一种桑白蚧微卫星标记开发方法与流程

1.本发明涉及生物微卫星标记技术领域，具体为一种桑白蚧微卫星标记开发方法。


背景技术：

2.ssr(simple sequence repeat，ssr)分子标记，又称为简单重复序列或者微卫星序列，通常包含1-6bp碱基，是一段有重复基元组成的dna序列，在生物遗传学的研究中已经有了很广泛的应用，因为它具有很好的多态性及共显性的特点，在基因中的数量也比较丰富。传统的ssr标记开发方法主要包括微卫星富集法、pcr分离法、同源序列借鉴法、基因组文库测序法、省略筛库法和数据库搜索法。微卫星富集法需构建和筛选基因组文库,操作过程比较繁琐，耗时长且成功率低，成本高；pcr分离法操作过程复杂，实验过程需要投入大量的精力和时间且实验中易发生污染；同源序列借鉴法耗时耗力，通用性低，并且在应用上有一定限制；基因组文库测序法其位点在基因组中覆盖率低，对设备要求高，成本高；省略筛库法操作过程繁琐，开发出的引物特异性低；数据库搜索法只限于在已有序列公布的物种中应用，具有局限性。
3.桑白蚧，pseudaulacaspis pentagona(targioni-tozzetti)又被称作桑拟轮蚧，桑盾蚧，隶属于半翅目hemiptera，蚧总科coccoidea，盾蚧科diaspididae，拟白轮盾蚧属，是一种果园常见的拟寄主性害虫，广泛分布于热带、亚热带和温带地区。该害虫是典型的多食性害虫，可以取食超过85科221属的植物，桑白蚧是食性最杂的盾蚧之一，桑白蚧有极大的危害性。由于桑白蚧寄主广泛，伴随着经济的不断发展，果树苗木调运的日趋频繁，桑白蚧通过我国各省和世界各国之间相互引进的苗木和果品迅速蔓延，危害范围日趋扩大。
4.在当前的研究中，目前桑白蚧的微卫星标记尚未见报道，桑白蚧微卫星的研究还处于空白状态，由于分子标记的缺失，严重的阻碍了桑白蚧防治策略的制定，不能对桑白蚧的种群遗传结构和种群遗传多样性提供数据支撑。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种桑白蚧微卫星标记开发方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，发明提供如下技术方案：一种桑白蚧微卫星标记开发方法，具体包括以下步骤：
7.步骤一：收集固着与植株枝干表面的雌成虫虫体50头，用液氮保存，存于-80℃冰箱中备用；
8.步骤二：进行总rna的提取；
9.步骤三：利用takaram-mlv反转录试剂盒进行cdna合成；
10.步骤四：用检测合格的样本送至测序公司进行转录组测序，组合拼接序列，得到dna序列结果，继而采用trinity软件对dna序列进行组装拼接成unigenes；
11.步骤五：利用ssr软件microsatellite找出微卫星序列，用primer3软件在核心序
列两侧设计引物并合成；
12.步骤六：利用温度梯度pcr进行引物退火温度的优化，根据引物合成的引物合成时的温度
±
5℃进行退火温度的筛选，扩增出引物设计时的目的片段的大小；
13.步骤七：利用8个不同地点中的每个地点中的单头桑白蚧提取的dna进行pcr扩增后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的为多态性微卫星引物；
14.步骤八：利用筛选得到的多态性引物对80头虫子的dna进行pcr扩增，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，统计凝胶成像系统条带结果，进行条带分析，评估多态性，分析桑白蚧遗传结构，评估不同种群桑白蚧的遗传多样性。
15.优选的，步骤二中的总rna的提取步骤为：
16.①
将1ml buffer rlysis-a加入1.5ml rnase-free的离心管中备用；
17.②
取50mg桑白蚧组织用液氮研磨成粉末，加到上述1.5ml离心管中，立即震荡混匀，室温放置3min；
18.③
向裂解样品中加入200μl氯仿，充分混匀，12000rpm、4℃、离心5min，取上清；
19.④
加入1/3体积无水乙醇，混匀，室温放置3min，12000rpm、4℃、离心5min，倒掉上清；
20.⑤
用700μl的75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm、4℃、离心3min，倒掉上清；
21.⑥
重复上面步骤
⑤
一次，室温倒置10min，使离心管中残留的乙醇彻底挥发，加入50μl的depc-treated ddh2o溶解沉淀，立即使用或-70℃长期保存；
22.⑦
提取得到的总rna用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测后，用bio-rad凝胶成像系统进行拍照保存，并且用微量核酸检测仪检测总rna的纯度和浓度。
23.优选的，步骤三中的cdna的合成步骤为：
24.①
取测定浓度的rna溶液，取含有1μg rna的溶液，加入1μl浓度为25μm的随机引物，加rnase-free的水补充体积到6μ；
25.②
混合均匀后，将混合液置于70℃加热10min；
26.③
取出样品，放置在冰上2min，冷却；
27.④
依次加入2μl的5
×
m-mlv buffer、0.5μl的浓度为10mm的dntp、0.25μl的浓度为40u/μl的rnase抑制剂、200u的m-mlv反转录酶，加水补齐到10μl，混匀；
28.⑤
将混匀的液体置于30℃加热10min，42℃加热1h，70℃加热15min。
29.优选的，步骤四中的dna序列结果展示如下：
30.》cluster-2294.20855
31.attccgtctgttcttcatgtgaattcctaatctcgtttaattcgttgcaaccatcttataattaattgagcaaaaagttg
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61.taagtacagattgcgctcatttacgttaaaatatacgtattac。
62.优选的，步骤七中的单头桑白蚧提取dna的步骤为：
63.①
用研钵和杵在液氮中研磨单头昆虫，将粉末放入1.5ml微量离心管中；
64.②
加入180μl buffer atl；
65.③
加入20μl蛋白酶k溶液，涡旋混合，充分混合，在56℃孵育直至昆虫完全溶解，在孵育过程中偶尔以涡旋分散样品；
66.④
涡旋15s，向样品中加入200μlbuffer al，并通过涡旋彻底混合，然后加入200μl乙醇(96
–
100％)，并通过涡旋再次彻底混合，加入缓冲液al和乙醇形成白色沉淀，该沉淀物不会干扰dneasy提取程序，大力摇动消解沉淀；
67.⑤
将来自第
④
步的混合物移入置于2ml收集管中的dneasy mini旋转柱中，≥6000xg(8000rpm)离心1分钟，丢弃流通和收集管；
68.⑥
将dneasy mini旋转柱放入新的2ml收集管中，添加500μlbuffer aw1，并以≥6000xg(8000rpm)离心1分钟，丢弃流通和收集管，洗脱后液体不能残留乙醇；
69.⑦
将dneasy mini旋转柱放在干净的1.5ml或2ml微量离心管中，然后将200μlbuffer ae直接吸到dneasy膜上，在室温下孵育1分钟，然后以≥6000xg(8000rpm)离心1分钟以洗脱；
70.⑧
将dneasy mini旋转柱放在干净的1.5ml或2ml微量离心管中，然后将200μlbuffer ae直接吸到dneasy膜上，在室温下孵育1分钟，然后以≥6000xg(8000rpm)离心1分钟以洗脱，得到最后dna提取溶液。
71.优选的，步
①
中用研钵和杵时应注意：为防止交叉污染，彻底清洁样品之间的研钵和研杵。
72.与现有技术相比，发明的有益效果是：该桑白蚧微卫星标记开发方法，采用创新的方法使用桑白蚧转录组测序技术，对基因组数据生物信息缺乏的桑白蚧进行微卫星开发，对桑白蚧微卫星位点进行深度挖掘，验证微卫星分子标记的多态性，继而为桑白蚧种群遗传学的探究提供理论依据和数据支撑。
具体实施方式
73.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
74.本发明提供一种技术方案：一种桑白蚧微卫星标记开发方法，具体包括以下步骤：
75.步骤一：收集固着与植株枝干表面的雌成虫虫体50头，用液氮保存，存于-80℃冰箱中备用；
76.步骤二：进行总rna的提取；
77.步骤三：利用takaram-mlv反转录试剂盒进行cdna合成；
78.步骤四：用检测合格的样本送至测序公司进行转录组测序，组合拼接序列，得到dna序列结果，继而采用trinity软件对dna序列进行组装拼接成unigenes；
79.步骤五：利用ssr软件microsatellite找出微卫星序列，用primer3软件在核心序列两侧设计引物并合成；
80.步骤六：利用温度梯度pcr进行引物退火温度的优化，根据引物合成的引物合成时的温度
±
5℃进行退火温度的筛选，扩增出引物设计时的目的片段的大小；
81.步骤七：利用8个不同地点中的每个地点中的单头桑白蚧提取的dna进行pcr扩增后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的为多态性微卫星引物；
82.步骤八：利用筛选得到的多态性引物对80头虫子的dna进行pcr扩增，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，统计凝胶成像系统条带结果，进行条带分析，评估多态性，分析桑白蚧遗传结构，评估不同种群桑白蚧的遗传多样性。
83.本实施例中，步骤二中的总rna的提取步骤为：
84.①
将1ml buffer rlysis-a加入1.5ml rnase-free的离心管中备用；
85.②
取50mg桑白蚧组织用液氮研磨成粉末，加到上述1.5ml离心管中，立即震荡混匀，室温放置3min；
86.③
向裂解样品中加入200μl氯仿，充分混匀，12000rpm、4℃、离心5min，取上清；
87.④
加入1/3体积无水乙醇，混匀，室温放置3min，12000rpm、4℃、离心5min，倒掉上清；
88.⑤
用700μl的75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm、4℃、离心3min，倒掉上清；
89.⑥
重复上面步骤
⑤
一次，室温倒置10min，使离心管中残留的乙醇彻底挥发，加入50μl的depc-treated ddh2o溶解沉淀，立即使用或-70℃长期保存；
90.⑦
提取得到的总rna用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测后，用bio-rad凝胶成像系统进行拍照保存，并且用微量核酸检测仪检测总rna的纯度和浓度。
91.本实施例中，步骤三中的cdna的合成步骤为：
92.①
取测定浓度的rna溶液，取含有1μg rna的溶液，加入1μl浓度为25μm的随机引物，加rnase-free的水补充体积到6μ；
93.②
混合均匀后，将混合液置于70℃加热10min；
94.③
取出样品，放置在冰上2min，冷却；
95.④
依次加入2μl的5
×
m-mlvbuffer、0.5μl的浓度为10mm的dntp、0.25μl的浓度为40u/μl的rnase抑制剂、200u的m-mlv反转录酶，加水补齐到10μl，混匀；
96.⑤
将混匀的液体置于30℃加热10min，42℃加热1h，70℃加热15min。
97.本实施例中，步骤四中的dna序列结果展示如下：
98.》cluster-2294.20855
99.attccgtctgttcttcatgtgaattcctaatctcgtttaattcgttgcaaccatcttataattaattgagcaaaaagttg
100.caccagtaggaagtattttgctcgcgaagctctcagattttcgtgtatactcgatgtcattgtgaacgagtttgagtgca
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129.taagtacagattgcgctcatttacgttaaaatatacgtattac。
130.本实施例中，步骤七中的单头桑白蚧提取dna的步骤为：
131.①
用研钵和杵在液氮中研磨单头昆虫，将粉末放入1.5ml微量离心管中；
132.②
加入180μl buffer atl；
133.③
加入20μl蛋白酶k溶液，涡旋混合，充分混合，在56℃孵育直至昆虫完全溶解，在孵育过程中偶尔以涡旋分散样品；
134.④
涡旋15s，向样品中加入200μlbuffer al，并通过涡旋彻底混合，然后加入200μl乙醇(96
–
100％)，并通过涡旋再次彻底混合，加入缓冲液al和乙醇形成白色沉淀，该沉淀物不会干扰dneasy提取程序，大力摇动消解沉淀；
135.⑤
将来自第
④
步的混合物移入置于2ml收集管中的dneasy mini旋转柱中，≥6000xg(8000rpm)离心1分钟，丢弃流通和收集管；
136.⑥
将dneasy mini旋转柱放入新的2ml收集管中，添加500μlbuffer aw1，并以≥6000xg(8000rpm)离心1分钟，丢弃流通和收集管，洗脱后液体不能残留乙醇；
137.⑦
将dneasy mini旋转柱放在干净的1.5ml或2ml微量离心管中，然后将200μlbuffer ae直接吸到dneasy膜上，在室温下孵育1分钟，然后以≥6000xg(8000rpm)离心1分钟以洗脱；
138.⑧
将dneasy mini旋转柱放在干净的1.5ml或2ml微量离心管中，然后将200μlbuffer ae直接吸到dneasy膜上，在室温下孵育1分钟，然后以≥6000xg(8000rpm)离心1分钟以洗脱，得到最后dna提取溶液。
139.本实施例中，步
①
中用研钵和杵时应注意：为防止交叉污染，彻底清洁样品之间的研钵和研杵。
140.技术效果：该桑白蚧微卫星标记开发方法，采用创新的方法使用桑白蚧转录组测序技术，对基因组数据生物信息缺乏的桑白蚧进行微卫星开发，对桑白蚧微卫星位点进行深度挖掘，验证微卫星分子标记的多态性，继而为桑白蚧种群遗传学的探究提供理论依据和数据支撑。
141.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。