培养基的倍数浓度来增加培养基中的营养物含量。这允许以相似或仅适度增加的灌注速率并因此以降低的细胞比灌注速率维持较高的活细胞密度。术语“倍数浓缩”是指1x无血清细胞培养灌注培养基的浓缩物(n》1)或稀释物(n》1)，其中1x无血清细胞培养灌注培养基是原始制备的或设计的无血清细胞培养灌注培养基配制剂。
148.所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)还确定细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中所述无血清细胞培养灌注培养基的倍数浓度(总营养物含量)，所述至少三种单独的水性浓缩进料添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中以提供将ph调节至近中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基。因此，使用浓缩进料的优势在于所述培养基的倍数浓度可以适应活细胞浓度和营养需要(维持营养平
衡)。渗透压可以用作估计系统内外营养平衡的替代指标。因此，渗透压平衡可以用于计算浓缩进料累积体积(以它们相对于彼此的固定比率)和稀释剂进料速率的调整，以实现期望的残留渗透压和营养水平。
149.任何补料策略都必须考虑由任何其他进料(如葡萄糖或碱性滴定剂)添加的渗透压。渗透压控制方案选择取决于细胞系，并且取决于每种细胞系对渗透压和废物积累的敏感性。优选最低可能灌注速率。进料速率可以基于已知的浓缩进料渗透压和假定的细胞比渗透压消耗速率来确定，所述消耗速率以天为基础进行计算。每日渗透压消耗的渗透压平衡可以根据以下等式进行计算：渗透压输入-渗透压输出＝渗透压消耗，其中渗透压输入是灌注到生物反应器中的培养基浓缩进料和稀释剂的渗透压，渗透压输出是生物反应器上清液的残留渗透压，并且渗透压消耗是输入和输出之间的渗透压差。然后将该每日渗透压消耗归一化为培养物中的细胞数目，即每日每细胞渗透压消耗。然后将该每细胞每日消耗速率(或细胞比渗透压消耗速率，csocr)乘以第二天的预测vcd以预测第二天的渗透压消耗。该消耗速率以及期望的渗透压输出可以用于计算第二天所需的渗透压输入。然后调整所述稀释剂和/或所述浓缩进料的灌注速率以匹配渗透压输入目标。
150.细胞培养物的最佳生长渗透压水平取决于细胞系，并且可以介于约280mosm至约390mosm之间，更优选地介于280至小于约350mosm(mosmol/kg水)之间。一些细胞系在高于390mosm的渗透压下仍可以最佳地生长。细胞培养物中哺乳动物细胞的最佳生长渗透压水平取决于所使用的哺乳动物细胞，并且也可能取决于培养条件。哺乳动物细胞的最佳生长渗透压水平可以容易地通过确定不同渗透压下的活细胞密度和活力来确定。最佳渗透压水平不取决于细胞密度，但优选地在约目标活细胞密度下确定。应将渗透压维持在最适合于生长的水平，至少直到达到约一半的目标活细胞密度。
151.一旦达到目标活细胞密度，就可以增加渗透压以抑制细胞生长，如增加哺乳动物细胞的最佳生长渗透压水平的约10-70％、约10-60％或约10-50％。渗透压应逐渐或逐步地增加，优选地从约一半的目标活细胞密度(即，大约一个群体，从目标活细胞密度加倍)开始，更优选地增加至最佳生长渗透压水平的约10-70％、约10-60％或约10-50％。在一个实施方案中，将渗透压增加至约350mosm或更高，优选至约380mosm或更高、至约400mosm或更高、至约420mosm或更高或至约450mosm或更高。将渗透压增加至抑制哺乳动物细胞的细胞生长且不会对哺乳动物细胞产生细胞毒性的水平。可以将渗透压增加至并维持在抑制优选约目标活细胞密度下的哺乳动物细胞的细胞生长的渗透压水平，其中抑制哺乳动物细胞的细胞生长的渗透压水平为约350mosm或更高或者约380mosm或更高。然而，重要的是，哺乳动物细胞的细胞活力基本上不受影响。对于大多数细胞系，渗透压水平在约400mosm以上开始变得具有细胞毒性，但对于个别细胞系，渗透压水平可以增加至450mosm且不会影响细胞毒性。渗透压增加至生理压力水平会抑制细胞生长。抑制细胞培养物中哺乳动物细胞的细胞生长的渗透压取决于所使用的哺乳动物细胞。通过测量不同渗透压下的活细胞密度和活力，可以很容易地确定抑制细胞培养物中特定哺乳动物细胞的细胞生长且没有达到细胞毒性水平的渗透压。优选地，增加的渗透压导致在生产阶段期间将细胞维持在约目标活细胞密度下且不会影响活力。因此，增加渗透压减少或消除了生产阶段期间对细胞排出的需要。通过增加细胞培养物的渗透压，可以抑制细胞生长以维持可持续的活细胞密度且没有细胞排出，特别是高活细胞密度且没有细胞排出，如《100x106个细胞/ml，优选《120x106个细胞/
ml，这也可被称为动态灌注培养。
152.通过增加细胞培养物的渗透压，细胞培养物中所产生的异源蛋白质的产率相对于对照细胞培养物的产率可以增加至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％或约5-50％，优选约10-100％，其中渗透压未增加。优选地，确定部分或整个培养期的产率。
153.通过使用根据本发明的无血清细胞培养基或通过根据本发明的方法获得的无血清细胞培养基并且任选地进一步增加细胞培养物的渗透压，细胞比灌注速率(pl/细胞/天)相对于1x无血清细胞培养基的细胞比灌注速率降低至少约25％、至少约30％或至少约50％。
154.在本发明的方法的一个实施方案中，细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含至少约100l无血清细胞培养灌注培养基，优选至少约1000l无血清细胞培养灌注培养基。优选地，细胞培养物的体积为至少约100l和/或生物反应器的体积为至少约100l。更优选地，细胞培养物的体积为至少约1000l和/或生物反应器的体积为至少约1000l。尽管本发明方法中所使用的或通过本发明方法制备的无血清细胞培养灌注培养基是完全无血清细胞培养灌注培养基，但培养物可以进一步被补充。可以单独添加到细胞培养物中的合适补充物是但不限于消泡剂、碱、葡萄糖和/或谷氨酰胺。
155.异源蛋白质可以是任何蛋白质，优选地其是治疗性蛋白质，如抗体或其治疗有效片段、融合蛋白或细胞因子或本文描述的任何异源蛋白质。抗体可以是单克隆抗体、双特异性抗体、多聚体抗体或其片段。
156.生物反应器
157.无血清细胞培养灌注培养基可以用于适合连续灌注的任何类型的细胞培养系统、类型或格式。
158.任何细胞灌注生物反应器和细胞保留装置都可以用于灌注培养。用于灌注的生物反应器与用于分批/补料分批培养的生物反应器并无很大不同，不同之处在于，用于灌注的生物反应器尺寸更紧凑并连接到细胞保留装置。用于将细胞保留在生物反应器内部的方法主要由细胞是附着于表面生长还是在单细胞悬浮液或细胞聚集体中生长来确定。虽然历史上大多数哺乳动物细胞附着于表面或基质生长(异质培养)，但已努力使许多工业哺乳动物细胞系适应悬浮生长(同质培养)，主要是因为悬浮培养更容易按比例扩大。因此，用于本发明方法的细胞优选地在悬浮液中生长。非限制性地，用于悬浮生长的细胞的示例性保留系统是旋转过滤器、外部过滤如切向流过滤(tff)、交替切向流(atf)系统、细胞沉降(垂直沉降和倾斜沉降)、离心、超声分离和水力旋流器。灌注系统可以分为两类：基于过滤的系统，如旋转过滤器、外部过滤和atf；以及开放灌注系统，如重力沉降器、离心机、超声分离装置和水力旋流器。基于过滤的系统示出高度的细胞保留，并且其不随流速而改变。然而，过滤器可能堵塞，并且因此培养运行的长度有限或需要更换过滤器。atf系统的实例是来自repligen
tm
的xcell
tm
atf系统，并且tff系统的实例是使用离心泵的来自的tff系统。错流过滤器(如中空纤维(hf)或平板过滤器)可以与atf和tff系统一起使用。特别地，由改性聚醚砜(mpes)、聚醚砜(pes)或聚砜(pe)制成的中空纤维可以与atf和tff系统一起使用。hf的孔径范围可以从几百kda至15μm。开放灌注系统不会堵塞，并且因此至少在理论上可以无限期地操作。然而，在更高的灌注速率下，细胞保留程度减少。目前存在可以在
工业规模下使用的三种系统：交替切向过滤器(atf)、重力(特别是倾斜沉降器)和离心机。适合于异源或同源培养的细胞保留装置由kompala和ozturk(cell culture technology for pharmaceutical and cell-based therapies,(2006),taylor&francis group,llc,pages 387-416)更详细地描述，该文献通过引用并入本文。灌注培养不是真正稳态过程，只有当从生物反应器中去除细胞排出流时，总细胞浓度和活细胞浓度才达到稳态。
159.灌注生物反应器中的物理参数(如ph、溶解氧和温度)应该在线监测并实时控制。可以使用离线或在线取样进行细胞密度、活力、代谢物和产物浓度的确定。当灌注操作以连续收获和补料开始时，灌注速率通常是指收获流速，其可以手动设定为期望值。例如，用于生物反应器的重量控制可以激活进料泵，使得可以维持生物反应器中的恒定体积。可替代地，可以通过将培养物体积泵出高于预定水平来实现水平控制。必须调整生物反应器中的灌注速率，以向细胞递送足够的营养物。
160.可以例如使用细胞密度测量、ph测量、氧消耗或代谢物测量来控制灌注速率。细胞密度是用于灌注速率调整的最重要的测量。取决于细胞密度测量如何进行，可以每日或实时调整灌注速率。已开发了若干在线探针以用于估计细胞密度，并且这些在线探针是本领域技术人员已知的，如电容探针，例如incyte
tm
活细胞密度探针(company)或futura
tm
生物量电容探针值(instruments)。这些细胞密度探针还可以用于通过从生物反应器中去除过量细胞，即细胞排出，将细胞密度控制在期望的设定点下。因此，细胞排出由培养物中哺乳动物细胞的比生长速率来确定。细胞排出通常不被收获，并且因此被视为废物。
161.本发明的方法进一步包含从灌注细胞培养物中收获所述异源蛋白质。本发明考虑了用于收获和纯化所关注蛋白质的任何合适方法。收获也可以在整个细胞培养生命周期中间歇性地发生，或在细胞培养结束时发生。优选地从渗透物中连续地进行收获，所述渗透物是细胞通过细胞保留装置回收后产生的上清液。由于与补料分批相比，灌注生物反应器内细胞培养物中的产物蛋白质的产物滞留时间较短，因此最大限度地减少了与蛋白酶、唾液酸酶和其他降解蛋白质的接触，这可能会导致灌注培养中所产生的异源蛋白质的产物质量更好。优选地，使用如美国临时申请62827504，特别是其图6中所描述的iskid来纯化收获的产物。iskid是集成撬块，其以高度自动化的方式将多个单元操作结合在一起，并且可以进行完整的连续自动化制造。
162.表达产物
163.通过本发明的方法和用途产生的异源蛋白质可以是任何分泌型蛋白质，优选地其是治疗性蛋白质。由于大多数治疗性蛋白质是重组治疗性蛋白质，因此其最优选地是重组治疗性蛋白质。治疗性蛋白质的实例是但不限于抗体、融合蛋白、细胞因子和生长因子。
164.根据本发明的方法在哺乳动物细胞中产生的治疗性蛋白质包括但不限于抗体或融合蛋白，如fc融合蛋白。其他分泌型重组治疗蛋白质可以是例如酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段，以及可以用作激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其他多肽和支架。
165.其他所关注重组蛋白质例如是但不限于：胰岛素，胰岛素样生长因子，hgh，tpa，细胞因子，如白细胞介素(il)，例如白细胞介素il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18，干扰素(ifn)α，ifn
β，ifnγ，ifnω或ifnτ，肿瘤坏死因子(tnf)，如tnfα和tnfβ，tnfγ，trail；g-csf，gm-csf，m-csf，mcp-1和vegf。还包括的是促红细胞生成素或任何其他激素生长因子以及可以用作激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其他多肽的产生。
166.优选的治疗性蛋白质是抗体或其片段或衍生物，更优选igg1抗体。因此，本发明可以有利地用于产生抗体，如单克隆抗体、多特异性抗体或其片段，优选单克隆抗体、双特异性抗体或其片段。在本发明的范围内的示例性抗体包括但不限于抗cd2、抗cd3、抗cd20、抗cd22、抗cd30、抗cd33、抗cd37、抗cd40、抗cd44、抗cd44v6、抗cd49d、抗cd52、抗egfr1(her1)、抗egfr2(her2)、抗gd3、抗igf、抗vegf、抗tnfα、抗il2、抗il-5r或抗ige抗体，并且优选地选自下组，所述组由以下各项组成：抗cd20、抗cd33、抗cd37、抗cd40、抗cd44、抗cd52、抗her2/neu(erbb2)、抗egfr、抗igf、抗vegf、抗tnfα、抗il2和抗ige抗体。
167.抗体片段包括例如“fab片段”(片段抗原结合＝fab)。fab片段由两条链的可变区组成，所述可变区由相邻的恒定区保持在一起。这些可以通过例如用木瓜蛋白酶进行的蛋白酶消化从常规抗体形成，但相似地fab片段也可以通过基因工程产生。进一步的抗体片段包括f(ab’)2片段，其可以通过用胃蛋白酶进行的蛋白水解切割来制备。
168.使用基因工程方法，有可能产生缩短的抗体片段，其仅由重链(vh)和轻链(vl)的可变区组成。这些被称为fv片段(片段可变＝可变部分的片段)。由于这些fv片段缺乏两条链通过恒定链的半胱氨酸的共价键合，因此fv片段经常是稳定的。通过短肽片段将重链和轻链的可变区连接是有利的，所述短肽片段例如具有10至30个氨基酸，优选15个氨基酸。以这种方式，获得通过肽接头连接、由vh和vl组成的单条肽链。这种抗体蛋白质被称为单链fv(scfv)。scfv抗体蛋白的实例是本领域技术人员已知的。
169.根据本发明的优选治疗性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体通常在一个分子中组合目标细胞(例如，恶性b细胞)和效应细胞(例如，t细胞、nk细胞或巨噬细胞)的抗原结合特异性。示例性双特异性抗体是但不限于双抗体、bite(双特异性t细胞衔接物)格式和dart(双重亲和力重新靶向)格式。双抗体格式在两条单独的多肽链上分开具有两种抗原结合特异性的重链和轻链的同源可变结构域，其中所述两条多肽链是非共价相关联的。dart格式基于双抗体格式，但其通过c末端二硫桥提供额外的稳定作用。
170.另一优选的治疗性蛋白质是融合蛋白，如fc融合蛋白。因此，本发明可以有利地用于产生融合蛋白，如fc融合蛋白。此外，根据本发明的增加蛋白质产生的方法可以有利地用于产生融合蛋白，如fc融合蛋白。
171.融合蛋白的效应部分可以是天然或经修饰的异源蛋白质的完全序列或序列的任何部分，或者天然或经修饰的异源蛋白质的完全序列或序列的任何部分的组合物。免疫球蛋白恒定结构域序列可以获得自任何免疫球蛋白亚型，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2亚型，或者类别如iga、ige、igd或igm。优先地，它们衍生自人免疫球蛋白，更优选地衍生自人igg，并且甚至更优选衍生自人igg1和igg2。fc融合蛋白的非限制性实例是mcp1-fc、icam-fc、epo-fc和scfv片段等，其偶联至包含n-连接糖基化位点的重链免疫球蛋白恒定区的ch2结构域。fc融合蛋白可以通过基因工程方案构建，所述方案通过将包含n-连接糖基化位点的重链免疫球蛋白恒定区的ch2结构域引入另一表达构建体内来进行，所述另一表达构建体包含例如其他免疫球蛋白结构域、酶促活性蛋白质部分或效应结构域。因此，根据本发明的fc融合蛋白还包含单链fv片段，其连接至包含例如nn-连接糖基化位点的重链免疫
球蛋白恒定区的ch2结构域。
172.表达产物的回收和配制
173.在进一步方面，使用本发明的方法提供了产生治疗性蛋白质的方法，并且所述产生治疗性蛋白质的方法任选地进一步包含将治疗蛋白质纯化并且配制成药物上可接受的配制剂的步骤。
174.治疗性蛋白质，尤其是抗体、抗体片段或fc融合蛋白优选地作为分泌型多肽从培养基中回收/分离。有必要从其他重组蛋白质和宿主细胞蛋白质中纯化治疗性蛋白质，以获得治疗性蛋白质的基本上同质制剂。作为第一步骤，从培养基中去除细胞和/或微粒细胞碎片。进一步地，例如，通过在免疫亲和或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相hplc、sephadex色谱以及在二氧化硅或阳离子交换树脂(如deae)上的色谱，从污染物可溶性蛋白质、多肽和核酸中纯化治疗性蛋白质。用于纯化由哺乳动物细胞表达的异源蛋白质的方法是本领域已知的。
175.表达载体
176.在一个实施方案中，使用本发明的方法表达的异源蛋白质由一个或多个表达盒编码，所述表达盒包含编码异源蛋白质的异源多核苷酸。异源蛋白质可以置于可扩增的遗传选择标记物(如二氢叶酸还原酶(dhfr)、谷氨酰胺合成酶(gs))的控制下。可扩增的选择标记物基因可以在与异源蛋白质表达盒相同的表达载体上。可替代地，可扩增的选择标记物基因和异源蛋白质表达盒可以在不同的表达载体上，但非常接近地整合到宿主细胞的基因组中。例如，同时共转染的两种或更多种载体经常紧密接近地整合到宿主细胞的基因组中。然后通过将扩增试剂(例如，用于dhfr的mtx或用于gs的msx)添加到培养基中，来介导含有分泌型治疗性蛋白质表达盒的遗传区域的扩增。
177.还可以通过例如将异源蛋白质编码多核苷酸的多重拷贝克隆到表达载体中，来实现由哺乳动物细胞表达的足够高稳定水平的异源蛋白质。如上文所描述的将异源蛋白质编码多核苷酸的多重拷贝克隆到表达载体中并且扩增异源蛋白质表达盒可以进一步组合。
178.哺乳动物细胞系
179.如本文使用的，哺乳动物细胞是适合于产生分泌性重组治疗蛋白质的哺乳动物细胞系，并且因此也可以称为“宿主细胞”。根据本发明的优选哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞，如仓鼠细胞。哺乳动物细胞是分离的细胞或细胞系。哺乳动物细胞优选地是转化和/或永生化的细胞系。它们适于细胞培养中的连续传代，并且不包括原代非转化的细胞或作为器官结构的一部分的细胞。优选的哺乳动物细胞是bhk21、bhk tk-、jurkat细胞、293细胞、hela细胞、cv-1细胞、3t3细胞、cho、cho-k1、cho-dxb11(也被称为cho-dukx或duxb11)、cho-s细胞和cho-dg44细胞或此种细胞系中任一种的衍生物/后代。特别优选的是cho细胞，如cho-dg44、cho-k1和bhk21，并且甚至更优选的是cho-dg44和cho-k1细胞。最优选的是cho-dg44细胞。还涵盖的是哺乳动物细胞，特别是cho-dg44和cho-k1细胞的谷氨酰胺合成酶(gs)缺陷衍生物。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞，优选cho-dg44细胞、cho-k1细胞、cho dxb11细胞、cho-s细胞、chogs缺陷细胞或其衍生物。
180.哺乳动物细胞可以进一步包含编码异源蛋白质，如治疗性蛋白质，优选重组分泌型治疗性蛋白质的一个或多个表达盒。宿主细胞还可以是鼠源性细胞，如鼠源性骨髓瘤细胞，如ns0和sp2/0细胞或此种细胞系中任一种的衍生物/后代。可以用于本发明含义的哺乳
动物细胞的非限制性实例还总结在表1中。然而，这些细胞、其他哺乳动物细胞(包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿类动物细胞系)的衍生物/后代也可以用于本发明，特别是用于产生生物药物蛋白。
181.表1：哺乳动物生产细胞系
[0182][0183][0184]1cap(cevec's amniocyte production)细胞是基于原代人羊水细胞的永生化细胞系。它们通过用含有腺病毒5的功能e1和pix的载体转染这些原代细胞来生成。由于真实的人翻译后修饰，cap细胞允许具有优异生物活性和治疗功效的重组蛋白质的竞争性稳定生产。
[0185]
当在无血清条件下，并且任选地在不含动物起源的任何蛋白质/肽的培养基中建立、适应并且完全培养时，哺乳动物细胞是最优选的。可商购的培养基，如ham
′
s f12(sigma,deisenhofen,germany)、rpmi-1640(sigma)、dulbecco
′
s改良eagle
′
s培养基(dmem；sigma)、最小必需培养基(mem；sigma)、iscove
′
s改良dulbecco
′
s培养基(imdm；sigma)、cd-cho(invitrogen,carlsbad,ca),cho-s-invitrogen)、无血清cho培养基(sigma)和无蛋白质cho培养基(sigma)是示例性的适当营养物溶液。任何培养基都可以根据需要补充有多种化合物，这些化合物的非限制性实例是重组激素和/或其他重组生长因
子(如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲液(如hepes)、核苷(如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等效能源、抗生素和微量元素。还可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必需的补充物。为了生长和选择表达可选择基因的遗传修饰细胞，将合适的选择试剂添加到培养基中。
[0186]
鉴于上述，将理解的是，本发明还涵盖以下条款：
[0187]
条款1提供了一种经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中第一浓缩进料是碱性浓缩进料，第二浓缩进料是酸性浓缩进料，并且第三浓缩进料是近中性浓缩进料；其中
[0188]
在将所得无血清细胞培养灌注培养基中的所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基将ph调节至中性ph。
[0189]
条款2具体说明了如条款1所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所得无血清细胞培养灌注培养基的ph介于6.7至7.5之间、介于6.9至7.4之间，优选地介于6.9至7.2之间。
[0190]
条款3具体说明了如条款1或2所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述稀释剂是无菌水。
[0191]
条款4具体说明了如条款1至3中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基用于
[0192]
(a)将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中；
[0193]
(b)将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料直接添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，无需之前的预混合；和/或
[0194]
(c)将所述至少三种单独的水性浓缩进料在细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中直接混合。
[0195]
条款5具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述碱性浓缩进料是2x至80x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是2x至40x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是2x至50x浓缩进料。
[0196]
条款6具体说明了如条款5所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中
[0197]
(a)所述碱性浓缩进料是20x至40x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是4x至20x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是10x至40x浓缩进料；
[0198]
(b)所述碱性浓缩进料是20x至30x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是5x至12x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是20x至30x浓缩进料；和/或
[0199]
(c)所述碱性浓缩进料是25x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是6x至10x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是25x浓缩进料。
[0200]
条款7具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述近中性浓缩进料的ph为6.5-8.5。
[0201]
条款8具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述碱性浓缩进料的ph为9或更高，所述酸性浓缩进料的ph为5或更低，并且所述近中性浓缩进料的ph为7至8.5。
[0202]
条款9具体说明了如条款8所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中
[0203]
(a)所述碱性浓缩进料的ph为9至11，所述酸性浓缩进料的ph为2至5，并且所述近中性浓缩进料的ph为7至8.5；
[0204]
(b)所述碱性浓缩进料的ph为9.8至10.8，所述酸性浓缩进料的ph为3.6至4.8，并且所述近中性浓缩进料的ph为7至8.5；或
[0205]
(c)所述碱性浓缩进料的ph为9.8至10.5，所述酸性浓缩进料的ph为3.8至4.5，并且所述近中性浓缩进料的ph为7.5至8.5。
[0206]
条款10具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基是(a)化学限定培养基，(b)无水解产物培养基，和/或(c)无蛋白质培养基或包含重组胰岛素和/或重组胰岛素样生长因子的无蛋白质培养基。
[0207]
条款11具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所得经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基是生产培养基。
[0208]
条款12具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中
[0209]
(a)所述碱性浓缩进料与所述酸性浓缩进料与所述近中性浓缩进料的比率(v/v/v)为固定比率，以提供将ph调节至中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基；并且
[0210]
(b)将ph调节至中性ph的所得无血清细胞培养灌注培养基中所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)确定所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压。
[0211]
条款13具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述酸性浓缩进料包含微量元素、微量金属、无机盐、螯合剂、聚胺和调控激素。
[0212]
条款14具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述酸性浓缩进料和/或所述近中性浓缩进料包含表面活性剂、抗氧化剂和碳源。
[0213]
条款15具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述碱性浓缩进料包含在碱性ph为9或更高时具有最大溶解度的氨基酸，优选地至少包含天冬氨酸、组氨酸和酪氨酸，并且任选地包含半胱氨酸和/或胱氨酸和/或叶酸。
[0214]
条款16具体说明了如条款15所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中剩余的氨基酸在所述酸性和/或近中性浓缩进料中，优选地在所述酸性浓缩进料中。
[0215]
条款17具体说明了如前述条款中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中维生素和金属在单独的进料中，优选地维生素在所述近中性进料中并且金属在所述酸性进料中。
[0216]
条款18具体说明了如条款17所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中难溶于水溶液的维生素，如氯化胆碱，存在于所述中性进料和所述酸性进料中。
[0217]
条款19具体说明了一种碱性水性浓缩进料，所述碱性水性浓缩进料用于与酸性水性浓缩进料、近中性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。
[0218]
条款20具体说明了一种酸性水性浓缩进料，所述酸性水性浓缩进料用于与碱性水性浓缩进料、近中性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。
[0219]
条款21具体说明了一种近中性水性浓缩进料，所述近中性水性浓缩进料用于与碱性水性浓缩进料、酸性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。
[0220]
条款22具体说明了一种制备无血清细胞培养灌注培养基的方法，所述方法包含：
[0221]
(a)基于在碱性、酸性和中性ph下的溶解度，提供至少三种组分亚组中的细胞培养基组分，
[0222]
(b)
[0223]
(i)于碱性水溶液溶解在碱性ph下可溶的亚组组分以形成碱性浓缩进料；
[0224]
(ii)于酸性水溶液溶解在酸性ph下可溶的亚组组分以形成酸性浓缩进料；以及
[0225]
(iii)于中性水溶液溶解在中性ph下可溶的亚组组分以形成近中性浓缩进料；
[0226]
(c)任选地将所制备的碱性浓缩进料、酸性浓缩进料和近中性浓缩进料储存在单独的容器中；以及
[0227]
(d)将所制备的碱性浓缩进料、酸性浓缩进料和近中性浓缩进料以及稀释剂添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，其中
[0228]
(i)将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中；并且
[0229]
(ii)将所述稀释剂单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，或者在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种预混合；
[0230]
其中在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所得无血清细胞培养灌注培养基的ph被自动调节至中性ph。
[0231]
条款23具体说明了如条款22所述的方法，其中在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，ph调节后的无血清细胞培养灌注培养基的ph介于6.7至7.5之间、介于6.9至7.4之间，优选地介于6.9至7.2之间。
[0232]
条款24具体说明了如条款22或23所述的方法，其中所述稀释剂是无菌水。
[0233]
条款25具体说明了如条款22至24中任一项所述的方法，其中将所述至少三种浓缩进料通过单独的端口逐滴添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中。
[0234]
条款26具体说明了如条款22至25中任一项所述的方法，其中与在添加到生物反应器之前混合和稀释的无血清细胞培养灌注培养基相比，容器内混合和稀释所述至少三种单独的水性浓缩进料允许在14天的培养期内使制备培养基消耗降低50-90％，优选60-90％。
[0235]
条款27具体说明了如条款22至26中任一项所述的方法，其中细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含哺乳动物细胞。
[0236]
条款28具体说明了如条款22至27中任一项所述的方法，所述方法进一步包含在储存和/或添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前对所述浓缩进料进行灭菌的步骤。
[0237]
条款29具体说明了如条款22至28中任一项所述的方法，其中所述碱性浓缩进料是
2x至80x浓缩进料，其中所述酸性浓缩进料是2x至40x浓缩进料并且所述近中性浓缩进料是2x至50x浓缩进料。
[0238]
条款30具体说明了如条款29所述的方法，其中
[0239]
(a)所述碱性浓缩进料是20x至40x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是4x至20x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是10x至40x浓缩进料；
[0240]
(b)所述碱性浓缩进料是20x至30x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是5x至12x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是20x至30x浓缩进料；和/或
[0241]
(c)所述碱性进料是25x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是6x至10x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是25x浓缩进料。
[0242]
条款31具体说明了如条款22至30中任一项所述的方法，其中所述近中性浓缩进料的ph为6.5-8.5。
[0243]
条款32具体说明了如条款22至32中任一项所述的方法，其中所述碱性浓缩进料的ph为9或更高，所述酸性浓缩进料的ph为5或更低，并且所述近中性浓缩进料的ph为7至8.5。
[0244]
条款33具体说明了如条款32所述的方法，其中
[0245]
(a)所述碱性浓缩进料的ph为9至11，所述酸性浓缩进料的ph为2至5，并且所述近中性浓缩进料的ph为7至8.5；
[0246]
(b)所述碱性浓缩进料的ph为9.8至10.8，所述酸性浓缩进料的ph为3.6至4.8，并且所述近中性浓缩进料的ph为7至8.5；或
[0247]
(c)所述碱性浓缩进料的ph为9.8至10.5，所述酸性浓缩进料的ph为3.8至4.5，并且所述近中性浓缩进料的ph为7.5至8.5。
[0248]
条款34具体说明了如条款33所述的方法，其中所述无血清细胞培养灌注培养基是(a)化学限定培养基，(b)无水解产物培养基，和/或(c)无蛋白质培养基或包含重组胰岛素和/或重组胰岛素样生长因子的无蛋白质培养基。
[0249]
条款35具体说明了如条款22至34中任一项所述的方法，其中将所述至少三种单独的浓缩进料和所述稀释剂单独添加使得能够控制生物反应器中所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压。
[0250]
条款36具体说明了如条款22至35中任一项所述的方法，其中
[0251]
(a)所述碱性浓缩进料与所述酸性浓缩进料与所述近中性浓缩进料的比率(v/v/v)为固定比率，以提供在细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中将ph调节至中性ph的所述无血清细胞培养灌注培养基；并且
[0252]
(b)所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料的累积体积的比率(v/v)确定细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压，所述至少三种单独的水性浓缩进料添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中以提供将ph调节至近中性ph的所述无血清细胞培养灌注培养基。
[0253]
条款37具体说明了如条款22至36中任一项所述的方法，其中所述酸性浓缩进料包含微量元素、微量金属、无机盐、螯合剂、聚胺和调控激素。
[0254]
条款38具体说明了如条款22至37中任一项所述的方法，其中所述酸性浓缩进料和/或所述近中性浓缩进料包含表面活性剂、抗氧化剂和碳源。
[0255]
条款39具体说明了如条款22至38中任一项所述的方法，其中所述碱性浓缩进料包
含在碱性ph为9或更高时具有最大溶解度的氨基酸，优选地至少包含天冬氨酸、组氨酸和酪氨酸，并且任选地包含半胱氨酸和/或胱氨酸和/或叶酸。
[0256]
条款40具体说明了如条款39所述的方法，其中剩余的氨基酸在所述酸性和/或近中性浓缩进料中，优选地在所述酸性浓缩进料中。
[0257]
条款41具体说明了如条款22至40中任一项所述的方法，其中维生素和金属在单独的进料中，优选地维生素在所述近中性进料中并且金属在所述酸性进料中。
[0258]
条款42具体说明了如条款41所述的方法，其中难溶于水溶液的维生素，如氯化胆碱，存在于所述中性进料和所述酸性进料中。
[0259]
条款43具体说明了如条款22至42中任一项所述的方法，其中细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含至少约100l无血清细胞培养灌注培养基，优选至少约1000l无血清细胞培养灌注培养基。
[0260]
条款44具体说明了一种能通过根据条款22至43所述的方法获得的无血清细胞培养灌注培养基。
[0261]
条款45具体说明了一种在灌注培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，所述方法包含：
[0262]
(a)在无血清细胞培养基中用表达异源蛋白质的哺乳动物细胞接种生物反应器；
[0263]
(b)通过用无血清细胞培养灌注培养基进料连续喂养所述哺乳动物细胞并去除用过的培养基并同时将所述细胞保持在培养中来在灌注培养中培养所述哺乳动物细胞，其中所述无血清细胞培养灌注培养基进料是(i)经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中第一浓缩进料是碱性浓缩进料，第二浓缩进料是酸性浓缩进料，并且第三浓缩料是近中性浓缩料；并且其中在将所得无血清细胞培养灌注培养基中的所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基将ph调节至中性ph；和/或(ii)根据条款44所述的无血清细胞培养灌注培养基，并且
[0264]
其中将所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基进料的所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，并且其中将所述稀释剂单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，或者在即将添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器之前将所述稀释剂与所述至少三种单独的水性浓缩进料中的一种预混合。
[0265]
条款46具体说明了如条款45所述的方法，其中在开始灌注培养之前，所述哺乳动物细胞最初以分批培养方式进行培养。
[0266]
条款47具体说明了条款45或46所述的方法，其中灌注培养从分批培养的第0天至第3天开始。
[0267]
条款48具体说明了如条款45至47中任一项所述的方法，其中灌注开始后灌注速率增加，直到达到目标活细胞密度。
[0268]
条款49具体说明了如条款48所述的方法，其中灌注速率从每天小于或等于0.5个容器体积增加至每天约5个容器体积，或者从每天小于或等于0.5个容器体积增加至每天约2个容器体积。
[0269]
条款50具体说明了如条款45至49中任一项所述的方法，其中将所述无血清细胞培
养灌注培养基的渗透压增加至高于最佳的生长渗透压水平，从而导致目标活细胞密度下的生长抑制，优选地其中从约一半的目标活细胞密度开始逐渐或逐步地增加所述无血清细胞培养灌注培养基的渗透压水平。
[0270]
条款51具体说明了如条款45至50中任一项所述的方法，其中所述目标活细胞密度为约30x106个细胞/ml或更高、约60x106个细胞/ml或更高、约80x106个细胞/ml，优选约100x106个细胞/ml或更高。
[0271]
条款52具体说明了如条款45至51中任一项所述的方法，其中渗透压使用以下各项来控制：
[0272]
(a)恒定的浓缩进料灌注速率和不同的稀释剂灌注速率，其导致不同的总灌注速率；或
[0273]
(b)恒定的总灌注速率和不同的浓缩进料灌注速率；
[0274]
其中所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维持1x无血清细胞培养灌注培养基中培养基组分的相对比例。
[0275]
条款53具体说明了如条款45至52中任一项所述的方法，其中渗透压使用以下各项来增加：
[0276]
(a)恒定的浓缩进料灌注速率和降低的稀释剂灌注速率，其导致降低的总灌注速率；或
[0277]
(b)恒定的总灌注速率和增加的浓缩进料灌注速率以及降低的稀释剂灌注速率；
[0278]
其中所述至少三种浓缩进料根据它们的倍数浓度以固定比率(v/v/v)彼此添加，以维持1x无血清细胞培养灌注培养基中培养基组分的相对比例。
[0279]
条款54具体说明了如条款50至53中任一项所述的方法，其中不将进一步添加剂添加到培养物中以增加渗透压。
[0280]
条款55具体说明了如条款50至54中任一项所述的方法，其中最佳的生长渗透压水平为约280至小于350mosm。
[0281]
条款56具体说明了如条款50至55中任一项所述的方法，其中将渗透压维持在最适合于生长的水平，直到达到约一半的目标活细胞密度。
[0282]
条款57具体说明了如条款50至56中任一项所述的方法，其中从约一半的目标活细胞密度开始逐渐或逐步地增加渗透压，优选地增加至最佳生长渗透压水平的约10-50％。
[0283]
条款58具体说明了如条款50至57中任一项所述的方法，其中将渗透压增加至并维持在抑制约目标活细胞密度下的细胞生长的渗透压水平，其中抑制细胞生长的渗透压水平优选地为约350mosm或更高，更优选地为约380mosm或更高。
[0284]
条款59具体说明了如条款50至58中任一项所述的方法，其中增加渗透压减少或消除了生产阶段期间对细胞排出的需要。
[0285]
条款60具体说明了如条款50至59中任一项所述的方法，其中细胞培养物中所产生的异源蛋白质的产率相对于对照细胞培养物的产率增加了至少5-50％，其中渗透压没有增加。
[0286]
条款61具体说明了如条款50至60中任一项所述的方法，其中抑制细胞生长以维持可持续的活细胞密度且没有细胞排出。
[0287]
条款62具体说明了如条款45至61中任一项所述的方法，其中细胞比灌注速率(pl/
细胞/天)相对于1x无血清细胞培养基的细胞比灌注速率降低了至少30％。
[0288]
条款63具体说明了如条款45至62中任一项所述的方法，所述方法进一步包含从细胞培养物中收获异源蛋白质。
[0289]
条款64具体说明了如条款45至63中任一项所述的方法，其中所述异源蛋白质是治疗性蛋白质、抗体或其治疗有效片段。
[0290]
条款65具体说明了如条款64所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或其片段。
[0291]
条款66具体说明了如条款45至65中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包含中国仓鼠卵巢(cho)细胞、jurkat细胞、293细胞、hela细胞、cv-1细胞或3t3细胞或这些细胞中任一种的衍生物，其中所述cho细胞可以进一步选自下组，所述组由以下各项组成：cho-dg44细胞、cho-k1细胞、cho dxb11细胞、cho-s细胞和cho gs缺陷细胞或其突变体。
[0292]
条款67具体说明了如条款45至66中任一项所述的方法，其中细胞培养物和/或生物反应器的反应容器包含至少约100l无血清细胞培养灌注培养基，优选至少约1000l无血清细胞培养灌注培养基。
[0293]
条款68具体说明了如条款45至67中任一项所述的方法，其中将选自消泡剂、碱和葡萄糖的列表的进一步补充物单独添加到细胞培养物中。
[0294]
条款69具体说明了一种使用如条款45至68中任一项所述的方法产生治疗性蛋白质的方法。
[0295]
条款70具体说明了如条款1至18中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基或如条款44所述的无血清细胞培养灌注培养基用于培养哺乳动物细胞的用途。
[0296]
条款71具体说明了如条款1至18中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基或如条款44所述的无血清细胞培养灌注培养基用于在灌注培养中培养哺乳动物细胞的用途。
[0297]
条款72具体说明了如条款1至18中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基或如条款44所述的无血清细胞培养灌注培养基用于控制灌注细胞培养物的渗透压的用途。
[0298]
条款73具体说明了如条款72所述的用途，其中增加细胞培养物的渗透压抑制细胞生长并增加异源蛋白质产生。
[0299]
条款74具体说明了如条款73所述的用途，其中细胞培养物中所产生的异源蛋白质的产率相对于对照细胞培养物的产率增加了至少5-50％，其中渗透压没有增加。
[0300]
条款75具体说明了如条款73或74所述的用途，其中生长抑制足以维持可持续的活细胞密度且没有细胞排出。
[0301]
条款76具体说明了如条款70或75所述的用途，其中细胞比灌注速率(pl/细胞/天)相对于1x无血清细胞培养基的细胞比灌注速率降低了至少30％。
[0302]
条款77具体说明了如条款1至18中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基用于将所述至少三种单独的水性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中的用途。
[0303]
实施例
[0304]
方法
[0305]
种子训练和接种物：
[0306]
将表达重组igg的中国仓鼠卵巢(cho)细胞系在corning-life sciences摇瓶(oneonta,ny)中悬浮培养，所述摇瓶由3e7细胞小瓶在专有生长培养基中扩展而成。将烧瓶以0.5e6细胞/ml接种3天，并且以0.8e6细胞/ml接种2天，并且以分批模式生长，以120rpm搅动直到形成n-3 3l摇瓶，其以80rpm、以50mm轨道半径搅动。将培养孵育器(infors,annapolis,md)维持在36.5℃、5％co2下，其中没有湿度控制。将n-2阶段以1.0
±
0.4e6个细胞/ml接种，并且在ge波(ge healthcare)中以5l工作体积以分批模式生长3天。将n-1阶段在ge wave 25系统(ge healthcare)中以灌注模式运行。在25l工作体积中，接种密度为1.0
±
0.4e6个细胞/ml。在培养的第1天以每天0.5个容器体积(vvd)开始灌注，并且每一天增加0.5vvd，直到第4天达到2.0vvd，将其一直保持直到第5天或第6天。基于达到目标活细胞密度(vcd)：40e6c/ml来确定运行持续时间。
[0307]
实验生物反应器设置：
[0308]
灌注n-1培养物以10
±
2e6个细胞/毫升的高密度接种100l一次性生物反应器(sub)，接种在如美国临时申请62827504，特别是其图6中所描述的boehringer ingelheims专有iskid(一种集成、连续的生物处理系统)中。将定制的thermofisher hyclone(logan,utah)sub袋与deltav分布式控制系统(emerson,st louis,mo)一起使用以将培养物维持在36.5℃下，目标氧气设定点为60％空气饱和度，ph设定点为7.1，其中单个船用式叶轮在每单位体积18w/m3功率下运转。使用低剪切离心泵(levitronix,zurich,switzerland)来通过0.2um孔径的聚乙烯砜(pes)切向流过滤(tff)细胞保留装置(repligen,waltham,ma)以每分钟13升(lpm)再循环细胞培养物。将穿过tff的收获细胞培养液或渗透物直接转载到iskid的纯化单元操作的捕获柱上。将生长培养基、三种浓缩培养基进料(酸性、碱性和中性)、0.1μm过滤无菌反渗透去离子(rodi)水稀释剂、维持培养期间的ph的碱性滴定剂(1m碳酸钠)、葡萄糖进料(500g/l)和1％医用消泡剂c乳剂(dow corning,midland,mi)经由无菌焊接管路或无菌防腐快速连接器(colder products company,st paul,mn)附接到sub。所有添加系都是单独的以避免沉淀，但碱性浓缩进料除外，所述碱性浓缩进料用无菌水稀释剂进行多支管分流，随后经过管路中的在线混合器，然后到达单管中的生物反应器。
[0309]
所使用的灌注培养基(三种浓缩培养基进料)制备如下：
[0310]
1x的酸性进料包含以下各项：
[0311]
不存在于碱性进料中的蛋白质氨基酸以及非蛋白原氨基酸羟脯氨酸和鸟氨酸，总计87.8mm；
[0312]
包括缓冲盐(微量金属盐和铁源单独列出)的无机盐，总计21.4mm；
[0313]
有机酸牛磺酸和替代碳源，总计16.3mm；
[0314]
组合铁源，总计0.25mm；
[0315]
0.28mm的聚胺；
[0316]
0.28mm的乙醇胺；
[0317]
微量金属(不包括铁)，总计0.1mm；
[0318]
0.02m的第一抗氧化剂；
[0319]
维生素，0.07mm的泛酸钙、0.04mm的硫胺素和0.3mm的吡哆醇；
[0320]
单独添加到酸性和中性进料中的氯化胆碱，在酸性进料中为1.27mm；
[0321]
50mm的碳源；
[0322]
2.4μm的作为生长因子的重组蛋白；以及
[0323]
0.2mm的表面活性剂。
[0324]
对于实施例中所使用的6x浓缩酸性进料，这些浓度增加6倍。将6x浓缩酸性进料的最终ph用氢氧化钠调节至4.2
±
0.1，并且渗透压为1700
±
50mosm。尽管不是必需的，但在添加碳源之前已将培养基制备为基础粉末，并且仅出于研磨目的已添加1g/l葡萄糖。
[0325]
1x的中性进料包含以下各项：
[0326]
25mm的碳酸氢盐；
[0327]
4.1mm的无机缓冲盐；
[0328]
1.69mm的肌醇；
[0329]
尚未包括在酸性进料中的所有其他维生素(但包括剩余的氯化胆碱)，总计0.57mm；
[0330]
0.01mm的第二抗氧化剂；
[0331]
0.043mm的l-α-氨基-正丁酸；
[0332]
0.2mm的表面活性剂；以及
[0333]
5μm的亚油酸。
[0334]
对于实施例中所使用的25x浓缩中性进料，这些浓度增加25倍。在不使用滴定剂的情况下，25x浓缩中性进料的最终ph自行调节至8.0
±
0.1，并且渗透压为1500
±
35mosm。
[0335]
1x的碱性进料包含：
[0336]
氨基酸，天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、半胱氨酸(包括胱氨酸)，总浓度43mm。
[0337]
对于本文实施例中所使用的25x浓缩碱性进料，该浓度增加25倍。使用氢氧化钠将25x浓缩碱性进料的最终ph调节至10.2
±
0.1，并且渗透压为1600
±
50mosm。
[0338]
由3种单独的水性浓缩进料构成的灌注培养基将ph调节至ph为7.0
±
0.1，其中酸性浓缩进料是ph为4.2
±
0.1、渗透压为1700
±
50mosm的6x浓缩进料，中性浓缩进料是ph为8.0
±
0.1、渗透压为1500
±
35mosm的25x浓缩进料，碱性浓缩进料是ph值为10.2
±
0.1、渗透压为1600
±
50mosm的25x浓缩进料。
[0339]
实施例1
[0340]
在第0天接种后，立即使用专有生长培养基以1vvd的速率开始灌注。灌注速率每天增加0.5vvd，直到第2天达到2.0vvd。通过经由生物反应器重量控制培养基添加来维持生物反应器工作体积。在第2天，浓缩培养基进料和稀释剂替换生长培养基以开始“生产阶段”，也就是说，当培养在渗透物中达到0.2克/lbr/天的产物时，开始装载捕获柱。在生产阶段期间，以恒定的0.5vvd总量补料浓缩进料(酸性进料为0.33vvd，碱性和中性进料各自为0.08vvd)。使用以下等式计算进料速率，使得与2vvd的完整1x配制剂相比，每种进料中的营养物比例保持相同：
[0341]
[1x]*2vvd＝[6x]*x vvd(等式1)
[0342]
其中x是以维持与2vvd的1x浓度配制剂相同的营养物含量所必需的酸性进料的vvd为单位的灌注速率。
[0343]
相似地，
[0344]
[1x]*2vvd＝[25x]*x vvd(等式2)
[0345]
其中x是以维持与2vvd的1x浓度配制剂相同的营养物含量所必需的碱性或中性进料的vvd为单位的灌注速率。
[0346]
这些实验中所使用的细胞系的vcd最大值为大约140
±
30e6个细胞/ml，这基于先前的工程运行，其示出该范围为最大可持续vcd(结果未示出)。vcd计数在beckman coulter vi-cell(indianapolis,in)上进行。为了达到比该细胞系的峰值生长能力低大约15-45％的目标(结果未示出)，逐渐增加培养物的渗透压以抑制细胞复制。用bioprofile flex分析仪(nova biomedical,waltham,ma)测量培养物渗透压，用roche cedex bioanalyzer(indianapolis,in)测量所有其他培养代谢物。渗透压增加通过每日调整稀释剂速率以达到培养物的目标残留渗透压并同时保持进料添加速率恒定来实现。因此，总灌注率每天都有所不同。每日渗透压消耗的渗透压平衡根据以下等式进行计算：
[0347]
渗透压输入-渗透压输出＝渗透压消耗(等式3)
[0348]
其中渗透压输入是灌注到生物反应器中的培养基浓缩进料和稀释剂的渗透压，渗透压输出是生物反应器上清液的残留渗透压，并且渗透压消耗是输入和输出之间的渗透压差。然后将该每日渗透压消耗归一化为培养物中的细胞数目，即每日每细胞渗透压消耗。然后将该每细胞每日消耗速率(或细胞比渗透压消耗速率，csocr)乘以第二天的预测vcd以预测第二天的渗透压消耗。然后，在等式3中使用该消耗率以及期望的渗透压输出，以计算第二天所需的渗透压输入。因此，在维持进料的同时调整稀释剂的灌注速率以匹配渗透压输入目标。根据表1，每天的期望渗透压目标和估计灌注速率都有所不同(每次运行的值各不相同，导致以下范围)：
[0349]
天估计活细胞密度(e6c/ml)目标渗透压(mosm)估计灌注速率(vvd)225300-3301.6-1.8350300-3302475330-3601.8-25100350-3801.5-1.66130-150380-4101.2-1.47150-170380-4101.2-1.78150-170380-4101.2-1.39140-170380-4101.2-1.310140-180380-4101.2-1.311130-180380-4101.2-1.312130-170380-4101.2-1.313130-170380-4101.2-1.414120-160380-4101.3-1.4
[0350]
进行每日葡萄糖测量，并且根据需要添加单独的葡萄糖推注进料以将残留葡萄糖保持在或高于2g/l。基于与典型补料分批培养的运行持续时间相匹配的商业案例，培养在14天时终止。三次100l生物反应器运行的结果示在图3(vcd)、图4(渗透压)、图5(反应器体积交换)、图6(渗透物生产率)、图7(每日比生产率)和图8(细胞比灌注速率)中。
[0351]
实施例2
[0352]
在2l生物反应器中培养表达不同重组igg分子的三种cho细胞系a(
◇
)、b(
□
)和c
(δ)(参见图9至14)。在第0天接种后，立即使用专有生长培养基以1vvd的速率开始灌注。灌注速率每天增加0.5vvd，直到第2天达到2.0vvd。通过经由生物反应器重量控制培养基添加来维持生物反应器工作体积。在第2天，浓缩培养基进料和稀释剂替换生长培养基以开始“生产阶段”，也就是说，当培养在渗透物中达到0.2克/lbr/天的产物时，开始装载捕获柱。用不同比例的三种浓缩培养基进料和无菌水稀释剂以约2vvd的恒定体积喂养细胞。如实施例1中所解释的，计算进料速率，使得与2vvd的完整1x配制剂相比，每种进料中的营养物比例保持相同。
[0353]
细胞系a和b的vcd最大值分别为大约180
±
30e6个细胞/ml和140
±
30e6个细胞/ml，这基于先前的工程运行，其示出该范围为这些细胞系的最大可持续vcd(结果未示出)。细胞系c的最大峰值vcd为100
±
20e6c/ml，因此不需要抑制该细胞系的生长，并且渗透压保持在330
±
30mosm的生理最佳范围内。vcd计数在beckman coulter vi-cell(indianapolis,in)上进行。对于细胞系a和b，为了达到比这些细胞系的峰值生长能力低大约15-45％的目标(结果未示出)，逐渐增加培养物的渗透压以抑制细胞复制。用bioprofile flex分析仪(nova biomedical,waltham,ma)测量培养物渗透压，用roche cedex bioanalyzer(indianapolis,in)测量所有其他培养代谢物。渗透压增加通过每日调整浓缩进料速率和稀释剂速率以达到培养物的目标残留渗透压并同时保持总vvd添加恒定在两vvd来实现。如实施例1中所解释的，根据以下等式计算每日渗透压消耗：
[0354]
渗透压输入-渗透压输出 渗透压消耗。
[0355]
与实施例1一样，确定每日渗透压消耗速率，然后将其用于计算实现第二天的新期望渗透压输出所必需的渗透压输入。然而，在实施例2渗透压控制策略的情况下，调整进料和稀释剂二者的速率(与实施例1中仅调整稀释剂速率的情况相反)以在2vvd的总灌注速率下实现目标渗透压输入。
[0356]
进行每日葡萄糖测量，并且根据需要添加单独的葡萄糖推注进料以将残留葡萄糖保持在或高于2g/l。基于与典型补料分批培养的运行持续时间相匹配的商业案例，培养在14天时终止，且不需要细胞排出。三次2l生物反应器运行的结果示在图9(vcd)、图10(渗透压)、图11(反应器体积交换)、图12(渗透物生产率)、图13(每日比生产率)和图14(细胞比灌注速率)中。
[0357]
实施例3
[0358]
用不同的稀释剂体积，使用固定在每天总计0.5个容器体积(vvd)的三种浓缩培养基进料，在2l生物反应器中培养cho dg44细胞系(细胞系a，δ)和以一式两份运行的两种不同cho-k1细胞系(细胞系b
□
，
◇
；细胞系c x，x)，所述cho dg44细胞系在二氢叶酸还原酶(dhfr)选择系统中表达，并且所述两种不同cho-k1细胞系在谷氨酰胺合成酶(gs)选择系统(参见图15)中表达。所有细胞系都表达不同的重组igg分子。通过经由生物反应器重量控制培养基添加来维持生物反应器工作体积。在第2天，浓缩培养基进料和稀释剂替换生长培养基以开始“生产阶段”，也就是说，当培养在渗透物中达到0.2克/l
生物反应器
/天的产物时，开始装载捕获柱。在生产阶段期间，以恒定的0.5vvd总量补料浓缩进料(酸性进料为0.33vvd，碱性和中性进料各自为0.08vvd)。如实施例1中所解释的，计算进料速率，使得与2vvd的完整1x配制剂相比，每种进料中的营养物比例保持相同。
[0359]
细胞系a在生理最佳渗透压(330
±
30mosm)下培养达整个培养持续时间(12天)，以
促进最大细胞培养生长(即可能的峰值vcd)。这被认为是该细胞系的“工程”或开发运行。细胞系b以150
±
30e6个细胞/ml
±
20e6c/ml的vcd最大值为目标，这基于先前的工程运行，其示出该范围为该细胞系的最大可持续vcd(结果未示出)。细胞系c的最大峰值vcd《100
±
20e6c/ml，因此不需要抑制该细胞系的生长，并且渗透压保持在330
±
30mosm的生理最佳范围内。vcd计数在beckman coulter vi-cell(indianapolis,in)上进行。对于细胞系b，为了达到比该细胞系的峰值生长能力低大约15-45％的目标(结果未示出)，逐渐增加培养物的渗透压以抑制细胞复制。用bioprofile flex分析仪(nova biomedical,waltham,ma)测量培养物渗透压，用roche cedex bioanalyzer(indianapolis,in)测量所有其他培养代谢物。渗透压增加通过每日调整稀释剂速率以达到培养物的目标残留渗透压并同时保持进料添加速率恒定来实现。如实施例1中所解释的，根据以下等式计算每日渗透压消耗：
[0360]
渗透压输入-渗透压输出 渗透压消耗
[0361]
与实施例1一样，确定每日渗透压消耗速率，然后将其用于计算实现第二天的新期望渗透压输出所必需的渗透压输入。
[0362]
进行每日葡萄糖测量，并且根据需要添加单独的葡萄糖推注进料以将残留葡萄糖保持在或高于2g/l。如图15所示，培养在11、12和14天时终止。2l生物反应器运行的结果示出如下：图15a示出活细胞密度(vcd；e5c/ml)；图15b示出活力(％)；图15c示出渗透物生产率(g/l/天)，所述渗透物生产率通过将如由cedex生物分析仪所测量的渗透物每日瞬时滴度(g/l
培养基
)乘以每日灌注速率(l
培养基
/l
生物反应器
/天)来计算；以及图15d示出以反应器体积交换(l
培养基
/l
生物反应器
/天)表示的灌注速率。
[0363]
实施例4
[0364]
在2l生物反应器中培养在谷氨酰胺合成酶(gs)选择系统中表达重组igg的cho-k1细胞系。如实施例2和3中所描述的，以“mc不同，总vvd固定”(
◇
)或“mc固定，总vvd不同”(
□
)灌注控制模式进行运行。“mc不同，总vvd固定”是指恒定的每日总容器体积(vvd)灌注速率，其通过改变组合培养基浓缩物(mc)的灌注速率并同时改变稀释剂速率以维持2vvd来实现。“mc固定，总vvd不同”是指就整体波动的灌注速率而言，mc在0.5vvd下的恒定灌注速率以及不同的稀释剂灌注速率。两种灌注控制模式都能够操纵培养基渗透压以设定目标(图16b)。使用该细胞系的两种灌注控制模式，活力和活细胞密度都相当。培养基浓缩进料(即营养物递送)与稀释剂的分开实现了低灌注速率(≤2vvd)，其具有通过改变培养基浓缩与稀释剂的比例来以高细胞密度提供足够的营养物的能力。因此，可以将残留培养物渗透压控制在高于生理最佳范围(根据细胞系而有所不同；对于该细胞系为300-330mosm)的升高水平，且不会将灌注速率增加到2vvd以上(最高灌注速率被认为可扩展至》该公司的100l生物反应器)。当在达到峰值活细胞密度(vcd)之前增加渗透压时，可以抑制峰值vcd(参见图3和图4)。
[0365]
调整后的生产率(图16c)被确定为系统的总生产率，即包括每天渗透物中和保留在生物反应器内的产物。对于示出的细胞系，两种灌注控制模式的生产率相似，因此可以选择任一灌注模式作为该细胞系的处理过程。细胞培养的反应器体积交换(l
培养基
/l
生物反应器
/天)或灌注速率示出在图16d中。由于在运行“mc不同，总vvd国定”的第4天和第5天出现操作员错误，因此这些天未达到目标2vvd。生产阶段(》第2天)的所有剩余天数均维持在目标2vvd。“mc固定，总vvd不同”运行示出了维持目标渗透压所必需的可变灌注速率(图16b)。