用于细胞可寻址核酸测序的方法
交叉引用
1.本技术要求于2019年9月23日提交的美国临时申请号62/904,623的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
背景技术：
2.癌症、传染病、生态失调以及其他疾病和病症的新兴诊断方法依赖于下一代测序(ngs)方法来提供高分辨率的遗传和基因组数据，从而实现稳健和个性化的诊断、治疗计划，并最终治愈以前无法驾驭的疾病。尽管ngs方法功能强大，但仍受限于可用于向执行实际测序的仪器提供核酸样品的方法。例如，鉴定特定肿瘤中存在的突变的精确性质需要分离肿瘤组织、分离核酸、以及在使用仪器获得实际序列数据之前为特定测序方法制备样品中的多个步骤。此外，以允许特定序列与特定细胞或组织相关联的方式对序列数据进行去卷积和处理由于ngs技术的性质而变得复杂，这通常需要汇集样品，在此期间空间和细胞身份信息会丢失。
3.已经提出了各种方法来解决ngs方法中细胞可寻址性丧失的问题，目标在于提供具有更高空间或组织分辨率的分子诊断。例如，一些方法依赖于细胞的分离，然后对来自每个单个细胞的核酸应用独特的条形码，然后进行批量测序，在测序运行完成后使用独特的条形码鉴定与每个单个细胞相关的序列。例如，这可以通过将单个细胞暴露于隔离环境(例如珠粒或乳液)中的裂解和杂交混合物来实现。这些方法可能还需要富集或处理靶细胞亚群，例如通过对循环细胞进行细胞分选，或通过组织收获然后对实体肿瘤细胞进行解离和蛋白酶处理。
4.虽然这些方法可以获得细胞可寻址信息，但它们面临着严重的限制，例如处理实体组织中的困难，以及受分离、标记和制备用于测序的核酸的能力限制的通量率。同样，也存在与为了执行测序步骤而需要将准备好的文库转移到单独的仪器、系统或位置相关联的一些限制。这为每次测序运行约50,000个细胞的测序通量提供了实际限制，鉴于组织、分泌物、排泄物或渗出物或微生物组样品的诊断相关样品中存在大量细胞，这会严格限制这些测定的灵敏度和实用性。可以简单地通过物理分离样品并以已知顺序执行分离、文库制备和测序反应来实现一定程度的可寻址性。然而，这个过程是劳动密集型和耗时的，使其作为筛选大量患者的手段或作为部署系统筛选方法的手段是不切实际的。
5.因此，需要组合物和方法，所述组合物和方法能够提高细胞可寻址测序方法以及消除现有技术的上述限制的细胞或空间可寻址测序方法的准确性和通量。
技术实现要素：
6.本文公开的方面提供了用于分析生物样品的方法，所述方法包括：(a)检测在生物样品或其衍生物的存在下在靶核酸分子或其衍生物的靶核酸序列与可检测的聚合物-核苷酸缀合物之间形成的多价结合复合物；以及(b)确定所述生物样品或其衍生物中所述靶核酸序列的来源。在一些实施方案中，(b)中的确定至少部分地通过分析所述靶核酸序列与所
述生物样品或其衍生物的参考点之间的相对三维关系来进行。在一些实施方案中，方法还包括在生物样品的所述存在下使所述生物样品或其衍生物与所述可检测聚合物-核苷酸缀合物接触。在一些实施方案中，方法还包括将所述靶核酸序列的至少一部分偶联至与基底的表面偶联的捕获寡核苷酸分子。在一些实施方案中，所述表面具有小于或等于45度的水接触角。在一些实施方案中，偶联包括在杂交缓冲液存在下进行杂交，所述杂交缓冲液包含：(i)具有不大于40的介电常数并且具有4-9的极性指数的第一极性非质子溶剂；以及(ii)具有小于或等于115的介电常数的第二极性非质子溶剂。在一些实施方案中，方法还包括以足以固定所述相对三维关系的方式将所述生物样品或其衍生物固定在所述表面上。在一些实施方案中，方法还包括任选地使用滚环扩增在所述基底的所述表面上扩增所述靶核酸序列。在一些实施方案中，在所述生物样品或其衍生物的所述存在下，所述表面的图像表现出大于或等于约5的对比度噪声比，该对比度噪声比是通过以下测量的：(a)使所述表面与经荧光标记的核苷酸分子接触，所述经荧光标记的核苷酸分子包含与固定于所述表面的捕获寡核苷酸的至少一部分互补的核酸序列；(b)在(a)之后，使用倒置显微镜和照相机在非信号饱和条件下在将所述表面浸入缓冲液中的同时对所述表面进行成像。在一些实施方案中，方法还包括在偶联至所述聚合物-核苷酸缀合物的核苷酸部分与所述靶核酸分子或其衍生物之间进行核苷酸结合反应。在一些实施方案中，所述靶核酸分子或其衍生物是脱氧核糖核酸(dna)分子。在一些实施方案中，所述生物样品或其衍生物包括流体生物样品。在一些实施方案中，所述来源是癌性组织。
7.本文公开的方面提供了用于原位鉴定细胞或组织内的亚细胞组分的至少一部分的方法，所述方法包括：(a)检测来自所述亚细胞组分或其衍生物与可检测聚合物-核苷酸缀合物之间的多价结合复合物的信号；(b)处理在(a)中检测到的至少所述信号以鉴定所述亚细胞组分或其衍生物的所述至少所述部分。在一些实施方案中，所述亚细胞组分或其衍生物是核酸。在一些实施方案中，所述核酸是dna。在一些实施方案中，方法还包括：(c)将所述细胞或所述组织固定在基底的表面上。在一些实施方案中，方法还包括：(d)将所述亚细胞组分的至少一部分偶联至与所述表面偶联的捕获分子。在一些实施方案中，方法还包括：(e)在(a)中的检测之前透化所述组织或裂解所述细胞。在一些实施方案中，所述表面具有小于或等于45度的水接触角。在一些实施方案中，(d)中的偶联包括在杂交缓冲液的存在下使所述捕获分子与所述亚细胞组分的所述至少所述部分杂交，所述杂交缓冲液包含：(i)具有不大于40的介电常数并且具有4-9的极性指数的第一极性非质子溶剂；以及(ii)具有小于或等于115的介电常数的第二极性非质子溶剂。在一些实施方案中，所述表面的图像表现出大于或等于约5的对比度噪声比，该对比度噪声比是通过以下测量的：(a)使所述表面与经荧光标记的核苷酸分子接触，所述经荧光标记的核苷酸分子包含与固定于所述表面的捕获寡核苷酸的至少一部分互补的核酸序列；和(b)在(a)之后，使用倒置显微镜和照相机在非信号饱和条件下在将所述表面浸入缓冲液中的同时对所述表面进行成像。在一些实施方案中，在(a)中检测来自所述多价结合复合物的所述信号包括在与所述聚合物-核苷酸缀合物偶联的核苷酸部分和所述亚细胞组分或其衍生物之间进行核苷酸结合反应。在一些实施方案中，所述组织来自肿瘤。
8.一种用于分析生物样品的系统，所述系统包括：基底，其包括偶联有聚合物层的表面，所述聚合物层适于将所述生物样品固定到所述表面，其中：所述生物样品或其衍生物包
括靶核酸分子或其衍生物；所述聚合物层被配置为与(i)所述生物样品或其衍生物，或(ii)所述靶核酸分子或其衍生物偶联；所述靶核酸分子或其衍生物被配置为与包含可检测标记的核苷酸部分偶联；并且当所述表面的图像是在非信号饱和条件下在将所述表面浸入缓冲液中的同时使用倒置显微镜和照相机获得并且其中所述可检测标记是荧光染料时，所述表面的所述图像表现出大于或等于约5的对比度噪声比。在一些实施方案中，所述聚合物层是亲水性的。在一些实施方案中，系统还包括固定剂，当所述生物样品在与所述表面相邻时与所述固定剂接触时，所述固定剂将所述生物样品固定到所述表面。在一些实施方案中，所述固定剂包括甲醛或戊二醛。在一些实施方案中，所述靶核酸分子是多联体。在一些实施方案中，所述靶核酸分子包含通用序列区域，所述通用序列区域包括空间条形码序列或样品条形码序列，其被配置为在所述生物样品中保留所述靶核酸分子的来源。在一些实施方案中，当获得所述表面的图像时，所述表面的所述图像表现出大于或等于约10的对比度噪声比。在一些实施方案中，所述基底是流动池装置，其包括第一流动通道和任选的第二流动通道。在一些实施方案中，所述基底是反射的、透明的或半透明的平面基底。在一些实施方案中，所述流动池装置是毛细管流动池装置。
9.本文公开的方面包括用于分析生物样品或其衍生物中的核酸序列信息的系统，所述系统包括：一个或多个计算机处理器，其被编程为：(a)检测来自在所述生物样品或其衍生物的存在下在靶核酸分子或其衍生物的靶核酸序列与可检测的聚合物-核苷酸缀合物之间形成的多价结合复合物的信号，其中所述信号指示所述靶核酸序列中核苷酸的身份；(b)确定所述生物样品中所述靶核酸序列的来源。在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被编程以通过分析所述靶核酸分子或其衍生物与所述生物样品或其衍生物之间的相对三维关系来确定(b)中所述靶核酸序列的所述来源。在一些实施方案中，所述系统还包括数据库，所述数据库被配置为存储与所述靶核酸序列的所述来源相关的三维数据。在一些实施方案中，所述数据库进一步被配置为存储包括所述靶核酸序列中所述核苷酸的所述身份的测序数据。在一些实施方案中，通过关联所述测序数据和所述三维数据来执行(b)。在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被编程以通过重复(a)至(b)在少于60分钟内鉴定所述靶核酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被编程为以特征在于对于至少80％的经鉴定的核苷酸的q得分大于25的碱基判定准确度执行(a)至(b)。在一些实施方案中，所述可检测的聚合物-核苷酸缀合物包含：(a)聚合物核心；以及(b)附接至所述聚合物核心的两个或更多个核苷酸部分，其中所述聚合物-核苷酸缀合物被配置为在所述两个或更多个核苷酸部分与所述靶核酸分子或其衍生物之间形成多价结合复合物。在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物。在一些实施方案中，所述聚合物核心包括具有星形、梳形、交联、瓶刷状或树枝状大分子构型的聚合物。在一些实施方案中，所述聚合物核心包括支化聚乙二醇(peg)分子。在一些实施方案中，系统还包括光学成像系统，所述光学成像系统包括大于1.0mm2的视场(fov)。
10.本文公开的方面提供了试剂盒，所述试剂盒包括：(a)可检测的聚合物-核苷酸缀合物，其包括：(i)聚合物核心；以及(ii)(ii)附接至所述聚合物核心的两个或更多个核苷酸部分；(b)针对以下的说明书：通过以下原位鉴定细胞或组织内的亚细胞组分的至少一部分：使所述可检测的聚合物-核苷酸缀合物与所述亚细胞组分在足以在所述两个或更多个
核苷酸部分与所述亚细胞组分之间形成多价结合复合物的条件下接触。在一些实施方案中，试剂盒包括4种类型的所述可检测聚合物-核苷酸缀合物，其中所述4种类型中的每一种具有与其附接的不同核苷酸部分。
11.本文公开的方面包括试剂盒，所述试剂盒包括：(a)包括表面的基底，所述表面具有与其偶联的聚合物层，所述聚合物层适于将生物样品或其衍生物固定到所述表面；以及(b)针对以下的说明书：确定所述表面上的所述生物样品或衍生物中的靶核酸序列和所述靶核酸序列的来源。在一些实施方案中，试剂盒还包括：(a)杂交缓冲液，所述杂交缓冲液包含：(i)具有不大于40的介电常数并且具有4-9的极性指数的第一极性非质子溶剂；以及(ii)具有小于或等于115的介电常数的第二极性非质子溶剂；以及(b)针对以下的说明书：将所述靶核酸序列的至少一部分与偶联至所述表面的捕获寡核苷酸的至少一部分杂交。通过引用并入
12.本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体并入本文，其程度如同具体地和单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入。
附图说明
13.在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考对利用了本发明原理的说明性实施方式加以阐述的以下详细描述并结合附图可以更好地理解本发明的新颖性特征和优点，在附图中：
14.图1是根据本公开的实施方案的低结合载体的一个实施方案的示意图，所述低结合载体包括玻璃基底和亲水涂层的交替层，所述亲水涂层共价或非共价地粘附至玻璃，并且还包含化学反应性官能团，其用作寡核苷酸引物(例如，捕获寡核苷酸和环化寡核苷酸)的附接位点。在替代实施方案中，载体可以由任何材料制成，例如玻璃、塑料或聚合物材料。
15.图2是示出根据本公开的实施方案的包括固定在其上的捕获寡核苷酸和环化寡核苷酸的载体的示意图。在一些实施方案中，载体包括固定在其上的多个捕获寡核苷酸和多个环化寡核苷酸。
16.图3是示出根据本公开的实施方案的载体以及放置在载体上的生物样品(例如，组织样品)(参见左侧示意图)的示意图，所述载体包括固定在其上的多个捕获寡核苷酸和环化寡核苷酸。图3示出了具有一系列特征的载体的放大截面，每个特征具有圆形形状并经标记用于在载体上进行空间鉴定(参见右侧示意图)。每个特征包括多个固定的捕获寡核苷酸和环化寡核苷酸。
17.图4是示出根据本公开的实施方案的包括固定在其上的捕获寡核苷酸的载体以及可溶性环化寡核苷酸的示意图。在一些实施方案中，载体包括固定在其上的多个捕获寡核苷酸。
18.图5a是示出根据本公开的实施方案的聚合物-核苷酸缀合物的核苷酸臂的示意图。
19.图5b是根据本公开的实施方案的聚合物-核苷酸缀合物的示意图，所述聚合物-核苷酸缀合物包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中每个核苷酸臂包含(i)核心附接部分，(ii)间隔子，(iii)接头和(iv)核苷酸单元。
20.图5c是根据本公开的实施方案的呈树枝状大分子形式的聚合物-核苷酸缀合物的
示意图，所述聚合物-核苷酸缀合物包含从中心附接点或中心部分辐射的支化聚合物，其中多个核苷酸臂从中心附接点辐射。
21.图5d是根据本公开的实施方案的聚合物-核苷酸缀合物的核苷酸臂，其包含生物素核心附接部分、间隔子、脂肪族链接头和通过碱基处的炔丙基连接与接头附接的核苷酸。
22.图6a示出了根据本公开的实施方案的聚合物-核苷酸缀合物的间隔子和接头的结构。
23.图6b示出了根据本公开的实施方案的聚合物-核苷酸缀合物的另外接头的结构。
24.图7示出了根据本公开的实施方案的工作流程。
25.图8a-图8b示意性地示出了对双表面载体结构成像的非限制性示例，其用于呈现样品位点以通过本文公开的成像系统进行成像。图8a：对流动池前和后内表面成像的图示。图8b：对基底的前和后外表面成像的图示。
26.图9a-图9b示出了包括二向色分束镜的多通道荧光成像模块的非限制性示例，所述二向色分束镜用于将激发光束传输至样品，并且接收所产生的荧光发射并将所产生的荧光发射通过反射重定向至四个检测通道，所述四个检测通道被配置为检测四个不同对应波长或波段的荧光发射。图9a：等距俯视图。图9b：等距仰视图。
27.图10a-图10b示出了图10a和图10b的多通道荧光成像模块内的光路，该多通道荧光成像模块包括二向色分束镜，所述二向色分束镜用于将激发光束传输至样品，并且接收所产生的荧光发射并将所产生的荧光发射通过反射重定向至四个检测通道，所述四个检测通道用于检测四个不同对应波长或波段的荧光发射。图10a：俯视图。图10b：侧视图。
28.图11a-图11b示出了本文公开的具有0.3的数值孔径(na)的示例性双表面成像系统的调制传递函数(mtf)。图11a：第一表面。图11b：第二表面。
29.图12a-图12b示出了本文公开的具有0.5的na的示例性双表面成像系统的mtf。图12a：第一表面。图12b：第二表面。
30.图13a-图13b示出了本文公开的具有0.7的na的示例性双表面成像系统的mtf。图13a：第一表面。图13b：第二表面。
31.图14a-图14b提供了用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的所计算的斯特列尔比的图。图14a：对于不同物镜和/或光学系统数值孔径，作为中间流体层厚度(流体通道高度)的函数的用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的斯特列尔比的图。图14b：针对通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像和厚度为0.1mm的中间水层，作为数值孔径的函数的斯特列尔比的图。
32.图15提供了用于物镜设计的光射线追迹图，所述物镜设计被设计为用于对0.17mm厚的盖玻片相对侧的表面成像。
33.图16提供了当用于对0.17mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图15中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
34.图17提供了当用于对0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
35.图18提供了当用于对与0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图15中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
36.图19提供了当用于对1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图15中示出的物镜
的随空间频率变化的调制传递函数的图。
37.图20提供了当用于对与1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图15中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
38.图21提供了用于镜筒透镜设计的射线追迹图，如果与图15中示出的物镜结合使用，则所述镜筒透镜设计提供通过1mm厚的盖玻片的改善的双面成像。
39.图22提供了当用于对1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图15中示出的物镜和镜筒透镜的组合的随空间频率变化的调制传递函数的图。
40.图23提供了当用于对与1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图15中示出的物镜和镜筒透镜的组合的随空间频率变化的调制传递函数的图。
41.图24图示了具有2个流体适配器的单个毛细管流动池的一个非限制性示例。
42.图25图示了流动池盒的一个非限制性示例，该流动池盒包括底座、流体适配器和任选的其他组件，并且被设计成容纳两个毛细管。
43.图26图示了系统的一个非限制性示例，该系统包括连接到各种流体流量控制组件的单个毛细管流动池，其中该单个毛细管与在显微镜载物台上或在定制成像仪器中的安装兼容，以用于各种成像应用。
44.图27是示意图，其示出了根据本文所述的各种实施方案的其上固定有捕获寡核苷酸和环化寡核苷酸的载体，以及用于从位于载体上的细胞生物样品捕获核酸的示例性方法。
45.图28是示意图，其示出了根据本文所述的各种实施方案的其上固定有捕获寡核苷酸的载体，以及用于从位于载体上的细胞生物样品捕获核酸的示例性方法，其中所述方法包括使用可溶性环化寡核苷酸。
具体实施方式
46.本文提供了空间可寻址和细胞可寻址测序方法和系统，以及可用于执行本文所述方法和系统的组合物、装置和试剂盒。本文所述的方法和系统可以在原位核苷酸结合反应中使用聚合物-核苷酸缀合物。核苷酸结合反应可以在亲水性表面上进行，这提供了本文所述的许多优点。本文还提供了与ph缓冲液组合的包含极性且非质子溶剂的杂交缓冲液。还提供了可用于在空间上解析测序数据的光学系统。在一些实施方案中，本文所述的光学系统具有大于1.0mm2的视场。
47.如图7所示，在一些实施方案中，本文所述的方法包括：(a)提供具有与其偶联的多个捕获寡核苷酸的表面(例如，低非特异性结合表面)(701)；将含有靶核酸分子的生物样品固定到表面，并任选地使生物样品透化(702)；(c)在足以允许多个捕获寡核苷酸的至少一部分与靶核酸分子杂交的条件下使多个捕获寡核苷酸与靶核酸分子接触(703)；(d)扩增靶核酸分子以产生扩增的靶核酸分子或其衍生物(704)；(e)使扩增的靶核酸分子或其衍生物与一种或多种聚合酶和具有与扩增的靶核酸分子或其衍生物的一个或多个区域互补的引物序列的一种或多种引物核酸分子接触，以产生引发的靶核酸分子或其衍生物(705)；(f)使引发的靶核酸分子或其衍生物与包含两个或更多个核苷酸部分的聚合物-核苷酸缀合物接触，所述两个或更多个核苷酸部分偶联到用可检测标记物(例如，荧光团)标记的聚合物
(例如，peg)核心上(706)；(g)检测在引发的靶核酸分子或其衍生物与聚合物-核苷酸缀合物之间形成的多价结合复合物(707)；(h)用足以从引发的靶核酸分子或其衍生物中去除聚合物-核苷酸缀合物的缓冲液洗涤表面(708)；(i)掺入核苷酸，所述核苷酸不含可检测标记，并且任选包含阻断第二核苷酸在引发的靶核酸分子或其衍生物上的n 1位置掺入的封闭基团(例如叠氮基甲基)(709)；(j)任选地，重复步骤(f)-(j)(710)。
48.现有的空间可寻址序列鉴定方法(在本文中也称为空间转录组学技术)具有低灵敏度、非特异性和目标转录物的空间定位不准确的问题。相反，本文所述的方法、系统、组合物和试剂盒通过以下克服了这些挑战：例如，通过利用低非特异性结合表面、高效杂交缓冲液、制备具有高拷贝数的纳米球的方法和多价分子。
49.与现有方法相比，本公开的低非特异性结合和改善的信号提供了显著改善的对比度噪声(cnr)比。通过利用高度紧凑的反应焦点(例如，具有高拷贝数的高度压实的核酸簇)、高效的表面杂交(允许核酸捕获的精确定位)和非常低的背景，至少部分改善了cnr，同时实现了高度有效的捕获、扩增和靶核酸聚簇。当生物样品(例如，组织、细胞悬浮液)与基底偶联时，测序反应可以在生物样品存在的情况下进行。测序反应的分析可以以提供细胞可寻址性和/或空间可寻址性的方式进行，使得序列数据可以与其来源于的组织、细胞类型、生理位置或空间位置相关联。
50.本文所述的高效杂交缓冲液促进核酸杂交反应的高度严格性(例如特异性)、速度和功效，并提高后续扩增和测序步骤的效率。高效杂交缓冲液可显著缩短核酸杂交时间，并降低样品输入要求。高效杂交缓冲液可用于等温条件下的核酸退火工作流程，这无需冷却步骤进行退火。高效杂交缓冲液提供表面上核酸捕获的精确定位，用于源自细胞或组织的核酸(例如转录物)的精确空间定位。
51.本文所述的滚环扩增方法包括两阶段方法，其采用非催化性二价阳离子然后是催化性二价阳离子来同步表面上的滚环扩增事件并产生多联体。滚环扩增反应之后可以是松弛条件和弯曲扩增(flexing amplification)反应，其从现有的多联体产生新的多联体。总之，这些扩增方法产生高度压实的纳米球，其包含高拷贝数的靶序列，这提高了测序信号强度。
52.本文所述的核酸分析方法可具有比现有方法更高的通量，允许每次运行分析50,000、100,000、150,000、250,000、500,000、750,000、1,000,000或更多个细胞，通过原则上允许检测每百万个细胞中少至一个细胞的突变，从而大大提高诊断灵敏度。本文公开的核酸方法的另一个优点是所需的反应可以在单一温度(例如等温条件)下进行，例如20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、50℃、60℃、65℃、70℃或72℃或更高，或在上述任何两个定义的范围内。
53.测序反应期间使用的多价分子提供了游离核苷酸所不具备的许多优势。多价分子包含与多个臂附接的核心，其中每个臂拴系到核苷酸。多价分子增加了聚合酶/模板结合位点附近核苷酸的局部浓度。多价分子在与聚合酶和核酸模板形成稳定的三元复合物时也表现出增加的持续时间。因此，经标记的多价分子在测序反应期间提供更短的成像时间并增加信号强度。
54.使用本文所述的方法和系统生成的测序数据的细胞和空间分辨率通过本文所述的成像方法和系统实现，本文所述的成像方法和系统为基因组学应用提供增加的光学分辨
率和改善的图像质量。
55.本文公开了用于高性能荧光成像方法和系统的光学组件和系统设计，其可以提供以下中任何一项或多项：更大的视场，改善的光学分辨率(包括高性能光学分辨率)，改善的对比度，改善的图像质量，重新定位样品平面以捕获一系列图像(例如不同视场的图像)时图像捕获之间的过渡更快，改善的成像系统占空比，以及更高通量的图像获取和分析。
56.在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用(包括使用厚流动池壁(例如壁(或盖玻片)厚度》700μm)和流体通道(例如，流体通道的高度或厚度是50-200μm))，成像性能的改善可以使用新颖的物镜设计来实现，所述物镜设计校正光学像差，所述光学像差是通过对厚盖玻片和/或流体通道的与物镜相对侧上的表面成像而引入的。
57.在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用(包括使用厚流动池壁(例如壁(或盖玻片)厚度》700μm)和流体通道(例如，流体通道的高度或厚度是50-200μm))，成像性能的改善可以甚至在使用商业上可用的现成物镜时通过以下实现：使用新颖的镜筒透镜设计(不同于只是在中间像平面上形成图像的传统显微镜中的镜筒透镜)，所述新颖的镜筒透镜设计与物镜组合地校正由厚流动池壁和/或中间流体层引起的光学像差。
58.在一些情况下，例如对于多通道(例如，两色或四色)成像应用，成像性能的改善可以通过以下来实现：使用多个镜筒透镜，一个镜筒透镜用于一个成像通道，其中每个镜筒透镜设计已经针对在该成像通道中使用的指定波长范围进行了优化。
59.在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用，成像性能的改善可以通过以下来实现：使用电光相位板与物镜组合以补偿由分隔流动池的上(近)内表面和下(远)内表面的流体层引起的光学像差。在一些情况下，该设计方法还可以补偿由例如运动致动的补偿器引入的振动，所述运动致动的补偿器根据对流动池的哪个表面进行成像而移入或移出光路。
60.所公开的成像光学器件设计的另外有利特征可以包括一个或多个激发光源以及一个或多个检测光路相对于物镜和接收激发光束的二向色滤光镜的位置和取向。激发光束也可以是线性偏振的，并且线性偏振的取向可以使得s偏振光入射在二向色滤光镜的二向色反射表面上。这样的特征可以潜在地改善激发光束滤波和/或减少由于，例如，二向色滤光镜的表面变形而引入到发射光束中的波前误差。
61.尽管本文主要在荧光成像(包括例如荧光显微镜法成像、荧光共聚焦成像、双光子荧光等)的背景下讨论，但本领域技术人员将理解，许多公开的光学设计方法和特征可应用于其他成像模式，例如，明场成像、暗场成像、相衬成像等。
62.除了本文公开的光学组件和成像系统设计之外，还公开了用于执行各种基因组分析方法(包括细胞可寻址核酸测序)的流动池装置和系统，其可以包括所公开的光学、机械、流体、热、电和计算模块或子系统的各种组合。所公开的流动池装置、盒和分析系统所赋予的优点包括但不限于：(i)降低了装置和系统的制造复杂性和成本，(ii)显著降低了可消耗成本(例如，与目前可用的核酸测序系统的可消耗成本相比)，(iii)与典型的流动池表面功能化方法的兼容性，(iv)与微流体组件(例如注射泵和隔膜阀等)组合时的灵活流量控制，以及(v)灵活的系统通量。
63.在一些情况下，所公开的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒可以由现成的、一次性的、单腔(例如，单流体流动通道)或多腔毛细管构成，其还可以包括流体适配器、盒底
座、一个或多个集成的流体流量控制组件，或它们的任何组合。在一些情况下，所公开的基于流动池的系统可以包括一个或多个毛细管流动池装置(或微流体芯片)、一个或多个毛细管流动池盒(或微流体盒)、流体流量控制器模块、温度控制模块、成像模块，或其任何组合。一些公开的毛细管流动池装置、盒和系统的设计特征包括但不限于(i)统一的流动通道构造，(ii)试剂流之间的密封、可靠和重复性的切换，这些可通过以下方式实现：简单的加载/卸载机制，从而可靠地密封了系统和毛细管之间的流体接口，由此有利于毛细管更换和系统重复使用，并能够精确控制反应条件，例如试剂浓度、ph和温度；(iii)可更换的单个流体流动通道装置或毛细管流动池盒包括多个可互换使用的流动通道，以提供灵活的系统通量，以及(iv)与多种检测方法(例如荧光成像)的兼容性。
64.尽管公开的毛细管流动池装置和系统以及微流体装置和系统主要在其用于核酸测序应用的背景下进行了描述，但是所公开的装置和系统的各个方面不仅可以应用于核酸测序，也可以应用于任何其他类型的化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用。应当理解，可以单独地、共同地或彼此结合地理解所公开的方法、装置和系统的不同方面。
65.文所述的实施方案为以下提供显著优势：诊断癌症(包括循环肿瘤和实体瘤)、分析活检样品(例如用于诊断遗传障碍)、分析微生物组样品(例如用于诊断与微生物菌群生态失调相关的障碍)、用于诊断伴随分泌物或渗出物的障碍或用于评估一般健康或疾病风险(其中可以根据特定细胞、组织或位置中特定基因序列的存在或身份来评估此类风险)。例如，使用高分辨率细胞可寻址测序技术来鉴定低水平的循环肿瘤细胞的存在以诊断血液癌症或早期转移可以是有用的。
66.在一些实施方案中，组织中的细胞或单个细胞可以在针对靶核酸的结合(捕获)而优化的条件下暴露于表面，例如通过包含高密度的聚t(聚胸苷酸)或聚dt寡核苷酸用于捕获rna转录物，然后进行逆转录，或包含随机序列捕获寡核苷酸用于与基因组、循环或细胞器dna杂交。在一些实施方案中，该捕获过程之后可以是一个或多个文库制备步骤，例如将至少一个衔接子附加到捕获的核酸，其中衔接子可以包含索引序列、条形码序列和/或独特分子标识符(umi)。衔接子附加步骤可以通过连接(例如平末端连接)或使用“夹板”寡核苷酸进行。这些文库制备步骤可导致或可还包括捕获的核酸的环化。在一些实施方案中，可例如通过滚环扩增(rca)来扩增环化的核酸分子，产生包含靶序列的多个串联重复序列的大的多拷贝核酸分子(例如，多联体)。在一些实施方案中，所述大的多拷贝核酸可以形成凝集状态，例如通过使用有利于紧密dna状态的缓冲条件、具有高密度捕获寡核苷酸的表面、使用在大的多拷贝核酸中桥接两个或更多个位点的二价或双特异性寡核苷酸(“聚簇寡核苷酸”或“聚簇寡聚核苷酸”)，或通过前述的任何组合，或通过本领域已知或将已知的任何方法以产生包含大的多拷贝核酸的紧密簇。
67.在一些实施方案中，用于从组织或细胞中捕获核酸的表面可以被构造成以保留具有高活性的核酸，同时保持对不需要的蛋白质、脂质、碳水化合物或细胞碎片的其他组分的低水平结合。因此，本文所考虑的表面能够与来自组织中的细胞或来自单细胞的核酸结合，所述细胞在与表面接触或与表面相邻时被裂解。此外，表面不保留细胞碎片，也不显示与添加的蛋白质(例如核酸聚合酶)或其他分子、部分、颗粒或物品(例如染料分子或荧光团)的显著非特异性结合。
68.在一些实施方案中，细胞裂解(和任选的核酸片段化)在与表面接触或接近表面时进行，使得大量的，例如代表性量的或从细胞或组织样品中释放的基本上所有的dna、rna或其他靶核酸将被表面捕获。表面可以被构造成使得细胞可以流过表面以到达所述表面上的捕获位点。可替代地，捕获表面可以被构造成使得组织(例如，组织切片)可以被放置为与表面接触或流体连通，其中然后试剂可以以促进原位捕获来自组织的核酸的方式流过组织，从而使得来自组织的一个细胞或区域的核酸相对于来自组织的其他细胞或区域的核酸将被以相同的位置和方向捕获，因为核酸被定向或定位在完整组织内。
69.在一些实施方案中，靶核酸的捕获、衔接子附加、环化、扩增和聚簇可以在附接到表面或紧邻表面的同时进行。可替代地，一个或多个前述制备步骤可以在游离溶液中进行，或者在附接到珠粒时进行。
70.细胞特异性核酸互补序列(例如细胞基因组或细胞转录组)的空间分辨结合，然后是衔接子附加、环化、扩增和聚簇，于是使得能够使用测序技术，例如基于亲和力的测序方法，例如在美国申请号62/897,172和16/579,794(在此通过引用以其整体并入)中描述的方法；并且如本文其他地方所述。如美国专利申请号16/363,842中公开的低结合表面、美国专利申请号16/543,351中公开的杂交方法和美国申请号62/767,943和相关公开的国际申请号wo 2020/102766中公开的文库制备方法方面的进展进一步提供了细胞或组织可寻址测序的实现，这些申请的内容特此出于所有目的通过引用明确并入本文。因此，在一些实施方案中，可以以空间映射到从中获得基因组或转录组核酸的细胞或组织的方式获得序列数据。在一些实施方案中，可以在与样品来源的细胞位置基本上一一对应的情况下获得序列数据。在一些实施方案中，可以在不同于与原始样品中的细胞位置的一一空间对应，但相对于组织内遗传、基因组或转录组样品的其他细胞或来源具有基本上相同的位置的情况下获得序列数据。
71.固体载体表面。本文提供了固体载体，其包括表面(例如，低非特异性结合)。在一些情况下，固体载体包括非亲水性表面。在一些情况下，固体载体包括亲水性表面。一般而言，所公开的载体可包括基底(或支撑结构)、一层或多层共价或非共价附接的低结合化学修饰层(例如硅烷层)、聚合物膜和一种或多种共价或非共价附接的引物序列，其可用于将单链模板寡核苷酸拴系到载体表面上(图1)。在一些情况下，表面的配制，例如一层或多层的化学构成、用于将所述一层或多层与载体表面交联和/或彼此交联的偶联化学以及层的总数可以改变，使得相对于可比较的单层，蛋白质、核酸分子和其他杂交和扩增反应组分与载体表面的非特异性结合被最小化或减少。通常，可以改变表面的配制，以使得载体表面上的非特异性杂交相对于可比较的单层被最小化或减少。可以改变表面的配制组成，以使得载体表面上的非特异性扩增相对于可比较的单层被最小化或减少。可以改变表面的配制以使得载体表面上的特异性扩增速率和/或产率最大化。在本文公开的一些情况下，在不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或超过30个扩增循环中达到适于检测的扩增水平。
72.可以制造基底或载体结构的材料的示例包括但不限于玻璃、熔融二氧化硅、硅、聚合物(例如聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hdpe)、环状烯烃聚合物(cop)、环状烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet))，或其任何组合。考虑了玻璃和塑料基底的各种组合物。
73.基底或载体结构可以被赋予本领域技术人员已知的多种几何形状和尺寸中的任何一种，并且可以包含本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种。例如，在一些情况下，基底或载体结构可以是局部平面的(例如，包括显微镜载玻片或显微镜载玻片的表面)。总体而言，基底或载体结构可以是圆柱形的(例如，包括毛细管或毛细管的内表面)、球形的(例如，包括无孔珠粒的外表面)或不规则的(例如，包括不规则形状的无孔珠粒或颗粒的外表面)。在一些情况下，用于核酸杂交和扩增的基底或载体结构的表面可以是固体、无孔表面。在一些情况下，用于核酸杂交和扩增的基底或载体结构的表面可以是多孔的，使得本文所述的涂层穿透多孔表面，并且在其上进行的核酸杂交和扩增反应可以在孔内发生。
74.包含一个或多个化学改性层(例如低非特异性结合聚合物层)的基底或载体结构可以是独立的或集成到另一个结构或组件中。例如，在一些情况下，基底或载体结构可以包括集成或组装的微流体流动池内的一个或多个表面。基底或载体结构可以包括微板形式内的一个或多个表面，例如微板中的孔的底表面。如上所述，在一些优选实施方案中，基底或载体结构包括毛细管的内表面(例如内腔表面)。在替代性实施方案中，基底或载体结构包括蚀刻到平面芯片中的毛细管的内表面(例如内腔表面)。
75.化学改性层可以均匀地涂布在基质或载体结构的表面上。或者，基质或载体结构的表面可以被不均匀地分布或图案化，使得化学改性层被限制在基底的一个或多个离散区域中。例如，可以使用光刻技术对基底表面进行图案化，以在表面上生成化学修饰区域的有序阵列或随机图案。可替代地或组合地，可以使用例如接触印刷和/或喷墨印刷技术对基底表面进行图案化。在一些情况下，化学修饰的离散区域的有序阵列或随机图案可包含至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400，500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000或更多个离散区域，或跨本文范围内的任何中间数量的离散区域。
76.为了获得低非特异性结合表面(在本文中也称为“低结合”或“钝化”表面)，可以将亲水性聚合物非特异性地吸附或共价接枝到基底或载体表面。通常，使用聚(乙二醇)(peg，也称为聚环氧乙烷(peo)或聚氧乙烯)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(phema)、聚(低聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、葡聚糖或其他具有不同分子量和端基(使用例如硅烷化学法将其连接到表面)的亲水性聚合物进行钝化。远离表面的端基可以包括但不限于生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、nhs酯、马来酰亚胺和双硅烷。在一些情况下，可以在表面上沉积两层或更多层亲水性聚合物，例如线性聚合物、支化聚合物或多支化聚合物。在一些情况下，两个或更多个层可以彼此共价偶联或内部交联以提高所得表面的稳定性。在一些情况下，具有不同碱基序列和碱基修饰的寡核苷酸引物(或其他生物分子，例如酶或抗体)可以各种表面密度拴系在所得表面层上。在一些情况下，例如，表面官能团密度和寡核苷酸浓度都可以变化以针对某个引物密度范围。此外，可以通过用带有相同官能团的其他分子稀释寡核苷酸来控制引物密度。例如，胺标记的寡核苷酸可以用与nhs酯涂覆的表面反应的胺标记的聚乙二醇稀释，以降低最终引物密度。在杂交区和表面附接官能团之间具有不同长度接头的引物也可用于控制表面密度。合适的接头的示例包括在引物的5’端的聚-t链和聚-a(聚腺苷酸)链(例如0至20个碱基)、peg接头(例如3至20个单体单
元)和碳链(例如c6、c12，c18等)。为了测量引物密度，可以将经荧光标记的引物拴系在表面上，然后将荧光读数与已知浓度的染料溶液的荧光读数进行比较。
77.在一些实施方案中，亲水性聚合物可以是交联聚合物。在一些实施方案中，交联聚合物可以包括与另一种类型的聚合物交联的一种类型的聚合物。交联聚合物的示例可包括与选自以下的另一种聚合物交联的聚(乙二醇)：聚环氧乙烷(peo)或聚氧乙烯)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(phema)、聚(低聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、葡聚糖或其他亲水性聚合物。在一些实施方案中，交联聚合物可以是与聚丙烯酰胺交联的聚(乙二醇)。
78.由于本文公开的表面钝化技术，蛋白质、核酸和其他生物分子不会“粘附”到基底上，也就是说，它们表现出低的非特异性结合(nsb)。下面示出了使用具有不同玻璃制备条件的标准单层表面制备的示例。已经被钝化以实现对蛋白质和核酸的超低nsb的亲水性表面需要新颖反应条件来提高引物沉积反应效率、杂交性能和诱导有效扩增。所有这些过程都需要寡核苷酸附接以及随后的蛋白质结合和递送到低结合表面。如下所述，新的引物表面缀合配制(cy3寡核苷酸接枝滴定)和所得超低非特异性背景(使用红色和绿色荧光染料进行的nsb功能测试)的组合产生的结果证明了所公开方法的可行性。本文公开的一些表面表现出荧光团(例如cy3)的特异性结合(例如，与拴系的引物或探针的杂交)与非特异性结合(例如，b
inter
)比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1或大于100:1或跨本文范围内的任何中间值。本文公开的一些表面表现出荧光团(例如cy3)的特异性荧光信号与非特异性荧光信号(例如，对于特异性杂交的经标记的寡核苷酸与非特异性结合的经标记的寡核苷酸，或对于特异性扩增的经标记的寡核苷酸与非特异性结合(b
inter
)的或非特异性扩增(b
intra
)的经标记的寡核苷酸或其组合(b
inter
b
intra
))的比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1或大于100:1或跨本文范围内的任何中间值。
79.为了缩放引物表面密度，并增加亲水性或两性表面的另外维度，已经开发了包含peg和其他亲水性聚合物的多层涂层的基底。通过使用亲水性和两性表面分层方法(其包括但不限于以下所述的聚合物/共聚物材料)，可以显著增加表面上的引物加载密度。传统的peg涂层方法使用单层引物沉积，其已针对单分子应用进行了一般性报道，但对于核酸扩增应用却无法获得高拷贝数。如本文所述，“分层”可以采用任何相容的聚合物或单体亚单元使用传统交联方法来完成，使得可以依次构建包括两个或更多个高度交联的层的表面。合适的聚合物的示例包括但不限于链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸以及聚赖氨酸和peg的共聚物。在一些情况下，不同的层可以通过多种缀合反应中的任一种彼此附接，所述缀合反应包括但不限于生物素-链霉亲和素结合、叠氮化物-炔烃点击反应、胺-nhs酯反应，硫醇-马来酰亚胺反应以及带正电荷的聚合物和带负电荷的聚合物之间的离子相互作用。在一些情况下，可以在溶液中构建高引物密度材料，然后通过多个步骤将其层叠在表面上。
80.用于将第一化学改性层接枝到载体表面的附接化学法通常取决于制造载体的材料和该层的化学性质。在一些情况下，第一层可以共价附接到载体表面。在一些情况下，第一层可以例如通过非共价相互作用例如静电相互作用、氢键或表面与第一层的分子组分之间的范德华相互作用而非共价附接例如吸附到表面上。无论哪种情况，都可以在附接或沉积第一层之前对基底表面进行处理。本领域技术人员已知的多种表面制备技术中的任何一种都可以用于清洁或处理载体表面。例如，可以使用piranha溶液(硫酸(h2so4)和过氧化氢(h2o2)的混合物)酸洗玻璃或硅表面和/或使用氧等离子体处理方法进行清洁。
81.硅烷化学法构成一种非限制性方法，用于共价修饰玻璃或硅表面上的硅烷醇基以附接更多的反应性官能团(例如胺基或羧基)，其然后可用于将接头分子(例如各种长度的线性烃分子，例如c6、cl2、c18烃或线性聚乙二醇(peg)分子)或层分子(例如，支化的peg分子或其他聚合物)偶联在表面上。可用于产生任何所公开的低结合性载体表面的合适硅烷的示例包括但不限于(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(aptms)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)以及多种peg-硅烷(例如，具有1k、2k、5k、10k、20k等的分子量)、氨基-peg硅烷(即具有游离的氨基官能团)、马来酰亚胺-peg硅烷、生物素-peg硅烷等中的任何一种。
82.本领域技术人员已知的多种分子中的任何一种，包括但不限于氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、其他单体或聚合物或其组合，都可以用于在载体表面上生成一个或多个化学改性层，其中所用组分的选择可以有所不同，以改变载体表面的一种或多种特性，例如，官能团和/或栓系的寡核苷酸引物的表面密度、载体表面的亲水性/疏水性或载体表面的三个三维性质(即“厚度”)。可用于在任何所公开的载体表面中产生一层或多层低非特异性结合材料的优选聚合物的示例包括但不限于各种分子量和分支结构的聚乙二醇(peg)、链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸和聚赖氨酸共聚物，或其任何组合。可以用于将一层或多层材料(例如，聚合物层)接枝到载体表面和/或使层彼此交联的缀合化学法的示例包括但不限于生物素-链霉亲和素相互作用(或其变型)、his标签
–
ni/nta缀合化学、甲氧基醚缀合化学、羧酸酯缀合化学、胺缀合化学、nhs酯、马来酰亚胺、硫醇、环氧、叠氮化物、酰肼、炔烃、异氰酸酯和硅烷。
83.多层表面的一层或多层可以包含支化聚合物或可以是线性的。合适的支化聚合物的示例包括，但不限于，支化peg、支化聚(乙烯基醇)(支化pva)、支化聚(乙烯基吡啶)、支化聚(乙烯基吡咯烷酮)(支化pvp)、支化)、聚(丙烯酸)(支化paa)、支化聚丙烯酰胺、支化聚(n-异丙基丙烯酰胺)(支化pnipam)、支化聚(甲基丙烯酸甲酯)(支化pma)、支化聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(支化phema)、支化聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(支化poegma)、支化聚谷氨酸(支化pga)、支化聚赖氨酸、支化聚葡萄糖苷和葡聚糖。
84.在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面的一层或多层的支化聚合物可以包含至少4个分支、至少5个分支、至少6个分支、至少7个分支、至少8个分支、至少9个分支、至少10个分支、至少12个分支、至少14个分支、至少16个分支、至少18个分支、至少20个分支、至少22个分支、至少24个分支、至少26个分支、至少28个分支、至少30个分支、至少32个分支、至少34个分支、至少36个分支、至少38个分支或至少40个分支。分子通常显示出“2的幂”数量个分支，例如2、4、8、16、32、64或128个分支。
85.示例性的peg多层包括在peg-胺-aptes上的peg(8,16,8)(8臂、16臂、8臂)。对于在暴露于8um引物的peg-胺-aptes上的3层多臂peg(8臂，16臂，8臂)和(8臂，64臂，8臂)以及使
用星形peg-胺代替16臂和64臂的3层多臂peg(8臂，8臂，8臂)观察到相似的浓度。还考虑了具有可比较的第一peg层、第二peg层和第三peg层的peg多层。
86.用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可是至少500道尔顿、至少1,000道尔顿、至少1,500道尔顿、至少2,000道尔顿、至少2,500道尔顿、至少3,000道尔顿、至少3,500道尔顿、至少4,000道尔顿、至少4,500道尔顿、至少5,000道尔顿、至少7,500道尔顿、至少10,000道尔顿、至少12,500道尔顿、至少15,000道尔顿、至少17,500道尔顿、至少20,000道尔顿、至少25,000道尔顿、至少30,000道尔顿、至少35,000道尔顿、至少40,000道尔顿、至少45,000道尔顿或至少50,000道尔顿。在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以是至多50,000道尔顿、至多45,000道尔顿、至多40,000道尔顿、至多35,000道尔顿、至多30,000道尔顿、至多25,000道尔顿、至多20,000道尔顿、至多17,500道尔顿、至多15,000道尔顿、至多12,500道尔顿、至多10,000道尔顿、至多7,500道尔顿、至多5,000道尔顿、至多4,500道尔顿、至多4,000道尔顿、至多3,500道尔顿、至多3,000道尔顿、至多2,500道尔顿、至多2,000道尔顿、至多1,500道尔顿、至多1,000道尔顿或至多500道尔顿。该段落中描述的下限值和上限值中任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面中的任何一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以在约1,500道尔顿至约20,000道尔顿的范围内。本领域技术人员将认识到，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以具有在该范围内的任何值，例如，约1,260道尔顿。
87.在一些情况下，例如，其中多层表面的至少一层包括支化聚合物，被沉积的层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以在每个分子约1个共价键至每个分子约32个共价键的范围内。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以为每个分子至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30、至少32或多于32个共价键。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以为至多32、至多30、至多28、至多26、至多24、至多22、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量范围可以为约4至约16。本领域技术人员将认识到，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以具有在该范围内的任何值，例如，在一些情况下为约11，或在其他情况下平均值为约4.6。
88.在材料层偶联至载体表面之后残留的任何反应性官能团可通过使用高产率偶联化学法偶联小的惰性分子来选择性地封闭。例如，在使用胺偶联化学法将新材料层附接到前一层的情况下，任何残留的胺基随后可通过与小氨基酸(例如，甘氨酸)偶联而被乙酰化或失活。
89.沉积在所公开的低结合载体表面上的低非特异性结合材料例如亲水性聚合物材料的层数可以在1至约10的范围内。在一些情况下，层的数量是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个。在一些情况下，层的数
量可以是至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，层的数量可以在约2个至约4个的范围内。在一些情况下，所有层可以包含相同的材料。在一些情况下，每个层可以包含不同的材料。在一些情况下，多个层可以包含多种材料。在一些情况下，至少一层可以包含支化聚合物。在一些情况下，所有层都可以包含支化聚合物。
90.在一些情况下，可以使用极性质子溶剂、极性非质子溶剂、非极性溶剂或其任何组合将一层或多层低非特异性结合材料沉积在基底表面上和/或与基底表面缀合。在一些情况下，用于层沉积和/或偶联的溶剂可以包括醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇等)、另一种有机溶剂(例如，乙腈、二甲亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)等)、水、水性缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)等)或其任何组合。在一些情况下，所用溶剂混合物的有机组分可占总体的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，或任何跨或接近本文范围的百分比，余量由水或缓冲水溶液构成。在一些情况下，所用溶剂混合物的水性组分可占总体的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，或任何跨或接近本文范围的百分比，余量由有机溶剂构成。所用溶剂混合物的ph可以小于5、5、5、5、6、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或大于10，或任何跨或接近本文所述范围的值。
91.在一些情况下，可以使用有机溶剂的混合物将一层或多层低非特异性结合材料沉积在基底表面上和/或与基底表面缀合，其中至少一个组分的介电常数小于40并且以体积计占总混合物的至少50％。在一些情况下，至少一种组分的介电常数可以小于10、小于20、小于30、小于40。在一些情况下，至少一种组分以体积计占总混合物的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
92.如所指出的，本公开的低非特异性结合载体表现出蛋白质、核酸和用于固相核酸扩增的杂交和/或扩增制剂的其他组分的减少的非特异性结合。给定的载体表面表现出的非特异性结合的程度可以被定性或定量地评估。例如，在一些情况下，在标准化的一组条件下，将表面暴露于荧光染料(例如cy3、cy5等)、经荧光标记的核苷酸、经荧光标记的寡核苷酸和/或经荧光标记的蛋白质(例如聚合酶)，随后进行指定的冲洗程序和荧光成像可用作定性工具，用于比较在包含不同表面制剂的载体上的非特异性结合。在一些情况下，在标准化的一组条件下，将表面暴露于荧光染料、经荧光标记的核苷酸、经荧光标记的寡核苷酸和/经或荧光标记的蛋白质(例如，聚合酶)，随后进行指定的冲洗程序和荧光成像可以用作定量工具，用于比较在包含不同表面制剂的载体上的非特异性结合-前提是要确保在荧光信号与载体表面上荧光团的数量呈线性相关(或者以可预测的方式相关)的条件下(例如，在信号饱和和/或荧光团的自猝灭不成问题的条件下)使用合适的校准标准进行荧光成像。在一些情况下，可以用本领域技术人员已知的其他技术例如放射性同位素标记和计数方法来定量评估本公开的不同载体表面制剂表现出的非特异性结合的程度。
93.本文公开的一些表面表现出荧光团例如cy3的特异性结合与非特异性结合的比率为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或跨本文范围内的任何中间值。本文公开的一些表面可以表现出荧光团例如
cy3的特异性荧光与非特异性荧光的比率为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或跨本文范围内的任何中间值。
94.正如指出的，在一些情况下，可以使用用于使表面与标记的蛋白质(例如，牛血清白蛋白(bsa)、链霉亲和素、dna聚合酶、逆转录酶、解旋酶、单链结合蛋白(ssb)等，或其任何组合)、经标记的核苷酸、经标记的寡核苷酸等在一组标准的温育和冲洗条件下接触的标准化程序，随后检测残留在表面上的标记量，并将由此产生的信号与适当的校准标准进行比较，来评估由所公开的低非特异性结合性载体表现出的非特异性结合的程度。在一些情况下，标记可以包括荧光标记。在一些情况下，标记可以包含放射性同位素。在一些情况下，标记可以包括本领域技术人员已知的任何其他可检测标记。在一些情况下，由给定的载体表面制剂所表现出的非特异性结合的程度由此可以根据每单位面积上非特异性结合的蛋白质分子(或其他分子)的数量来评估。在一些情况下，本公开的低非特异性结合载体可以表现出低于0.001分子/μm2、低于0.01分子/μm2、低于0.1个分子/μm2、低于0.25个分子/μm2、低于0.5个分子/μm2、低于1个分子/μm2、低于10个分子/μm2、低于100个分子/μm2或低于1,000个分子/μm2的非特异性蛋白质结合(或其他特定分子，例如cy3染料的非特异性结合)。本领域技术人员将认识到，本公开的给定载体表面可以表现出落在该范围内的任何数值的非特异性结合，例如，为低于86个分子/μm2。例如，在磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中与1um的经cy3标记的链霉亲和素(ge amersham)溶液接触15分钟，然后用去离子水冲洗3次后，本文公开的某些修饰表面表现出的非特异性蛋白质结合低于0.5个分子/um2。本文公开的某些修饰表面表现出cy3染料分子的非特异性结合低于0.25个分子/um2。在独立的非特异性结合测定中，将1um经标记的cy3 sa(thermofisher)、1um cy5 sa染料(thermofisher)、10um氨基烯丙基-dutp-atto-647n(jena biosciences)、10um氨基烯丙基-dutp-atto-rho11(jena biosciences)、10um氨基烯丙基-dutp-atto-rho11(jena biosciences)、10um 7-炔丙基氨基-7-去氮-dgtp-cy5(jena biosciences、和10um 7-炔丙基氨基-7-去氮-dgtp
–
cy3(jena biosciences)在低结合基底上以384孔板的形式在37℃下温育15分钟。每个孔用50ul去离子rnase/dnase free水冲洗2-3次，并用25mm aces缓冲液(ph 7.4)冲洗2-3次。在ge typhoon(ge healthcare lifesciences，pittsburgh，pa)仪器上使用制造商指定的cy3、af555或cy5滤光器组(根据进行的染料测试)在pmt增益设置为800和分辨率为50-100μm下对384孔板进行成像。对于更高分辨率的成像，在olympus ix83显微镜(olympus corp.，center valley，pa)上采集图像，该olympus ix83显微镜具有全内反射荧光(tirf)物镜(20x，0.75na或100x，1.5na，olympus)，scmos andor相机(zyla 4.2)，激发波长为532nm或635nm。二向色镜购自semrock(idex health&science,llc，rochester，纽约)，例如405、488、532或633nm二向色反射镜/分束器，带通滤波器选为532lp或645lp，与适当的激发波长一致。本文公开的某些修饰表面显示染料分子的非特异性结合低于0.25个分子/μm2。
95.在一些情况下，本文公开的表面表现出荧光团例如cy3的特异性结合与非特异性结合的比率为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或跨本文范围内的任何中间值。在一些情况下，本文公开的表面可以表现出荧光团例如cy3的特异性荧光信号与非特异性荧光信号的比率为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或跨本文范围内的任何中间值。
96.与本文公开一致的低背景表面可以表现出特异性染料附接(例如cy3附接)与非特异性染料吸附(例如cy3染料吸附)的比率为至少3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1，或超过50的附接的特异性染料分子/非特异性吸附的分子比率。类似地，当经受激发能量时，与本文公开内容一致的、已附接荧光团例如cy3的低背景表面可以表现出至少3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1或大于50:1的特异性荧光信号(例如，由附接于表面的经cy3标记的寡核苷酸产生)与非特异性吸附的染料荧光信号的比率。
97.在一些情况下，可以例如通过测量水接触角来评估所公开的载体表面的亲水性(或水溶液情况下的“润湿性”)程度，其中将小滴的水放置在表面上，并使用例如光学张力计测量其与表面的接触角。在一些情况下，可以确定静态接触角。在一些情况下，可以确定前进或后退接触角。在一些情况下，本文公开的亲水性、低结合性载体表面的水接触角可以在约0度至约50度的范围内。在一些情况下，本文公开的亲水性、低结合性载体表面的水接触角可以不超过50度、45度、40度、35度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在许多情况下，接触角不超过该范围内的任何值，例如不超过40度。本领域技术人员将认识到，本公开的给定的亲水性、低结合性的载体表面可以表现出具有在该范围内的任何值的水接触角，例如约27度。
98.在一些情况下，本文公开的亲水性表面有助于减少生物测定的洗涤时间，这通常是由于生物分子与低结合表面的非特异性结合减少所致。在一些情况下，可以在不到60、50、40、30、20、15、10或不到10秒内执行充分的洗涤步骤。例如，在一些情况下，可以在不到30秒内执行充分的洗涤步骤。
99.本公开的一些低结合表面在对长时间暴露于溶剂和升高的温度，或对溶剂暴露或温度变化的重复循环的稳定性或耐久性方面表现出显著改善。例如，在一些情况下，可以通过对表面上的官能团或表面上的拴系生物分子(例如寡核苷酸引物)进行荧光标记，并在长时间暴露于溶剂和升高的温度或者溶剂暴露或温度变化的重复循环之前、期间和之后监测荧光信号来测试所公开表面的稳定性。在一些情况下，在暴露于溶剂和/或升高温度1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时或100小时的时间段内，用于评估表面质量的荧光变化程度可小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％(或在这些时间段内测量的这些百分比的任何组合)。在一些情况下，在反复暴露于溶剂变化和/或温度变化的5个循环、10个循环、20个循环、30个循环、40个循环、50个循环、60个循环、70个循环、80个循环、90个循环、100个循环、200个循环、300个循环、400个循环、500个循环、600个循环、700个循环循环、800个循环、900个循环或1,000个循环内，用于评估表面质量的荧光变化程度可小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％(或在此循环范围内测量的这些百分比的任何组合)。
100.在一些情况下，本文公开的表面可表现出特异信号与非特异信号或其他背景的高比率。例如，当用于核酸扩增时，一些表面可表现出是表面的相邻无填充区域的信号的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100倍或大于100倍的扩增信号。类似地，一些表面表现出是表面的相邻扩增核酸群体区域的信号的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100倍或大于100倍的扩增信号。
101.荧光激发能量在特定的荧光团和方案之间变化，并且可以在从小于400nm到超过800nm的激发波长范围内，与荧光团选择或本文公开的表面使用的其他参数一致。
102.因此，本文公开的低非特异性结合表面相对于本领域已知表面表现出低的背景荧光信号或高的对比度噪声(cnr)比。例如，在一些情况下，表面的在空间上不同的或从表面(包含杂交的核酸分子簇，或通过例如经由热循环的20个核酸扩增循环产生的经克隆扩增的核酸分子簇)上的经标记的特征(例如，表面的经标记的点、簇、离散区域、子部分或子集)中去除的位置的背景荧光可以是在执行所述杂交或所述20个核酸扩增循环之前在相同位置测量的背景荧光的不超过20x、10x、5x、2x、1x、0.5x、0.1x或不到0.1x大。
103.在一些情况下，所公开的低背景表面(当用于核酸杂交或扩增应用中以产生杂交或克隆扩增的核酸分子的簇时(例如，已经用荧光团直接或间接标记的))的荧光图像表现出至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、210、220、230、240、250或大于250的对比度噪声比(cnr)。
104.通常，一层或多层低非特异性结合材料中的至少一层可包含用于共价或非共价附接寡核苷酸分子，例如衔接子或引物序列的官能团，或至少一层在其沉积在载体表面上时可以已经包含共价或非共价附接的寡核苷酸衔接子或引物序列。在一些情况下，拴系到至少一个第三层的聚合物分子的寡核苷酸可以在整个层中以多个深度分布。
105.在一些情况下，即在将聚合物偶联或沉积在表面上之前，将寡核苷酸衔接子或引物分子与聚合物在溶液中共价偶联。在一些情况下，在已经将聚合物偶联或沉积在表面上之后，将寡核苷酸衔接子或引物分子共价偶联至聚合物。在一些情况下，至少一个亲水性聚合物层包含多个共价附接的寡核苷酸衔接子或引物分子。在一些情况下，至少两层、至少三层、至少四层或至少五层亲水性聚合物包含多个共价连附的衔接子或引物分子。
106.在一些情况下，可使用本领域技术人员已知的各种合适的缀合化学法中的任一种将寡核苷酸衔接子或引物分子偶联至一层或多层亲水性聚合物。例如，寡核苷酸衔接子或引物序列可包含与胺基、羧基、硫醇基等反应的部分。可以使用的合适的胺反应性缀合化学法的示例包括但不限于涉及异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰基叠氮化物基团、nhs酯基、磺酰氯基、醛基、乙二醛基、环氧化物基团、环氧乙烷基、碳酸酯基、芳基卤化物基团、酰亚胺酯基、碳二亚胺基、酸酐基和氟苯基酯基的反应。合适的羧基反应性缀合化学法的示例包括但不限于涉及碳二亚胺化合物，例如水溶性edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
·
hcl)的反应。合适的巯基反应性缀合化学法的示例包括马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。
107.可以将一种或多种类型的寡核苷酸分子附接或拴系在载体表面上。在一些情况下，一种或多种类型的寡核苷酸衔接子或引物可包含间隔子序列、用于与衔接子连接的模板文库核酸序列杂交的衔接子序列、正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物和/或分子条形码化序列或其任何组合。在一些情况下，可以将1个引物或衔接子序列栓系至表面的至少一层。在一些情况下，可以将至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个不同的引物或衔接子序列拴系在表面的至少一层上。
108.栓系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度范围可以为约10个核苷酸至约100个核苷酸。在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列可以是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个核苷酸长。在一些情况
下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列可以是至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20个或至多10个核苷酸长。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些情况下，栓系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以在约20个核苷酸至约80个核苷酸的范围内。本领域技术人员将认识到栓系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以具有该范围内的任何值，例如约24个核苷酸。
109.在一些情况下，栓系的衔接子或引物序列可以包含设计用于促进如在低结合载体上进行的核酸扩增的特异性和效率的修饰。例如，在一些情况下，引物可包含聚合酶终止点，使得在表面缀合点和修饰位点之间的引物序列的链段始终为单链形式，并充当一些依赖解旋酶的等温扩增方法中的5’至3’解旋酶的加载位点。可用于产生聚合酶终止点的引物修饰的其他示例包括但不限于将peg链朝向5’端插入引物主链的两个核苷酸之间、插入无碱基核苷酸(即，既没有嘌呤也没有嘧啶碱基的核苷酸)或可被解旋酶绕过的病变部位。
110.如将在以下实施例中进一步讨论的，可能需要改变载体表面上拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度和/或拴系的衔接子或引物远离载体表面的间距(例如，通过改变用于将衔接子或引物拴系到表面的接头分子的长度)，从而在使用给定的扩增方法时“调整”载体以获得最佳性能。如下文所述，调节拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度可能会以根据所选的扩增方法而变化的方式影响在载体上观察到的特异性和/或非特异性扩增水平。在一些情况下，可以通过调节用于产生载体表面的分子组分的比例来改变拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度。例如，在使用寡核苷酸引物-peg缀合物产生低结合性载体的最终层的情况下，可以改变寡核苷酸引物-peg缀合物与非缀合的peg分子的比例。然后可以使用本领域技术人员已知的各种技术中的任何一种来估计或测量所栓系的引物分子的表面密度。示例包括但不限于使用放射性同位素标记和计数方法；可裂解分子的共价偶联，所述可裂解分子包括可从限定区域的载体表面裂解的光学可检测标签(例如，荧光标签)，将其收集在固定体积的适当溶剂中，然后通过将荧光信号与已知光学标签浓度的校准溶液的荧光信号进行比较或使用荧光成像技术来量化(条件是已注意标记反应条件和图像采集设置以确保荧光信号与表面上的荧光团数量线性相关)(例如，表面上的荧光团没有明显的自猝灭)。
111.在一些情况下，本公开的低结合载体表面上的寡核苷酸衔接子或引物的所得表面密度可以在约100个引物分子/μm2至约1,000,000个引物分子/μm2的范围内。在一些情况下，寡核苷酸衔接子或引物的表面密度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少5,500、至少6,000、至少6,500、至少7,000、至少7,500、至少8,000、至少8,500、至少9,000、至少9,500、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000或至少1,000,000个分子/μm2。在一些情况下，寡核苷酸衔接子或引物的
表面密度可以是至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,500、至多9,000、至多8,500、至多8,000、至多7,500、至多7,000、至多6,500、至多6,000、至多5,500、至多5,000、至多4,500、至多4,000、至多3,500、至多3,000、至多2,500、至多2,000、至多1,500、至多1,000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多400、至多300、至多200或至多100个分子/μm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，衔接子或引物的表面密度可以在约10,000个分子/μm2至约100,000个分子/μm2的范围内。本领域技术人员将认识到，衔接子或引物分子的表面密度可以具有在该范围内的任何值，例如，在一些情况下为约3,800个分子/μm2，或在其他情况下为约455,000个分子/μm2。在一些情况下，如将在下面进一步讨论的，最初与载体表面上的衔接子或引物序列杂交的模板文库核酸序列(例如，样品dna分子)的表面密度可小于或等于拴系的寡核苷酸引物的表面密度所指示的表面密度。在一些情况下，如还将在下面进一步讨论的，与载体表面上的衔接子或引物序列杂交的经克隆扩增的模板文库核酸序列的表面密度可以跨与拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度所指示的表面密度的相同范围或不同范围。
112.上面列出的衔接子或引物分子的局部表面密度不排除在整个表面上的密度变化，使得表面可以包括具有例如500,000/μm2的寡核苷酸密度的区域，同时还包括具有明显不同的局部密度的至少第二区域。
113.用于捕获和分析dna的固体载体。在一些实施方案中，表面在其上结合了用于捕获靶核酸，例如dna分子的多个寡核苷酸(例如，捕获寡核苷酸；(200))，如图2所示。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸各自包括单链寡核苷酸。捕获寡核苷酸可以通过它们的5’端固定到钝化表面上，或者捕获寡核苷酸的内部部分可以固定到钝化表面上。捕获寡核苷酸可各自包含可延伸的3’端。如图2中所示，捕获寡核苷酸可各自包含可切割区(250)，该可切割区可位于固定到钝化表面的末端附近。例如，捕获寡核苷酸可各自包含靠近5’端的可切割区。可切割区可以用酶、化合物、光或热切割。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸各自包含靶捕获区(210)和通用序列区(220、230、240)。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的靶捕获区包含可以与靶核酸的至少一部分杂交的序列。靶捕获区可包含例如随机核苷酸序列或对应于靶核酸的已知序列的靶特异性序列。在一些实施方案中，通用序列区包含样品条形码序列(220)，其可用于在多重测定中区分来自不同样品来源的靶核酸。在一些实施方案中，通用序列区域包含空间条形码序列(230)，其传递载体上的捕获寡核苷酸的位置信息，其进而传递组织样品内的细胞或单细胞的位置信息。在一些实施方案中，样品条形码序列(220)可以在空间条形码序列(230)的上游或下游。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的通用序列区包括与促进捕获的核酸环化(300)的第二类型寡核苷酸的一部分杂交的环化锚定区(240)。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的通用序列区包含至少一个与通用引物序列(例如测序引物序列和/或扩增引物序列)结合/杂交的序列。在一些实施方案中，环化锚定区(240)包含
测序引物序列、扩增引物序列、样品条形码序列和/或空间条形码序列中的任何一种或两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中，环化锚定区(240)包含与促进捕获的核酸环化的第二类型寡核苷酸的一部分杂交的单独序列。在一些实施方案中，通用序列区包括可被酶、化合物、光或热切割的可切割区。
114.仍然参考图2，在一些实施方案中，表面已在其上结合了促进捕获的靶核酸环化的多个第二类型的寡核苷酸(例如环化寡核苷酸(300))。在一些实施方案中，环化寡核苷酸各自包括单链寡核苷酸。环化寡核苷酸可以通过它们的5’端固定到钝化表面上，或者环化寡核苷酸的内部部分可以固定到钝化表面上。环化寡核苷酸可各自包含可延伸的3’端。环化寡核苷酸各自包含均聚物区(310)和通用序列区(320)，如图3中所示。均聚物区可以选自聚t尾、聚dt尾、聚a尾、聚da尾、聚c尾、聚dc尾、聚g尾和聚dg尾。均聚物区可以位于或靠近环化寡核苷酸的3’端。在一些实施方案中，环化寡核苷酸的通用序列区与捕获寡核苷酸的环化锚定区杂交。在一些实施方案中，环化寡核苷酸的通用序列区包含至少一个与通用引物序列(例如捕获寡核苷酸的测序引物序列)结合/杂交的序列。在一些实施方案中，环化寡核苷酸的通用序列区包含至少一个与通用引物序列(例如捕获寡核苷酸的扩增引物序列)结合/杂交的序列。在一些实施方案中，环化寡核苷酸的通用序列区包含至少一个与捕获寡核苷酸的样品条形码序列和/或空间条形码序列结合/杂交的序列。在一些实施方案中，环化寡核苷酸包含与捕获寡核苷酸的环化锚定区的一部分结合/杂交的单独序列(例如，环化锚定结合序列)。
115.在一些实施方案中，捕获寡核苷酸(图2，200)和环化寡核苷酸(图3，300)可以在钝化表面与靶核酸分子接触以用于靶分子捕获步骤之前固定到钝化表面上。在一个替代实施方案中，在使钝化表面与靶核酸分子接触以用于靶分子捕获步骤之前，将捕获寡核苷酸固定到钝化表面上，并且随后可以在溶液中提供多个环化寡核苷酸(例如，以可溶形式)并使其流到钝化表面上以固定环化寡核苷酸。
116.在一些实施方案中，所述环化寡核苷酸可与所述捕获寡核苷酸相同、可包括所述捕获寡核苷酸或可被包括在所述捕获寡核苷酸内。在一些实施方案中，所述环化寡核苷酸可包括单独的分子。
117.本公开提供了具有涂层的低结合载体，其中该涂层为蛋白质、碳水化合物、脂质、细胞碎片或溶液载染料分子提供低非特异性结合表面。在一些实施方案中，组织样品或细胞或单细胞可以放置在载体的表面上(图3，左)。在一些实施方案中，低非特异性结合表面包括位于载体上不同预定位置的多个区域(例如，特征部)(图3，右)。载体上的不同特征部可以放置在载体上的非重叠位置或重叠位置。特征部可以被配置为具有任何形状，例如圆形、卵形、正方形、矩形或多边形。特征部可以布置成具有行和列的网格图案，或者可以布置成行或列。在一些实施方案中，任何给定的特征部包含固定到涂层上的多个捕获寡核苷酸和多个环化寡核苷酸。多个特征部至少包括第一和第二特征部。
118.在一些实施方案中，第一特征部包含具有第一靶捕获区、第一空间条形码序列、第一样品条形码序列和第一可切割区的多个第一捕获寡核苷酸，并且第一特征部包含具有第一环化锚定结合序列、第一扩增引物结合序列和第一测序引物结合序列的多个第一环化寡核苷酸。在一些实施方案中，第一捕获寡核苷酸还包含第一扩增引物结合序列和/或第一扩增引物结合序列。在一些实施方案中，第一环化寡核苷酸还包含可以结合/杂交第一空间条
形码序列的序列和/或可以结合第一样品条形码序列的序列。
119.在一些实施方案中，第二特征部包含具有第二靶捕获区、第二空间条形码序列、第二样品条形码序列和第二可切割区的多个第二捕获寡核苷酸，并且第二特征部包含具有第二环化锚定结合序列、第二扩增引物结合序列和第二测序引物结合序列的多个第二环化寡核苷酸。在一些实施方案中，第二捕获寡核苷酸还包含第二扩增引物结合序列和/或第二扩增引物结合序列。在一些实施方案中，第二环化寡核苷酸还包含可以结合/杂交第二空间条形码序列的序列和/或可以结合第二样品条形码序列的序列。
120.在一些实施方案中，第一特征部中的第一靶捕获区的序列与第二特征部中的第二靶捕获区的序列相同或不同。在一些实施方案中，第一特征部中的第一空间条形码序列不同于第二特征部中的第二空间条形码序列。在一些实施方案中，第一特征部中的第一样品条形码序列与第二特征部中的第二样品条形码序列相同或不同。第一特征部中的第一扩增引物结合序列可以与第二特征部中的第二扩增引物结合序列相同。第一特征部中的第一测序引物结合序列可以与第二特征部中的第二序列引物结合序列相同。第一特征部中的第一可切割区可以在与第二特征部中的第二可切割区相同或不同的条件(例如，相同的酶、化合物、光或热)下可切割。
121.在一些实施方案中，低非特异性结合涂层包括多个区(例如，特征部)，在这些区(例如，特征部)中，特征部与附接于涂层的多个捕获和环化寡核苷酸附接。在一些实施方案中，第一特征部与第一多个捕获寡核苷酸和第一多个环化寡核苷酸附接，并且第二特征部与第二多个捕获寡核苷酸和第二多个环化寡核苷酸附接，其中第一和第二捕获寡核苷酸以及第一和第二环化寡核苷酸彼此流体连通，使得捕获寡核苷酸和环化寡核苷酸可以以大规模并行方式与试剂(例如，包括聚合酶的酶、聚合物-核苷酸缀合物、核苷酸和/或二价阳离子)反应。
122.在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的可切割区可被酶切割。在一些实施方案中，图2中所示的可切割区(250)包含至少一个尿嘧啶碱基或聚尿嘧啶序列，其可被尿嘧啶dna糖基化酶(udg)或dna糖基化酶-裂解酶核酸内切酶viii(例如，市售酶user
tm
)切割。在一些实施方案中，可切割位点包含至少一个可用dna-甲酰胺基嘧啶糖基化酶(fpg)切割的8-氧代鸟嘌呤(8-oxog)。在一些实施方案中，可切割区包含可被核酸内切酶iv或核酸内切酶viii切割的无碱基位点。在一些实施方案中，可被酶切割的可切割区包含被切割双链或单链核酸链(例如，dna)的限制性核酸内切酶识别和切割的核苷酸序列。在一些实施方案中，酶可切割区包含可被淀粉酶切割的糖苷键，或可被蛋白酶切割的肽键。
123.如图2所示，在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的可切割区(250)可被包含不稳定化学键(例如包括但不限于酯键、硫醇键、邻二醇键、砜键、甲硅烷基醚键、无碱基或无嘌呤/无嘧啶(ap)位点)的化合物切割。可用酸、碱或羟胺切割酯键。硫醇键可以是可被谷胱甘肽或还原剂切割的二硫键。可用高碘酸钠切割邻二醇键。可用碱切割磺酸酯键。可用酸切割甲硅烷基醚键。无碱基或无嘌呤/无嘧啶(ap)位点可用碱或ap核酸内切酶切割。
124.在一些实施方案中，可被光切割的捕获寡核苷酸的可切割区(250)包含光可切割部分，其可通过暴露于光、uv光或激光而被切割。光可切割部分可通过暴露于任何波长的光而被切割。光可切割部分包括3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(anp)、双香豆素、6-溴-7-烷氧基香豆素-4-基甲氧基羰基、苯甲酰甲基酯衍生物或8-喹啉基苯磺酸酯。光可切割部分包括
基于bimane的接头、基于双芳基腙的接头或邻硝基苄基(onb)接头。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的可切割区(250)在暴露于热时是可切割的，包含diels-alder接头。
125.用于捕获和分析rna的载体。本文在图4中提供了包括多个固定的寡核苷酸的载体(700)。载体可用于捕获和分析靶核酸，例如rna分子。在一些实施方案中，载体包括本文别处公开的钝化表面(例如，涂层或层)(图1)，使得该表面与蛋白质、碳水化合物、脂质、细胞碎片或溶液载染料分子的结合很少或没有结合。在一些实施方案中，表面已在其上结合了用于捕获靶核酸的多个寡核苷酸(例如，捕获寡核苷酸；图4(700))。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸各自包括单链寡核苷酸。捕获寡核苷酸可以通过它们的5’端固定到钝化表面上，或者捕获寡核苷酸的内部部分可以固定到钝化表面上。捕获寡核苷酸可各自包含可延伸的3’端。如图4中所示，捕获寡核苷酸可各自包含可切割区(740)，该可切割区可位于固定到钝化表面的末端附近。例如，捕获寡核苷酸可各自包含靠近5’端的可切割区。可切割区可以用酶、化合物、光或热切割。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸各自包含靶捕获区(710)和通用序列区(720，730)。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的靶捕获区包含可以与靶核酸的至少一部分杂交的序列。靶捕获区可包含例如均聚物序列(例如，聚t或聚dt)、随机核苷酸序列或对应于靶核酸的已知序列的靶特异性序列。在一些实施方案中，通用序列区包含样品条形码序列(720)，其可用于在多重测定中区分来自不同样品来源的靶核酸。在一些实施方案中，通用序列区域包含空间条形码序列(730)，其传递载体上的捕获寡核苷酸的位置信息，其进而传递组织样品内的细胞或单细胞的位置信息。在一些实施方案中，样品条形码序列(720)可以在空间条形码序列(730)的上游或下游。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的通用序列区包含至少一个与通用引物序列(例如测序引物序列和/或扩增引物序列)结合/杂交的序列。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸包含可被酶、化合物、光或热切割的可切割区(740)。
126.仍然参考图4，在一些实施方案中，本文提供了以可溶形式或固定于表面(例如，涂层)的多个第二类型寡核苷酸(例如环化寡核苷酸；800)。环化寡核苷酸可以促进捕获的靶核酸的环化。在一些实施方案中，环化寡核苷酸各自包括单链寡核苷酸。环化寡核苷酸可以是可溶形式，或者环化寡核苷酸可以通过它们的5’端固定到钝化表面上，或者环化寡核苷酸的内部部分可以固定到钝化表面上。环化寡核苷酸可各自包含可延伸的3’端。环化寡核苷酸各自包含衔接子结合区(810)。在一些实施方案中，衔接子结合区包括测序引物结合区。在一些实施方案中，衔接子结合区包括扩增引物结合区。在一些实施方案中，环化寡核苷酸各自包含均聚物区(图4(830))。均聚物区可以选自聚t、聚dt、聚a、聚da、聚c、聚dc、聚g和聚dg。在一些实施方案中，环化寡核苷酸各自包含锚定区域(830)和锚定部分(840)。
127.在一些实施方案中，捕获寡核苷酸(图5，(700))和环化寡核苷酸(图4，(800))可以在使钝化表面与靶核酸分子(例如，rna)接触以用于靶分子捕获步骤之前固定在钝化表面上。在一个替代实施方案中，在使钝化表面与靶核酸分子接触以用于靶分子捕获步骤之前，将捕获寡核苷酸固定在钝化表面上，并且随后可以在溶液中提供多个环化寡核苷酸(例如，以可溶形式)并使其流到钝化表面上以固定环化寡核苷酸。
128.在一些实施方案中，所述环化寡核苷酸可与所述捕获寡核苷酸相同、可包括所述捕获寡核苷酸或可被包括在所述捕获寡核苷酸内。在一些实施方案中，所述环化寡核苷酸可包括单独的分子。
129.在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的可切割区(图4(740))可被酶切割。在一些实施方案中，可切割区包含至少一个尿嘧啶碱基或聚尿嘧啶序列，其可被尿嘧啶rna糖基化酶(udg)或rna糖基化酶-裂解酶核酸内切酶viii(例如，市售酶user
tm
)切割。在一些实施方案中，可切割位点包含至少一个可被rna-甲酰胺基嘧啶糖基化酶(fpg)切割的8-氧代鸟嘌呤(8-oxog)。在一些实施方案中，可切割区包含可被核酸内切酶iv或核酸内切酶viii切割的无碱基位点。在一些实施方案中，可被酶切割的可切割区包含被切割双链或单链核酸链(例如，rna)的限制性核酸内切酶识别和切割的核苷酸序列。在一些实施方案中，酶可切割区包含可被淀粉酶切割的糖苷键，或可被蛋白酶切割的肽键。
130.在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的可切割区(图4(740))可被包含不稳定化学键(例如包含但不限于酯键、硫醇键、邻二醇键、砜键、甲硅烷基醚键、无碱基或无嘌呤/无嘧啶(ap)位点)的化合物切割。可用酸、碱或羟胺切割酯键。硫醇键可以是可被谷胱甘肽或还原剂切割的二硫键。可用高碘酸钠切割邻二醇键。可以用碱切割磺酸酯键。可用酸切割甲硅烷基醚键。无碱基或无嘌呤/无嘧啶(ap)位点可用碱或ap核酸内切酶切割。
131.在一些实施方案中，可被光切割的捕获寡核苷酸的可切割区(图4(740))包含光可切割部分，其可通过暴露于光、uv光或激光而被切割。光可切割部分可通过暴露于任何波长的光而被切割。光可切割部分包括3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(anp)、双香豆素、6-溴-7-烷氧基香豆素-4-基甲氧基羰基、苯甲酰甲基酯衍生物或8-喹啉基苯磺酸酯。光可切割部分包括基于bimane的接头、基于双芳基腙的接头或邻硝基苄基(onb)接头。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸的可切割区(图4(740))在暴露于热时是可切割的，包含diels-alder接头。
132.将生物样品固定到表面。本文提供了还包含与其相邻的生物样品的固体载体(例如，低非特异性结合载体)。在一些实施方案中，生物样品包括单细胞、多个细胞、组织、器官、生物体或这些生物样品的切片。在一些实施方案中，生物样品来源于真核生物(例如动物、植物、真菌、原生生物)、古细菌或真细菌。生物样品可以来源于原核或真核细胞，例如贴壁或非贴壁真核细胞。生物样品可以来源于啮齿动物、猪、猫、犬、牛、马、灵长类动物或人类细胞系的原代或永生化细胞系。
133.生物样品可以是固体样品，例如组织活检物。生物样品可以是流体样品，例如血液或血液组分(例如血清或血浆)。在一些实施方案中，生物样品取自皮肤、心脏、肺、肾、呼吸物、骨髓、粪便、精液、阴道流体、源自肿瘤组织的间质流体、乳腺、胰腺、脑脊液、组织、咽拭子、活检物、胎盘流体、羊水、肝、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、腔流体、痰、脓、微生物群(micropiota)、胎粪、母乳、前列腺、食管、甲状腺、血清、唾液、尿、胃液和消化液、泪、眼流体、汗、粘液、耳垢、油、腺体分泌物、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脐带血、重点流体(emphatic fluid)和/或其他排泄物或身体组织。生物样品可以是无细胞样品。
134.生物样品可以包括细胞。本文所述的细胞可以是白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子，或来自心脏、肺、脑、肝、肾、脾、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠或小肠的细胞。细胞可以是正常或健康细胞。可替代地或组合地，细胞可以是患病细胞，例如癌细胞，或来自感染宿
主的病原细胞。在一些实施方案中，细胞属于细胞的亚群，例如免疫细胞(例如，t细胞、细胞毒性(杀伤性)t细胞、辅助t细胞、αβt细胞、γδt细胞、t细胞祖细胞、b细胞、b细胞祖细胞、淋巴干细胞、髓样祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、浆细胞、记忆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞和/或巨噬细胞，或其任何组合)、未分化的人类干细胞、已被诱导分化的人类干细胞或稀有细胞(例如，循环肿瘤细胞(ctc)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞或滋养层细胞)。考虑其他细胞并且与本文的公开一致。
135.生物样品可以从生物体中提取(例如，活检)，或从在液体或培养皿中生长的细胞培养物中获得。生物样品包括新鲜的、冷冻的、新鲜冷冻的或存档的(例如经福尔马林固定石蜡包埋的；ffpe)的样品。生物样品可以包埋在蜡、树脂、环氧树脂或琼脂中。生物样品可以例如固定在丙酮、乙醇、甲醇、甲醛、多聚甲醛-triton或戊二醛中的任何一种或两种或更多种的任何组合中。生物样品可以被切片或不被切片。生物样品可以被染色、脱色或不染色。
136.在一些实施方案中，生物样品可以在固定到本文所述的表面后被透化，以允许样品内的核酸，包括靶核酸分子，从一个或多个细胞迁移到被固定到表面上的多个捕获寡核苷酸。透化可以使试剂(例如磷选择性抗体、核酸缀合抗体、核酸探针、引物等)进入细胞并在细胞内达到的浓度大于在没有这种透化处理的情况下通常会渗透到细胞中的浓度。在一些实施方案中，细胞可以在至少约60％、70％、80％、90％或更高的甲醇(或乙醇)的存在下被透化并在冰上温育一段时间。温育时间段可以是至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60或更多分钟。
137.可以通过使生物样品与一种或多种透化剂接触来使生物样品透化，所述透化剂包括有机溶剂、去污剂、交联剂和/或酶。在一些实施方案中，有机溶剂包括丙酮、乙醇和甲醇。在一些实施方案中，去污剂包括皂苷、triton x-100、tween-20或十二烷基硫酸钠(sds)或n-月桂酰基肌氨酸钠盐溶液。在一些实施方案中，交联剂包括多聚甲醛。在一些实施方案中，酶包括胰蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶(例如朊酶k)。在一些实施方案中，来自生物样品的靶核酸分子以保留靶核酸分子在生物样品中的空间位置信息的方式与固定在载体上的捕获寡核苷酸杂交(被捕获寡核苷酸捕获)。
138.生物样品可用于产生包括生物样品的细胞和亚细胞组分(例如核酸分子)的三维聚合物基质。三维聚合物基质可以以共价或非共价方式偶联至本文所述的表面。在一些实施方案中，三维聚合物基质是多孔的并且包括聚合的或交联的亚细胞组分，包括靶核酸分子。可以通过将一种或多种聚合物前体(例如单体，例如对于聚乙二醇的环氧乙烷)流入生物样品中并且使一种或多种聚合物前体进行聚合或交联，而在生物样品(例如，细胞或组织)内形成聚合物基质。在形成聚合物基质之前、期间或之后，可以使用例如固定剂(例如甲醛)来固定生物样品内的部分(例如dna、rna、蛋白质)的位置。可以根据各种方法制备多孔基质。例如，聚丙烯酰胺凝胶基质可以与生物素化的dna分子和丙烯酰胺基(acrydite)修饰的链霉亲和素单体聚合，其中使用合适的丙烯酰胺:双丙烯酰胺比例来控制交联密度。可以通过添加另外的交联剂(例如官能化聚乙二醇)来实现对分子筛尺寸和密度的另外控制。pct/us2019/055434(该专利在此通过引用以其整体并入)中提供了用于将生物样品固定到表面以及在生物样品内生成聚合物基质的实现方式。
139.生物样品包括一种或多种靶核酸分子，在一些情况下，使用本文所述的系统、方法和组合物对其进行分析。在一些实施方案中，靶核酸包括天然存在的核酸、重组核酸和/或合成的核酸。靶核酸包括线性和/或环状形式。在一些实施方案中，靶核酸可以是dna。在一些实施方案中，靶核酸可以是基因组dna。在一些实施方案中，靶核酸可以是病毒dna。在一些实施方案中，靶核酸可以是无细胞dna(cfdna)。在一些实施方案中，dna是基因组dna、甲基化或非甲基化dna和/或细胞器dna。dna可以是片段化的和/或未片段化的。在一些实施方案中，一种或多种靶核酸分子包括rna，包括聚arna和/或非聚a rna。rna包括编码和/或非编码rna。rna包括trna、rrna、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、piwi相互作用rna(pirna)、反义rna、非编码rna和/或编码蛋白质的rna。
140.本公开的靶核酸在生物样品与表面偶联后与生物样品具有固定的三维关系。这种固定的三维关系至少部分地能够在使用本文所述的系统和方法进行核酸鉴定之后鉴定生物样品内的空间和细胞来源。
141.靶核酸捕获和制备。本文提供了在生物样品存在下使靶核酸与偶联至表面(例如，低非特异性结合表面)的捕获寡核苷酸杂交的方法。在一些情况下，所描述的杂交缓冲液制剂与所公开的低结合载体组合提供改善的杂交速率、杂交特异性(或严格性)和杂交效率(或产率)。如本文所用，杂交特异性是栓系衔接子序列、引物序列或寡核苷酸序列通常仅与完全互补序列正确杂交的能力的量度，而杂交效率是通常与互补序列杂交的总可用栓系衔接子序列、引物序列或寡核苷酸序列的百分比的量度。
142.改善的杂交特异性和/或效率可以通过优化与所公开的低结合表面一起使用的杂交缓冲液制剂来实现，并且将在下面的实施例中更详细地讨论。可调节以实现改善性能的杂交缓冲液组分的示例包括但不限于缓冲液类型、有机溶剂混合物、缓冲液ph、缓冲液粘度、去污剂和两性离子组分、离子强度(包括单价和二价离子浓度的调节)、抗氧化剂和还原剂、碳水化合物、bsa、聚乙二醇、硫酸葡聚糖、甜菜碱、其他添加剂等。
143.作为非限制性示例，用于配制杂交缓冲液的合适缓冲液可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(pbs)、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、乙酸盐、tris、taps、mops、pipes、hepes、mes等。适当缓冲液的选择通常取决于杂交缓冲溶液的目标ph。通常，缓冲溶液的所需ph范围为约ph 4至约ph 8.4。在一些实施方案中，缓冲液ph可以是至少4.0、至少4.5、至少5.0、至少5.5、至少6.0、至少6.2、至少6.4、至少6.6、至少6.8、至少7.0、至少至少7.2、至少7.4、至少7.6、至少7.8、至少8.0、至少8.2或至少8.4。在一些实施方案中，缓冲液ph可以是至多8.4、至多8.2、至多8.0、至多7.8、至多7.6、至多7.4、至多7.2、至多7.0、至多6.8、至多6.6、至多6.4、至多6.2、至多6.0、至多5.5、至多5.0、至多4.5或至多4.0。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，期望ph的范围可以为约6.4至约7.2。本领域技术人员将认识到，缓冲液ph可具有该范围内的任何值，例如约7.25。
144.适用于杂交缓冲液制剂的去污剂包括：但不限于，两性离子去污剂(例如，1-十二烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、3-(4-叔丁基-1-吡啶基)-1-丙磺酸盐、3-(n,n-二甲基肉豆蔻基铵基)丙磺酸盐、3-(n,n二甲基肉豆蔻基铵基)丙磺酸盐、asb-c80、c7bzo、chaps、chaps水合物、chapso、ddmab、二甲基乙基铵丙磺酸盐、n,n-二甲基十二烷基胺n氧化物、n-十二烷基-n,n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐或n-十二烷基-n,n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐)和阴
离子、阳离子、和非离子去污剂。非离子去污剂的示例包括聚(氧乙烯)醚和相关聚合物(例如triton x-100和ca-630)、胆汁盐和糖苷去污剂。
145.所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用可以产生是常规杂交方案约2x至约20x快的相对杂交速率。在一些情况下，相对杂交速率可以是常规杂交方案的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍或至少40倍。
146.所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用对于任何这些完成度量可以产生不到60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟的总杂交反应时间(即杂交反应完成90％、95％、98％或99％所需的时间)。
147.与常规杂交方案相比，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用可产生改善的杂交特异性。在一些实施方案中，可实现的杂交特异性优于10个杂交事件中有1个碱基错配、20个杂交事件中有1个碱基错配、30个杂交事件中有1个碱基错配、40个杂交事件中有1个碱基错配、50个杂交事件中有1个碱基错配、75个杂交事件中有1个碱基错配、100个杂交事件中有1个碱基错配、200个杂交事件中有1个碱基错配、300个杂交事件中有1个碱基错配、400个杂交事件中有1个碱基错配、500个杂交事件中有1个碱基错配、600个杂交事件中有1个碱基错配、700个杂交事件中有1个碱基错配、800个杂交事件中有1个碱基错配、900个杂交事件中有1个碱基错配、1,000个杂交事件中有1个碱基错配、2,000个杂交事件中有1个碱基错配、3,000个杂交事件中有1个碱基错配、4,000个杂交事件中有1个碱基错配、5,000个杂交事件中有1个碱基错配、6,000个杂交事件中有1个碱基错配、7,000个杂交事件中有1个碱基错配、8,000个杂交事件中有1个碱基错配、9,000个杂交事件中有1个碱基错配或10,000个杂交事件中有1个碱基错配。
148.在一些情况下，与常规杂交方案相比，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用可产生改善的杂交效率(例如，载体表面上与靶寡核苷酸序列成功杂交的可用寡核苷酸引物的分数)。在一些情况下，对于下文指定的任何输入靶寡核苷酸浓度和上文指定的任何杂交反应时间，可实现的杂交效率优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些情况下，例如，其中杂交效率低于100％，与载体表面杂交的靶核酸序列的所得表面密度可小于表面上寡核苷酸衔接子或引物序列的表面密度。
149.在一些情况下，将所公开的低非特异性结合载体用于使用常规杂交(或扩增)方案或优化的杂交(或扩增)方案进行的核酸杂交(或扩增)应用可导致对与载体表面接触的靶(或样品)核酸分子的输入浓度的要求降低。例如，在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以范围为约10pm至约1μm的浓度与载体表面接触(即，在退火或扩增之前)。在一些情况下，可以以下浓度来施用靶(或样品)核酸分子：至少10pm、至少20pm、至少30pm、至少40pm、至少50pm、至少100pm、至少200pm、至少300pm、至少400pm、至少500pm、至少600pm、至少700pm、至少800pm、至少900pm、至少1nm、至少10nm、至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少200nm、至少300nm、至少400nm、至少500nm、至少600nm、至少700nm、至少800nm、至少900nm或至少1μm。在一些情况下，可以以下浓度来施用靶(或样品)核酸分子：至多1μm、至多900nm、至多800nm、至多700nm、至多600nm、
至多500nm、至多400nm、至多300nm、至多200nm、至多100nm、至多90nm、至多80nm、至多70nm、至多60nm、至多50nm、至多40nm、至多30nm、至多20nm、至多10nm、至多1nm、至多900pm、至多800pm、至多700pm、至多600pm、至多500pm、至多400pm、至多300pm、至多200pm、至多100pm、至多90pm、至多80pm、至多70pm、至多60pm、至多50pm、至多40pm、至多30pm、至多20pm或至多10pm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，可以以约90pm至约200nm的浓度范围施用靶(或样品)核酸分子。本领域技术人员将认识到，可以以具有该范围内的任何值例如约855nm的浓度来施用靶(或样品)核酸分子。
150.在另一个示例中，相对于使用标准杂交试剂使用可比较表面分析的可比较生物样品，可以减小可与表面接触的生物样品的体积。在一些实施方案中，包含靶(或样品)核酸分子的流体样品可以在约5μl至约900μl的样品体积范围内。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约800μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约700μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约600μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约500μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约400μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约300μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约200μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约150μl。在一些情况下，样品体积范围是5μl至约100μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约90μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约85μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约80μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约75μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约70μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约65μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约60μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约55μl。在一些情况下，样品体积范围是约5μl至约50μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约150μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约120μl。在一些情况下，样品体积范围是15μl至约100μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约90μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约85μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约80μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约75μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约70μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约65μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约60μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约55μl。在一些情况下，样品体积范围是约15μl至约50μl。
151.在一些情况下，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用可导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子的表面密度(即，在进行任何后续固相或克隆扩增反应之前)的范围为约0.0001个靶寡核苷酸分子/μm2至约1,000,000个靶寡核苷酸分子/μm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至少0.0001、至少0.0005、至少0.001、至少0.005、至少0.01、至少0.05、至少0.1、至少0.5、至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少5,500、至少6,000、至少6,500、至少7,000、至少7,500、至少8,000、至少8,500、至少9,000、至少9,500、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至
少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000或至少1,000,000个分子/μm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,500、至多9,000、至多8,500、至多8,000、至多7,500、至多7,000、至多6,500、至多6,000、至多5,500、至多5,000、至多4,500、至多4,000、至多3500、至多3,000、至多2500、至多2,000、至多1,500、至多1,000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多400、至多300、至多200、至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10、至多5、至多1、至多0.5、至多0.1、至多0.05、至多0.01、至多0.005、至多0.001、至多0.0005或至多0.0001个分子/μm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以在约3,000个分子/μm2至约20,000个分子/μm2范围内。本领域技术人员将认识到，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以具有在该范围内的任何值，例如约2,700个分子/μm2。
152.换句话说，在一些情况下，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的杂交缓冲液制剂组合使用可导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子的表面密度(即，在进行任何后续固相或克隆扩增反应之前)范围为100个杂交的靶寡核苷酸分子/mm2至1
×
107个寡核苷酸分子/mm2，或为约100个杂交的靶寡核苷酸分子/mm2至约1
×
10
12
个杂交的靶寡核苷酸分子/mm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少4,000、至少5,000、至少6,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1
×
107、至少5
×
107、至少1
×
108、至少5
×
108、至少1
×
109、至少5
×
109、至少1
×
10
10
、至少5
×
10
10
、至少1
×
10
11
、至少5
×
10
11
或至少1
×
10
12
个分子/mm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至多1
×
10
12
、至多5
×
10
11
、至多1
×
10
11
、至多5
×
10
10
、至多1
×
10
10
、至多5
×
109、至多1
×
109、至多5
×
108、至多1
×
108、至多5
×
107、至多1
×
107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,
000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个分子/mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以在约5,000个分子/mm2至约50,000个分子/mm2的范围内。本领域技术人员将认识到，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以具有在该范围内的任何值，例如，约50,700个分子/mm2。
153.在一些情况下，与附接于低结合性载体表面的寡核苷酸衔接子或引物分子杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度范围可以为约0.02千碱基(kb)至约20kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb。在一些情况下，靶寡核苷酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少0.6kb、至少0.7kb、至少0.8kb、至少0.9kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb或至少40kb，或跨本文所述范围内的任何中间值，例如长度为至少0.85kb。
154.在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包括单链或双链多聚体核酸分子，所述多聚体核酸分子还包含规则出现的单体单元的重复。在一些情况下，单链或双链多聚体核酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb、至少30kb或至少40kb，或跨本文所述范围内的任何中间值，例如，长度为约2.45kb。
155.在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包括单链或双链多聚体核酸分子，所述多聚体核酸分子包含约2至约100个拷贝的规则重复的单体单元。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3个或至多2个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以在约4至约60的范围内。本领域技术人员将认识到，规则重复的单体单元的拷贝数可以具有该范围内的任何值，例如约17。因此，在一些情况下，即使杂交效率小于100％，就每单位面积的载体表面上的靶序列的拷贝数而言，杂交的靶序列的表面密度也可超过寡核苷酸引物的表面密度。
156.如本文所用，短语“核酸表面扩增”(nasa)可与短语“固相核酸扩增”(或简称为“固相扩增”)互换使用。在本公开的一些方面，描述了核酸扩增制剂，其与所公开低结合性载体组合，提供了改善的扩增速率、扩增特异性和扩增效率。如本文所用，特异性扩增是指已经共价或非共价拴系在固体载体上的模板文库寡核苷酸链的扩增。如本文所用，非特异性扩增是指引物二聚体或其他非模板核酸的扩增。如本文所用，扩增效率是在给定的扩增循环或扩增反应期间成功扩增的载体表面上的栓系寡核苷酸的百分比的量度。在本文公开的表面上进行的核酸扩增可获得至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％(例如98％
或99％)的扩增效率。
157.各种热循环或等温核酸扩增方案中的任何一种均可与所公开的低结合性载体一起使用。可与所公开的低非特异性结合载体一起使用的核酸扩增方法的示例包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)、多重置换扩增(mda)、转录介导的扩增(tma)、基于核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)、实时sda、桥式扩增、等温桥式扩增、滚环扩增、环到环扩增、解旋酶依赖性扩增、重组酶依赖性扩增或单链结合(ssb)蛋白依赖性扩增。
158.在一些实施方案中，滚环扩增反应包括：(1)通过使多个固定的共价闭合环状核酸分子与以下接触形成捕获型核苷酸-聚合酶复合物：(i)具有链置换活性的第一多个聚合酶；(ii)多个核苷酸(例如，一种类型的核苷酸或datp、dgtp、dctp和dttp的混合物)；(iii)介导核苷酸结合但不介导核苷酸掺入的非催化性二价阳离子(例如，锶或钡)，和任选的(iv)多个扩增引物(如果共价闭合环状分子缺乏引物)。滚环扩增反应还包括：(4)通过在适于进行等温滚环扩增反应的条件下使捕获型核苷酸-聚合酶复合物与以下接触来进行核苷酸聚合反应以产生多个固定的多联体：(i)至少一种介导核苷酸结合且介导核苷酸掺入的二价阳离子(例如，镁和/或锰)和(ii)第二多个核苷酸(例如datp、dgtp、dctp和dttp的混合物)。
159.在一些实施方案中，滚环扩增反应还包含多个压实寡核苷酸，其可以与多联体的部分杂交以将多联体塌缩成更压实的形状和尺寸。压实寡核苷酸是具有由短接头序列隔开的两个相同序列的单链核酸分子，其中两个相同序列与多联体的一部分反向互补。压实寡核苷酸可以是任何长度，例如20-100个核苷酸。两个相同序列区与多联体杂交以将多联体的远端部分拉到一起，从而使多联体压实。在一些实施方案中，压实寡核苷酸对3’核酸外切酶降解和/或单链核酸内切酶降解具有抗性。在一些实施方案中，压实寡核苷酸包含以下中的任何一种或两种或更多种的任何组合：3’端磷酸化；之间具有硫代磷酸酯键的至少两个3’端核苷酸；具有2
’‑
o-甲基部分的至少一个3’端核苷酸；和/或具有2’氟碱基的至少一个3’端核苷酸。
160.在一些实施方案中，在步骤(c)的捕获型核苷酸-聚合酶混合物中，具有链置换活性的第一多个聚合酶包括phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌(e.coli)dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶或deep vent dna聚合酶。phi29dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)，或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)，或嵌合的qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
161.在一些实施方案中，在扩增中的引物包括长度为约5-25个核苷酸的单链核酸引物。在一些实施方案中，扩增引物对3’核酸外切酶降解和/或单链核酸内切酶降解具有抗性。在一些实施方案中，扩增引物包括以下中的任何一种或两种或更多种的任何组合：3’端磷酸化；之间具有硫代磷酸酯键的至少两个3’端核苷酸；具有2
’‑
o-甲基部分的至少一个3’端核苷酸；和/或具有2’氟碱基的至少一个3’端核苷酸。
162.在一些实施方案中，滚环扩增反应还包括至少一种辅助蛋白或酶，包括解旋酶、单链结合(ssb)蛋白或重组酶(例如，t4 uvsx)和/或重组酶辅助因子(例如，t4 uvsy或t4 gp32)。
163.在一些实施方案中，等温滚环扩增反应可以在约30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39或40℃的温度下进行。
164.在一些实施方案中，多联体可包含至少2、10、100、200、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多个拷贝的重复单元。
165.滚环扩增法之后可以进行使用随机序列引物的多重置换扩增反应。多重置换扩增反应包括：(1)通过将多个固定的多联体与以下接触形成多重置换扩增(mda)反应混合物：(i)具有链置换活性的第二多个聚合酶，和(ii)多个可溶性扩增引物，其中所述多个可溶性扩增引物中的单个扩增引物是核酸外切酶抗性的并且具有3’可延伸端并且包含可与单链环状核酸模板的部分杂交的随机序列，(iii)第二多个核苷酸(例如，datp、dgtp、dctp和dttp的混合物)，和(iv)介导核苷酸结合且介导核苷酸掺入的至少一种二价阳离子(例如，镁和/或锰)；以及(2)进行等温多重置换扩增(mda)反应，以生成多个固定的支化多联体。
166.在一些实施方案中，在多重置换扩增(mda)反应混合物中，具有链置换活性的第二多个聚合酶包括phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段、和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶或deep vent dna聚合酶。phi29 dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)，或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)，或嵌合的qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
167.在一些实施方案中，在多重置换扩增(mda)反应混合物中，多个扩增引物包括长度为约5-25个核苷酸的单链核酸引物。在一些实施方案中，多个可溶性扩增引物包括未受保护的单链核酸引物。在一些实施方案中，多个可溶性扩增引物包括对3’核酸外切酶降解和/或单链核酸内切酶降解具有抗性的受保护的单链核酸引物。在一些实施方案中，多个可溶性扩增引物包括以下中的任何一种或两种或更多种的任何组合：3’端磷酸化；之间具有硫代磷酸酯键的至少两个3’端核苷酸；具有2
’‑
o-甲基部分的至少一个3’端核苷酸；和/或具有2’氟碱基的至少一个3’端核苷酸。在一些实施方案中，多个可溶性扩增引物包括具有相同长度(例如6或9个核苷酸的长度)的引物群。在一些实施方案中，多个可溶性扩增引物包括具有不同长度的混合物(例如包括6-聚体和9-聚体引物的混合物)的引物群。在一些实施方案中，多个可溶性扩增引物包括具有随机序列的引物混合物，该随机序列包括多达46种不同序列(例如，对于6-聚体)或49种不同序列序列(例如，对于9-聚体)。
168.在一些实施方案中，多重置换扩增(mda)反应混合物可还包含至少一种辅助蛋白或酶，包括解旋酶、单链结合(ssb)蛋白或重组酶(例如，t4 uvsx)和/或重组酶辅助因子(例如，t4 uvsy或t4 gp32)。
169.在一些实施方案中，等温多重置换扩增(mda)反应可以在约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45
°
c的温度进行。
170.滚环扩增法之后可以进行使用引发酶-聚合酶的多重置换扩增反应。多重置换扩增反应包括：(1)通过将多个固定的多联体与以下接触形成多重置换扩增(mda)反应混合物：(i)具有链置换活性的第二多个聚合酶，(ii)多个dna引发酶-聚合酶，(iii)第二多个核苷酸(例如，datp、dgtp、dctp和dttp的混合物)，和(iv)介导核苷酸结合且介导核苷酸掺入的至少一种二价阳离子(例如，镁和/或锰)，以及(2)进行等温多重置换扩增(mda)反应，以生成多个固定的支化多联体。在一些实施方案中，在不添加扩增引物的情况下进行多重置换扩增反应(例如，无引物反应)。
171.在一些实施方案中，在多重置换扩增(mda)反应混合物中，具有链置换活性的第二多个聚合酶包括phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段、和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶或deep vent dna聚合酶。phi29 dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)，或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)，或嵌合的qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
172.在一些实施方案中，多个dna引发酶-聚合酶包括来自嗜热栖热菌(thermus thermophilus)hb27的酶(例如，tth primpol酶)。
173.在一些实施方案中，多重置换扩增(mda)反应混合物还包含至少一种辅助蛋白或酶，包括解旋酶、单链结合(ssb)蛋白或重组酶(例如，t4 uvsx)和/或重组酶辅助因子(例如，t4 uvsy或t4 gp32)。
174.在一些实施方案中，等温多重置换扩增(mda)反应可以在约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45
°
c的温度进行。
175.两阶段扩增方法的另一个实施方案包括将多联体暴露于核酸松弛剂(第一阶段)，然后在第二阶段期间进行弯曲扩增反应。不希望受理论束缚，假定一种或多种核酸松弛剂可以破坏多个固定的核酸多联体中的氢键(例如变性)，这导致核酸多联体的结构松弛并增加固定的表面捕获引物与核酸多联体的部分之间形成新双链体的数量，从而增加从双链体固定的表面捕获引物产生新多联体的机会。新多联体可以在弯曲扩增反应期间产生。包括松弛剂可导致核酸变性，而无需使用变性温度或变性化学品。
176.在一些实施方案中，扩增方法包括：(1)在载体上进行滚环扩增以产生多个单链多联体，(2)形成松弛反应混合物，(3)形成弯曲扩增反应混合物，(4)在载体上进行弯曲扩增反应(例如，不添加可溶性引物)以产生多个双链多联体，(5)洗涤，(6)重复步骤(2)-(5)至少一次。
177.在一些实施方案中，步骤(2)的松弛反应混合物可以用至少一种可以破坏固定的核酸多联体中的氢键合的核酸松弛剂形成。示例性松弛剂包括核酸变性剂、离液化合物、酰胺化合物、非质子化合物、伯醇和乙二醇衍生物。离液化合物包括脲、盐酸胍或硫氰酸胍。酰胺化合物包括甲酰胺、乙酰胺或nn-二甲基甲酰胺(dmf)。非质子化合物包括乙腈、dmso(二甲基亚砜)、1,4-二噁烷或四氢呋喃。伯醇包括1-丙醇、乙醇或甲醇。乙二醇衍生物包括1,3-丙二醇、乙二醇、甘油、1,2-二甲氧基乙烷或2-甲氧基乙醇。其他松弛剂包括碘化钠、碘化钾和多胺。
178.在一些实施方案中，松弛反应混合物包括选自以下的组中的任何一种或两种或更多种的组合：脲、盐酸胍、硫氰酸胍、甲酰胺、乙酰胺、nn-二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、dmso(二甲基亚砜)、1,4-二噁烷、四氢呋喃、1-丙醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇、乙二醇、甘油、1,2-二甲氧基乙烷、2-甲氧基乙醇、碘化钠、碘化钾和/或多胺。
179.在一些实施方案中，松弛反应混合物包括甲酰胺和ssc。在一些实施方案中，松弛反应混合物包括乙腈、甲酰胺和ssc。在一些实施方案中，松弛反应混合物包括乙腈、甲酰胺和mes(2-(4-吗啉代)-乙磺酸)。在一些实施方案中，松弛反应混合物包括乙腈、甲酰胺、盐酸胍和hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。在一些实施方案中，松弛反应混合物包括乙腈、甲酰胺、脲和hepes。在一些实施方案中，松弛反应混合物中的ssc可以是1x、2x、3x或4x。
180.在一些实施方案中，在步骤(2)的松弛反应混合物的形成中，可以从约20℃至约70℃进行温度斜升条件，可以在约40-70℃的温度进行松弛温育条件，可以从约70℃至约20℃进行温度斜降条件。熟练的技术人员将认识到可以修改温度斜升条件、松弛温育温度和温度斜降条件。
181.在一些实施方案中，在步骤(3)的弯曲扩增反应混合物中，具有链置换活性的第二多个聚合酶包括bst dna聚合酶的大片段(例如，核酸外切酶阴性(minus))、phi29 dna聚合酶、bsu dna聚合酶的大片段、和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶或deep vent dna聚合酶。phi29 dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)，或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)，或嵌合的qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
182.在一些实施方案中，在步骤(2)的弯曲扩增反应混合物中，第三多个核苷酸的浓度(例如，总浓度)可以促进核苷酸聚合反应。例如，第三多个核苷酸的浓度(例如，总浓度)为约0.1-10mm。
183.在一些实施方案中，步骤(2)的弯曲扩增反应混合物中的第三多个核苷酸包括选自datp、dgtp、dctp和dttp的两种或更多种核苷酸的混合物。
184.在一些实施方案中，在步骤(2)的弯曲扩增反应混合物中，介导核苷酸结合且介导核苷酸聚合的至少一种二价阳离子包括催化性二价阳离子。在一些实施方案中，催化性二价阳离子包括镁和/或锰。扩增反应混合物中的催化性二价阳离子的浓度可为约1-20mm。
185.在一些实施方案中，步骤(2)的弯曲扩增反应混合物可以包含至少一种辅助蛋白或酶，包括解旋酶、单链结合(ssb)蛋白或重组酶(例如，t4 uvsx)和/或重组酶辅助因子(例如，t4 uvsy或t4 gp32)。在一些实施方案中，可以省去这些辅助蛋白。
186.在一些实施方案中，在步骤(4)的弯曲扩增反应中，可以从约20
°
c至约90℃进行温度斜升条件。在一些实施方案中，在步骤(4)的弯曲扩增反应中，温度斜升条件可以进行约5-15秒，或约15-30秒，或约30-45秒，或约45-60秒，或更长。在一些实施方案中，在步骤(4)的弯曲扩增反应中，扩增温育条件可以为约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63，64、65、66、67、68、69或70
°
c或更高温度。在一些实施方案中，在步骤(4)的弯曲扩增反应中，扩增温育条件可以进行约30-45秒，或约45-60秒，或约60-75秒，或约75-90秒，或更长。在一些实施方案中，在步骤(4)的弯曲扩增反应中，可以从约90℃至约20℃进行温度斜降条件。
187.在一些实施方案中，在步骤(4)的弯曲扩增反应中，温度斜降条件可以进行约5-15秒，或约15-30秒，或约30-45秒，或约45-60秒，或更长。在一些实施方案中，在步骤(5)的洗涤中，洗涤缓冲液包括1xssc，或具有钴六胺的1x ssc。在一些实施方案中，可以将步骤(2)-(5)重复至少一次，或重复多达10次，或重复多达15次，或重复多达20次，或重复多达30次或更多次。
188.通常，单独使用所公开的低非特异性结合载体或与扩增反应组分的制剂组合使用可以实现扩增速率、扩增特异性和扩增效率的改善。除了包含核苷酸、一种或多种聚合酶、解旋酶、单链结合蛋白等(或其任何组合)以外，还可以通过各种方式调节扩增反应混合物以实现改善的性能，包括但不限于缓冲液类型、缓冲液ph值、有机溶剂混合物、缓冲液粘度、
去污剂和两性离子组分、离子强度(包括一价和二价离子浓度的调节)、抗氧化剂和还原剂、碳水化合物、bsa、聚乙二醇、硫酸葡聚糖、甜菜碱、其他添加剂等的选择。
189.与使用常规载体和扩增方案获得的那些扩增速率相比，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增反应制剂组合使用可产生增大的扩增速率。在一些情况下，对于上述任何一种扩增方法，可以达到的相对扩增速率可以是使用常规的载体和扩增方案的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍或至少20倍。
190.在一些情况下，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用对于任何这些完成度量可以产生不到180分钟、120分钟、90分钟、60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、3分钟、1分钟、50秒、40秒、30秒、20秒或10秒的扩增反应时间(即扩增反应完成90％、95％、98％或99％所需的时间)。
191.本文公开的一些低结合载体表面表现出荧光团(例如cy3)的特异性结合与非特异性结合的比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1或大于100:1或跨本文范围内的任何中间值。本文公开的一些表面表现出荧光团(例如cy3)的特异性荧光信号与非特异性荧光信号的比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1或大于100:1或跨本文范围内的任何中间值。
192.在一些情况下，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用可以实现不超过60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟的更快的扩增反应时间(即，扩增反应完成90％、95％、98％或99％所需的时间)。类似地，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用在一些情况下可以使得能够在不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或不超过30个循环中完成扩增反应。
193.在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案获得的相比，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增反应制剂组合使用可产生增加的特异性扩增和/或减少的非特异性扩增。在一些情况下，可实现的特异性扩增与非特异性扩增的所得比率为至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1或1,000:1。
194.在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案获得的相比，低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增反应制剂组合使用可产生增高的扩增效率。在一些情况下，在以上指定的任何扩增反应时间中，可实现的扩增效率优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
195.在一些情况下，与附接到低结合载体表面的寡核苷酸衔接子或引物分子杂交的经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度范围可以为约0.02千碱基(kb)至约20kb或约0.1kb至约20kb。在一些情况下，经克隆扩增的靶寡核苷酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb，或跨本文所述范围内的任何中间值，例如，长度为至少0.85kb。
196.在一些情况下，经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包括单链或双链多聚体核酸分子，所述多聚体核酸分子还包括规则出现的单体单元的重复。在一些情况下，经克隆扩增的单链或双链多聚体核酸分子的长度可以为至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb，或跨本文所述范围内的任何中间值，例如长度为约2.45kb。
197.在一些情况下，经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包括单链或双链多聚体核酸分子，所述多聚体核酸分子包含约2至约100个拷贝的规则重复的单体单元。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以为至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3个或至多2个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以在约4至约60的范围内。本领域技术人员将认识到，规则重复的单体单元的拷贝数可以具有该范围内的任何值，例如约12个。因此，在一些情况下，就每单位面积的载体表面上的靶序列的拷贝数而言，即使杂交和/或扩增效率低于100％，经克隆扩增的靶序列的表面密度也可超过寡核苷酸引物的表面密度。
198.在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案获得的相比，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增反应制剂组合使用可产生增加的克隆拷贝数。在一些情况下，例如其中经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子包含单体靶序列的串联的多聚体重复序列，克隆拷贝数可比使用常规载体和扩增方案获得的克隆拷贝数少得多。因此，在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的群落约1个分子至约100,000个分子(例如靶序列分子)。在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的群落至少1、至少5、至少10、至少50、至少100、至少500、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少6,000、至少7,000、至少8,000、至少9,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000或至少100,000个分子。在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的群落至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,000、至多8,000、至多7,000、至多6,000、至多5,000、至多4,000、至多3,000、至多2,000、至多1,000、至多500、至多100、至多50、至多10、至多5或至多1个分子。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，克隆拷贝数可以在约2,000个分子至约9,000个分子的范围内。本领域技术人员将认识到，克隆拷贝数可以具有该范围内的任何值，例如在一些情况下为约2,220个分子，在其他情况下为约2个分子。
199.如上所述，在一些情况下，经扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包
含单体靶序列的串联的多聚体重复序列。在一些情况下，经扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含多个分子，每个分子均包含单个单体靶序列。因此，所公开的低非特异性结合载体或单独使用与优化的扩增反应制剂组合使用可导致靶序列拷贝的表面密度范围为约100个靶序列拷贝/mm2至约1
×
10
12
个靶序列拷贝/mm2。在一些情况下，靶序列拷贝的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1
×
107、至少5
×
107、至少1
×
108、至少5
×
108、至少1
×
109、至少5
×
109、至少1
×
10
10
、至少5
×
10
10
、至少1
×
10
11
、至少5
×
10
11
或至少1
×
10
12
个经克隆扩增的靶序列分子/mm2。在一些情况下，靶序列拷贝的表面密度可以是至多1
×
10
12
、至多5
×
10
11
、至多1
×
10
11
、至多5
×
10
10
、至多1
×
10
10
、至多5
×
109、至多1
×
109、至多5
×
108、至多1
×
108、至多5
×
107、至多1
×
107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个靶序列拷贝/mm2。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，靶序列拷贝的表面密度可以在约1,000个靶序列拷贝/mm2至约65,000个靶序列拷贝/mm2的范围内。本领域技术人员将认识到，靶序列拷贝的表面密度可以具有该范围内的任何值，例如，为约49,600个靶序列拷贝/mm2。
200.在一些情况下，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用可导致经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或簇)的表面密度范围为约100个分子/mm2至约1
×
10
12
个集落/mm2。在一些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1
×
107、至少5
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107、至少1
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108、至少5
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108、至少1
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109、至少5
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109、至少1
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、至少5
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、至少1
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、至少5
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或至少1
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个分子/mm2。在一些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度可以为至多1
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、至多5
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、至多1
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、至多1
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、至多5
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109、至多5
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108、至多1
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108、至多5
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107、至多1
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107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,
000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个分子/mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度范围可以为约5,000个分子/mm2至约50,000个分子/mm2。本领域技术人员将认识到，经克隆扩增的群落的表面密度可以具有在该范围内的任何值，例如，为约48,800个分子/mm2。
201.在一些情况下，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用可导致经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或簇)的表面密度范围为约100个分子/mm2至约1
×
10
12
个集落/mm2。在以些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1
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107、至少5
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108、至少5
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108、至少1
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109、至少5
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、至少1
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、至少5
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个分子/mm2。在一些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度可以是至多1
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、至多5
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、至多1
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、至多5
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、至多1
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、至多5
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109、至多5
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108、至多1
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108、至多5
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107、至多1
×
107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个分子/mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度可以在约5,000个分子/mm2至约50,000个分子/mm2的范围内。本领域技术人员将认识到，经克隆扩增的分子的表面密度可以具有在该范围内的任何值，例如，为约48,800个分子/mm2。
202.在一些情况下，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用可导致经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸集落(或簇)的表面密度范围为约100个集落/mm2至约1
×
10
12
个集落/mm2。在一些情况下，经克隆扩增的集落的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,
000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1
×
107、至少5
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108、至少5
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109、至少1
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、至少1
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、至少5
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或至少1
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个集落/mm2。在一些情况下，经克隆扩增的集落的表面密度可以是至多1
×
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、至多5
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、至多1
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、至多5
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、至多1
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、至多5
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109、至多1
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109、至多5
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108、至多1
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108、至多5
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107、至多1
×
107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个集落/mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，经克隆扩增的集落的表面密度可以在约5,000个集落/mm2至约50,000个集落/mm2的范围内。本领域技术人员将认识到，经克隆扩增的集落的表面密度可以具有在该范围内的任何值，例如，为约48,800个集落/mm2。
203.在一些情况下，所公开的低非特异性结合载体单独使用或与优化的扩增反应制剂组合使用可产生来自经扩增和经标记的核酸群体的信号(例如，荧光信号)，其方差系数不大于大于50％，例如50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或小于5％。
204.在一些情况下，本文公开的载体表面和方法允许在升高的延伸温度下扩增，例如在15℃、20℃、25℃、30℃、40℃或更高，或例如在约21℃或23℃下扩增。
205.在一些情况下，使用本文公开的载体表面和方法能够简化扩增反应。例如，在一些情况下，使用不超过1、2、3、4或5种离散试剂进行扩增反应。
206.在一些情况下，使用本文公开的载体表面和方法能够在扩增期间使用简化的温度曲线，使得反应在15℃、20℃、25℃、30℃或40℃的低温至40℃、45℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或高于80℃的高温范围内进行，例如在20℃至65℃范围内进行。
207.扩增反应也得到了改善，使得较少量的模板(例如，靶分子或样品分子)足以在表面上产生可辨别的信号，例如1pm、2pm、5pm、10pm、15pm、20pm、30pm、40pm、50pm、60pm、70pm、80pm、90pm、100pm、200pm、300pm、400pm、500pm、600pm、700pm、800pm、900pm、1,000pm、2,000pm、3,000pm、4,000pm、5,000pm、6,000pm、7,000pm、8,000pm、9,000pm、10,000pm或大于10,000pm的样品，例如500nm。在示例性实施方案中，大约100pm的输入足以生成用于可靠信号确定的信号。
208.所公开的固相核酸扩增反应制剂和低非特异性结合载体可用于多种核酸分析应用中的任一种，例如核酸碱基鉴别、核酸碱基分类、核酸碱基判定、核酸检测应用、核酸测序应用和基于核酸的(遗传和基因组)诊断应用。在许多这些应用中，荧光成像技术可用于监测在低结合载体上进行的杂交、扩增和/或测序反应。
209.可以使用本领域技术人员已知的多种荧光团、荧光成像技术和荧光成像仪器中的
任何一种来进行荧光成像。可以使用(例如，通过与核苷酸、寡核苷酸或蛋白质缀合)的合适荧光染料的示例包括但不限于荧光素、罗丹明、香豆素、花青及其衍生物，包括花青衍生物花青染料-3(cy3)、花青染料-5(cy5)、花青染料-7(cy7)等。可以使用的荧光成像技术的示例包括但不限于荧光显微镜法成像、荧光共聚焦成像、双光子荧光等。可以使用的荧光成像仪器的示例包括但不限于配备有图像传感器或摄像机的荧光显微镜，共聚焦荧光显微镜，双光子荧光显微镜或包括合适选择的光源、透镜、反射镜、棱镜、二向色反射器、光圈和图像传感器或照相机的定制仪器等。配备用于获取所公开的低结合载体表面和在其上杂交的靶核酸序列的经克隆扩增的集落(或簇)的图像的荧光显微镜的非限制性示例是olympus ix83倒置荧光显微镜，其配备有20x、0.75na、532nm光源、带通和二向色镜滤光器组(针对532nm长通激发优化)和cy3荧光发射滤光器、semrock 532nm二向色反射镜以及相机(andor scmos，zyla 4.2)，其中调节激发光强度以避免信号饱和。通常，在获取图像时，可以将载体表面浸入缓冲液(例如，25mm aces，ph 7.4缓冲液)中。
210.在一些情况下，使用荧光成像技术可以评估使用公开的反应制剂和低非特异性结合载体进行的核酸杂交和/或扩增反应，其中图像的对比度噪声比(cnr)提供了评估载体上的扩增特异性和非特异性结合的关键量度。cnr通常定义为：cnr＝(信号-背景)/噪声。背景项通常被认为是在指定的关注区域(roi)中针对围绕特定特征(衍射受限光斑，dls)的间隙区测量的信号。虽然信噪比(snr)通常被认为是整体信号质量的基准，但可以表明，改善的cnr相对于snr作为要求快速图像捕获的应用(例如，必须将循环次数最小化的测序应用)中信号质量的基准，可以提供明显的优势，如以下实施例所示。本公开的表面还在同审的国际申请序列号pct/us2019/061556(其通过引用以其整体并入本文)中提供。
211.在大多数基于集合的测序方法中，背景项通常被测量为与“间隙”区相关的信号。除了“间隙”背景(b
inter
)之外，“细胞内”背景(b
intra
)存在于经扩增的dna集落所占据的区内。这两个背景信号的组合决定了可实现的cnr，随后直接影响光学仪器要求、架构成本、试剂成本、运行时间、成本/基因组，并最终影响基于循环阵列的测序应用的准确性和数据质量。b
inter
背景信号由多种来源引起；一些示例包括来自消耗性流动池的自发荧光、检测分子的非特异性吸附(其产生可能掩盖来自roi的信号的虚假荧光信号)、非特异性dna扩增产物的存在(例如，由引物二聚体产生的那些)。在典型的下一代测序(ngs)应用中，当前视场(fov)中的背景信号会随时间进行平均并减去。来自单个dna群落的信号(即fov中的(s)-b
inter
)产生可被分类的可识别的特征。在一些情况下，细胞内背景(b
intra
)可能会产生混杂的荧光信号，该信号并非特异于目的靶标，但存在于相同的roi中，因此更难以平均和减去。
212.如将在以下实施例中所示，在本公开的低结合基底上实施核酸扩增可通过减少非特异性结合来降低b
inter
背景信号，可改善特异性核酸扩增，并可导致非特异性扩增减少，非特异性扩增会影响来自间隙区和细胞内区域的背景信号。在一些情况下，与使用常规载体和杂交、扩增和/或测序方案所获得的那些相比，所公开的低结合载体表面任选地与所公开的杂交和/或扩增反应制剂组合使用，可导致cnr提高到2、5、10、100或1000倍。尽管这里在使用荧光成像作为读出或检测模式的背景下进行了描述，但相同的原理也适用于将所公开的低非特异性结合载体和核酸杂交和扩增制剂用于其他检测模式，包括光学和非光学检测模式。
213.所公开的低结合载体，任选地与所公开的杂交和/或扩增方案组合使用，产生表现
出以下的固相反应：(i)蛋白质和其他反应组分的可忽略的非特异性结合(从而最小化基底背景)，(ii)可以忽略的非特异性核酸扩增产物，以及(iii)提供可调整的核酸扩增反应。
214.用于捕获和分析dna的方法。本公开提供了用于以细胞或空间可寻址方式分析核酸的方法，所述方法包括：(a)提供包含低非特异性结合涂层的载体，多个捕获寡核苷酸和多个环化寡核苷酸被固定到所述低非特异性结合涂层上(例如，图2)，其中所述多个捕获寡核苷酸包含(i)与靶核酸分子的至少一部分杂交的靶捕获区，(ii)包含空间条形码序列的通用序列区，(iii)环化锚定序列，和(iv)可切割区，其中所述多个环化寡核苷酸包含(i)均聚物区，(ii)包含测序引物结合序列的通用序列区和(iii)环化锚定结合序列，并且其中低非特异性结合涂层包含至少一个亲水性聚合物涂层，其具有不超过45度的水接触角。
215.在一些实施方案中，步骤(a)中的低非特异性结合涂层相对于本领域已知的表面表现出低背景荧光信号或高对比度噪声(cnr)比。在一些实施方案中，低非特异性结合涂层表现出小于约0.25分子/μm2的非特异性cy3染料吸收水平，其中不超过5％的靶核酸在不与固定的捕获寡核苷酸杂交的情况下与表面涂层缔合。在一些实施方案中，当在非信号饱和条件下使用荧光成像系统时，具有多个经克隆扩增的核酸簇的表面涂层的荧光图像表现出至少20或至少50的对比度噪声比(cnr)或更高的对比度噪声比(cnr)。
216.在一些实施方案中，步骤(a)中的固定的捕获寡核苷酸可以包含以下的任何组合：(i)与靶核酸分子的至少一部分杂交的靶捕获区，(ii)包含空间条形码序列的通用序列区，(iii)结合环化寡核苷酸的一部分的环化锚定序列，和/或(iv)可切割区。
217.在一些实施方案中，步骤(a)中的固定的捕获寡核苷酸的靶捕获区包含靶特异性序列或随机序列。
218.在一些实施方案中，步骤(a)中的固定的环化寡核苷酸可以包含以下的任何组合：(i)均聚物区，(ii)包含测序引物结合序列的通用序列区和/或(iii)结合捕获寡核苷酸的环化锚定序列的环化锚定结合序列。
219.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(b)在适于促进靶核酸分子从细胞生物样品迁移到固定的捕获寡核苷酸中的一个的条件下，在高效杂交缓冲液的存在下，使低非特异性结合涂层与细胞生物样品接触，从而形成固定的靶核酸双链体，其中靶核酸分子以保留靶核酸分子在细胞生物样品中的空间位置信息的方式被固定到低非特异性结合涂层，其中靶核酸包括dna或rna(例如，图7)。
220.在一些实施方案中，步骤(b)中的细胞生物样品包括新鲜的、冷冻的、新鲜冷冻的或存档的(例如经福尔马林固定石蜡包埋的；ffpe)的样品。
221.在一些实施方案中，将步骤(b)中的细胞生物样品进行透化反应以促进包括靶核酸分子在内的细胞核酸分子(例如dna和/或rna)从细胞生物样品迁移固定的捕获寡核苷酸中的一个。
222.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其具有不大于40的介电常数并且具有4-9的极性指数；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于高效杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲液体系，其将高效杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8范围内；以及(iv)拥挤剂，其量足以增强或促进分子拥挤化。
223.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其
包含以高效杂交缓冲液的体积计为25％-50％的乙腈；(ii)第二极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5％-10％的甲酰胺；(iii)ph缓冲液体系，其包含2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph为5-6.5；以及(iv)拥挤剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5％-35％的聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液还包含甜菜碱。
224.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液促进核酸杂交反应的高度严格性(例如特异性)、速度和功效，并提高后续扩增和测序步骤的效率。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液显著缩短核酸杂交时间，并降低样品输入要求。核酸退火可以在等温条件下进行，并消除了用于退火的冷却步骤。
225.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(c)使用杂交的靶核酸分子为模板，对固定的核酸双链体进行引物延伸反应，从而形成固定的靶延伸产物。在一些实施方案中，引物延伸反应包括使固定的核酸双链体与多个核苷酸和聚合酶接触。在一些实施方案中，聚合酶包括大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段、t7 dna聚合酶或t4 dna聚合酶。
226.在一些实施方案中，步骤(c)的引物延伸反应可以是逆转录反应，其包括(i)逆转录酶，(ii)多个核苷酸，和(iii)多个逆转录酶引物。在一些实施方案中，步骤(a)的逆转录反应包括多个核苷酸和具有逆转录活性的酶，包括来自amv(禽成髓细胞血症病毒)、m-mlv(莫洛尼鼠白血病病毒)或hiv(人类免疫缺陷病毒)的逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶可以是市售酶，包括multiscribe
tm
、thermoscript
tm
或arrayscript
tm
。在一些实施方案中，逆转录酶包括superscript i、ii、iii或iv酶。在一些实施方案中，逆转录反应可以包括rnase抑制剂。
227.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(d)在适于将均聚物尾附加到固定的靶延伸产物的条件下对固定的靶延伸产物进行非模板加尾反应，从而形成固定的加尾靶延伸产物(例如，图27)。在一些实施方案中，非模板加尾反应包括使固定的靶延伸产物与多个核苷酸和聚合酶接触，其中聚合酶是taq聚合酶、tfi dna聚合酶、3’核酸外切酶阴性-大(klenow)片段或3’核酸外切酶阴性-t4聚合酶。
228.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(e)切割固定的加尾靶延伸产物以从低结合涂层释放固定的加尾靶延伸产物，从而形成可溶的加尾靶延伸产物。在一些实施方案中，可切割区可以用酶、化合物、光或热切割。
229.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(f)在一定条件下将可溶性加尾靶延伸产物与固定的环化寡核苷酸中的一个结合，所述条件适于将可溶性加尾靶延伸产物的附加均聚物尾与固定的环化寡核苷酸的均聚物区杂交，并适于将可溶性加尾靶延伸产物的环化锚定序列与固定的环化寡核苷酸的环化锚定结合序列杂交，从而形成具有缺口和/或断口的开环靶延伸产物，这样使得固定的环化寡核苷酸用作夹板分子以促进可溶性加尾靶延伸产物的环化(例如，图27)。
230.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(g)通过进行缺口填充引物延伸反应来闭合缺口(如果存在)并通过对开环靶延伸产物进行连接反应来闭合断口(如果存在)，从而形成与固定的环化寡核苷酸杂交的共价闭合的环状靶延伸产物，其中固定的环化寡核苷酸包含具有3’可延伸端的均聚物区(例如，图27)。
231.在一些实施方案中，步骤(g)的形成共价闭合环状靶延伸产物包括聚合酶介导的
缺口填充反应、酶促连接反应或聚合酶介导的间隙填充反应和酶促连接反应。在一些实施方案中，聚合酶介导的缺口填充反应包括使开环靶分子与dna聚合酶和多个核苷酸接触，其中dna聚合酶包括大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段、t7 dna聚合酶或t4 dna聚合酶。在一些实施方案中，酶促连接反应包括使用连接酶，包括t3、t4、t7或taq dna连接酶。在一些实施方案中，形成共价闭合环状靶分子包括使开环靶分子与circligase或circligase ii酶接触。
232.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(h)在适于形成具有串联重复区(所述串联重复区包含测序引物结合序列、靶序列和空间条形码序列)的固定的核酸多联体分子的条件下，使用固定的环化寡核苷酸的均聚物区的3’可延伸端进行滚环扩增反应(例如，图27)。
233.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应包括在适于产生至少一种核酸多联体的条件下使共价闭合的环化锁式探针(例如一个或多个环化的核酸模板分子)与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种催化性二价阳离子接触，其中所述至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
234.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应包括：(1)使共价闭合的环化锁式探针(例如一个或多个环化的核酸模板分子)与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种非催化性二价阳离子(其不促进聚合酶催化的核苷酸掺入扩增引物中)接触，其中所述非催化性二价阳离子包括锶或钡；以及(2)在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环化锁式探针与至少一种催化性二价阳离子接触，其中所述至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
235.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应在室温至约50℃，或室温至约65℃的恒定温度(例如，等温)下进行。
236.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应可以在多个压实寡核苷酸的存在下进行，所述多个压实寡核苷酸使固定的多联体的尺寸和/或形状压实以形成固定的压实纳米球。
237.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应包括具有链置换活性的dna聚合酶，其选自phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段、和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶或deep vent dna聚合酶。在一些实施方案中，phi29dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)，或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)，和嵌合的qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
238.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中所述mda反应包括使至少一种核酸多联体与至少一种扩增引物(其包含随机序列)、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及催化性二价阳离子(其包括镁或锰)接触。
239.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中所述mda反应包括使至少一种核酸多联体与dna引发酶-聚合酶、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及催化性二价阳离子(其包括镁或锰)接触。在一些实施方案中，dna引发酶-聚合酶包括具有dna聚合酶和rna引发酶活性的酶。dna引发酶-聚合酶可以利用脱氧核糖核苷酸三
磷酸以模板序列依赖性方式在单链dna模板上合成dna引物，并且可以在催化性二价阳离子(例如镁和/或锰)存在下通过核苷酸聚合(例如引物延伸)延伸引物链。dna引发酶-聚合酶包括作为类dnag引发酶(例如细菌)和类aep引发酶(古细菌和真核生物)成员的酶。示例性的dna引发酶-聚合酶是来自嗜热栖热菌hb27的tth primpol。
240.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是弯曲扩增反应而不是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，弯曲扩增反应包括：(a)通过使核酸多联体与选自甲酰胺、乙腈、乙醇、盐酸胍、脲、碘化钾和/或多胺中的一种或两种或更多种化合物的组合接触而形成核酸松弛反应混合物，以产生松弛的核酸多联体，其中形成核酸松弛反应混合物是在温度斜升、松弛温育温度和温度斜降的情况下进行的；(b)洗涤松弛的多联体；(c)通过将松弛的多联体与链置换dna聚合酶、多个核苷酸、催化性二价阳离子(在没有添加的扩增引物的情况下)接触而形成弯曲扩增反应混合物，以产生双链多联体，其中形成弯曲扩增反应混合物是在温度斜升、弯曲温育温度和温度斜降的情况下进行的；(d)洗涤双链多联体；和(e)将步骤(a)
–
(d)重复至少一次。
241.捕获和分析rna的方法。本文提供了用于分析核酸(例如，rna)的方法，所述方法包括：(a)提供包含低非特异性结合涂层的载体，多个捕获寡核苷酸被固定到所述涂层上(例如，图4和28)，其中所述多个捕获寡核苷酸包含(i)与靶核酸分子的至少一部分杂交的靶捕获区，(ii)包含空间条形码序列和任选的样品条形码序列的通用序列区，和(iii)可切割区，其中低非特异性结合涂层包含至少一个亲水性聚合物涂层，其具有不超过45度的水接触角。在一些实施方案中，靶捕获区包括具有聚t序列的均聚物区。
242.在一些实施方案中，步骤(a)中的低非特异性结合涂层相对于本领域已知的表面表现出低背景荧光信号或高对比度噪声(cnr)比。在一些实施方案中，低非特异性结合涂层表现出小于约0.25个分子/μm2的非特异性cy3染料吸收水平，其中不超过5％的靶核酸在不与固定的捕获寡核苷酸杂交的情况下与表面涂层缔合。在一些实施方案中，当在非信号饱和条件下使用荧光成像系统时，具有多个经克隆扩增的核酸簇的表面涂层的荧光图像表现出至少20或至少50的对比度噪声比(cnr)或更高的对比度噪声比(cnr)。
243.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(b)在适于促进靶核酸分子从细胞生物样品迁移到固定的捕获寡核苷酸中的一个的条件下，在存在高效杂交缓冲液的情况下，使低非特异性结合涂层与细胞生物样品接触，从而形成固定的靶核酸双链体，其中靶核酸分子以保留靶核酸分子在细胞生物样品中的空间位置信息的方式固定到低非特异性结合涂层，其中靶核酸包含聚a rna分子。在一些实施方案中，具有聚t序列的靶捕获区可以与聚a rna杂交(例如，图28)。
244.在一些实施方案中，步骤(b)中的细胞生物样品包括新鲜的、冷冻的、新鲜冷冻的或存档的(例如经福尔马林固定石蜡包埋的；ffpe)的样品。
245.在一些实施方案中，将步骤(b)中的细胞生物样品进行透化反应以促进包括靶核酸分子在内的细胞核酸分子(例如dna和/或rna)从细胞生物样品迁移固定的捕获寡核苷酸中的一个。
246.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其具有不大于40的介电常数并且具有4-9的极性指数；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于高效杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲
液体系，将高效杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8范围内；以及(iv)拥挤剂，其量足以增强或促进分子拥挤。
247.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为25％-50％的乙腈；(ii)第二极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5％-10％的甲酰胺；(iii)ph缓冲液体系，其包含2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph为5-6.5；以及(iv)拥挤剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5％-35％的聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液还包含甜菜碱。
248.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液促进核酸杂交反应的高度严格性(例如特异性)、速度和功效，并提高后续扩增和测序步骤的效率。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液显著缩短核酸杂交时间，并降低样品输入要求。核酸退火可以在等温条件下进行，并消除了用于退火的冷却步骤。
249.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(c)使用杂交的靶核酸分子为模板，对固定的核酸双链体进行逆转录反应，从而形成固定的靶延伸产物(例如，cdna)(例如，图28)。
250.在一些实施方案中，步骤(c)的逆转录反应包括(i)逆转录酶，(ii)多个核苷酸，和(iii)多个逆转录酶引物。在一些实施方案中，步骤(a)的逆转录反应包括多个核苷酸和具有逆转录活性的酶，包括来自amv(禽成髓细胞血症病毒)、m-mlv(莫洛尼鼠白血病病毒)或hiv(人类免疫缺陷病毒)的逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶可以是市售酶，包括multiscribe
tm
、thermoscript
tm
或arrayscript
tm
。在一些实施方案中，逆转录酶包括superscript i、ii、iii或iv酶。在一些实施方案中，逆转录反应可以包括rnase抑制剂。
251.在一些实施方案中，用于分析核酸(例如，rna)的方法还包括：(d)将核酸衔接子附加到固定的靶延伸产物的非固定端，从而产生附加衔接子的固定的双链靶延伸产物(图28)。核酸衔接子可以是单链或双链的。可以使用rna连接酶或dna连接酶附加核酸衔接子。可以使用t4 rna连接酶、kod连接酶、circligase或splintr连接酶将单链衔接子附加到固定的靶延伸产物的一条链的3’端。可以使用t4dna连接酶、tth dna连接酶、taq dna连接酶、热球菌属(thermococcus sp)(菌株9
°
n)dna连接酶、ampligase或splintr连接酶将双链衔接子附加到固定的靶延伸产物的非固定端。附加衔接子的固定的双链靶延伸产物包含与靶核酸分子杂交的固定的捕获寡核苷酸(通过逆转录延伸并附加衔接子)。在一些实施方案中，对附加衔接子的固定的双链靶延伸产物进行解离/去除或降解靶核酸分子的条件，从而使附加衔接子的固定的单链靶延伸产物保持附接于表面。
252.用于分析核酸的方法还可包括以下步骤：(e)使附加衔接子的固定的单链靶延伸产物与多个可溶性环化寡核苷酸接触以形成靶环化双链体，其中可溶性环化寡核苷酸各自包含(i)衔接子结合区，(ii)均聚物区，(iii)锚定区，和(iv)锚定部分，其中均聚物区包含可与靶核酸分子的聚a区杂交的聚t序列，其中接触是在适于将至少一种可溶性环化寡核苷酸紧邻附加衔接子的固定的单链靶延伸产物固定到低非特异性结合涂层的条件下进行的(例如，图28)。
253.在一些实施方案中，衔接子结合区包括测序引物结合区。在一些实施方案中，衔接子结合区包括扩增引物结合区。在一些实施方案中，均聚物区包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自聚t、聚dt、聚a、聚da、聚c、聚dc、聚g和聚dg。在一些实施方案中，均聚物区包含聚t或聚dt序列。在一些实施方案中，锚定部分可以附接到表面，从而产生固定的环化寡
核苷酸。固定的环化寡核苷酸的衔接子结合区可以与附加衔接子的固定的单链靶延伸产物的附加衔接子序列杂交。固定的环化寡核苷酸的均聚物区可以与附加衔接子的固定的单链靶延伸产物的均聚物区(例如聚a)杂交。
254.用于分析核酸的方法还可包括以下步骤：(f)切割靶环化双链体的可切割区以从低非特异性结合涂层中释放固定的末端以产生释放的靶延伸产物，其中释放的靶延伸产物的附加衔接子区保持与固定的环化寡核苷酸的衔接子结合区杂交，并且释放的靶延伸产物的均聚物区可以与固定的环化寡核苷酸的均聚物区重新杂交，从而形成具有缺口和/或断口的开环靶环化双链体，这样使得固定的环化寡核苷酸用作夹板分子以促进释放的靶延伸产物的环化(例如，图8)。在一些实施方案中，可切割区可以用酶、化合物、光或热切割。在一些实施方案中，释放的靶延伸产物的附加衔接子区保持与附加衔接子的固定的单链靶延伸产物杂交。在一些实施方案中，释放的靶延伸产物的均聚物区可以与固定的环化寡核苷酸的均聚物区重新杂交，从而形成具有缺口或断口的开环的附加衔接子的靶延伸产物。固定的环化寡核苷酸可用作夹板分子以促进释放的靶延伸产物的环化，因为固定的环化寡核苷酸的均聚物区和衔接子结合区可与释放的靶延伸产物的末端杂交。
255.用于分析核酸的方法还可包括以下步骤：(g)通过进行缺口填充引物延伸反应来闭合缺口(如果存在)并通过对开环靶环化双链体进行连接反应来闭合断口(如果存在)，从而形成与固定的环化寡核苷酸杂交的共价闭合的环状靶延伸产物，其中固定的环化寡核苷酸包括含有3’可延伸端的衔接子结合区(例如，图28)。
256.在一些实施方案中，步骤(g)的形成共价闭合环状靶延伸产物包括聚合酶介导的缺口填充反应、酶促连接反应或聚合酶介导的缺口填充反应和酶促连接反应。在一些实施方案中，聚合酶介导的缺口填充反应包括使开环靶分子与dna聚合酶和多个核苷酸接触，其中dna聚合酶包括大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段、t7 dna聚合酶或t4 dna聚合酶。在一些实施方案中，酶促连接反应包括使用连接酶，包括t3、t4、t7或taq dna连接酶。在一些实施方案中，形成共价闭合环状靶分子包括使开环靶分子与circligase或circligase ii酶接触。
257.用于分析核酸的方法还可包括以下步骤：(h)在适于形成具有串联重复区(所述串联重复区包含测序引物结合序列、靶序列和空间条形码序列)的固定的核酸多联体分子的条件下，通过延伸固定的环化寡核苷酸的衔接子结合区的3’可延伸端而进行滚环扩增反应(例如，图28)。
258.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应包括在适于产生至少一种核酸多联体的条件下使共价闭合的环化锁式探针(例如一个或多个环化的核酸模板分子)与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种催化性二价阳离子接触，其中所述至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
259.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应包括：(1)使共价闭合的环化锁式探针(例如一个或多个环化的核酸模板分子)与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种非催化性二价阳离子(其不促进聚合酶催化的核苷酸掺入扩增引物中)接触，其中所述非催化性二价阳离子包括锶或钡；以及(2)在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环化锁式探针与至少一种催化性二价阳离子接触，其中所述至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
260.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应在室温至约50℃，或室温至约65℃的恒定温度(例如，等温)下进行。
261.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应可以在多个压实寡核苷酸的存在下进行，所述多个压实寡核苷酸使固定的多联体的尺寸和/或形状压实以形成固定的压实纳米球。
262.在一些实施方案中，步骤(h)的滚环扩增反应包括具有链置换活性的dna聚合酶，其选自phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段、和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶或deep vent dna聚合酶。在一些实施方案中，phi29dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)，或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)，和嵌合的qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
263.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中所述mda反应包括使至少一种核酸多联体与至少一种扩增引物(其包含随机序列)、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及催化性二价阳离子(其包括镁或锰)接触。
264.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中所述mda反应包括使至少一种核酸多联体与dna引发酶-聚合酶、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及催化性二价阳离子(其包括镁或锰)接触。在一些实施方案中，dna引发酶-聚合酶包括具有dna聚合酶和rna引发酶活性的酶。dna引发酶-聚合酶可以利用脱氧核糖核苷酸三磷酸以模板序列依赖性方式在单链dna模板上合成dna引物，并且可以在催化性二价阳离子(例如镁和/或锰)存在下通过核苷酸聚合(例如引物延伸)延伸引物链。dna引发酶-聚合酶包括作为类dnag引发酶(例如细菌)和类aep引发酶(古细菌和真核生物)成员的酶。示例性的dna引发酶-聚合酶是来自嗜热栖热菌hb27的tth primpol。
265.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是弯曲扩增反应而不是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，弯曲扩增反应包括：(a)通过使核酸多联体与选自甲酰胺、乙腈、乙醇、盐酸胍、脲、碘化钾和/或多胺中的一种或两种或更多种化合物的组合接触而形成核酸松弛反应混合物，以产生松弛的核酸多联体，其中形成核酸松弛反应混合物是在温度斜升、松弛温育温度和温度斜降的情况下进行的；(b)洗涤松弛的多联体；(c)通过使松弛的多联体与链置换dna聚合酶、多个核苷酸、催化性二价阳离子(在没有添加的扩增引物的情况下)接触而形成弯曲扩增反应混合物，以产生双链多联体，其中形成弯曲扩增反应混合物是在温度斜升、弯曲温育温度和温度斜降的情况下进行的；(d)洗涤双链多联体；和(e)将步骤(a)
–
(d)重复至少一次。
266.用于核酸确定的方法和组合物。本文提供了用于分析核酸的方法，所述方法包括确定本文提及的靶核酸(例如，固定的多联体)的序列。测序可以是靶向测序。测序可以是全基因组测序。全基因组测序可以包括大规模平行测序(“下一代测序”或“第二代测序”)。在一些实施方案中，测序通过连接进行。在一些实施方案中，测序包括连续监测经标记的核苷酸在生长的多核苷酸分子中的掺入。测序可以通过大规模平行阵列测序或单分子测序来进行。
267.用于分析核酸的方法还包括以下步骤：(i)对固定的核酸多联体的至少一部分进行测序，包括对靶序列和空间条形码序列进行测序，以确定靶核酸在细胞生物样品中的空间位置。
268.在一些实施方案中，步骤(i)的测序包括使用包括大于1.0mm2的视场(fov)的光学成像系统对核酸多联体的至少一部分进行测序。
269.在一些实施方案中，步骤(i)的测序包括将细胞生物样品置于流动池中，该流动池具有壁(例如，顶壁或第一壁，以及底壁或第二壁)和中间的缺口，其中可以使用流体填充缺口，其中将流动池定位于荧光光学成像系统中。当使用传统成像系统时，细胞生物样品的厚度可能需要使用成像系统分别在流动池的第一和第二表面上聚焦。为了改善对来自细胞生物样品的核酸的测序反应的成像，可以将流动池放置在高性能荧光成像系统中，该系统包括两个或更多个镜筒透镜，这些镜筒透镜被设计用于在两个或更多个荧光波长下为流动池的第一和第二表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，高性能成像系统还包括聚焦机构，该聚焦机构被配置为在采集流动池的第一表面和第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，高性能成像系统被配置为对第一流动池表面或第二流动池表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。
270.在一些实施方案中，步骤(i)的测序包括：使多个核酸多联体与多个测序引物、多个聚合酶和多个多价分子接触，其中每个多价分子包括通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体。
271.在一些实施方案中，多价分子包括与颗粒(或核心)结合的多个核苷酸，所述颗粒(或核心)是例如聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、胶束、脂质体、微粒、纳米颗粒、量子点或其他本领域已知的合适的颗粒。
272.在一些实施方案中，多价分子包括：(a)核心；和(b)多个核苷酸臂，其包括(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头，和(iv)核苷酸单元，其中核心附接到多个核苷酸臂。在一些实施方案中，间隔子附接至接头。在一些实施方案中，接头附接至核苷酸单元。在一些实施方案中，核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团，并且其中接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施方案中，接头包括脂族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链均具有2-6个亚基并且任选地接头包含芳香族部分。
273.在一些实施方案中，多价分子包括附接至多个核苷酸臂的核心，并且其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元，其选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
274.在一些实施方案中，多价分子还包括多个多价分子，其包括具有两种或更多种不同类型的核苷酸的多价分子的混合物，所述核苷酸选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
275.在一些实施方案中，多价分子包括与多个核苷酸臂附接的核心，并且其中各个核苷酸臂包括在糖2’位置、糖3’位置或在糖的2’和3’位置具有链终止部分(例如，封闭部分)的核苷酸单元。
276.在一些实施方案中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，链终止部分选自3
’‑
脱氧核苷酸、2’,3
’‑
双脱氧核苷酸、3
’‑
甲基、3
’‑
叠氮基、3
’‑
叠氮基甲基、3
’‑
o-叠氮基烷基、3
’‑
o-乙炔基、3
’‑
o-氨基烷基、3
’‑
o-氟烷基、3
’‑
氟甲基、3
’‑
二氟甲基、3
’‑
三氟甲基、3
’‑
磺酰基、3
’‑
丙二酰基、3
’‑
氨基、3
’‑
o-氨基、3
’‑
巯基、3
’‑
氨基甲基、3
’‑
乙基、3’丁基、3
’‑
叔丁基、3
’‑
芴基甲氧基羰基、3’叔丁氧基羰基、3
’‑
o-烷基羟基
氨基、3
’‑
硫代磷酸酯、和3-o-苄基，或其衍生物。
277.在一些实施方案中，链终止部分可从核苷酸单元切割/去除。
278.在一些实施方案中，链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团，其可被膦化合物切割。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
279.在一些实施方案中，多价分子包括附接至多个核苷酸臂的核心，其中该核心用可检测的报告部分标记。在一些实施方案中，可检测的报告部分包括荧光团。
280.在一些实施方案中，多价分子的核心包括亲和素蛋白样部分并且核心附接部分包括生物素。
281.在一些实施方案中，步骤(i)的测序包括：(1)在一定条件下使多个核酸多联体与(i)多个聚合酶，(ii)至少一个多价分子，其包含通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，以及(iii)与多联体的一部分杂交的多个测序引物接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与核酸多联体分子中的一个的一部分结合，并且适于将多价分子的至少一个核苷酸部分在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸部分不掺入测序引物中；(2)检测和鉴定多价分子的结合核苷酸部分，从而确定多联体分子的序列；(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次；(4)在一定条件下使多联体分子与(i)多个聚合酶和(ii)多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶结合到多联体分子的至少一部分并且适于将多个核苷酸中的至少一个核苷酸在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置结合到杂交的测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入杂交的测序引物中；(5)任选地检测掺入的核苷酸；(6)任选地鉴定掺入核苷酸，从而确定或确认多联体的序列；以及(7)将步骤(1)
–
(6)重复至少一次。
282.在一些实施方案中，步骤(i)的测序包括：(1)在一定条件下使多个固定的多联体和与测序引物结合序列杂交的多个测序引物、多个聚合酶和多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与固定的多联体的一部分结合，并且适于将核苷酸中的至少一个在与固定的多联体中的互补核苷酸相反的位置结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入测序引物的3’端；(2)检测和鉴定掺入的核苷酸，从而确定固定的多联体分子的序列；以及(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次。在一些实施方案中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含在糖2’或3’位置的链终止部分。在一些实施方案中，链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团，其可被膦化合物切割。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
283.测序方法可以包括使包含靶序列的多个连接或未连接拷贝的一种或多种靶核酸与本文所述的多价结合组合物接触。使包含靶序列的多个连接或未连接拷贝的所述一种或多种靶核酸与一种或多种聚合物-核苷酸缀合物接触可以提供在给定测序循环中被询问的正确核苷酸的显著增加的局部浓度，因此抑制来自不当掺入或定相核酸链的信号(即，具有一个或多个跳过循环的那些延长核酸链)。
284.本文提供了获得核酸序列信息的方法，所述方法包括使一种或多种靶核酸与一种或多种聚合物-核苷酸缀合物接触。在一些实施方案中，一种或多种靶核酸包含靶序列的多
个连接或未连接拷贝。在一些实施方案中，所述方法导致测序错误率的降低，如通过在碱基的错误鉴定、不存在碱基的报告或未能报告正确碱基方面的减少所指示的。在一些实施方案中，所述测序错误率的降低可以包括与使用单价配体(包括游离核苷酸、经标记的游离核苷酸、蛋白质或肽结合的核苷酸或经标记的蛋白质或肽结合的核苷酸)观察到的错误率相比降低5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％或更多。在一些实施方案中，所述方法导致平均读段长度与使用单价配体(包括游离核苷酸、经标记的游离核苷酸、蛋白质或肽结合的核苷酸、或经标记的蛋白质或肽结合的核苷酸)观察到的平均读段长度相比增加5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％或更多。在一些实施方案中，所述方法导致平均读段长度与使用单价配体(包括游离核苷酸、经标记的游离核苷酸、蛋白质或肽结合的核苷酸、或经标记的蛋白质或肽结合的核苷酸)观察到的平均读段长度相比增加10、20、25、30、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、500个核苷酸。
285.使用聚合物-核苷酸缀合物进行测序可以缩短测序反应或测序运行的总时间。包括接触、检测和掺入步骤的测序反应循环在约5分钟至约60分钟的总时间范围内进行。在一些实施方案中，测序反应循环在至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟内进行。在一些实施方案中，测序反应循环在至多60分钟、至多50分钟、至多40分钟、至多30分钟、至多20分钟、至多10分钟或至多5分钟内进行。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些实施方案中，测序反应循环可以在约10分钟至约30分钟的总时间范围内进行。本领域技术人员将认识到测序循环时间可以具有该范围内的任何值，例如约16分钟。
286.使用聚合物-核苷酸缀合物进行测序提供了更准确的碱基读出。所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于测序运行中碱基判定准确度将提供在约20至约50范围内的平均q得分。在一些实施方案中，平均q得分为至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。本领域技术人员将认识到，平均q得分可以具有在该范围内的任何值，例如约32。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于30的q得分。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于35的q得分。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于40的q得分。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于45的q得分。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于50的q得分。
287.本公开涉及聚合物-核苷酸缀合物，其各自都具有缀合至颗粒或核心(例如，聚合物、支化聚合物、树枝状大分子或等效结构)的多个核苷酸。使聚合物-核苷酸缀合物与聚合
酶和引发的靶核酸接触可导致形成可被检测的三元复合物，进而实现靶核酸碱基的更准确确定。
288.当使用聚合物-核苷酸缀合物代替单个未缀合或未拴系的核苷酸与聚合酶和靶核酸形成复合物时，核苷酸的局部浓度增加了许多倍，这进而又增强了信号强度，特别是相比于错配的正确信号。本文所述的聚合物-核苷酸缀合物可以包括用于与靶核酸相互作用的至少一种聚合物-核苷酸缀合物。多价组合物还可以包括两种、三种或四种不同的聚合物-核苷酸缀合物，每种具有缀合至颗粒的不同核苷酸。
289.在具有聚合物-核苷酸缀合物形式或核心-核苷酸缀合物形式的聚合物-核苷酸缀合物中，相同核苷酸的多个拷贝可以与颗粒共价结合或非共价结合。颗粒的示例可以包括支化聚合物；树枝状大分子；交联聚合物颗粒，例如琼脂糖、聚丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、氰基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯颗粒；玻璃颗粒；陶瓷颗粒；金属颗粒；量子点；脂质体；乳液颗粒或本领域已知的任何其他颗粒(例如，纳米颗粒、微粒等)。在一个优选的实施方案中，颗粒是支化聚合物。
290.核苷酸可以通过接头连接到颗粒或核心，并且核苷酸可以附接到聚合物的一个末端或位置。核苷酸可以通过核苷酸的碱基或5’端与颗粒缀合。在一些聚合物-核苷酸缀合物中，一个核苷酸附接到聚合物的一个末端或位置。在一些聚合物-核苷酸缀合物中，多个核苷酸附接到聚合物的一个末端或位置。缀合的核苷酸可在空间上触及一个或多个蛋白质、一个或多个酶和核苷酸结合部分。在一些实施方案中，核苷酸可以与核苷酸结合部分例如聚合酶分开提供。在一些实施方案中，接头不包括光发射基团或光吸收基团。
291.颗粒或核心也可以具有结合部分。在一些实施方案中，颗粒或核心可以在不使用单独的相互作用部分的情况下自缔合。在一些实施方案中，颗粒或核心可由于缓冲条件或盐条件而自缔合，例如，在羟基磷灰石颗粒的钙介导的相互作用、胶束或脂质体的脂质或聚合物介导的相互作用、或金属(如铁或金)纳米颗粒的盐介导的聚集的情况下。
292.聚合物-核苷酸缀合物可以具有一个或多个标记(例如，可检测的报告部分)。标记的示例包括但不限于荧光团、自旋标记、金属或金属离子、比色标记、纳米颗粒、pet标记、放射性标记或可以使所述组合物可通过检测大分子或分子相互作用的领域中已知的此类方法检测的其他此类标记。标记可以附接到核苷酸(例如通过附接至核苷酸的碱基或5’磷酸部分)、附接至颗粒本身(例如，附接至peg亚基)或附接至核心(例如，附接至链霉亲和素核心)、附接至聚合物的末端、附接至中心部分或附接至所述聚合物-核苷酸缀合物内的任何其他位置，本领域技术人员将认识到其足以使所述组合物例如颗粒可通过本领域已知或本文别处描述的此类方法检测。在一些实施方案中，提供一种或多种标记以对应或区分特定的聚合物-核苷酸缀合物。
293.聚合物-核苷酸缀合物(例如，聚合物-核苷酸缀合物)的一个示例是聚合物-核苷酸缀合物。支化聚合物的示例包括聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚甘氨酸、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖或其他此类聚合物。在一个实施方案中，聚合物是peg。在另一个实施方案中，聚合物可以具有peg分支。
294.合适的聚合物的特征可以在于重复单元，所述重复单元具有适于衍生化的官能团，例如胺、羟基、羰基或烯丙基。聚合物还可以具有一个或多个预衍生的取代基，使得一个或多个特定的亚单元包括衍生位点或分支位点，而不管其他亚单元是否包括相同的位点、
取代基或部分。预衍生的取代基可包括或可还包括例如核苷酸、核苷、核苷酸类似物、标记(例如荧光标记、放射性标记或自旋标记)、相互作用部分、另外的聚合物部分等，或前述的任何组合。
295.在聚合物-核苷酸缀合物(例如，聚合物-核苷酸缀合物)中，聚合物可以具有多个分支。支化聚合物可以具有多种构型，包括但不限于星状(“星爆”)形式、聚集的星状(“螺旋滑梯(helter skelter)”)形式、瓶刷状或树枝状大分子。支化聚合物可以从中心附接点或中心部分辐射，或可以包括多个分支点，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个分支点。在一些实施方案中，聚合物的每个亚单元可以任选地构成单独的分支点。
296.在聚合物-核苷酸缀合物中，分支的长度和大小可以根据聚合物的类型而不同。在一些支化聚合物中，分支的长度可为1至1,000nm、1至100nm、1至200nm、1至300nm、1至400nm、1至500nm、1至600nm、1至700nm、1至800nm、或1至900nm，或更大，或具有落入本文公开的任何值之内或之间的长度。在一些支化聚合物中，分支可以具有对应于如下表观分子量的大小：1k、2k、3k、4k、5k、10k、15k、20k、30k、50k、80k、100k，或由上述任何两个所定义范围内的任何值。聚合物的表观分子量可以由代表性数目的亚单元的已知分子量计算，如通过尺寸排阻色谱法测定、如通过质谱法测定、或如通过本领域已知的任何其他方法测定。聚合物可以有多个分支。聚合物中的分支数可以是2、3、4、5、6、7、8、12、16、24、32、64、128或更多，或落入由这些值中的任何两个定义的范围内的数量。
297.对于聚合物-核苷酸缀合物，具有4、8、16、32或64个分支的支化聚合物可以使核苷酸附到peg分支末端，使得每个末端附接有0、1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸。在一个非限制性示例中，具有3至128个peg臂的支化聚合物在聚合物分支末端附接一个或多个核苷酸，使得每个末端附接有0、1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，支化聚合物或树枝状大分子具有偶数个臂。在一些实施方案中，支化聚合物或树枝状大分子具有奇数个臂。
298.在聚合物-核苷酸缀合物中，聚合物的每个分支或分支的子集可以附接有包括核苷酸(例如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤残基或衍生物或模拟物)的部分，并且该部分能够结合聚合酶、逆转录酶或其他核苷酸结合结构域。任选地，核苷酸部分可以能够结合聚合酶-模板-引物复合物但不掺入，或可以在聚合酶反应期间掺入延长的核酸链中。在一些实施方案中，核苷酸部分包括链终止部分，其在聚合酶介导的反应期间阻断后续核苷酸的掺入。在一些实施方案中，核苷酸部分可以是未封闭的(可逆封闭的)，使得随后的核苷酸不能在聚合酶反应期间掺入延长的核酸链中，直到这种封闭被去除，之后随后的核苷酸能够在聚合酶反应期间被掺入延长的核酸链中。
299.聚合物-核苷酸缀合物还可在每个分支或分支子集中具有结合部分。结合部分的一些示例包括但不限于生物素、亲和素、链霉亲和素等，聚组氨酸结构域、互补配对的核酸结构域、g-四联体形成核酸结构域、钙调蛋白、麦芽糖结合蛋白、纤维素酶、麦芽糖、蔗糖、谷胱甘肽-s-转移酶、谷胱甘肽、o-6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶、苄基鸟嘌呤及其衍生物、苄基半胱氨酸及其衍生物、抗体、表位、蛋白a、蛋白g。结合部分可以是本领域已知用于结合或促进蛋白质之间、蛋白质与配体之间、蛋白质与核酸之间、核酸之间或小分子相互作用结构域或部分之间的相互作用的任何相互作用分子或其片段。
300.在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物可以包括互补相互作用部分的一个或
多个元件。示例性的互补相互作用部分包括例如生物素和亲和素；snap-苄基鸟苷；抗体或fab和表位；igg fc和蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或蛋白l；麦芽糖结合蛋白和麦芽糖；凝集素和同源多糖；离子螯合部分、互补核酸、能够形成三重或三螺旋相互作用的核酸；能够形成g-四联体的核酸等。本领域技术人员将容易地认识到存在许多配对部分并且通常针对它们的特性(即它们彼此之间强烈且特异性地相互作用)而使用；因此，任何此类互补对或组被认为适用于构建或构想本公开的组合物的此目的。在一些实施方案中，本文公开的组合物可包括其中互补相互作用部分的一个元件附接到一个分子或多价配体，并且互补相互作用部分的另一个元件附接到单独的分子或多价配体的组合物。在一些实施方案中，如本文所公开的组合物可包括其中互补相互作用部分的两个或所有元件均附接至单个分子或多价配体的组合物。在一些实施方案中，如本文所公开的组合物可包括其中互补相互作用部分的两个或所有元件均附接至单个分子或多价配体的单独臂或位置的组合物。在一些实施方案中，如本文所公开的组合物可包括其中互补相互作用部分的两个或所有元件均附接至单个分子或多价配体的相同臂或位置的组合物。在一些实施方案中，包括互补相互作用部分的一个元件的组合物和包括互补相互作用部分的另一个元件的组合物可以同时或依次混合。在一些实施方案中，如本文所公开的分子或颗粒之间的相互作用允许多个分子或颗粒的缔合或聚集，从而例如增加可检测信号。在一些实施方案中，荧光、比色或放射性信号被增强。在其他实施方案中，预期本文公开的或本领域已知的其他相互作用部分。在一些实施方案中，可以提供如本文提供的组合物，使得包括第一相互作用部分(例如，一个或多个咪唑或吡啶部分)的一个或多个分子和包括第二相互作用部分(例如组氨酸残基)的一个或多个另外的分子同时或依次混合。在一些实施方案中，所述组合物包括1、2、3、4、5、6或更多个咪唑或吡啶部分。在一些实施方案中，所述组合物包括1、2、3、4、5、6或更多个组氨酸残基。在这样的实施方案中，所提供的分子或颗粒之间的相互作用可以通过诸如镍、锰、镁、钙、锶等的二价阳离子的存在来促进。在一些实施方案中，例如，(his)3基团可以通过镍或锰离子的配位与另一个分子或颗粒上的(his)3基团相互作用。
301.聚合物-核苷酸缀合物可包括一种或多种缓冲液、盐、离子或添加剂。在一些实施方案中，代表性的添加剂可以包括，但不限于，甜菜碱、亚精胺、去污剂(例如triton x-100、tween 20、sds或np-40)、乙二醇、聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯醇、乙烯醇、甲基纤维素、肝素，硫酸乙酰肝素、甘油、蔗糖、1,2-丙二醇、dmso、n,n,n-三甲基甘氨酸、乙醇、乙氧基乙醇、丙二醇、聚丙二醇、嵌段共聚物(例如pluronic(r)系列聚合物)、精氨酸、组氨酸、咪唑或其任何组合，或本领域已知作为dna“松弛剂”(一种化合物，具有以下效果：改变dna持续长度、改变聚合物内连接点或交叉点的数量、或改变dna分子的构象动力学，从而增加链内位点对dna结合部分的可及性)的任何物质。
302.聚合物-核苷酸缀合物可以包括两性离子化合物作为添加剂。另外的有代表性的添加剂可以在lorenz,t.c.j.vis.exp.(63),e3998,doi:10.3791/3998(2012)(其通过引用并入本文)关于其公开的用于促进核酸结合或动力学，或促进涉及核酸的操作、使用或储存的过程的添加剂中找到。
303.在一些实施方案中，多价结合组合物包括至少一种阳离子，其可包括但不限于钠、镁、锶、钡、钾、锰、钙、锂、镍、钴或本领域已知的其他此类阳离子，用于促进核酸相互作用，例如自缔合、二级或三级结构形成、碱基配对、表面缔合、肽缔合、蛋白质结合等。
304.当使用聚合物-核苷酸缀合物代替未缀合或未拴系的核苷酸与聚合酶和靶核酸形成复合物时，核苷酸的局部浓度增加了许多倍，这进而又增强了信号强度，特别是相比于错配的正确信号。本公开考虑使聚合物-核苷酸缀合物与聚合酶和引发的靶核酸接触以确定三元结合复合物的形成。
305.由于聚合物-核苷酸缀合物上核苷酸的局部浓度增加，当核苷酸与靶核酸的下一个碱基互补时，聚合酶、引发的靶链和核苷酸之间的结合变得更有利。形成的结合复合物具有更长的持续时间，这进而有助于缩短成像步骤。使用聚合物-核苷酸缀合物产生的高信号强度在整个结合和成像步骤中得以保持。聚合酶、引发的靶链和核苷酸或核苷酸类似物之间的强结合也意味着形成的结合复合物在洗涤步骤期间将保持稳定，并且当其他反应混合物和未匹配的核苷酸类似物被洗掉时，信号将保持高强度。在成像步骤之后，可以使结合复合物不稳定，然后可以将引发的靶核酸延伸一个碱基。延伸后，可以使用聚合物-核苷酸缀合物再次重复结合和成像步骤以确定下一个碱基的身份。
306.本公开的组合物和方法提供了建立和保持三元酶复合物(例如，在测序期间)的稳健且可控的手段，并且也提供了可以鉴定和/或测量所述复合物的存在的大大改善的手段，以及可以控制所述复合物的持久性的手段。这为诸如在核酸测序应用中确定n 1碱基的身份等问题提供了重要的解决方案。
307.无意受任何特定理论的束缚，已观察到本文公开的多价结合组合物与聚合酶核苷酸复合物以具有时间依赖性但比游离溶液中的核苷酸已知可获得的缔合速率慢得多的速率缔合以形成三元结合复合物。因此，缔合速率(kon)显著且出人意料地比单核苷酸或未附接到多价配体复合物的核苷酸的缔合速率慢得多。然而，重要的是，多价配体复合物的解离速率(koff)比针对游离溶液中核苷酸观察到的解离速率慢得多。因此，本公开的多价配体复合物对三元聚合酶-多核苷酸-核苷酸复合物的持久性提供了出人意料且有益的改善(特别是相对于与游离核苷酸形成的此类复合物)，例如显著提高核酸测序应用的成像质量，优于目前可用的方法和试剂。重要的是，本文所公开的多价底物的这种性质使得可见三元复合物的形成是可控的，从而可以进行随后的可视化、修饰或处理步骤，而基本上不考虑复合物的解离——也就是说，复合物可以根据需要形成、成像、修饰或以其他方式使用，并且将保持稳定，直到使用者执行确认的解离步骤，例如将复合物暴露于解离缓冲液中。
308.在各种实施方案中，适用于本文所述的结合相互作用(例如，在测序期间)的聚合酶可包括本领域已知的或可能已知的任何聚合酶。示例性聚合酶可包括但不限于：klenow dna聚合酶、水生栖热菌(thermus aquaticus)dna聚合酶i(taq聚合酶)、klentaq聚合酶和噬菌体t7 dna聚合酶；人类α、δ和εdna聚合酶；噬菌体聚合酶，例如t4、rb69和phi29噬菌体dna聚合酶、激烈火球菌(pyrococcus furiosus)dna聚合酶(pfu聚合酶)；枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)dna聚合酶iii，以及大肠杆菌dna聚合酶iiiα和ε；9
°
n聚合酶、逆转录酶例如hiv m型或o型逆转录酶、禽成髓细胞血症病毒逆转录酶或莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)逆转录酶或端粒酶。dna聚合酶的其他非限制性示例可以包括来自各种古细菌属(例如，气火菌属(aeropyrum)、古生球菌属(archaeglobus)、除硫球菌属(desulfurococcus)、火棒菌属(pyrobaculum)、火球菌属(pyrococcus)、火叶菌属(pyrolobus)、热网菌属(pyrodictium)、葡萄热菌属(staphylothermus)、斯梯特氏菌属(stetteria)、硫化叶菌属(sulfolobus)、高温球菌属(thermococcus)和火山鬃菌属(vulcanisaeta)等)的那些dna聚
合酶或其变体，包括本领域已知的此类聚合酶，例如vent
tm
、deepvent
tm
、pfu、kod、pfx、therminator
tm
和tgo聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是klenow聚合酶。
309.当聚合物-核苷酸缀合物上的核苷酸与靶核酸互补时相比于不互补时，三元复合物具有更长的持续时间。当聚合物-核苷酸缀合物上的核苷酸与靶核酸互补时相比于未缀合或拴系的互补核苷酸，三元复合物也具有更长的持续时间。例如，在一些实施方案中，所述三元复合物的持续时间可以不到1s、超过1s、超过2s、超过3s、超过5s、超过10s、超过15s、超过20s、超过30s、超过60s、超过120s、超过360s、超过3600s或更长，或在由这些值中的任何两个或更多个定义的范围内的时间。
310.例如，可以通过观察结合复合物的开始和/或持续时间，例如通过观察来自结合复合物的经标记组分的信号来测量持续时间。例如，经标记的核苷酸或包括一个或多个核苷酸的经标记的试剂可以存在于结合复合物中，从而允许在结合复合物的持续时间期间检测来自标记的信号。
311.已经观察到，使用不同的盐或离子可实现不同范围的持续时间，这表明，例如，在例如镁的存在下形成的复合物比在其他离子情况下形成的复合物形成得更快。还观察到，在存在例如锶的情况下形成的复合物容易地形成并且在撤出离子后或在用缺乏本发明组合物的一种或多种组分(例如，聚合物和/或一种或多种核苷酸，和/或一种或多种相互作用部分)的缓冲液或含有例如螯合剂(其可引起或加速从含有多价试剂的复合物中去除二价阳离子)的缓冲液洗涤后完全解离或基本完全解离。因此，在一些实施方案中，本公开的组合物包含镁。在一些实施方案中，本公开的组合物包含钙。在一些实施方案中，本公开的组合物包含锶或钡。在一些实施方案中，本公开的组合物包含钴。在一些实施方案中，本公开的组合物包含mgcl2。在一些实施方案中，本公开的组合物包含cacl2。在一些实施方案中，本公开的组合物包含srcl2。在一些实施方案中，本公开的组合物包含cocl2。在一些实施方案中，组合物不包含或基本上不包含镁。在一些实施方案中，组合物不包含或基本上不包含钙。在一些实施方案中，本公开的方法提供使一种或多种核酸与本文公开的一种或多种组合物接触，其中所述组合物缺乏钙或镁中的一种，或缺乏钙和镁两者。
312.三元复合物的解离可以通过改变缓冲条件来控制。在成像步骤之后，使用盐含量增加的缓冲液使三元复合物解离，从而可以洗掉经标记的聚合物-核苷酸缀合物，从而提供一种可以例如在一个测序周期和下一个测序周期之间的转换中衰减或终止信号的手段。在一些实施方案中，这种解离可以通过用缺乏必需金属或辅因子的缓冲液洗涤复合物来实现。在一些实施方案中，出于保持ph控制的目的，洗涤缓冲液可以包括一种或多种组合物。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可包括一种或多种单价阳离子，例如钠。在一些实施方案中，洗涤缓冲液缺少或基本缺少二价阳离子，例如不具有或基本不具有锶、钙、镁或锰。在一些实施方案中，洗涤缓冲液还包含螯合剂，例如edta、egta、次氮基三乙酸、聚组氨酸、咪唑等。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可以将环境的ph保持在与结合复合物相同的水平。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可以相对于针对结合复合物所见的水平升高或降低环境的ph。在一些实施方案中，ph可以在2-4、2-7、5-8、7-9、7-10的范围内，或低于2，或高于10，或由本文提供的任何两个值限定的范围内。
313.特定离子的添加可影响聚合酶与引发的靶核酸的结合、三元复合物的形成、三元复合物的解离，或例如在聚合酶反应期间一个或多个核苷酸至延伸核酸中的掺入。在一些
实施方案中，相关阴离子可包括氯离子、乙酸根、葡萄糖酸根、硫酸根、磷酸根等。在一些实施方案中，可以通过添加一种或多种酸、碱、或盐例如nicl2、cocl2、mgcl2、mncl2、srcl2、cacl2、caso4、srco3、bacl2等，将离子包括在本公开的组合物中。代表性的盐、离子、溶液和条件可以在remington:the science and practice of pharmacy,第20版,gennaro,a.r.,ed.(2000)(其通过引用以其整体并入本文)，特别是关于第17章和盐、离子、盐溶液和离子溶液的相关公开内容中找到。
314.本公开考虑使聚合物-核苷酸缀合物与一种或多种聚合酶接触。可以任选地在一种或多种靶核酸存在下进行接触。在一些实施方案中，所述靶核酸是单链核酸。在一些实施方案中，靶核酸与核酸引物杂交。在一些实施方案中，所述靶核酸是双链核酸。在一些实施方案中，所述接触包括使聚合物-核苷酸缀合物与一种聚合酶接触。在一些实施方案中，所述接触包括使包含一种或多种核苷酸的所述组合物与多种聚合酶接触。聚合酶可以与单个核酸分子结合。
315.靶核酸和聚合物-核苷酸缀合物之间的结合可以在已经变得不具有催化活性的聚合酶的存在下提供。在一个实施方案中，聚合酶可已经通过突变而变得不具有催化活性。在一个实施方案中，聚合酶可已经通过化学修饰而变得不具有催化活性。在一些实施方案中，聚合酶可由于缺少必要的底物、离子或辅因子而变得不具有催化活性。在一些实施方案中，聚合酶可已经由于不存在镁离子而变得不具有催化活性。
316.靶核酸和聚合物-核苷酸缀合物之间的结合在聚合酶存在下发生，其中结合溶液、反应溶液或缓冲液缺乏催化性离子，例如镁或锰。可替代地，靶核酸和聚合物-核苷酸缀合物之间的结合在聚合酶存在下发生，其中结合溶液、反应溶液或缓冲液包含非催化性离子例如锶、钡或钙。
317.当不具有催化活性的聚合酶用于帮助核酸与多价结合组合物相互作用时，所述组合物和所述聚合酶之间的相互作用使三元复合物稳定，从而使复合物可通过荧光或通过本文公开的或本领域已知的其他方法检测。未结合的聚合物-核苷酸缀合物可任选地在检测三元结合复合物之前被洗掉。
318.在含有钙或镁中的一个或含有钙和镁两者的溶液中使一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸缀合物接触。可替代地，在缺乏钙或镁中的一种，或缺乏钙或镁两者的溶液中，并且在单独的步骤(不考虑步骤的顺序)中使一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸缀合物接触，向溶液中加入钙或镁中的一种，或加入钙和镁两者。在一些实施方案中，在缺乏锶或钡的溶液中使一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸缀合物接触，并且包括在单独的步骤中(不考虑步骤的顺序)向溶液中添加锶。
319.本文公开了聚合物-核苷酸缀合物及其在分析核酸中的用途，包括测序或其他生物测定应用。增加核苷酸与酶(例如聚合酶)或酶复合物的结合可以通过增加核苷酸的有效浓度来实现。该增加可以通过增加游离溶液中核苷酸的浓度，或通过增加相关结合位点附近的核苷酸量来实现。这种增加也可以通过将一些核苷酸物理限制在有限的体积中来实现，从而导致浓度的局部增加，并且因此结构可以以比未缀合的、未拴系的或其他不受限制的单个核苷酸观察到的更高的表观亲合力与结合位点结合。实现这种限制的一种示例性手段是通过提供其中多个核苷酸结合到颗粒上的聚合物-核苷酸缀合物，所述颗粒例如聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、胶束、脂质体、微粒、纳米颗粒、量子点或领域已知的其他本
合适的颗粒。
320.本文公开的聚合物-核苷酸缀合物可以包括附接到颗粒的多个核苷酸部分。在一些实施方案中，多个核苷酸部分由相同类型的核苷酸部分(例如，具有相同或相似的碱基配对特性)构成。当多个核苷酸部分与待鉴定的靶核酸中的下一个核苷酸互补时，聚合物-核苷酸缀合物在至少两个核苷酸部分与靶核酸序列的至少两个拷贝中的下一个核苷酸之间形成结合复合物(多价结合复合物)。在一些实施方案中，多价结合复合物包含与靶核酸分子的引发模板结合的两个或更多个聚合酶。本文所述的多价结合复合物表现出比使用单个未缀合或未拴系的核苷酸形成的结合复合物增加的稳定性和更长的持续时间。当与聚合酶结合时，多价结合复合物可以耐受洗涤步骤，因此在工作流程的整个成像和洗涤步骤中保持高的信号强度，参见例如图7。聚合物-核苷酸缀合物的聚合物核心可以用两种或更多种可检测标记进行标记，这至少部分有助于增强可检测的信号。
321.在一些实施方案中，至少一种聚合物-核苷酸缀合物包含通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，例如图5a和图5b中。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物包含：(a)核心，和(b)多个核苷酸臂，其中每个核苷酸臂包括(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头，和(iv)核苷酸单元，例如图5a-图5d和图6a-图6b中所示。
322.在一些实施方案中，间隔子附接至接头，其中接头附接至核苷酸单元。在一些实施方案中，核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团。在一些实施方案中，接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施方案中，接头包括脂族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链均具有2-6个亚基，并且任选地，接头包含芳香族部分(图6a和图6b)。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物包含附接至多个核苷酸臂的核心，并且其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元，其选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。在一些实施方案中，低结合载体还包括多个聚合物-核苷酸缀合物，其包括具有两种或更多种不同类型的核苷酸的聚合物-核苷酸缀合物的混合物，所述核苷酸选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
323.在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物包含与多个核苷酸臂附接的核心，其中各个核苷酸臂包括在糖2’位置、糖3’位置、或在糖的2’和3’位置具有链终止部分(例如，封闭部分)的核苷酸单元。在一些实施方案中，链终止部分选自烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮化物基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫基团、二硫基、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团。
324.在一些实施方案中，链终止部分包括3
’‑
o-烷基羟基氨基基团、3
’‑
硫代磷酸酯基团、3
’‑
o-丙二酰基基团或3
’‑
o-苄基基团。在一些实施方案中，链终止部分选自3
’‑
脱氧核苷酸、2’,3
’‑
双脱氧核苷酸、3
’‑
甲基、3
’‑
叠氮基、3
’‑
叠氮基甲基、3
’‑
o-叠氮基烷基、3
’‑
o-乙炔基、3
’‑
o-氨基烷基、3
’‑
o-氟烷基、3
’‑
氟甲基、3
’‑
二氟甲基、3
’‑
三氟甲基、3
’‑
磺酰基、3
’‑
丙二酰基、3
’‑
氨基、3
’‑
o-氨基、3
’‑
巯基、3
’‑
氨基甲基、3
’‑
乙基、3’丁基、3
’‑
叔丁基、3
’‑
芴基甲氧基羰基、3’叔丁氧基羰基、3
’‑
o-烷基羟基氨基、3
’‑
硫代磷酸酯、和3-o-苄基或其衍生物。在一些实施方案中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。
325.在一些实施方案中，链终止部分是例如用化合物、光或热可从核苷酸臂切割/去除的。在一些实施方案中，链终止部分包括烷基、烯基、炔基或烯丙基基团，其可被四(三苯基膦)钯(0)(pd(pph3)4)、哌啶或2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq)切割。在一些实施方案
中，链终止部分包括可被pd/c切割的芳基或苄基基团。在一些实施方案中，链终止部分包括胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫基团或二硫基，其可被膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(dtt))切割。在一些实施方案中，链终止部分包括碳酸酯基团，该碳酸酯基团可被在meoh中的碳酸钾(k2co3)、在吡啶中的三乙胺或在乙酸(acoh)中的zn切割。在一些实施方案中，链终止部分包括脲或甲硅烷基基团，其可被四丁基氟化铵、吡啶-hf、氟化铵或三乙胺三氢氟酸盐切割。在一些实施方案中，链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团，其可被膦化合物切割。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
326.在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中所述核心或核苷酸碱基包括标记。在一些实施方案中，标记是可检测报告部分。聚合物-核苷酸缀合物可以具有一种或多种标记。可检测报告部分的示例包括但不限于荧光团、自旋标记、金属或金属离子、比色标记、纳米颗粒、pet标记、放射性标记或可以使所述组合物可通过检测大分子或分子相互作用领域中已知的此类方法检测的其他此类标记。可检测报告部分可以附接到核苷酸(例如通过附接至核苷酸的5’磷酸部分)、附接到颗粒本身(例如，附接到peg亚基)、附接到聚合物的末端、附接到中心部分，或附接到本领域技术人员将认识到的足以使所述组合物(例如颗粒)可通过本领域已知或本文别处描述的方法检测的、在所述聚合物-核苷酸缀合物内的任何其他位置。在一些实施方案中，提供一种或多种标记以对应或区分特定的聚合物-核苷酸缀合物。可检测报告部分可以是荧光团。在一些实施方案中，核心可以是亲和素样部分并且核心附接部分可以是生物素部分。
327.示例性聚合物-核苷酸缀合物和使用方法在2019年9月23日提交的美国申请号16/579,794中进行了描述，上述专利申请的内容特此通过引用明确并入本文以用于所有目的。
328.聚合物-核苷酸缀合物(聚合物-核苷酸缀合物)可用于将可检测信号定位到生化相互作用的活性区域，例如蛋白质-核酸相互作用、核酸杂交反应或酶促反应(例如聚合酶反应)的位点。例如，本文所述的聚合物-核苷酸缀合物可用于在聚合酶反应期间鉴定与模板结合的碱基位点或掺入延伸核酸链中的碱基位点，并为测序和基于阵列的应用提供碱基区分。当核苷酸与靶核酸互补时，靶核酸与多价结合组合物中的核苷酸之间增加的结合提供增强的信号，从而大大提高碱基判定准确度并缩短成像时间。
329.此外，聚合物-核苷酸缀合物的使用允许来自给定序列的测序信号源自包含多个靶序列拷贝的簇区之中。包括靶序列(例如多联体)的多个拷贝的测序方法具有的优点是信号可以被放大，因为在定义的区域内存在多个同时的测序反应，每个测序反应都提供自己的信号。定义的区域内多个信号的存在也减少了任何单个跳过循环的影响，因为来自大量正确碱基判定的信号会压倒来自较少数量的跳过或不正确碱基判定的信号，因此提供用于减少定相错误和/或提高测序反应中读段长度的方法。
330.本文公开的聚合物-核苷酸缀合物及其用途导致以下中的一项或多项：(i)与传统核酸扩增和测序方法相比，对于更高碱基判定准确度，信号更强；(ii)允许从背景信号中更好地区分序列特异性信号；(iii)减少对所必需起始材料量的要求，(iv)提高测序速率并缩短测序时间；(v)减少定相错误，和(vi)提高测序反应中的读段长度。
331.普通技术人员将认识到，在一系列迭代测序反应中，有时一个或多个位点在给定
循环期间将不能掺入核苷酸，从而导致一个或多个位点与延长的核酸链本体不同步。在测序信号来源于发生在靶核酸的单拷贝上的反应的条件下，这些掺入失败将在输出序列中产生各别错误。使用聚合物-核苷酸缀合物进行测序可以减少测序反应中的此类型错误。例如，通过在三元聚合酶复合物提早解离后提供增加的重新结合概率，使用能够与聚合酶-模板-引物复合物结合或能够掺入延长链中的多价底物，可以降低不掺入碱基的“跳过”循环的频率。因此，在一些实施方案中，本公开考虑使用如本文公开的多价底物，其包含具有游离的或经可逆修饰的5’磷酸、二磷酸或三磷酸部分的核苷酸，并且其中所述核苷酸通过不稳定或可切割的连接连接至如本文所公开的颗粒或聚合物。在一些实施方案中，本公开考虑因使用本文公开的多价底物而使得降低由于跳过掺入所导致的固有错误率。
332.本公开还考虑测序反应，其中来自给定序列或与给定序列相关的测序信号衍生自或源自包含靶序列的多个拷贝的可定义区域。结合靶序列的多个拷贝的测序方法具有的优点是信号可以被放大，因为在定义的区域内存在多个同时的测序反应，每个测序反应都提供自己的信号。定义的区域内多个信号的存在也减少了任何单个跳过循环的影响，因为来自大量正确碱基判定的信号会压倒来自较少数量的跳过或不正确碱基判定的信号。本公开进一步考虑在延伸反应期间或在延伸循环的单独部分期间包括游离的未标记的核苷酸，以便在先前循环中可能已经跳过的位点提供掺入。例如，在掺入循环期间或之后，可以添加未标记的封闭核苷酸，使得它们可以掺入跳过的位点。未标记的封闭核苷酸可以与附接到多价结合底物或在特定循环期间存在或曾存在的底物的核苷酸具有相同的类型，或可以包括1、2、3、4或更多种类型的未标记的封闭核苷酸的混合物。
333.当每个测序循环完美进行时，定义的区域内的每个反应都将提供相同的信号。然而，如本文别处所述，在一系列迭代测序反应中，有时一个或多个位点在给定循环期间将不能掺入核苷酸，从而导致一个或多个位点与延长的核酸链本体不同步。这个被称为“定相(phasing)”的问题会导致测序信号衰退，因为信号被来自已跳过一个或多个循环的位点的杂散信号污染。这进而又造成碱基鉴定错误的可能性。由于每个循环中测序信号的逐渐衰退，多个循环中跳过循环的逐渐累积也降低了有效读段长度。本公开的另一个目的是提供用于减少定相错误和/或提高测序反应中的读段长度的方法。
334.测序方法可以包括使包括多个连接或未连接的靶序列拷贝的一种或多种靶核酸与本文所述的多价结合组合物接触。使包括多个连接或未连接的靶序列拷贝的所述一种或多种靶核酸与一种或多种聚合物-核苷酸缀合物接触可以提供在给定测序循环中被询问的正确核苷酸的显著增加的局部浓度，因此抑制来自不当掺入或定相核酸链(即，具有一个或多个跳过循环的那些延长核酸链)的信号。
335.获得核酸序列信息的方法可以包括使一种靶核酸或多种靶核酸与一种或多种聚合物-核苷酸缀合物接触，其中所述一种靶核酸或多种靶核酸包括靶序列的多个连接或未连接的拷贝。所述方法导致测序错误率的降低，如通过碱基的错误鉴定、不存在碱基的报告或未能报告正确碱基的减少所指示的。在一些实施方案中，所述测序错误率的降低可以包括与使用单价配体(包括游离核苷酸、经标记的游离核苷酸、蛋白质或肽结合的核苷酸、或经标记的蛋白质或肽结合的核苷酸)观察到的错误率相比降低5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％或更多。
336.获得核酸序列信息的方法可以包括使一种靶核酸或多种靶核酸与一种或多种聚
合物-核苷酸缀合物接触，其中所述一种模板核酸或多种靶核酸包含靶序列的多个连接或未连接的拷贝。所述方法导致平均读段长度与使用单价配体(包括游离核苷酸、经标记的游离核苷酸、蛋白质或肽结合的核苷酸、或经标记的蛋白质或肽结合的核苷酸)观察到的平均读段长度相比增加5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％或更多。
337.获得核酸序列信息的方法，所述方法包括使一种靶核酸或多种靶核酸与一种或多种聚合物-核苷酸缀合物接触，其中所述一种靶核酸或多种靶核酸包含靶序列的多个连接或未连接的拷贝。所述方法导致平均读段长度与使用单价配体(包括游离核苷酸、经标记的游离核苷酸、蛋白质或肽结合的核苷酸、或经标记的蛋白质或肽结合的核苷酸)观察到的平均读段长度相比增加10、20、25、30、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、500个核苷酸。
338.使用聚合物-核苷酸缀合物进行测序有效地缩短了测序时间。包括接触、检测和掺入步骤的测序反应循环在约5分钟至约60分钟的总时间范围内进行。在一些实施方案中，测序反应循环在至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟内进行。在一些实施方案中，测序反应循环在至多60分钟、至多50分钟、至多40分钟、至多30分钟、至多20分钟、至多10分钟或至多5分钟内进行。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些实施方案中，测序反应循环可以在约10分钟至约30分钟的总时间范围内进行。本领域技术人员将认识到测序循环时间可以具有该范围内的任何值，例如约16分钟。
339.使用聚合物-核苷酸缀合物进行测序提供了更准确的碱基读出。所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于测序运行中碱基判定准确度将提供在约20至约50范围内的平均q得分。在一些实施方案中，平均q得分为至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。本领域技术人员将认识到，平均q得分可以具有在该范围内的任何值，例如约32。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于30的q得分。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于35的q得分。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于40的q得分。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于45的q得分。在一些实施方案中，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于被鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于50的q得分。
340.本公开涉及聚合物-核苷酸缀合物，其各自都具有缀合至颗粒或核心(例如，聚合物、支化聚合物、树枝状大分子或等效结构)的多个核苷酸。使聚合物-核苷酸缀合物与聚合酶和引发的靶核酸接触可导致形成可被检测的三元复合物，进而实现靶核酸碱基的更准确
的确定。
341.当使用聚合物-核苷酸缀合物代替单个未缀合或未拴系的核苷酸与聚合酶和靶核酸形成复合物时，核苷酸的局部浓度增加了许多倍，这进而又增强了信号强度，特别是相比于错配的正确信号。本文所述的聚合物-核苷酸缀合物可以包括用于与靶核酸相互作用的至少一种聚合物-核苷酸缀合物。多价组合物还可以包括两种、三种或四种不同的聚合物-核苷酸缀合物，每种具有缀合至颗粒的不同核苷酸。
342.在具有聚合物-核苷酸缀合物形式或核心-核苷酸缀合物形式的聚合物-核苷酸缀合物中，相同核苷酸的多个拷贝可以与颗粒共价结合或非共价结合。颗粒的示例可以包括支化聚合物；树枝状大分子；交联聚合物颗粒，例如琼脂糖、聚丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、氰基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯颗粒；玻璃颗粒；陶瓷颗粒；金属颗粒；量子点；脂质体；乳液颗粒或本领域已知的任何其他颗粒(例如，纳米颗粒、微粒等)。在一个优选的实施方案中，颗粒是支化聚合物。
343.核苷酸可以通过接头连接到颗粒或核心，并且核苷酸可以附接到聚合物的一个末端或位置。核苷酸可以通过核苷酸的碱基或5’端与颗粒缀合。在一些聚合物-核苷酸缀合物中，一个核苷酸附接到聚合物的一个末端或位置。在一些聚合物-核苷酸缀合物中，多个核苷酸附接到聚合物的一个末端或位置。缀合的核苷酸可在空间上触及一个或多个蛋白质、一个或多个酶和核苷酸结合部分。在一些实施方案中，核苷酸可以与核苷酸结合部分例如聚合酶分开提供。在一些实施方案中，接头不包括光发射基团或光吸收基团。
344.颗粒或核心也可以具有结合部分。在一些实施方案中，颗粒或核心可以在不使用单独的相互作用部分的情况下自缔合。在一些实施方案中，颗粒或核心可由于缓冲条件或盐条件而自缔合，例如，在羟基磷灰石颗粒的钙介导的相互作用、胶束或脂质体的脂质或聚合物介导的相互作用、或金属(如铁或金)纳米颗粒的盐介导的聚集的情况下。
345.聚合物-核苷酸缀合物可以具有一个或多个标记(例如，可检测的报告部分)。标记的示例包括但不限于荧光团、自旋标记、金属或金属离子、比色标记、纳米颗粒、pet标记、放射性标记或可以使所述组合物可通过检测大分子或分子相互作用领域中已知的方法此类检测的其他此类标记。标记可以附接到核苷酸(例如通过附接至核苷酸的碱基或5’磷酸部分)、附接到颗粒本身(例如，附接到peg亚基)或附接到核心(例如，附接到链霉亲和素核心)、附接到聚合物的末端、附接到中心部分，或附接到本领域技术人员将认识到足以使所述组合物例如颗粒可通过本领域已知或本文别处描述的方法检测的、在所述聚合物-核苷酸缀合物内的任何其他位置。在一些实施方案中，提供一种或多种标记以对应或区分特定的聚合物-核苷酸缀合物。
346.聚合物-核苷酸缀合物(例如，聚合物-核苷酸缀合物)的一个示例是聚合物-核苷酸缀合物。支化聚合物的示例包括聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚甘氨酸、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖或其他此类聚合物。在一个实施方案中，聚合物是peg。在另一个实施方案中，聚合物可以具有peg分支。
347.合适的聚合物的特征可以在于重复单元，所述重复单元具有适于衍生化的官能团，例如胺、羟基、羰基或烯丙基。聚合物还可以具有一个或多个预衍生的取代基，使得一个或多个特定的亚单元包括衍生位点或分支位点，而不管其他亚单元是否包括相同的位点、取代基或部分。预衍生的取代基可包含或可还包含例如核苷酸、核苷、核苷酸类似物、标记
(例如荧光标记、放射性标记或自旋标记)、相互作用部分、另外的聚合物部分等，或前述的任何组合。
348.在聚合物-核苷酸缀合物(例如，聚合物-核苷酸缀合物)中，聚合物可以具有多个分支。支化聚合物可以具有多种构型，包括但不限于星状(“星爆”)形式、聚集的星状(“螺旋滑梯”)形式、瓶刷状或树枝状大分子。支化聚合物可以从中心附接点或中心部分辐射，或可以包括多个分支点，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个分支点。在一些实施方案中，聚合物的每个亚单元可以任选地构成单独的分支点。
349.在聚合物-核苷酸缀合物中，分支的长度和大小可以根据聚合物的类型而不同。在一些支化聚合物中，分支的长度可为1至1,000nm、1至100nm、1至200nm、1至300nm、1至400nm、1至500nm、1至600nm、1至700nm、1至800nm、或1至900nm、或更大，或具有落入本文公开的任何值之内或之间的长度。在一些支化聚合物中，分支可以具有对应于如下表观分子量的大小：1k、2k、3k、4k、5k、10k、15k、20k、30k、50k、80k、100k，或上述任何两个所定义范围内的任何值。聚合物的表观分子量可以由代表性数目的亚单元的已知分子量计算，如通过尺寸排阻色谱法测定、如通过质谱法测定、或如通过本领域已知的任何其他方法测定。聚合物可以有多个分支。聚合物中的分支数可以是2、3、4、5、6、7、8、12、16、24、32、64、128或更多，或落入由这些值中的任何两个定义的范围内的数量。
350.对于聚合物-核苷酸缀合物(例如，聚合物-核苷酸缀合物)，具有4、8、16、32或64个分支的支化聚合物可以具有连接到peg分支末端的核苷酸，使得每个末端附接有0、1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸。在一个非限制性示例中，具有3至128个peg臂的支化聚合物在聚合物分支末端附接一个或多个核苷酸，使得每个末端附接有0、1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，支化聚合物或树枝状大分子具有偶数个臂。在一些实施方案中，支化聚合物或树枝状大分子具有奇数个臂。
351.在聚合物-核苷酸缀合物(例如，聚合物-核苷酸缀合物)中，聚合物的每个分支或分支的子集可以附接有包含核苷酸(例如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤残基或其衍生物或模拟物)的部分，并且该部分能够结合聚合酶、逆转录酶或其他核苷酸结合结构域。任选地，核苷酸部分可以能够结合聚合酶-模板-引物复合物但不掺入，或可以在聚合酶反应期间掺入延长的核酸链中。在一些实施方案中，核苷酸部分包括链终止部分，其在聚合酶介导的反应期间阻断后续核苷酸的掺入。在一些实施方案中，核苷酸部分可以是未封闭的(可逆封闭的)，使得随后的核苷酸在聚合酶反应期间不能掺入延长的核酸链中，直到这种封闭被去除，之后随后的核苷酸能够在聚合酶反应期间被掺入延长的核酸链中。
352.聚合物-核苷酸缀合物还可在每个分支或分支子集中具有结合部分。结合部分的一些示例包括但不限于生物素、亲和素、链霉亲和素等、聚组氨酸结构域、互补配对的核酸结构域、g-四联体形成核酸结构域、钙调蛋白、麦芽糖结合蛋白、纤维素酶、麦芽糖、蔗糖、谷胱甘肽-s-转移酶、谷胱甘肽、o-6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶、苄基鸟嘌呤及其衍生物、苄基半胱氨酸及其衍生物、抗体、表位、蛋白a、蛋白g。结合部分可以是本领域已知的用于结合或促进蛋白质之间、蛋白质与配体之间、蛋白质与核酸之间、核酸之间或小分子相互作用结构域或部分之间的相互作用的任何相互作用分子或其片段。
353.在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物可以包括互补相互作用部分的一个或多个元件。示例性的互补相互作用部分包括例如生物素和亲和素；snap-苄基鸟苷；抗体或
fab和表位；igg fc和蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或蛋白l；麦芽糖结合蛋白和麦芽糖；凝集素和同源多糖；离子螯合部分、互补核酸、能够形成三重或三螺旋相互作用的核酸；能够形成g-四联体的核酸等。本领域技术人员将容易地认识到存在许多配对部分并且通常针对它们的特性(即它们彼此之间强烈且特异性地相互作用)而使用；因此，任何此类互补对或组被认为适用于构建或构想本公开的组合物的此目的。在一些实施方案中，本文公开的组合物可包括其中互补相互作用部分的一个元件附接到一个分子或多价配体，并且互补相互作用部分的另一个元件附接到单独的分子或多价配体的组合物。在一些实施方案中，如本文所公开的组合物可包括其中互补相互作用部分的两个或所有元件均附接至单个分子或多价配体的组合物。在一些实施方案中，如本文所公开的组合物可包括其中互补相互作用部分的两个或所有元件均附接至单个分子或多价配体的单独臂或位置的组合物。在一些实施方案中，如本文所公开的组合物可包括其中互补相互作用部分的两个或所有元件均附接至单个分子或多价配体的相同臂或位置的组合物。在一些实施方案中，包括互补相互作用部分的一个元件的组合物和包括互补相互作用部分的另一个元件的组合物可以同时或依次混合。在一些实施方案中，如本文所公开的分子或颗粒之间的相互作用允许多个分子或颗粒的缔合或聚集，从而例如增加可检测信号。在一些实施方案中，荧光、比色或放射性信号被增强。在其他实施方案中，预期本文公开的或本领域已知的其他相互作用部分。在一些实施方案中，可以提供如本文提供的组合物，使得包括第一相互作用部分(例如，一个或多个咪唑或吡啶部分)的一个或多个分子和包括第二相互作用部分(例如组氨酸残基)的一个或多个另外的分子同时或依次混合。在一些实施方案中，所述组合物包括1、2、3、4、5、6或更多个咪唑或吡啶部分。在一些实施方案中，所述组合物包括1、2、3、4、5、6或更多个组氨酸残基。在这样的实施方案中，所提供的分子或颗粒之间的相互作用可以通过诸如镍、锰、镁、钙、锶等的二价阳离子的存在来促进。在一些实施方案中，例如，(his)3基团可以通过镍或锰离子的配位与另一个分子或颗粒上的(his)3基团相互作用。
354.聚合物-核苷酸缀合物可包含一种或多种缓冲液、盐、离子或添加剂。在一些实施方案中，代表性的添加剂可以包括，但不限于，甜菜碱、亚精胺、去污剂(例如triton x-100、tween 20、sds或np-40)、乙二醇、聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯醇、乙烯醇、甲基纤维素、肝素，硫酸乙酰肝素、甘油、蔗糖、1,2-丙二醇、dmso、n,n,n-三甲基甘氨酸、乙醇、乙氧基乙醇、丙二醇、聚丙二醇、嵌段共聚物(例如pluronic(r)系列聚合物)、精氨酸、组氨酸、咪唑或其任何组合，或本领域已知作为dna“松弛剂”(一种化合物，具有以下效果：改变dna持续长度、改变聚合物内连接点或交叉点的数量或改变dna分子的构象动力学，从而增加链内位点对dna结合部分的可及性)的任何物质。
355.聚合物-核苷酸缀合物可以包含两性离子化合物作为添加剂。更多有代表性的添加剂可以在lorenz,t.c.j.vis.exp.(63),e3998,doi:10.3791/3998(2012)(将其通过引用并入本文)关于其公开的用于促进核酸结合或动力学，或促进涉及核酸的操作、使用或储存的过程的添加剂中找到。
356.在一些实施方案中，多价结合组合物包含至少一种阳离子，其可包括但不限于钠、镁、锶、钡、钾、锰、钙、锂、镍、钴或本领域已知的其他此类阳离子以促进核酸相互作用，例如自缔合、二级或三级结构形成、碱基配对、表面缔合、肽缔合、蛋白质结合等。
357.当使用聚合物-核苷酸缀合物代替未缀合或未拴系的核苷酸与聚合酶和靶核酸形
成复合物时，核苷酸的局部浓度增加了许多倍，这进而又增强了信号强度，特别是相比于错配的正确信号。本公开考虑使聚合物-核苷酸缀合物与聚合酶和引发的靶核酸接触以确定三元结合复合物的形成。
358.由于聚合物-核苷酸缀合物上核苷酸的局部浓度增加，当核苷酸与靶核酸的下一个碱基互补时，聚合酶、引发的靶链和核苷酸之间的结合变得更有利。形成的结合复合物具有更长的持续时间，这进而有助于缩短成像步骤。使用聚合物-核苷酸缀合物产生的高信号强度在整个结合和成像步骤中得以保持。聚合酶、引发的靶链和核苷酸或核苷酸类似物之间的强结合也意味着形成的结合复合物在洗涤步骤期间将保持稳定，并且当其他反应混合物和不匹配的核苷酸类似物被洗掉时，信号将保持在高强度。在成像步骤之后，可以使结合复合物不稳定，然后可以将引发的靶核酸延伸一个碱基。延伸后，可以使用聚合物-核苷酸缀合物再次重复结合和成像步骤以确定下一个碱基的身份。
359.本公开的组合物和方法提供了建立和保持三元酶复合物(例如，在测序期间)的稳健且可控的手段，也提供了可以鉴定和/或测量所述复合物的存在的大大改善的手段，以及可以控制所述复合物的持久性的手段。这为诸如在核酸测序应用中确定n 1碱基的身份等问题提供了重要的解决方案。
360.无意受任何特定理论的束缚，已观察到本文公开的多价结合组合物与聚合酶核苷酸复合物在具有时间依赖性但比游离溶液中的核苷酸已知可获得的缔合速率慢得多的速率下缔合以形成三元结合复合物。因此，缔合速率(kon)出人意料地比单核苷酸或未附接到多价配体复合物的核苷酸的缔合速率慢得多。然而，重要的是，多价配体复合物的解离速率(koff)比针对游离溶液中核苷酸观察到的解离速率慢得多。因此，本公开的多价配体复合物对三元聚合酶-多核苷酸-核苷酸复合物的持久性提供了出人意料且有益的改善(特别是相对于与游离核苷酸形成的复合物)，使得例如显著提高核酸测序应用的成像质量，优于目前可用的方法和试剂。重要的是，本文所公开的多价底物的这种性质使得可见三元配合物的形成是可控的，从而可以进行随后的可视化、修饰或处理步骤，而无须考虑复合物的解离——也就是说，复合物可以根据需要形成、成像、修饰或以其他方式使用，并且将保持稳定，直到使用者执行确认的解离步骤，例如将复合物暴露于解离缓冲液中。
361.在各种实施方案中，适用于本文所述的结合相互作用(例如，在测序期间)的聚合酶可包括本领域已知的或可能已知的任何聚合酶。示例性聚合酶可包括但不限于：klenow dna聚合酶、水生栖热菌dna聚合酶i(taq聚合酶)、klentaq聚合酶和噬菌体t7 dna聚合酶；人类α、δ和εdna聚合酶；噬菌体聚合酶，例如t4、rb69和phi29噬菌体dna聚合酶、激烈火球菌dna聚合酶(pfu聚合酶)；枯草芽孢杆菌dna聚合酶iii，以及大肠杆菌dna聚合酶iiiα和ε；9
°
n聚合酶、逆转录酶例如hiv m型或o型逆转录酶、禽成髓细胞血症病毒逆转录酶或莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)逆转录酶或端粒酶。dna聚合酶的其他非限制性示例可以包括来自各种古细菌属(例如，气火菌属、古生球菌属、除硫球菌属、火棒菌属、火球菌属、火叶菌属、热网菌属、葡萄热菌属、斯梯特氏菌属、硫化叶菌属、高温球菌属和火山鬃菌属等)的那些dna聚合酶或其变体，包括本领域已知的聚合酶，例如vent
tm
、deepvent
tm
、pfu、kod、pfx、therminator
tm
和tgo聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是klenow聚合酶。
362.当聚合物-核苷酸缀合物上的核苷酸与靶核酸互补时相比于非互补核苷酸时，三元复合物具有更长的持续时间。当聚合物-核苷酸缀合物上的核苷酸与靶核酸互补时相比
于未缀合或拴系的互补核苷酸，三元复合物也具有更长的持续时间。例如，在一些实施方案中，所述三元复合物的持续时间可以不到1s、超过1s、超过2s、超过3s、超过5s、超过10s、超过15s、超过20s、超过30s、超过60s、超过120s、超过360s、超过3600s或更长，或在由这些值中的任何两个或更多个定义的范围内的时间。
363.例如，可以通过观察结合复合物的开始和/或持续时间，例如通过观察来自结合复合物的经标记组分的信号来测量持续时间。例如，经标记的核苷酸或包含一个或多个核苷酸的经标记的试剂可以存在于结合复合物中，从而允许在结合复合物的持续时间内检测来自标记的信号。
364.已经观察到，使用不同的盐或离子可实现不同范围的持续时间，表明，例如，在例如镁的存在下形成的复合物比与其他离子形成的复合物形成得更快。还观察到，在存在例如锶的情况下形成的复合物容易地形成并且在撤出离子后或在用缺乏本发明组合物的一种或多种组分(例如，聚合物和/或一种或多种核苷酸，和/或一种或多种相互作用部分)的缓冲液或含有例如螯合剂(其可引起或加速从含有多价试剂的复合物中去除二价阳离子)的缓冲液洗涤后完全解离或基本完全解离。因此，在一些实施方案中，本公开的组合物包含镁。在一些实施方案中，本公开的组合物包含钙。在一些实施方案中，本发明的组合物包含锶或钡。在一些实施方案中，本公开的组合物包含钴。在一些实施方案中，本公开的组合物包含mgcl2。在一些实施方案中，本公开的组合物包含cacl2。在一些实施方案中，本公开的组合物包含srcl2。在一些实施方案中，本公开的组合物包含cocl2。在一些实施方案中，组合物不包含或基本上不包含镁。在一些实施方案中，组合物不包含或基本上不包含钙。在一些实施方案中，本公开的方法提供使一种或多种核酸与本文公开的一种或多种组合物的接触，其中所述组合物缺乏钙或镁中的一种，或缺乏钙和镁两者。
365.三元复合物的解离可以通过改变缓冲条件来控制。在成像步骤之后，使用盐含量增加的缓冲液使三元复合物解离，从而可以洗掉经标记的聚合物-核苷酸缀合物，从而提供一种可以例如在一个测序周期和下一个测序周期之间的转换中衰减或终止信号的手段。在一些实施方案中，这种解离可以通过用缺乏必需金属或辅因子的缓冲液洗涤复合物来实现。在一些实施方案中，出于保持ph控制的目的，洗涤缓冲液可以包含一种或多种组合物。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可包含一种或多种单价阳离子，例如钠。在一些实施方案中，洗涤缓冲液缺少或基本缺少二价阳离子，例如不具有或基本不具有锶、钙、镁或锰。在一些实施方案中，洗涤缓冲液还包含螯合剂，例如edta、egta、次氮基三乙酸、聚组氨酸、咪唑等。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可以将环境的ph维持在与结合复合物相同的水平。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可以相对于针对结合复合物所见的水平升高或降低环境的ph。在一些实施方案中，ph可以在2-4、2-7、5-8、7-9、7-10的范围内，或低于2，或高于10，或由本文提供的任何两个值定义的范围内。
366.特定离子的添加可影响聚合酶与引发的靶核酸的结合、三元复合物的形成、三元复合物的解离，或例如在聚合酶反应期间一个或多个核苷酸至延长核酸中的掺入。在一些实施方案中，相关阴离子可包括氯离子、乙酸根、葡萄糖酸根、硫酸根、磷酸根等。在一些实施方案中，可以通过添加一种或多种酸、碱或盐，例如nicl2、cocl2、mgcl2、mncl2、srcl2、cacl2、caso4、srco3、bacl2等，将离子包含在本公开的组合物中。代表性的盐、离子、溶液和条件可以在remington:the science and practice of pharmacy,第20版,gennaro,a.r.,
ed.(2000)(其通过引用以其整体并入本文)，特别是关于第17章和盐、离子、盐溶液和离子溶液的相关公开内容中找到。
367.本公开考虑使聚合物-核苷酸缀合物与一种或多种聚合酶接触。可以任选地在一种或多种靶核酸存在下进行接触。在一些实施方案中，所述靶核酸是单链核酸。在一些实施方案中，靶核酸与核酸引物杂交。在一些实施方案中，所述靶核酸是双链核酸。在一些实施方案中，所述接触包括使聚合物-核苷酸缀合物与一种聚合酶接触。在一些实施方案中，所述接触包括使包含一种或多种核苷酸的所述组合物与多种聚合酶接触。聚合酶可以与单个核酸分子结合。
368.靶核酸和聚合物-核苷酸缀合物之间的结合可以在已经变得不具有催化活性的聚合酶的存在下提供。在一个实施方案中，聚合酶可已经通过突变而变得不具有催化活性。在一个实施方案中，聚合酶可已经通过化学修饰而变得不具有催化活性。在一些实施方案中，聚合酶可由于缺少必要的底物、离子或辅因子而变得不具有催化活性。在一些实施方案中，聚合酶可已经由于不存在镁离子而被变得不具有催化活性。
369.靶核酸和聚合物-核苷酸缀合物之间的结合在聚合酶存在下发生，其中结合溶液、反应溶液或缓冲液缺乏催化性离子，例如镁或锰。可替代地，靶核酸和聚合物-核苷酸缀合物之间的结合在聚合酶存在下发生，其中结合溶液、反应溶液或缓冲液包含非催化性离子例如锶、钡或钙。
370.当不具有催化活性的聚合酶用于帮助核酸与多价结合组合物相互作用时，所述组合物和所述聚合酶之间的相互作用使三元复合物稳定，从而使复合物可通过荧光或通过本文公开的或本领域已知的其他方法检测。未结合的聚合物-核苷酸缀合物可任选地在检测三元结合复合物之前被洗掉。
371.使一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸缀合物在含有钙或镁中的一个或含有钙和镁两者的溶液中接触。可替代地，一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸缀合物在缺乏钙或镁中的一种，或缺乏钙或镁两者的溶液中，并且在单独的步骤(不考虑步骤的顺序)中接触，向溶液中加入钙或镁中的一种，或加入钙和镁两者。在一些实施方案中，使一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸缀合物在缺乏锶或钡的溶液中接触，并且包括在单独的步骤中(不考虑步骤的顺序)，向溶液中添加锶。
372.本文提供了用于分析核酸的方法，所述方法包括通过以下来确定固定的靶核酸分子(例如，多联体分子)的序列：(1)在一定条件下使固定的多联体分子与(i)多个聚合酶，(ii)多个核苷酸，和(iii)与测序引物结合序列杂交的多个测序引物接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与固定的多联体分子的一部分结合，并且适于将核苷酸中的至少一个在与固定的多联体分子中的互补核苷酸相反的位置结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入测序引物的3’端；(2)检测和鉴定掺入的核苷酸，从而确定固定的多联体分子的序列；以及(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次。在一些实施方案中，确定固定的多联体分子的序列包括对靶序列和空间条形码序列进行测序。在一些实施方案中，适于将来自多个核苷酸的至少一个核苷酸结合到杂交的测序引物的3’端并适于将结合的核苷酸掺入杂交的测序引物(步骤(1))的条件包括至少一种催化性阳离子，包括镁和/或锰。
373.在一些实施方案中，用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法还包括步骤
(g)：对核酸多联体的至少一部分进行测序，包括对靶序列和空间条形码序列进行测序，以确定靶核酸在细胞生物样品中的空间位置。
374.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括使用包括大于1.0mm2的视场(fov)的光学成像系统对核酸多联体的至少一部分进行测序。在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括将细胞生物样品置于流动池中，该流动池具有壁(例如，顶壁或第一壁，以及底壁或第二壁)和中间的缺口，其中可以使用流体填充缺口，其中将流动池定位于荧光光学成像系统中。当使用传统成像系统时，细胞生物样品的厚度可能需要使用成像系统分别聚焦在流动池的第一和第二表面上。为了改善对来自细胞生物样品的核酸的测序反应的成像，可以将流动池放置在高性能荧光成像系统中，该系统包括两个或更多个镜筒透镜，这些镜筒透镜被设计用于在两个或更多个荧光波长下为流动池的第一和第二表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，高性能成像系统还包括聚焦机构，该聚焦机构被配置为在采集流动池的第一表面和第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，高性能成像系统被配置为对第一流动池表面或第二流动池表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。
375.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：使多个核酸多联体与多个测序引物、多个聚合酶和多个多价分子接触，其中每个多价分子包含通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复(图5a和5b)。
376.在一些实施方案中，多价分子包含与颗粒(或核心)结合的多个核苷酸，所述颗粒(或核心)是例如聚合物、支化聚合物、树枝状大分子(图5c)、胶束、脂质体、微粒、纳米颗粒、量子点或本领域已知的其他合适的颗粒。
377.在一些实施方案中，多价分子包括：(a)核心，和(b)多个核苷酸臂，其包含(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头，和(iv)核苷酸单元，其中核心附接到多个核苷酸臂(图5a-图5d和6a-图6b)。在一些实施方案中，间隔子附接至接头。在一些实施方案中，接头附接至核苷酸单元。在一些实施方案中，核苷酸单元包括碱基、糖和至少一个磷酸基团，并且其中接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施方案中，接头包括脂族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链均具有2-6个亚基并且任选地接头包含芳香族部分。
378.在一些实施方案中，多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心，并且其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元，其选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
379.在一些实施方案中，多价分子还包括多个多价分子，其包括具有两种或更多种不同类型的核苷酸的多价分子的混合物，所述核苷酸选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
380.在一些实施方案中，多价分子包含与多个核苷酸臂附接的核心，并且其中各个核苷酸臂包括在糖2’位置、糖3’位置、或在糖的2’和3’位置具有链终止部分(例如，封闭部分)的核苷酸单元。
381.在一些实施方案中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，链终止部分选自3
’‑
脱氧核苷酸、2’,3
’‑
双脱氧核苷酸、3
’‑
甲基、3
’‑
叠氮基、3
’‑
叠氮基甲基、3
’‑
o-叠氮基烷基、3
’‑
o-乙炔基、3
’‑
o-氨基烷基、3
’‑
o-氟烷基、3
’‑
氟甲基、3
’‑
二氟甲基、3
’‑
三氟甲基、3
’‑
磺酰基、3
’‑
丙二酰基、3
’‑
氨基、3
’‑
o-氨基、3
’‑
巯基、3
’‑
氨基甲基、3
’‑
乙基、3’丁基、3
’‑
叔丁基、3
’‑
芴基甲氧基羰基、3
’‑
叔丁氧基羰基、3
’‑
o-烷基羟基氨基、3
’‑
硫代磷酸酯和3-o-苄基或其衍生物。
382.在一些实施方案中，链终止部分可从核苷酸单元切割/去除。
383.在一些实施方案中，链终止部分是可用膦化合物切割的叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
384.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中该核心用可检测的报告部分标记。在一些实施方案中，可检测的报告部分包含荧光团。
385.在一些实施方案中，多价分子的核心包含类亲和素部分，且核心附接部分包含生物素。
386.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：(1)在一定条件下使多个核酸多联体与(i)多个聚合酶，(ii)至少一个多价分子，其包含通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，以及(iii)与多联体的一部分杂交的多个测序引物接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与核酸多联体分子中的一个的一部分结合，并且适于将多价分子的至少一个核苷酸部分在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置的结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸部分不掺入测序引物中；(2)检测和鉴定多价分子的结合核苷酸部分，从而确定多联体分子的序列；(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次；(4)在一定条件下使多联体分子与(i)多个聚合酶和(ii)多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶结合到多联体分子的至少一部分并且适于将多个核苷酸中的至少一个核苷酸在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置结合到杂交的测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入杂交的测序引物中；(5)任选地检测掺入的核苷酸；(6)任选地鉴定掺入核苷酸，从而确定或确认多联体的序列；以及(7)将步骤(1)
–
(6)重复至少一次。
387.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：(1)在一定条件下使多个固定的多联体和与测序引物结合序列杂交的多个测序引物、多个聚合酶和多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与固定的多联体的一部分结合，并且适于将核苷酸中的至少一个在与固定的多联体中的互补核苷酸相反位置结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入测序引物的3’端；(2)检测和鉴定掺入的核苷酸，从而确定固定的多联体分子的序列；以及(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次。在一些实施方案中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含在糖2’或3’位置的链终止部分。在一些实施方案中，链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团，其可被膦化合物切割。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
388.原位单细胞测序。本发明提供了一种用于原位分析细胞生物样品中的核酸的方法，其中细胞生物样品的细胞包括细胞rna和样品中至少一个具有靶rna的细胞，所述方法包括步骤(a)：在适于生成至少一个对应于靶rna的cdna的条件下，在细胞生物样品中进行逆转录反应，其中所述合适的条件包括使至少一个细胞中的靶rna与(i)高效杂交缓冲液，(ii)逆转录酶，(iii)多个核苷酸，以及(iv)多个结合靶rna的至少一部分的逆转录酶引物接触。
389.在一些实施方案中，细胞生物样品包括新鲜、冷冻、新鲜冷冻或存档的样品(例如，经福尔马林固定石蜡包埋；ffpe)。
390.在一些实施方案中，至少一些靶rna保留在细胞生物样品的细胞内。在一些实施方案中，靶rna未固定在细胞生物样品外部的任何类型的载体上。
391.在一些实施方案中，处理细胞生物样品以固定包括靶rna的核酸在样品细胞内的位置。例如，细胞生物样品可以用福尔马林处理。细胞生物样品可以用甲醛、乙醇、甲醇或苦味酸处理。细胞生物样品可以包埋在石蜡中。
392.在一些实施方案中，可将步骤(a)中的多个逆转录酶引物改性，使其与细胞结合或与细胞中的细胞组分结合，使得通过进行逆转录酶反应生成的cdna与细胞组分结合并保留在细胞中。例如，可将逆转录酶引物改性以在其5’端包含反应部分，或逆转录酶引物可包含经改性以包含反应部分的核苷酸残基。反应部分包括亲核官能团(例如胺、醇、硫醇和酰肼)，亲电官能团(例如，醛、酯、环氧化物、异氰酸酯、马来酰亚胺和乙烯基酮)，能够进行环加成反应、形成二硫键或与金属结合的官能团。反应部分包括伯胺或仲胺、低级烷基胺基团、乙酰基、羟肟酸、n-羟基琥珀酰亚胺基酯、n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、马来酰亚胺、氧羰基咪唑、硝基苯酯、三氟乙酯、缩水甘油醚或乙烯基砜。反应部分包括亲和结合基团，例如生物素。反应部分包括荧光素或吖啶。
393.在一些实施方案中，步骤(a)的逆转录反应包含多个核苷酸和具有逆转录活性的酶，包括来自amv(禽成髓细胞血症病毒)、m-mlv(莫罗尼鼠白血病病毒)或hiv(人类免疫缺陷病毒)的逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶可以是市售酶，包括multiscribe
tm
、thermoscript
tm
或arrayscript
tm
。在一些实施方案中，逆转录酶包含superscripti、ii、iii或iv酶。在一些实施方案中，逆转录反应可包括rnase抑制剂。在一些实施方案中，多个逆转录引物对核糖核酸酶降解具有抗性。例如，可将逆转录引物改性以包括两个或更多个硫代磷酸酯键，或2
’‑
o-甲基、2’氟碱基、磷酸化3’端或锁定核酸残基。
394.在一些实施方案中，步骤(a)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其介电常数不大于40且极性指数为4-9；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于高效杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲体系，其将高效杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8的范围内；和(iv)足以增强或促进分子拥挤的量的拥挤剂。在一些实施方案中，步骤(a)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为25-50％的乙腈；(ii)第二极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5-10％的甲酰胺；(iii)ph缓冲体系，其包含2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph为5-6.5；和(iv)拥挤剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5-35％的聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液还包含甜菜碱。
395.在一些实施方案中，步骤(a)的高效杂交缓冲液促进核酸杂交反应的高严格性(例如，特异性)、速度和效率，并提高后续扩增和测序步骤的效率。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液显著缩短核酸杂交时间，并降低样品输入要求。核酸退火可以在等温条件下进行，并消除了用于退火的冷却步骤。
396.在一些实施方案中，用于原位分析细胞生物样品中的核酸的方法还包括步骤(b)：降解一些或全部细胞rna并至少保留细胞生物样品的细胞膜。在一些实施方案中，用核糖核酸酶降解细胞rna。
397.在一些实施方案中，用于原位分析细胞生物样品中的核酸的方法还包括步骤(c)：使至少一个cdna与多个锁式探针接触，每个锁式探针包含两个末端区，其与至少一个cdna的部分结合以生成至少一个具有与cdna的相邻区杂交的两个探针末端区的cdna-锁式探针复合物以形成断口或缺口。
398.在一些实施方案中，步骤(c)的锁式探针包含单个寡核苷酸链，该单个寡核苷酸链在其5’末端和3’末端包括与靶核酸分子(例如，rna)的连续区互补的靶捕获序列。锁式探针还可以包含两个或更多个衔接子序列的任何一个或任何组合，衔接子序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、固定化序列和/或样品索引序列。各种衔接子序列可以位于任何区域，例如锁式探针的内部部分。锁式探针的5’和3’端可以与靶核酸分子上的相邻位置杂交，以形成开放的环状分子，在杂交的5’和3’端之间有断口或缺口。
399.在一些实施方案中，用于原位分析细胞生物样品中的核酸的方法还包括步骤(d)：在至少一个cdna-锁式探针复合物上进行缺口填充反应和/或连接反应，以生成共价闭合的环状锁式探针。
400.在一些实施方案中，缺口填充反应包括将开放的环状分子与dna聚合酶和多个核苷酸接触，其中dna聚合酶包括大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段、t7 dna聚合酶或t4 dna聚合酶。在一些实施方案中，连接反应包括使用连接酶，包括t3、t4、t7或taq dna连接酶。
401.在一些实施方案中，用于原位分析细胞生物样品中的核酸的方法还包括步骤(e)：在环状锁式探针上进行滚环扩增反应，以生成多个核酸多联体。
402.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应包括在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，将共价闭合的环状锁式探针(例如，环状核酸模板分子(多个))与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
403.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应包括：(1)将共价闭合的环状锁式探针(例如，环状核酸模板分子(多个))与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种不促进聚合酶催化的核苷酸掺入扩增引物的非催化性二价阳离子接触，其中，非催化性二价阳离子包括锶或钡；和(2)在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环状锁式探针与至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
404.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应在室温至约50℃或室温至约65℃的恒定温度(例如等温)下进行。
405.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应可在存在多个压实寡核苷酸的情况下进行，所述压实寡核苷酸压实固定的多联体的尺寸和/或形状以形成固定的压实纳米球。
406.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应包括具有链置换活性的dna聚合酶，其选自phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶，或deep vent dna聚合酶。在一些实施方案中，phi29 dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)、或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)和嵌合型qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
407.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中mda反应包括将至少一种核酸多联体与至少一种包含随机序列的扩增引物、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸，以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。
408.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实
施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中mda反应包括使至少一种核酸多联体与dna引发酶-聚合酶、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸，以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。在一些实施方案中，dna引发酶-聚合酶包含具有dna聚合酶和rna引发酶活性的酶。dna引发酶-聚合酶可利用脱氧核糖核苷酸三磷酸以模板序列依赖性方式在单链dna模板上合成dna引物，并可在存在催化性二价阳离子(例如，镁和/或锰)的情况下通过核苷酸聚合(例如，引物延伸)延伸引物链。dna引发酶-聚合酶包括属于类dnag引发酶(例如，细菌)和类aep引发酶(古细菌和真核生物)成员的酶。一种示例性的dna引发酶-聚合酶是来自嗜热栖热菌(thermus thermophilus)hb27的tth primpol。
409.在一些实施方案中，用于原位分析细胞生物样品中的核酸的方法还包括步骤(f)：对核酸多联体的至少一部分进行测序。在一些实施方案中，测序包括使用光学成像系统对核酸多联体的至少一部分进行测序，该光学成像系统包括大于1.0mm2的视场(fov)。
410.在一些实施方案中，步骤(f)的测序包括将细胞生物样品放置在流动池中，流动池具有壁(例如，顶壁或第一壁，以及底壁或第二壁)和其间的空隙，其中该空隙可填充流体，其中将流动池定位于荧光光学成像系统中。当使用传统成像系统时，细胞生物样品的厚度可能需要使用成像系统分别聚焦于流动池的第一和第二表面。为了改善细胞生物样品中测序反应的成像，可将流动池定位在高性能荧光成像系统中，其包括两个或更多个镜筒透镜，所述两个或更多个镜筒透镜设计为在两个或更多个荧光波长下为流动池的第一和第二表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，高性能成像系统还包括聚焦机构，其被配置为在获取流动池的第一和第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，高性能成像系统被配置为对在第一流动池表面或第二流动池表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。
411.在一些实施方案中，步骤(a)-(f)在细胞生物样品内进行。在一些实施方案中，在步骤(a)之前将细胞生物样品定位在载体上，其中载体缺乏固定的捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，靶rna或cdna未固定到任何类型的载体上。在一些实施方案中，在整个步骤(a)-(f)中，至少一些靶rna和/或cdna保留在细胞生物样品内。
412.在一些实施方案中，步骤(f)的测序包括：使多个核酸多联体与多个测序引物、多个聚合酶和多个多价分子接触，其中每个多价分子包含通过接头连接到核心的两个或更多个核苷酸部分的重复体。
413.在一些实施方案中，多价分子包含多个核苷酸，该多个核苷酸结合到颗粒(或核心)，所述颗粒(或核心)是例如聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、胶束、脂质体、微粒、纳米颗粒、量子点或本领域已知的其他合适颗粒。
414.在一些实施方案中，多价分子包括：(1)核心；以及(2)多个核苷酸臂，其包含(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头，以及(iv)核苷酸单元，其中核心附接到多个核苷酸臂。在一些实施方案中，间隔子附接到接头。在一些实施方案中，接头附接到核苷酸单元。在一些实施方案中，核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团，且其中接头通过碱基附接到核苷酸单元。在一些实施方案中，接头包括脂肪族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链具有2-6个亚基，并且任选地，接头包含芳香族部分。
415.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，并且其中多个核苷酸臂具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的相同类型的核苷酸单元。
416.在一些实施方案中，多价分子还包含多个多价分子，其包括多价分子的混合物，所述多价分子具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的两种或更多种不同类型的核苷酸。
417.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中单个核苷酸臂包含在糖2’位置、糖3’位置或糖2’和3’位置具有链终止部分(例如，封闭部分)的核苷酸单元。
418.在一些实施方案中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，链终止部分选自3
’‑
脱氧核苷酸、2’,3
’‑
双脱氧核苷酸、3
’‑
甲基、3
’‑
叠氮基、3
’‑
叠氮基甲基、3
’‑
o-叠氮基烷基、3
’‑
o-乙炔基、3
’‑
o-氨基烷基、3
’‑
o-氟烷基、3
’‑
氟甲基、3
’‑
二氟甲基、3
’‑
三氟甲基、3
’‑
磺酰基、3
’‑
丙二酰基、3
’‑
氨基、3
’‑
o-氨基、3
’‑
巯基、3
’‑
氨基甲基、3
’‑
乙基、3’丁基、3
’‑
叔丁基、3
’‑
芴基甲氧基羰基、3
’‑
叔丁氧基羰基、3
’‑
o-烷基羟基氨基、3
’‑
硫代磷酸酯和3-o-苄基或其衍生物。
419.在一些实施方案中，链终止部分可从核苷酸单元切割/去除。
420.在一些实施方案中，链终止部分是可用膦化合物切割的叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
421.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中该核心用可检测的报告部分标记。在一些实施方案中，可检测的报告部分包含荧光团。
422.在一些实施方案中，多价分子的核心包含类亲和素部分，且核心附接部分包含生物素。
423.在一些实施方案中，步骤(f)的测序包括：(1)在一定条件下使多个核酸多联体与(i)多个聚合酶，(ii)至少一个多价分子，其包含通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，以及(iii)与多联体的一部分杂交的多个测序引物接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与核酸多联体分子中的一个的一部分结合，并且适于将多价分子的至少一个核苷酸部分在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置的结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸部分不掺入测序引物中；(2)检测和鉴定多价分子的结合核苷酸部分，从而确定多联体分子的序列；(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次；(4)在一定条件下使多联体分子与(i)多个聚合酶和(ii)多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶结合到多联体分子的至少一部分并且适于将多个核苷酸中的至少一个核苷酸在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置结合到杂交的测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入杂交的测序引物中；(5)任选地检测掺入的核苷酸；(6)任选地鉴定掺入核苷酸，从而确定或确认多联体的序列；以及(7)将步骤(1)
–
(6)重复至少一次。
424.在一些实施方案中，步骤(f)的测序包括：(1)在一定条件下使多个固定的多联体和与测序引物结合序列杂交的多个测序引物、多个聚合酶和多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与固定的多联体的一部分结合，并且适于将核苷酸中的至少一个在与固定的多联体中的互补核苷酸相反位置结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入测序引物的3’端；(2)检测和鉴定掺入的核苷酸，从而确定固定的多联体分子的序列；以及(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次。在一些实施方案中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含在糖2’或3’位置的链终止部分。在一些实施方案中，链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团，其可被膦化合物切割。在一些实施方案中，膦化
合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
425.原位单细胞测序.本发明提供了一种用于在单细胞中原位分析核酸的方法，其中该单细胞被放置在细胞培养基中，并且其中该单细胞包含包括靶rna的细胞rna，所述方法包括：(a)在适于产生至少一个对应于靶rna的cdna的条件下在单细胞中进行逆转录反应，其中，合适的条件包括使单细胞中的靶rna与(i)高效杂交缓冲液，(ii)逆转录酶，(iii)多个核苷酸，和(iv)结合靶rna的至少一部分的多个逆转录酶引物接触。
426.在一些实施方案中，单细胞是新鲜、冷冻、新鲜冷冻或存档的细胞样品(例如，经福尔马林固定石蜡包埋；ffpe)。
427.在一些实施方案中，靶rna保留在单细胞内。在一些实施方案中，靶rna未固定在单细胞外部的任何类型的载体上。
428.在一些实施方案中，可处理单细胞以固定包括靶rna的核酸在单细胞内的位置。例如，单细胞可以用福尔马林处理。单细胞可以用甲醛、乙醇、甲醇或苦味酸处理。单细胞可以包埋在石蜡中。
429.在一些实施方案中，可将步骤(a)中的多个逆转录酶引物改性，使其与细胞结合或与细胞中的细胞组分结合，使得通过进行逆转录酶反应生成的cdna与细胞组分结合并保留在细胞中。例如，可将逆转录酶引物改性以在其5’端包含反应部分，或逆转录酶引物可包含经改性以包含反应部分的核苷酸残基。反应部分包括亲核官能团(例如胺、醇、硫醇和酰肼)，亲电官能团(例如，醛、酯、环氧化物、异氰酸酯、马来酰亚胺和乙烯基酮)，能够进行环加成反应、形成二硫键或与金属结合的官能团。反应部分包括伯胺或仲胺、低级烷基胺基团、乙酰基、羟肟酸、n-羟基琥珀酰亚胺基酯、n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、马来酰亚胺、氧羰基咪唑、硝基苯酯、三氟乙酯、缩水甘油醚或乙烯基砜。反应部分包括亲和结合基团，例如生物素。反应部分包括荧光素或吖啶。
430.在一些实施方案中，步骤(a)的逆转录反应包含多个核苷酸和具有逆转录活性的酶，包括来自amv(禽成髓细胞血症病毒)、m-mlv(莫罗尼鼠白血病病毒)或hiv(人类免疫缺陷病毒)的逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶可以是市售酶，包括multiscribe
tm
、thermoscript
tm
或arrayscript
tm
。在一些实施方案中，逆转录酶包括superscript i、ii、iii或iv酶。在一些实施方案中，逆转录反应可包括rnase抑制剂。在一些实施方案中，多个逆转录引物对核糖核酸酶降解具有抗性。例如，可将逆转录引物改性以包含两个或更多个硫代磷酸酯键，或2
’‑
o-甲基、2’氟碱基、磷酸化3’端或锁定核酸残基。
431.在一些实施方案中，多个逆转录引物对核糖核酸酶降解具有抗性。例如，可将逆转录引物改性以包含两个或更多个硫代磷酸酯键，或2
’‑
o-甲基、2’氟碱基、磷酸化3’端或锁定核酸残基。
432.在一些实施方案中，步骤(a)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其介电常数不大于40且极性指数为4-9；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于高效杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲体系，其将高效杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8的范围内；和(iv)足以增强或促进分子拥挤的量的拥挤剂。在一些实施方案中，步骤(a)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为25-50％的乙腈；(ii)第二极性非质子溶剂，其包含以高效杂
交缓冲液的体积计为5-10％的甲酰胺；(iii)ph缓冲体系，其包含2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph为5-6.5；和(iv)拥挤剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5-35％的聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液还包含甜菜碱。
433.在一些实施方案中，步骤(a)的高效杂交缓冲液促进核酸杂交反应的高严格性(例如，特异性)、速度和效率，并提高后续扩增和测序步骤的效率。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液显著缩短核酸杂交时间，并降低样品输入要求。核酸退火可以在等温条件下进行，并消除了用于退火的冷却步骤。
434.在一些实施方案中，将单细胞置于细胞培养基中，该细胞培养基包括具有从生物流体中获得的流体的复杂细胞培养基，该生物流体选自胎牛血清、血浆、血清、淋巴液、人胎盘脐带血清和羊水，其中该复杂细胞培养基可支持细胞生长和/或增殖。在一些实施方案中，复杂细胞培养基包括含血清培养基、无血清培养基、化学定义的培养基或无蛋白质培养基。在一些实施方案中，复杂细胞培养基包括rpmi-1640、mem、dmem或imdm。
435.在一些实施方案中，将单细胞置于细胞培养基中，该细胞培养基包括简单细胞培养基，该简单细胞培养基包含缓冲液、磷酸盐化合物、钠化合物、钾化合物、钙化合物、镁化合物和/或葡萄糖中的任何一种或两种或更多种的任何组合，并且其中简单细胞培养基不能支持细胞生长和/或增殖。在一些实施方案中，简单细胞培养基包括pbs、dpbs、hbss、dmem、emem或ebss。
436.在一些实施方案中，用于原位分析单细胞中的核酸的方法还包括步骤(b)：降解一些或全部细胞rna并至少保留单细胞的细胞膜。在一些实施方案中，用核糖核酸酶降解细胞rna。
437.在一些实施方案中，用于原位分析单细胞中的核酸的方法还包括步骤(c)：使至少一个cdna与多个锁式探针接触，每个锁式探针包含两个末端区，其与至少一个cdna的部分结合以生成至少一个具有与cdna的相邻区杂交的两个探针末端区的cdna-锁式探针复合物以形成断口或缺口。
438.在一些实施方案中，步骤(c)的锁式探针包含单个寡核苷酸链，该寡核苷酸链在其5’末端和3’末端包括与靶核酸分子(例如，rna)的连续区互补的靶捕获序列。锁式探针还可以包括两个或更多衔接子序列的任何一个或任何组合，衔接子序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、固定化序列和/或样品索引序列。各种衔接子序列可以位于任何区域，例如锁式探针的内部部分。锁式探针的5’和3’端可以与靶核酸分子上的相邻位置杂交，以形成开放的环状分子，在杂交的5’和3’端之间有断口或缺口。
439.在一些实施方案中，用于原位分析单细胞中的核酸的方法还包括步骤(d)：在至少一个cdna-锁式探针复合物上进行缺口填充反应和/或连接反应，以生成共价闭合的环状锁式探针。
440.在一些实施方案中，缺口填充反应包括将开放的环状分子与dna聚合酶和多个核苷酸接触，其中dna聚合酶包括大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段、t7 dna聚合酶或t4 dna聚合酶。在一些实施方案中，连接反应包括使用连接酶，包括t3、t4、t7或taq dna连接酶。
441.在一些实施方案中，用于原位分析单细胞中的核酸的方法还包括步骤(e)：在共价闭合的环状锁式探针上进行滚环扩增反应，以生成多个核酸多联体。
442.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应包括在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环状锁式探针(例如，环状核酸模板分子(多个))与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
443.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应包括：(1)使共价闭合的环状锁式探针(例如，环状核酸模板分子(多个))与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种不促进聚合酶催化的核苷酸掺入扩增引物中的非催化性二价阳离子接触，其中，非催化性二价阳离子包括锶或钡；和(2)在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环状锁式探针与至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
444.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应在室温至约50℃或室温至约65℃的恒定温度(例如等温)下进行。
445.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应可在存在多个压实寡核苷酸的情况下进行，所述压实寡核苷酸压实固定的多联体的尺寸和/或形状以形成固定的压实纳米球。
446.在一些实施方案中，步骤(e)的滚环扩增反应包括具有链置换活性的dna聚合酶，其选自phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶，或deep vent dna聚合酶。在一些实施方案中，phi29 dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)、或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)和嵌合型qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
447.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中mda反应包括使至少一种核酸多联体与至少一种包含随机序列的扩增引物、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。
448.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中mda反应包括使至少一种核酸多联体与dna引发酶-聚合酶、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。在一些实施方案中，dna引发酶-聚合酶包括具有dna聚合酶和rna引发酶活性的酶。dna引发酶-聚合酶可利用脱氧核糖核苷酸三磷酸以模板序列依赖性方式在单链dna模板上合成dna引物，并可在存在催化性二价阳离子(例如，镁和/或锰)的情况下通过核苷酸聚合(例如，引物延伸)延伸引物链。dna引发酶-聚合酶包括作为类dnag引发酶(例如，细菌)和类aep引发酶(古细菌和真核生物)成员的酶。一种示例性的dna引发酶-聚合酶是来自嗜热栖热菌(thermus thermophilus)hb27的tth primpol。
449.在一些实施方案中，用于原位分析单细胞中的核酸的方法还包括步骤(f)：对核酸多联体的至少一部分进行测序。在一些实施方案中，测序包括使用光学成像系统对核酸多联体的至少一部分进行测序，该光学成像系统包括大于1.0mm2的视场(fov)。
450.在一些实施方案中，步骤(f)的测序包括将单细胞放置在流动池中，流动池具有壁(例如，顶壁或第一壁，以及底壁或第二壁)和其间的空隙，其中该空隙可填充流体，其中将流动池定位于荧光光学成像系统中。当使用传统成像系统时，单细胞的厚度可能需要使用成像系统分别聚焦于流动池的第一和第二表面。为了改善单细胞中测序反应的成像，可将
流动池定位在高性能荧光成像系统中，其包括两个或更多个镜筒透镜，所述两个或更多个镜筒透镜设计为在两个或更多个荧光波长下为流动池的第一和第二表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，高性能成像系统还包括聚焦机构，其被配置为在获取流动池的第一和第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，高性能成像系统被配置为对第一流动池表面或第二流动池表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。
451.在一些实施方案中，步骤(a)-(f)在单细胞内进行。在一些实施方案中，靶rna或cdna未固定到任何类型的载体上。在一些实施方案中，在整个步骤(a)-(f)中，至少一些靶rna和/或cdna保留在细胞生物样品内。
452.在一些实施方案中，在步骤(a)-(f)中任一个之前将单细胞定位在载体上，其中载体缺乏固定的捕获寡核苷酸。例如，所述方法包括：(1)在适于将单细胞固定到低非特异性结合载体表面的条件下，将单细胞定位在缺乏固定的捕获寡核苷酸的低非特异性结合涂层上，其中定位在步骤(a)之前进行，并且其中细胞rna保留在单细胞内；(2)在适于将单细胞固定到低非特异性结合载体表面的条件下，将单细胞定位在缺乏固定的捕获寡核苷酸的低非特异性结合涂层上，其中定位在步骤(b)之前进行，并且其中至少一个cdna保留在单细胞内；(3)在适于将单细胞固定到低非特异性结合载体表面的条件下，将单细胞定位在缺乏固定的捕获寡核苷酸的低非特异性结合涂层上，其中定位在步骤(e)之前进行，并且其中环状锁式探针保留在单细胞内；或(4)在适于将单细胞固定到低非特异性结合载体表面的条件下，将单细胞定位在缺乏固定的捕获寡核苷酸的低非特异性结合涂层上，其中定位在步骤(f)之前进行，并且其中多个核酸多联体保留在单细胞内。
453.在一些实施方案中，低非特异性结合载体包括具有涂层的载体，其中涂层包括至少一个亲水性聚合物层，所述亲水性聚合物层具有不大于45度的水接触角。
454.在一些实施方案中，步骤(f)的测序包括：使多个核酸多联体与多个测序引物、多个聚合酶和多个多价分子接触，其中每个多价分子包含通过接头连接到核心的两个或更多个核苷酸部分的重复体。
455.在一些实施方案中，多价分子包含多个核苷酸，所述多个核苷酸结合到颗粒(或核心)，所述颗粒(或核心)是例如聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、胶束、脂质体、微粒、纳米颗粒、量子点或本领域已知的其他合适颗粒。
456.在一些实施方案中，多价分子包括：(1)核心；以及(2)多个核苷酸臂，其包含(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头，以及(iv)核苷酸单元，其中核心附接到多个核苷酸臂。在一些实施方案中，间隔子附接到接头。在一些实施方案中，接头附接到核苷酸单元。在一些实施方案中，核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团，且其中接头通过碱基附接到核苷酸单元。在一些实施方案中，接头包括脂肪族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链具有2-6个亚基，并且任选地，接头包含芳香族部分。
457.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，并且其中多个核苷酸臂具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的相同类型的核苷酸单元。
458.在一些实施方案中，多价分子还包含多个多价分子，其包括多价分子的混合物，所述多价分子具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的两种或更多种不同类型的核苷酸。
459.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中单个核苷酸臂包含在糖2’位置、糖3’位置或糖2’和3’位置具有链终止部分(例如，封闭部分)的核苷酸
单元。
460.在一些实施方案中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，链终止部分选自3
’‑
脱氧核苷酸、2’,3
’‑
双脱氧核苷酸、3
’‑
甲基、3
’‑
叠氮基、3
’‑
叠氮基甲基、3
’‑
o-叠氮基烷基、3
’‑
o-乙炔基、3
’‑
o-氨基烷基、3
’‑
o-氟烷基、3
’‑
氟甲基、3
’‑
二氟甲基、3
’‑
三氟甲基、3
’‑
磺酰基、3
’‑
丙二酰基、3
’‑
氨基、3
’‑
o-氨基、3
’‑
巯基、3
’‑
氨基甲基、3
’‑
乙基、3’丁基、3
’‑
叔丁基、3
’‑
芴基甲氧基羰基、3
’‑
叔丁氧基羰基、3
’‑
o-烷基羟基氨基、3
’‑
硫代磷酸酯和3-o-苄基或其衍生物。
461.在一些实施方案中，链终止部分可从核苷酸单元切割/去除。
462.在一些实施方案中，链终止部分是可用膦化合物切割的叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
463.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中该核心用可检测的报告部分标记。在一些实施方案中，可检测的报告部分包含荧光团。
464.在一些实施方案中，多价分子的核心包含类亲和素部分，且核心附接部分包含生物素。
465.在一些实施方案中，步骤(f)的测序包括：(1)在一定条件下使多个核酸多联体与(i)多个聚合酶，(ii)至少一个多价分子，其包含通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，以及(iii)与多联体的一部分杂交的多个测序引物接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与核酸多联体分子中的一个的一部分结合，并且适于将多价分子的至少一个核苷酸部分在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置的结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸部分不掺入测序引物中；(2)检测和鉴定多价分子的结合核苷酸部分，从而确定多联体分子的序列；(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次；(4)在一定条件下使多联体分子与(i)多个聚合酶和(ii)多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶结合到多联体分子的至少一部分并且适于将多个核苷酸中的至少一个核苷酸在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置结合到杂交的测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入杂交的测序引物中；(5)任选地检测掺入的核苷酸；(6)任选地鉴定掺入核苷酸，从而确定或确认多联体的序列；以及(7)将步骤(1)
–
(6)重复至少一次。
466.在一些实施方案中，步骤(f)的测序包括：(1)在一定条件下使多个固定的多联体和与测序引物结合序列杂交的多个测序引物、多个聚合酶和多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与固定的多联体的一部分结合，并且适于将核苷酸中的至少一个在与固定的多联体中的互补核苷酸相反位置结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入测序引物的3’端；(2)检测和鉴定掺入的核苷酸，从而确定固定的多联体分子的序列；以及(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次。在一些实施方案中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含在糖2’或3’位置的链终止部分。在一些实施方案中，链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团，其可被膦化合物切割。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
467.低结合涂层上的生物分子捕获和分析.本公开提供了一种用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法，其中细胞生物样品中的细胞包含细胞核酸和多肽，并且其中样品
中的至少一个细胞包含编码靶多肽的靶核酸，所述方法包括以下一般步骤：(a)提供载体，其包含固定多个捕获寡核苷酸和任选的多个环化寡核苷酸的低非特异性结合涂层，其中所述多个固定的捕获寡核苷酸包含(i)与靶核酸分子的至少一部分杂交的靶捕获区，以及(ii)空间条形码序列，其中低非特异性结合涂层包括至少一个亲水性聚合物层，所述亲水性聚合物层具有不大于45度的水接触角。
468.在一些实施方案中，步骤(a)中的低非特异性结合涂层相对于本领域的已知表面表现出低背景荧光信号或高对比度噪声(cnr)比。在一些实施方案中，低非特异性结合涂层表现出小于约0.25个分子/μm2的非特异性cy3染料吸收水平，其中不超过5％的靶核酸在不与固定的捕获寡核苷酸杂交的情况下与表面涂层缔合。在一些实施方案中，当在非信号饱和条件下使用荧光成像系统时，具有多个经克隆扩增的核酸簇的表面涂层的荧光图像表现出至少20或至少50的对比度噪声比(cnr)或更高的对比度噪声比(cnr)。
469.在一些实施方案中，步骤(a)的低非特异性结合涂层具有位于涂层上预定位置的区(例如，特征部)。低非特异性结合涂层包括多个特征部，包括至少一个第一和第二特征部，其中每个特征部包括固定在涂层上的多个捕获寡核苷酸和任选的多个环化寡核苷酸。在一些实施方案中，第一特征部包括具有第一靶捕获区和第一空间条形码序列的多个第一捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，第二特征部包括具有第二靶捕获区和第二空间条形码序列的多个第二捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，第一特征部中的第一靶捕获区的序列与第二特征部中的第二靶捕获区的序列相同或不同。在一些实施方案中，第一特征部中的第一空间条形码序列不同于第二特征部中的第二空间条形码序列。
470.在一些实施方案中，用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法还包括步骤(b)：在适于促进细胞核酸(包括靶核酸分子)从细胞生物样品到固定的捕获寡核苷酸中的一个的迁移的条件下，在高效杂交缓冲液存在下，使低非特异性结合涂层与细胞生物样品接触，从而形成固定的靶核酸双链体，其中靶核酸分子以保留靶核酸分子在细胞生物样品中的空间位置信息的方式固定到低非特异性结合涂层。
471.在一些实施方案中，步骤(b)中的细胞生物样品包括新鲜、冷冻、新鲜冷冻或存档的细胞生物样品(例如，经福尔马林固定石蜡包埋；ffpe)。
472.在一些实施方案中，对步骤(b)中的细胞生物样品进行透化反应，以促进包括靶核酸分子的细胞核酸分子(例如，dna和/或rna)从细胞生物样品到固定的捕获寡核苷酸中的一个的迁移。
473.在一些实施方案中，靶核酸包含rna。在一些实施方案中，靶rna在细胞生物样品中的空间位置对应于表达编码靶多肽的靶rna的至少一个细胞在细胞生物样品中的空间位置。
474.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其介电常数不大于40且极性指数为4-9；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于高效杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲体系，其将高效杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8的范围内；和(iv)足以增强或促进分子拥挤的量的拥挤剂。
475.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为25-50％的乙腈；(ii)第二极性非质子溶剂，其包含以高
效杂交缓冲液的体积计为5-10％的甲酰胺；(iii)ph缓冲体系，其包含2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph为5-6.5；和(iv)拥挤剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5-35％的聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液还包含甜菜碱。
476.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液促进核酸杂交反应的高严格性(例如，特异性)、速度和效率，并提高后续扩增和测序步骤的效率。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液显著缩短核酸杂交时间，并降低样品输入要求。核酸退火可以在等温条件下进行，并消除了用于退火的冷却步骤。
477.在一些实施方案中，用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法还包括步骤(c)：在固定的靶核酸双链体上进行引物延伸反应，从而形成固定的靶延伸产物。
478.在一些实施方案中，步骤(c)的引物延伸反应可以是包含(i)逆转录酶、(ii)多个核苷酸和(iii)结合靶rna的至少一部分的多个逆转录酶引物的逆转录反应。在一些实施方案中，步骤(a)的逆转录反应包含多个核苷酸和具有逆转录活性的酶，包括来自amv(禽成髓细胞血症病毒)、m-mlv(莫罗尼鼠白血病病毒)或hiv(人类免疫缺陷病毒)的逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶可以是市售酶，包括multiscribe
tm
、thermoscript
tm
或arrayscript
tm
。在一些实施方案中，逆转录酶包括superscript i、ii、iii或iv酶。在一些实施方案中，逆转录反应可包含rnase抑制剂。
479.在一些实施方案中，多个逆转录引物对核糖核酸酶降解具有抗性。例如，可将逆转录引物改性以包含两个或更多个硫代磷酸酯键，或2
’‑
o-甲基、2’氟碱基、磷酸化3’端或锁定核酸残基。
480.在一些实施方案中，用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法还包括步骤(d)：使用固定的环化寡核苷酸形成开放的环状靶分子，或者，如果低非特异性结合涂层尚未包括固定的环化寡核苷酸，则将可溶性环化寡核苷酸靠近固定的靶延伸产物固定到低非特异性结合涂层上，并使用现在固定的环化寡核苷酸形成开放的环状靶分子；
481.在一些实施方案中，用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法还包括步骤(e)：形成固定到低非特异性结合涂层上的共价闭合的环状靶分子。
482.在一些实施方案中，形成共价闭合的环状靶分子包括聚合酶介导的缺口填充反应、酶促连接反应、或聚合酶介导的缺口填充反应和酶促连接反应。在一些实施方案中，聚合酶介导的缺口填充反应包括使开放的环状靶分子与dna聚合酶和多个核苷酸接触，其中dna聚合酶包括大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段、t7 dna聚合酶或t4 dna聚合酶。在一些实施方案中，酶促连接反应包括使用连接酶，包括t3、t4、t7或taq dna连接酶。在一些实施方案中，形成共价闭合的环状靶分子包括使开放的环状靶分子与circligase或circligaseii酶接触。
483.在一些实施方案中，用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法还包括步骤(f)：在固定的共价闭合的环状靶分子上进行滚环扩增反应，以形成具有包含靶序列和空间条形码序列的串联重复区的固定的核酸多联体分子。
484.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应包括在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环状锁式探针(例如，环状核酸模板分子(多个))与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
485.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应包括：(1)使共价闭合的环状锁式探针(例如，环状核酸模板分子(多个))与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种不促进聚合酶催化的核苷酸掺入扩增引物中的非催化性二价阳离子接触，其中，非催化性二价阳离子包括锶或钡；和(2)在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环状锁式探针与至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
486.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应在室温至约50℃或室温至约65℃的恒定温度(例如等温)下进行。
487.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应可在存在多个压实寡核苷酸的情况下进行，所述压实寡核苷酸压实固定的多联体的尺寸和/或形状以形成固定的压实纳米球。
488.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应包含具有链置换活性的dna聚合酶，其选自phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶或deep vent dna聚合酶。在一些实施方案中，phi29 dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)、或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)和嵌合型qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
489.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中mda反应包括使至少一种核酸多联体与至少一种包含随机序列的扩增引物、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。
490.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中mda反应包括使至少一种核酸多联体与dna引发酶-聚合酶、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸，以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。在一些实施方案中，dna引发酶-聚合酶包括具有dna聚合酶和rna引发酶活性的酶。dna引发酶-聚合酶可利用脱氧核糖核苷酸三磷酸以模板序列依赖性方式在单链dna模板上合成dna引物，并可在存在催化性二价阳离子(例如，镁和/或锰)的情况下通过核苷酸聚合(例如，引物延伸)延伸引物链。dna引发酶-聚合酶包括作为类dnag引发酶(例如，细菌)和类aep引发酶(古细菌和真核生物)成员的酶。一种示例性的dna引发酶-聚合酶是来自嗜热栖热菌(thermus thermophilus)hb27的tth primpol。
491.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是弯曲扩增反应，而不是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，弯曲扩增反应包括：(1)通过使核酸多联体与选自甲酰胺、乙腈、乙醇、盐酸胍、脲、碘化钾和/或多胺的化合物中的一种或两种或更多种的组合接触，形成核酸松弛反应混合物，以生成松弛的核酸多联体，其中，形成核酸松弛反应混合物是在温度斜升、松弛温育温度和温度斜降的情况下进行的；(2)洗涤松弛的多联体；(3)通过使松弛的多联体与链置换dna聚合酶、多个核苷酸、催化性二价阳离子(在没有添加扩增引物的情况下)接触形成弯曲扩增反应混合物，以生成双链多联体，其中形成弯曲扩增反应混合物是在温度斜升、弯曲温育温度和温度斜降的情况下进行的；(4)洗涤双链多联体；以及(5)将步骤(1)-(4)重复至少一次。
492.在一些实施方案中，用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法还包括步骤(g)：对核酸多联体的至少一部分进行测序，包括对靶序列和空间条形码序列进行测序，以
确定靶核酸在细胞生物样品中的空间位置。
493.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括使用光学成像系统对核酸多联体的至少一部分进行测序，该光学成像系统包括大于1.0mm2的视场(fov)。在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括将细胞生物样品放置在流动池中，流动池具有壁(例如，顶壁或第一壁，以及底壁或第二壁)和其间的空隙，其中该空隙可填充流体，其中将流动池定位在荧光光学成像系统中。当使用传统成像系统时，细胞生物样品的厚度可能需要使用成像系统分别聚焦于流动池的第一和第二表面。为了改善来自细胞生物样品的核酸的测序反应的成像，可将流动池定位在高性能荧光成像系统中，其包括两个或更多个镜筒透镜，所述两个或更多个镜筒透镜设计为在两个或更多个荧光波长下为流动池的第一和第二表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，高性能成像系统还包括聚焦机构，其被配置为在获取流动池的第一和第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，高性能成像系统被配置为对第一流动池表面或第二流动池表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。
494.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：使多个核酸多联体与多个测序引物、多个聚合酶和多个多价分子接触，其中每个多价分子包含通过接头连接到核心的两个或更多个核苷酸部分的重复体。
495.在一些实施方案中，多价分子包含多个核苷酸，所述多个核苷酸结合到颗粒(或核心)，所述颗粒(或核心)是例如聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、胶束、脂质体、微粒、纳米颗粒、量子点或本领域已知的其他合适颗粒。
496.在一些实施方案中，多价分子包括：(1)核心；以及(2)多个核苷酸臂，其包含(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头，以及(iv)核苷酸单元，其中核心附接到多个核苷酸臂。在一些实施方案中，间隔子附接到接头。在一些实施方案中，接头附接到核苷酸单元。在一些实施方案中，核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团，且其中接头通过碱基附接到核苷酸单元。在一些实施方案中，接头包括脂肪族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链具有2-6个亚基，并且任选地，接头包含芳香族部分。
497.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，并且其中多个核苷酸臂具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的相同类型的核苷酸单元。
498.在一些实施方案中，多价分子还包含多个多价分子，其包括多价分子的混合物，所述多价分子具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的两种或更多种不同类型的核苷酸。
499.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中单个核苷酸臂包含在糖2’位置、糖3’位置或糖2’和3’位置具有链终止部分(例如，封闭部分)的核苷酸单元。
500.在一些实施方案中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，链终止部分选自3
’‑
脱氧核苷酸、2’,3
’‑
双脱氧核苷酸、3
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甲基、3
’‑
叠氮基、3
’‑
叠氮基甲基、3
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o-叠氮基烷基、3
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o-乙炔基、3
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o-氨基烷基、3
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o-氟烷基、3
’‑
氟甲基、3
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二氟甲基、3
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三氟甲基、3
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磺酰基、3
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丙二酰基、3
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氨基、3
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o-氨基、3
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巯基、3
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氨基甲基、3
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乙基、3’丁基、3
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叔丁基、3
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芴基甲氧基羰基、3
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叔丁氧基羰基、3
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o-烷基羟基氨基、3
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硫代磷酸酯和3-o-苄基或其衍生物。
501.在一些实施方案中，链终止部分可从核苷酸单元切割/去除。
502.在一些实施方案中，链终止部分是可用膦化合物切割的叠氮化物、叠氮基或叠氮
基甲基。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
503.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中该核心用可检测的报告部分标记。在一些实施方案中，可检测的报告部分包含荧光团。
504.在一些实施方案中，多价分子的核心包含类亲和素部分，且核心附接部分包含生物素。
505.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：(1)在一定条件下使多个核酸多联体与(i)多个聚合酶，(ii)至少一个多价分子，其包含通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，以及(iii)与多联体的一部分杂交的多个测序引物接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与核酸多联体分子中的一个的一部分结合，并且适于将多价分子的至少一个核苷酸部分在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置的结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸部分不掺入测序引物中；(2)检测和鉴定多价分子的结合核苷酸部分，从而确定多联体分子的序列；(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次；(4)在一定条件下使多联体分子与(i)多个聚合酶和(ii)多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶结合到多联体分子的至少一部分并且适于将多个核苷酸中的至少一个核苷酸在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置结合到杂交的测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入杂交的测序引物中；(5)任选地检测掺入的核苷酸；(6)任选地鉴定掺入核苷酸，从而确定或确认多联体的序列；以及(7)将步骤(1)
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(6)重复至少一次。
506.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：(1)在一定条件下使多个固定的多联体和与测序引物结合序列杂交的多个测序引物、多个聚合酶和多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与固定的多联体的一部分结合，并且适于将核苷酸中的至少一个在与固定的多联体中的互补核苷酸相反位置结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入测序引物的3’端；(2)检测和鉴定掺入的核苷酸，从而确定固定的多联体分子的序列；以及(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次。在一些实施方案中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含在糖2’或3’位置的链终止部分。在一些实施方案中，链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团，其可被膦化合物切割。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
507.从单细胞中捕获核酸以及分析.本公开提供了一种用于分析来自单细胞(例如，细胞生物样品)的核酸的方法，其中将单细胞放置在细胞培养基中，并且其中单细胞包含细胞核酸和多肽，并且其中单细胞包含编码靶多肽的靶核酸，所述方法包括以下一般步骤：(a)提供载体，其包含固定多个捕获寡核苷酸和任选的多个环化寡核苷酸的低非特异性结合涂层，其中所述多个固定的捕获寡核苷酸包含(i)与靶核酸分子的至少一部分杂交的靶捕获区，以及(ii)空间条形码序列，其中低非特异性结合涂层包括至少一个亲水性聚合物层，所述亲水性聚合物层具有不大于45度的水接触角。
508.在一些实施方案中，步骤(a)中的低非特异性结合涂层相对于本领域的已知表面表现出低背景荧光信号或高对比度噪声(cnr)比。在一些实施方案中，低非特异性结合涂层表现出小于约0.25个分子/μm2的非特异性cy3染料吸收水平，其中不超过5％的靶核酸在不与固定的捕获寡核苷酸杂交的情况下与表面涂层缔合。在一些实施方案中，当在非信号饱
和条件下使用荧光成像系统时，具有多个经克隆扩增的核酸簇的表面涂层的荧光图像表现出至少20或至少50的对比度噪声比(cnr)或更高的对比度噪声比(cnr)。
509.在一些实施方案中，步骤(a)的低非特异性结合涂层具有位于涂层上预定位置的区(例如，特征部)。低非特异性结合涂层包括多个特征部，包括至少第一和第二特征部，其中每个特征部包括固定到涂层上的多个捕获寡核苷酸和任选的多个环化寡核苷酸。在一些实施方案中，第一特征部包括具有第一靶捕获区和第一空间条形码序列的多个第一捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，第二特征部包括具有第二靶捕获区和第二空间条形码序列的多个第二捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，第一特征部中的第一靶捕获区的序列与第二特征部中的第二靶捕获区的序列相同或不同。在一些实施方案中，第一特征部中的第一空间条形码序列不同于第二特征部中的第二空间条形码序列。
510.在一些实施方案中，将单细胞置于细胞培养基中，该细胞培养基包括具有从生物流体中获得的流体的复杂细胞培养基，该生物流体选自胎牛血清、血浆、血清、淋巴液、人胎盘脐带血清和羊水，其中该复杂细胞培养基可支持细胞生长和/或增殖。在一些实施方案中，复杂细胞培养基包括含血清培养基、无血清培养基、化学定义的培养基或无蛋白质培养基。在一些实施方案中，复杂细胞培养基包括rpmi-1640、mem、dmem或imdm。
511.在一些实施方案中，将单细胞置于细胞培养基中，该细胞培养基包括简单细胞培养基，该简单细胞培养基包含缓冲液、磷酸盐化合物、钠化合物、钾化合物、钙化合物、镁化合物和/或葡萄糖中的任何一种或两种或更多种的任何组合，并且其中简单细胞培养基不能支持细胞生长和/或增殖。在一些实施方案中，简单细胞培养基包括pbs、dpbs、hbss、dmem、emem或ebss。
512.在一些实施方案中，用于分析来自单细胞的生物分子的方法还包括步骤(b)：在适于促进细胞核酸(包括靶核酸分子)从单细胞到固定的捕获寡核苷酸中的一个的迁移的条件下，在高效杂交缓冲液存在下，使低非特异性结合涂层与单细胞接触，从而形成固定的靶核酸双链体，其中来自单细胞的靶核酸分子以保留靶核酸分子在单细胞中的空间位置信息的方式固定到低非特异性结合涂层。
513.在一些实施方案中，步骤(b)中的单细胞包括新鲜、冷冻、新鲜冷冻或存档的单细胞(例如，经福尔马林固定石蜡包埋；ffpe)。
514.在一些实施方案中，对步骤(b)中的单细胞进行透化反应，以促进包括靶核酸分子的细胞核酸分子(例如，dna和/或rna)从单细胞到固定的捕获寡核苷酸中的一个的迁移。
515.在一些实施方案中，靶核酸包含rna。在一些实施方案中，靶rna在单细胞中的空间位置对应于编码靶多肽的靶rna的空间位置。
516.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其介电常数不大于40且极性指数为4-9；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于高效杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲体系，其将高效杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8的范围内；和(iv)足以增强或促进分子拥挤的量的拥挤剂。
517.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为25-50％的乙腈；(ii)第二极性非质子溶剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5-10％的甲酰胺；(iii)ph缓冲体系，其包含2-(n-吗啉代)乙磺酸
(mes)，ph为5-6.5；和(iv)拥挤剂，其包含以高效杂交缓冲液的体积计为5-35％的聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液还包含甜菜碱。
518.在一些实施方案中，步骤(b)的高效杂交缓冲液促进核酸杂交反应的高严格性(例如，特异性)、速度和效率，并提高后续扩增和测序步骤的效率。在一些实施方案中，高效杂交缓冲液显著缩短核酸杂交时间，并降低样品输入要求。核酸退火可以在等温条件下进行，并消除了用于退火的冷却步骤。
519.在一些实施方案中，用于分析来自单细胞的核酸的方法还包括步骤(c)：在固定的靶核酸双链体上进行引物延伸反应，从而形成固定的靶延伸产物。
520.在一些实施方案中，步骤(c)的引物延伸反应可以是包含(i)逆转录酶、(ii)多个核苷酸和(iii)结合靶rna的至少一部分的多个逆转录酶引物的逆转录反应。在一些实施方案中，步骤(a)的逆转录反应包含多个核苷酸和具有逆转录活性的酶，包括来自amv(禽成髓细胞血症病毒)、m-mlv(莫罗尼鼠白血病病毒)或hiv(人类免疫缺陷病毒)的逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶可以是市售酶，包括multiscribe
tm
、thermoscript
tm
或arrayscript
tm
。在一些实施方案中，逆转录酶包括superscript i、ii、iii或iv酶。在一些实施方案中，逆转录反应可包含rnase抑制剂。
521.在一些实施方案中，多个逆转录引物对核糖核酸酶降解具有抗性。例如，可将逆转录引物改性以包含两个或更多个硫代磷酸酯键、或2
’‑
o-甲基、2’氟碱基、磷酸化3’端或锁定核酸残基。
522.在一些实施方案中，用于分析来自单细胞的核酸的方法还包括步骤(d)：使用固定的环化寡核苷酸形成开放环状靶分子，或者，如果低非特异性结合涂层尚未包括固定的环化寡核苷酸，则将可溶性环化寡核苷酸靠近固定的靶延伸产物固定到低非特异性结合涂层上，并使用现在固定的环化寡核苷酸形成开放环状靶分子。
523.在一些实施方案中，用于分析来自单细胞的核酸的方法还包括步骤(e)：形成固定到低非特异性结合涂层上的共价闭合的环状靶分子。
524.在一些实施方案中，形成共价闭合的环状靶分子包括聚合酶介导的缺口填充反应、酶促连接反应、或聚合酶介导的缺口填充反应和酶促连接反应。在一些实施方案中，聚合酶介导的缺口填充反应包括使开放的环状靶分子与dna聚合酶和多个核苷酸接触，其中dna聚合酶包括大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段、t7 dna聚合酶或t4 dna聚合酶。在一些实施方案中，酶促连接反应包括使用连接酶，包括t3、t4、t7或taq dna连接酶。在一些实施方案中，形成共价闭合的环状靶分子包括使开放的环状靶分子与circligase或circligase ii酶接触。
525.在一些实施方案中，用于分析来自单细胞的核酸的方法还包括步骤(f)：在固定的共价闭合的环状靶分子上进行滚环扩增反应，以形成具有包含靶序列和空间条形码序列的串联重复区的固定的核酸多联体分子。
526.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应包括在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环状锁式探针(例如，环状核酸模板分子(多个))与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
527.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应包括：(1)使共价闭合的环状锁式探
针(例如，环状核酸模板分子(多个))与扩增引物、dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种不促进聚合酶催化的核苷酸掺入扩增引物中的非催化性二价阳离子接触，其中，非催化性二价阳离子包括锶或钡；和(2)在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环状锁式探针与至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。
528.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应在室温至约50℃的恒定温度(例如等温)下进行。
529.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应可在存在多个压实寡核苷酸的情况下进行，所述压实寡核苷酸压实固定的多联体的尺寸和/或形状以形成固定的压实纳米球。
530.在一些实施方案中，步骤(f)的滚环扩增反应包含具有链置换活性的dna聚合酶，其选自phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段和bca(exo-)dna聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶或deep vent dna聚合酶。在一些实施方案中，phi29 dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)、或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)和嵌合型qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
531.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中mda反应包括使至少一种核酸多联体与至少一种包含随机序列的扩增引物、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。
532.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，所述方法还包括：在步骤(f)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中mda反应包括使至少一种核酸多联体与dna引发酶-聚合酶、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。在一些实施方案中，dna引发酶-聚合酶包括具有dna聚合酶和rna引发酶活性的酶。dna引发酶-聚合酶可利用脱氧核糖核苷酸三磷酸以模板序列依赖性方式在单链dna模板上合成dna引物，并可在存在催化性二价阳离子(例如，镁和/或锰)的情况下通过核苷酸聚合(例如，引物延伸)延伸引物链。dna引发酶-聚合酶包括作为类dnag引发酶(例如，细菌)和类aep引发酶(古细菌和真核生物)成员的酶。一种示例性的dna引发酶-聚合酶是来自嗜热栖热菌(thermus thermophilus)hb27的tth primpol。
533.在一些实施方案中，滚环扩增反应之后可以是弯曲扩增反应，而不是多重置换扩增(mda)反应。在一些实施方案中，弯曲扩增反应包括：(1)通过使核酸多联体与选自甲酰胺、乙腈、乙醇、盐酸胍、脲、碘化钾和/或多胺的化合物中的一种或两种或更多种的组合接触，形成核酸松弛反应混合物，以生成松弛的核酸多联体，其中，形成核酸松弛反应混合物是在温度斜升、松弛温育温度和温度斜降的情况下进行的；(2)洗涤松弛的多联体；(3)通过使松弛的多联体与链置换dna聚合酶、多个核苷酸、催化性二价阳离子(在没有添加扩增引物的情况下)接触形成弯曲扩增反应混合物，以生成双链多联体，其中形成弯曲扩增反应混合物是在温度斜升、弯曲温育温度和温度斜降的情况下进行的；(4)洗涤双链多联体；以及(5)将步骤(1)-(4)重复至少一次。
534.在一些实施方案中，用于分析来自单细胞的核酸的方法还包括步骤(g)：对核酸多联体的至少一部分进行测序，包括对靶序列和空间条形码序列进行测序，以确定靶核酸在单细胞中的空间位置。
535.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括使用光学成像系统对核酸多联体的至少一部分进行测序，该光学成像系统包括大于1.0mm2的视场(fov)。在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括将单细胞放置在流动池中，流动池具有壁(例如，顶壁或第一壁，以及底壁或第二壁)和其间的空隙，其中该空隙可填充流体，其中将流动池定位于荧光光学成像系统中。当使用传统成像系统时，单细胞的厚度可能需要使用成像系统分别聚焦于流动池的第一和第二表面。为了改善来自单细胞的核酸的测序反应的成像，可将流动池定位在高性能荧光成像系统中，其包括两个或更多个镜筒透镜，所述两个或更多个镜筒透镜设计为在两个或更多个荧光波长下为流动池的第一和第二表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，高性能成像系统还包括聚焦机构，其被配置为在获取流动池的第一和第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，高性能成像系统被配置为对第一流动池表面或第二流动池表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。
536.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：使多个核酸多联体与多个测序引物、多个聚合酶和多个多价分子接触，其中每个多价分子包含通过接头连接到核心的两个或更多个核苷酸部分的重复体。
537.在一些实施方案中，多价分子包含多个核苷酸，所述多个核苷酸结合到颗粒(或核心)，所述颗粒(或核心)是例如聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、胶束、脂质体、微粒、纳米颗粒、量子点或本领域已知的其他合适颗粒。
538.在一些实施方案中，多价分子包括：(1)核心；以及(2)多个核苷酸臂，其包含(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头，以及(iv)核苷酸单元，其中核心附接到多个核苷酸臂。在一些实施方案中，间隔子附接到接头。在一些实施方案中，接头附接到核苷酸单元。在一些实施方案中，核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团，且其中接头通过碱基附接到核苷酸单元。在一些实施方案中，接头包括脂肪族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链具有2-6个亚基，并且任选地，接头包含芳香族部分。
539.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，并且其中多个核苷酸臂具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的相同类型的核苷酸单元。
540.在一些实施方案中，多价分子还包含多个多价分子，其包括多价分子的混合物，所述多价分子具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的两种或更多种不同类型的核苷酸。
541.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中单个核苷酸臂包含在糖2’位置、糖3’位置或糖2’和3’位置具有链终止部分(例如，封闭部分)的核苷酸单元。
542.在一些实施方案中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，链终止部分选自3
’‑
脱氧核苷酸、2’,3
’‑
双脱氧核苷酸、3
’‑
甲基、3
’‑
叠氮基、3
’‑
叠氮基甲基、3
’‑
o-叠氮基烷基、3
’‑
o-乙炔基、3
’‑
o-氨基烷基、3
’‑
o-氟烷基、3
’‑
氟甲基、3
’‑
二氟甲基、3
’‑
三氟甲基、3
’‑
磺酰基、3
’‑
丙二酰基、3
’‑
氨基、3
’‑
o-氨基、3
’‑
巯基、3
’‑
氨基甲基、3
’‑
乙基、3’丁基、3
’‑
叔丁基、3
’‑
芴基甲氧基羰基、3
’‑
叔丁氧基羰基、3
’‑
o-烷基羟基氨基、3
’‑
硫代磷酸酯和3-o-苄基或其衍生物。
543.在一些实施方案中，链终止部分可从核苷酸单元切割/去除。
544.在一些实施方案中，链终止部分是可用膦化合物切割的叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在
一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
545.在一些实施方案中，多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中该核心用可检测的报告部分标记。在一些实施方案中，可检测的报告部分包含荧光团。
546.在一些实施方案中，多价分子的核心包含类亲和素部分，且核心附接部分包含生物素。
547.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：(1)在一定条件下使多个核酸多联体与(i)多个聚合酶，(ii)至少一个多价分子，其包含通过接头连接至核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，以及(iii)与多联体的一部分杂交的多个测序引物接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与核酸多联体分子中的一个的一部分结合，并且适于将多价分子的至少一个核苷酸部分在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置的结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸部分不掺入测序引物中；(2)检测和鉴定多价分子的结合核苷酸部分，从而确定多联体分子的序列；(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次；(4)在一定条件下使多联体分子与(i)多个聚合酶和(ii)多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶结合到多联体分子的至少一部分并且适于将多个核苷酸中的至少一个核苷酸在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置结合到杂交的测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入杂交的测序引物中；(5)任选地检测掺入的核苷酸；(6)任选地鉴定掺入核苷酸，从而确定或确认多联体的序列；以及(7)将步骤(1)
–
(6)重复至少一次。
548.在一些实施方案中，步骤(g)的测序包括：(1)在一定条件下使多个固定的多联体和与测序引物结合序列杂交的多个测序引物、多个聚合酶和多个核苷酸接触，所述条件适于将至少一个聚合酶和至少一个测序引物与固定的多联体的一部分结合，并且适于将核苷酸中的至少一个在与固定的多联体中的互补核苷酸相反位置结合到测序引物的3’端，其中结合的核苷酸掺入测序引物的3’端；(2)检测和鉴定掺入的核苷酸，从而确定固定的多联体分子的序列；以及(3)任选地将步骤(1)和(2)重复至少一次。在一些实施方案中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含在糖2’或3’位置的链终止部分。在一些实施方案中，链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团，其可被膦化合物切割。在一些实施方案中，膦化合物包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物包括三(2-羧基乙基)膦(tcep)或双磺基三苯基膦(bs-tpp)。
549.在一些实施方案中，在任何一个测序步骤中，都可以通过执行结合测序程序来进行，该结合测序程序包括：(1)在聚合酶、引物化模板核酸和与引物化模板核酸的下一个碱基互补的测试核苷酸之间形成稳定的三元复合物的条件下，使引物化模板核酸(例如，与核酸多联体杂交的引物)与聚合酶和两种或三种类型的测试核苷酸的第一组合接触；(2)检测三元复合物，同时阻止测试核苷酸掺入引物；(3)使用引物化模板核酸、聚合酶和两种或三种类型的测试核苷酸的第二组合重复步骤(1)和(2)，其中第二组合不同于第一组合；(4)在步骤(c)之后，将与下一碱基互补的核苷酸掺入引物；和(5)重复步骤(1)至(4)以识别/确定引物化模板核酸的序列。
550.在一些实施方案中，两种或三种类型的测试核苷酸的第一组合包括两种且仅两种类型的测试核苷酸。任选地，第二组合还可以包括两种且仅两种类型的测试核苷酸。
551.在一些实施方案中，对两种类型的测试核苷酸的四种不同组合连续执行步骤(1)和(2)，其中使每种不同的核苷酸类型与引物化模板核酸总共接触两次。或者，可以对两种
类型的测试核苷酸的六种不同组合连续进行步骤(1)和(2)，其中每种不同的核苷酸类型总共存在三次。
552.还提供了一种确定引物化模板核酸分子(例如，与核酸多联体杂交的引物)的下一正确核苷酸的身份的方法。所述方法包括以下步骤：(1)提供用引物(例如，与核酸多联体杂交的引物)引物化的模板核酸分子；(2)在(i)稳定包含引物化模板核酸分子、聚合酶和下一正确核苷酸的三元复合物，同时阻止任何核苷酸掺入引物中，和(ii)破坏包含引物化模板核酸分子和聚合酶但不包含下一个正确的核苷酸的二元复合物的稳定性的条件下，使来自步骤(1)的引物化模板核酸分子与包含聚合酶和至少一个测试核苷酸的第一反应混合物接触；(3)在不将任何核苷酸化学掺入引物化模板核酸分子的引物中的情况下检测(例如，监测)聚合酶与引物化模板核酸分子的相互作用，以确定是否在步骤(2)中形成三元复合物；以及(4)使用步骤(3)的结果确定任何测试核苷酸是否是引物化模板核酸分子的下一个正确核苷酸。根据一个一般优选的实施方案，可通过在第一反应混合物中包含抑制聚合的非催化金属离子来提供稳定三元复合物同时阻止任何核苷酸掺入引物的条件。
553.单通道和多通道荧光成像模块和系统：本文公开了单通道和多通道成像系统，其在视场、图像分辨率、整个视场的图像质量、双表面成像、成像占空比时间和用于基因组学应用(例如核酸测序)的成像通量方面提供改善的性能。在一些情况下，本文公开的成像模块或系统可包括荧光成像模块或系统。
554.在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可包括单个荧光激发光源(用于提供单个波长或单个激发波长范围内的激发光)和配置为将激发光递送到样品(例如，布置在基底表面上的经荧光标记的核酸分子或其簇)的光路。在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可以包括单个荧光发射成像和检测通道，例如光路，所述光路被配置为收集由样品发射的荧光，并将样品的图像(例如，其上布置有经荧光标记的核酸分子或其簇的基底表面的图像)递送至图像传感器或其他光检测装置。在一些情况下，荧光成像系统可包括两个、三个、四个或多于四个的荧光激发光源和/或光路，其被配置为以两个、三个、四个或多于四个的激发波长(或在两个、三个、四个或多于四个的激发波长范围内)递送激发光。在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可包括两个、三个、四个或多于四个的荧光发射成像和检测通道，其被配置为收集样品在两个、三个、四个或多于四个发射波长(或在两个、三个、四个或多于四个的发射波长范围内)发射的荧光，并将样品的图像(例如，其上布置有经荧光标记的核酸分子或其簇的基底表面的图像)递送至两个、三个、四个或多于四个的图像传感器或其他光检测装置。
555.双表面成像：在一些情况下，本文公开的成像系统，包括荧光成像系统，可以被配置为获取单个样品载体结构或基底表面的高分辨率图像。在一些情况下，本文公开的成像系统，包括荧光成像系统，可以被配置为获取两个或更多个样品载体结构或基底表面(例如，流动池的两个或更多个表面)的高分辨率图像。在一些情况下，由所公开的成像系统提供的高分辨率图像可以用于随着各种试剂流过流动池或在流动池基底周围流动而监测在流动池的两个或更多个表面上发生的反应(例如，核酸杂交、扩增和/或测序反应)。图8a和图8b提供了这种双表面载体结构的示意图。图8a示出了双表面载体结构，例如流动池，其包括内部流动通道，分析物或试剂可通过所述内部流动通道流动。流动通道可以在第一层和第二层、顶层和底层和/或前层和后层之间形成，例如在所示的第一板和第二板、顶板和底
板和/或前板和后板之间形成。一个或多个板可包括玻璃板，例如盖玻片等。在一些实施方式中，所述层包括硼硅酸盐玻璃、石英或塑料。这些顶层和底层的内表面提供了流动通道的壁，这些壁有助于限制分析物或试剂通过流动池的流动通道的流动。在一些设计中，这些内表面是平的。类似地，顶层和底层可以是平的。在一些设计中，在顶层和底层之间布置至少一个另外的层(未示出)。该另外的层可在其中切出一个或多个通道，这些通道有助于限定一个或多个流动通道并控制分析物或试剂在流动通道内的流动。样品载体结构(例如流动池)的另外讨论可在下面找到。
556.图8a示意性地示出了流动池的第一内表面和第二内表面、顶内表面和底内表面，和/或前内表面和后内表面上的多个发荧光的样品位点。在一些实施方式中，可在这些位点处发生反应以结合样品，使得荧光从这些位点发射(注意，图8a是示意性的且未按比例绘制；例如，发荧光的样品位点的尺寸和间距可能小于所示)。
557.图8b示出了具有两个表面的另一个双表面载体结构，所述两个表面包含要成像的发荧光的样品位点。样品载体结构包括具有第一外表面和第二外表面、顶外表面和底外表面和/或前外表面和后外表面的基底。在一些设计中，这些外表面是平的。在各种实施方式中，分析物或试剂流过这些第一外表面和第二外表面。图8b示意性地示出了在样品载体结构的第一外表面和第二外表面、顶外表面和底外表面和/或前外表面和后外表面上的多个发荧光的样品位点。在一些实施方式中，可在这些位点处发生反应以结合样品，使得荧光从这些位点发射(注意，图8b是示意性的且未按比例绘制；例如，发荧光的样品位点的尺寸和间距可能小于所示)。
558.在一些情况下，本文描述的荧光成像模块和系统可以被配置为对距物镜不同距离的第一表面和第二表面上的这种发荧光的样品位点成像。在一些设计中，一次仅对第一表面或第二表面中的一个聚焦。因此，在这样的设计中，这些表面中的一个在第一时间成像，并且另一个表面在第二时间成像。可以在对这些表面中的一个进行成像之后改变荧光成像模块的焦点，以便以可比较的光学分辨率对另一个表面成像，因为两个表面的图像不同时对焦。在一些设计中，可以将光学补偿元件引入到样品载体结构与图像传感器之间的光路中，以对两个表面中的一个成像。在这种荧光成像配置中，景深可能不够大，不能包括第一表面和第二表面两者。在本文所述的荧光成像模块的一些实施方式中，第一表面和第二表面两者可以在同一时间，即同时成像。例如，荧光成像模块可以具有足够大的景深以包括两个表面。在一些情况下，可以通过例如减小物镜(或显微镜物镜)的数值孔径来提供这种增加的景深，这将在下面更详细地讨论。
559.如图8a和图8b所示，成像光学器件(例如，物镜)可以与第一表面和第二表面相距合适的距离(例如，与工作距离相对应的距离)定位，以在检测通道的图像传感器上形成第一表面和第二表面的对焦图像。如图8a和图8b的示例所示，第一表面可以在所述物镜和第二表面之间。例如，如所示，物镜布置在第一表面和第二表面两者之上，并且第一表面布置在第二表面之上。第一表面和第二表面例如处于不同的深度。第一表面和第二表面与荧光成像模块、照明和成像模块、成像光学器件或物镜中的任何一个或多个相距不同的距离。第一表面和第二表面彼此分开，其中第一表面在第二表面上方间隔开。在所示的示例中，第一表面和第二表面是平面，并且沿着垂直于所述第一平面和第二平面的方向彼此分开。同样，在所示的示例中，所述物镜具有光轴，并且所述第一表面和第二表面沿所述光轴的方向彼
此分开。类似地，第一表面和第二表面之间的间隔可以对应于纵向距离，诸如沿着激发光束的光路和/或沿着穿过荧光成像模块和/或物镜的光轴。因此，这两个表面可以在纵向(z)方向上彼此分开一定距离，所述纵向方向可以沿着激发光束的中心轴和/或物镜和/或荧光成像模块的光轴的方向。在一些实施方式中，该间隔可以例如对应于流动池内的流动通道。
560.在各种设计中，物镜(可与另一个光学组件，例如镜筒透镜组合)具有至少与第一表面和第二表面之间的纵向间隔(沿z方向)一样大的景深和/或聚焦深度。因此，物镜可以单独地或与另外的光学组件组合地在一个或多个检测通道的图像传感器上同时形成第一表面和第二表面两者的对焦图像，其中这些图像具有可比较的光学分辨率。在一些实施方式中，成像模块可以需要或可以不需要重新聚焦以捕获具有可比较的光学分辨率的第一表面和第二表面两者的图像。在一些实施方式中，补偿光学器件不需要移入或移出成像模块的光路以形成第一表面和第二表面的对焦图像。类似地，在一些实施方式中，与用于形成第二表面的对焦图像时成像模块(例如，物镜和/或镜筒透镜)中的一个或多个光学元件(例如透镜元件)的位置相比，所述一个或多个光学元件不需要例如沿着第一光路和/或第二光路(例如，沿着成像光学器件的光轴)在纵向上移动以形成第一表面的对焦图像。然而，在一些实施方式中，成像模块包括自动聚焦系统，所述自动聚焦系统被配置为同时使第一表面和第二表面对焦。在各种实施方式中，将样品对焦以充分分辨样品位点，所述样品位点在横向方向(例如，x和y方向)上紧密地间隔在一起。因此，在各种实施方式中，没有光学元件进入样品载体结构(例如，支撑样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器(或光电检测器阵列)之间的光路，以形成样品载体结构的第一表面和所述样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。类似地，在各种实施方式中，没有光学补偿用于在图像传感器或光电检测器阵列上形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像，所述光学补偿与用于在图像传感器或光电检测器阵列上形成样品载体结构第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像的光学补偿不相同。另外，在某些实施方式中，与形成样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像相比，在样品载体结构(例如在支撑样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器之间的光路中没有光学元件被不同地调节以形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。类似地，在一些各种实施方式中，与在图像传感器上形成所述样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像相比，在样品载体结构(例如在支撑样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器之间的光路中没有光学元件被移动不同的量或不同的方向以在图像传感器上形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。特征的任何组合都是可能的。例如，在一些实施方式中，在无需将光学补偿器移入或移出流动池和至少一个图像传感器之间的光路并且无需使成像系统的一个或多个光学元件(例如，物镜和/或镜筒透镜)沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，可以获得流动池的上内表面和下内表面的对焦图像。例如，在无需将镜筒透镜的一个或多个光学元件移入或移出光路或者无需使镜筒透镜的一个或多个光学元件沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，可以获得流动池的上内表面和下内表面的对焦图像。
561.可以将荧光成像模块、照明光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为减少或最小化在两个位置(例如，与流动池或其他样品载体结构上的两个表面相对应的两个平面，例如发荧光的样品位点所在之处)处的光学像差。可以将荧光成像模块、照
明光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为相对于其他位置或平面减小或最小化所选位置或平面，例如在双表面流动池上包含发荧光的样品位点的第一表面和第二表面处的光学像差。例如，可以将荧光成像模块、照明光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为与位于距物镜其他距离的其他深度或平面相关的像差相比，减小或最小化位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的光学像差。例如，用于成像第一表面和第二表面的光学像差可以比距物镜约1mm至约10mm范围的区域中的其他地方更小。另外，在一些情况下，荧光成像模块、照明光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个可被配置为补偿由发射光穿过样品载体结构的一个或多个部分(例如包括样品附着在其上的表面中的一个的层以及可能与样品接触的溶液)的透射引起的光学像差。该层(例如，盖玻片或流动池的壁)可包括例如具有折射率并引入光学像差的玻璃、石英、塑料或其他透明材料。
562.因此，当对第一表面和第二表面成像时，成像性能可以基本相同。例如，对于第一表面和第二表面的成像，光学传递函数(otf)和/或调制传递函数(mtf)可以基本相同。这些传递函数中的一个或两个在一个或多个指定的空间频率下或在一系列空间频率上取平均值时可以例如在彼此的20％之内、15％之内、10％之内、5％之内、2.5％之内或1％之内，或由这些值中的任何形成的任何范围内。因此，在无需将光学补偿器移入或移出流动池和至少一个图像传感器之间的光路并且无需使成像系统(例如，物镜和/或镜筒透镜)的一个或多个光学元件沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，成像性能指标对于流动池的上内表面或下内表面成像可以是基本相同的。例如，在无需将镜筒透镜的一个或多个光学元件移入或移出光路或者无需使镜筒透镜的一个或多个光学元件沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，成像性能指标对于流动池的上内表面或下内表面成像可以是基本相同的。下文和于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723中包含了mtf的其他讨论，该申请的全部内容通过引用合并于本文。
563.本领域技术人员将理解，在一些情况下，所公开的成像模块或系统可以是设计用于对样品或基底表面成像的独立光学系统。在一些情况下，它们可以包括一个或多个处理器或计算机。在一些情况下，它们可以包括一个或多个提供仪器控制功能和/或图像处理功能的软件包。在一些情况下，除了光学组件，例如光源(例如，固态激光器、染料激光器、二极管激光器、弧光灯、钨卤素灯等)、透镜、棱镜、反射镜、二向色反射器、分束镜、光学滤波器、光学带通滤波器、光导、光纤、光圈和图像传感器(例如，互补金属氧化物半导体(cmos)图像传感器和照相机、电荷耦合器件(ccd)图像传感器和相机等)，它们还可以包括机械和/或光机械组件，例如x-y平移台、x-y-z平移台、压电聚焦机构、电光相位板等。在一些情况下，它们可以充当设计用于例如基因组学应用(例如基因测试和/或核酸测序应用)的较大系统的模块、组件、子组件或子系统。例如，在一些情况下，它们可以充当较大系统的模块、组件、子组件或子系统，这些较大系统还包括不透光和/或其他环境控制外壳、温度控制模块、流动池和盒、流体学控制模块、流体分配机器人、盒和/或微孔板处理(拾放)机器人、一个或多个处理器或计算机、一个或多个基于本地和/或基于云的软件包(例如，仪器/系统控制软件包、图像处理软件包、数据分析软件包)、数据存储模块、数据通信模块(例如，蓝牙、wifi、内联网或因特网通信硬件和相关软件)、显示模块等，或其任何组合。较大系统(例如设计用于基因组学应用的系统)的这些另外组件将在下面更详细讨论。
564.图9a和图9b示出了用于多通道荧光成像的照明和成像模块100的非限制性示例。照明和成像模块100包括物镜110、照明源115、多个检测通道120和第一二向色滤光镜130，其可以包括二向色反射器或分束镜。在一些设计中可以包括自动聚焦系统，所述自动聚焦系统可以包括自动聚焦激光器102，其例如投射光斑，所述光斑的大小被监视以确定成像系统何时对焦。照明和成像模块100的一些或全部组件可以耦合到基板105。
565.照明或光源115可以包括被配置为产生至少期望的激发波长的光的任何合适的光源(在下文中更详细地讨论)。光源可以是发射一个或多个激发波长范围(或频带)内的光的宽带光源。光源可以是窄带光源，其发射一个或多个更窄波长范围内的光。在一些情况下，光源可以产生与期望的激发波长相对应的单个单独的波长(或线)，或者多个单独的波长(或线)。在一些情况下，线可以具有一些非常窄的带宽。可以适合用于照明源115的示例光源包括但不限于白炽灯丝、氙弧灯、汞蒸气灯、发光二极管、激光源(例如激光二极管)或固态激光器或其他类型的光源。如下所述，在一些设计中，光源可以包括偏振光源，例如线性偏振光源。在一些实施方式中，光源的取向使得s偏振光入射在一个或多个光学组件的一个或多个表面上，例如一个或多个二向色滤光镜的二向色反射表面上。
566.照明源115还可以包括一个或多个另外的光学组件，例如透镜、滤光器、光纤或任何其他合适的透射或反射光学器件，以向第一二向色滤光镜130输出具有合适特性的激发光束。例如，可以包括光束整形光学器件，以例如接收来自光源中的光发射器的光并产生光束和/或提供期望的光束特性。这样的光学器件可以例如包括准直透镜，所述准直透镜被配置为减小光的发散和/或增加准直和/或使光准直。
567.在一些实施方式中，照明和成像模块100中包括多个光源。在一些这样的实施方式中，不同的光源可以产生具有不同的光谱特性的光，例如，以激发不同的荧光染料。在一些实施方式中，由不同光源产生的光可以被引导以重合并形成聚集的激发光束。该复合激发光束可以由来自每个光源的激发光束构成。与重叠以形成复合光束的单个光束相比，复合激发光束将具有更大的光功率。例如，在包括产生两个激发光束的两个光源的一些实施方式中，由两个单独的激发光束形成的复合激发光束可以具有作为单独的光束的光功率之和的光功率。类似地，在一些实施方式中，可以包括三个、四个、五个或更多个光源，并且这些光源可以各自输出激发光束，所述激发光束一起形成具有光功率为各个光束的光功率之和的复合光束。
568.在一些实施方式中，光源115输出足够大量的光以产生足够强的荧光发射。较强的荧光发射可以增加荧光成像模块获取的图像的信噪比(snr)和对比度噪声比(cnr)。在一些实施方式中，光源和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的输出的功率范围可以为约0.5w至约5.0w，或更大(如将在下面更详细地讨论的)。
569.再次参考图9a和图9b，第一二向色滤光镜130相对于光源布置以从其接收光。第一二向色滤光镜可以包括二向色镜、二向色反射器、二向色分束镜或二向色合束镜，其被配置为透射第一光谱区域(或波长范围)中的光并反射具有第二光谱区域(或波长范围)的光。第一光谱区域可以包括一个或多个光谱带，例如，在紫外光和蓝光波长范围内的一个或多个光谱带。类似地，第二光谱区域可以包括一个或多个光谱带，例如，从绿光到红光和红外光波长延伸的一个或多个光谱带。其他光谱区域或波长范围也是可能的。
570.在一些实施方式中，第一二向色滤光镜可以被配置为将来自光源的光透射到样品
载体结构，例如显微镜载玻片、毛细管、流动池、微流体芯片或其他基底或载体结构。样品载体结构相对于照明和成像模块100支撑并定位样品，例如包含经荧光标记的核酸分子或其互补序列的组合物。因此，第一光路经由第一二向色滤光镜从光源延伸至样品。在各种实施方式中，样品载体结构包括至少一个表面，在所述至少一个表面上布置样品或将样品结合到所述至少一个表面上。在一些情况下，样品可以被布置在以下中或结合至以下：样品载体结构的至少一个表面上的不同的局部区域或位点。
571.在一些情况下，载体结构可以包括两个表面，所述两个表面距物镜110的距离不同(即，沿物镜110的光轴位于不同位置或深度)，样品布置在所述两个表面上。如下所述，例如，流动池可以包括至少部分地由第一和第二(例如，上和下)内表面形成的流体通道，并且样品可以布置在第一内表面、第二内表面或两个内表面上的局部位点处。第一表面和第二表面可以由与溶液流过的流体通道相对应的区域分开，并且因此相对于照明和成像模块100的物镜110处于不同的距离或深度。
572.物镜110可以被包括在第一二向色滤光镜和样品之间的第一光路中。该物镜可以被配置为例如具有焦距长度、工作距离、和/或被定位成将来自光源的光聚焦到样品上，例如显微镜载玻片、毛细管、流动池、微流体芯片或其他基质或载体结构的表面上。类似地，物镜110可被配置为具有合适的焦距长度、工作距离、和/或被定位为收集从样品反射、散射或发射的光(例如，荧光发射)，并形成样品的图像(例如荧光图像)。
573.在一些实施方式中，物镜110可以包括显微镜物镜，例如现成的物镜。在一些实施方式中，物镜110可以包括定制物镜。定制物镜和/或定制物镜-镜筒透镜组合的示例在下文以及于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723(其全部内容通过引用合并于本文)中进行了描述。物镜110可以被设计为减小或最小化在两个位置，例如与流动池或其他样品载体结构的两个表面相对应的两个平面处的光学像差。物镜110可以被设计为相对于光路中的其他位置或平面减小在所选位置或平面(例如，双表面流动池的第一表面和第二表面)处的光学像差。例如，物镜110可以被设计为与和距物镜其他距离的其他深度或平面相关的光学像差相比，减小位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的光学像差。例如，在一些情况下，用于成像流动池的第一表面和第二表面的光学像差可以比在距物镜前表面1至10mm跨度的区域中的其他地方显示的像差更小。另外，定制物镜110在一些情况下可以被配置为补偿由荧光发射光通过样品载体结构的一个或多个部分(例如包含一个或多个流动池表面(其上布置有样品)的层，或包含填充流动池的流体通道的溶液的层)的透射所引起的光学像差。这些层可以包括例如玻璃、石英、塑料或具有折射率并且可以引入光学像差的其他透明材料。
574.在一些实施方式中，物镜110可具有0.6或更大的数值孔径(na)(如下文更详细地讨论)。这样的数值孔径可以提供减小的聚焦深度和/或景深、改善的背景辨别力以及增加的成像分辨率。
575.在一些实施方式中，物镜110可具有0.6或更小的数值孔径(na)(如下文更详细地讨论)。这样的数值孔径可以提供增加的聚焦深度和/或景深。这种增加的聚焦深度和/或景深可以提高对相隔一定距离的平面进行成像的能力，例如，所述一定距离将双表面流动池的第一表面和第二表面分开。
576.如上所述，流动池可包括例如第一层和第二层，其分别包括第一内表面和第二内
表面，所述第一内表面和第二内表面由流体通道隔开，分析物或试剂可流过所述流体通道。在一些实施方式中，物镜110和/或照明和成像模块100可以被配置为提供足够大的景深和/或聚焦深度，从而以相当的光学分辨率顺序地(通过在成像第一表面和第二表面之间重新聚焦成像模块)或同时地(通过确保足够大的景深和/或聚焦深度)对流动池的第一内表面和第二内表面成像。在一些情况下，景深和/或聚焦深度可以至少等于或大于将要被成像的流动池的第一表面和第二表面(例如流动池的第一内表面和第二内表面)分开的距离。在一些情况下，第一表面和第二表面，例如双表面流动池或其他样品载体结构的第一内表面和第二内表面，例如可以以约10μm至约700μm的范围或更大的距离分开(如下面将更详细讨论的)。因此，在一些情况下，景深和/或聚焦深度可以在约10μm至约700μm范围内，或者更大(如下面将更详细讨论的)。
577.在一些设计中，补偿光学器件(例如，“光学补偿器”或“补偿器”)可以移入或移出成像模块中的光路，例如，由物镜110收集的光被传递到图像传感器所通过的光路，以使成像模块能够成像双表面流动池的第一表面和第二表面。成像模块可以被配置为，当补偿光学器件被包括在物镜和被配置为捕获第一表面的图像的图像传感器或光电检测器阵列之间的光路中时，例如对第一表面进行成像。在这样的设计中，成像模块可以被配置为，当从物镜110和被配置为捕获第二表面的图像传感器或光电检测器阵列之间的光路中去除或不包括补偿光学器件时，对第二表面成像。当使用具有高数值孔径(na)值(例如，对于至少0.6、至少0.65、至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.85、至少0.9、至少0.95、至少1.0或更高的数值孔径值)的物镜110时，对光学补偿器的需求可能会更加明显。在一些实施方式中，光学补偿光学器件(例如，光学补偿器或补偿器)包括折射光学元件(例如透镜)，光学透明材料板(例如玻璃)，光学透明材料板(例如玻璃)，或者在偏振光束情况下的四分之一波长板或半波长板等。可以采用其他配置以使第一表面和第二表面能够在不同时间成像。例如，一个或多个透镜或光学元件可以被配置为在物镜110和图像传感器之间的光路中移入和移出或沿其平移。
578.然而，在某些设计中，物镜110被配置为提供足够大的聚焦深度和/或景深，以使得第一表面和第二表面能够以相当的光学分辨率成像，无需此类补偿光学器件移入和移出成像模块中的光路，例如物镜与图像传感器或光电检测器阵列之间的光路。类似地，在各种设计中，物镜110被配置为提供足够大的聚焦深度和/或景深，以使得第一表面和第二表面能够以相当的光学分辨率成像，无需移动光学器件，例如无需将一个或多个透镜或其他光学组件沿着成像模块中的光路(例如物镜与图像传感器或光电检测器阵列之间的光路)平移。这种物镜的示例将在下面更详细地描述。
579.在一些实施方式中，物镜(或显微镜物镜)110可以被配置为具有减小的放大率。物镜110可以被配置为例如使得荧光成像模块具有从小于2倍到小于10倍的放大率(如将在下面更详细地讨论的)。这种减小的放大率可以改变设计约束，使得可以实现其他设计参数。例如，物镜110也可以被配置为使得荧光成像模块具有大的视场(fov)，其范围例如为约1.0mm至约5.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)，如将在下面更详细地讨论的。
580.在一些实施方式中，物镜110可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得fov具有衍射受限性能，例如，在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中小于0.15波的像差，如将在下面更详细地讨论的。
581.在一些实施方式中，物镜110可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得fov具有衍射受限性能，例如，在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中斯特列尔比大于0.8，如将在下面更详细地讨论的。
582.再次参考图9a和9b，第一二向色分束镜或合束镜布置在光源和样品之间的第一光路中，以用一个或多个激发光束照射样品。该第一二向色分束镜或合束镜也在从样品到用于检测荧光发射的不同光通道的一个或多个第二光路中。因此，第一二向色滤光镜130将由照明源115发射的激发光束的第一光路和由样品样本发射的发射光的第二光路耦合到各个光通道，在所述光通道中，光被导引至用于捕获样品图像的相应图像传感器或光电检测器阵列。
583.在各种实施方式中，第一二向色滤光镜130(例如，第一二向色反射器或分束镜或合束镜)具有被选择为仅在指定的波长带内或可能在多个波长带(包括所需的一个或多个激发波长)内透射来自照明源115的光的通带。例如，第一二向色分束镜130包括具有二向色反射器的反射面，所述二向色反射器具有光谱透射率响应，即例如被配置为透射由光源输出的具有至少一些波长的光，其形成激发光束的一部分。光谱透射率响应可以被配置为不透射(例如，而是反射)一个或多个其他波长的光，例如一个或多个其他荧光发射波长的光。在一些实施方式中，光谱透射率响应也可以被配置为不透射(例如，而是反射)由光源输出的一个或多个其他波长的光。因此，第一二向色滤光镜130可以用于选择光源输出的光的哪个波长或哪些波长到达样品。相反，第一二向色分束镜130中的二向色反射器具有光谱反射率响应，所述光谱反射率响应反射具有与来自样品的期望的荧光发射相对应的一个或多个波长的光，并且可能反射从光源输出的具有一个或多个波长的不意图到达样品的光。因此，在一些实施方式中，二向色反射器具有光谱透射率，其包括一个或多个通带，用于透射要入射到样品上的光；和一个或多个阻带，其反射通带外的光，例如，一个或多个发射波长的光，以及由光源输出的不意图到达样品的可能的一个或多个波长的光。同样，在一些实施方式中，二向色反射器具有光谱反射率，其包括一个或多个光谱区域(该一个或多个光谱区域被配置为反射一个或多个发射波长以及由光源输出的不意图到达样品的可能的一个或多个波长)，并且包括一个或多个在这些反射区域之外透射光的区域。包括在第一二向色滤光镜130中的二向色反射器可以包括反射滤光器，诸如被配置为提供适当的光谱透射和反射分布的干涉滤光器(例如，四分之一波长堆叠)。图9a和图9b还示出了二向色滤光镜105，其可以包括例如二向色分束镜或合束镜，其可以用于引导自动聚焦激光器102穿过物镜并到达样品载体结构。
584.尽管图9a和图9b中示出并且如上所述的成像模块100被配置为使得激发光束被第一二向色滤光镜130透射至物镜110，但在一些设计中，照明源115可以相对于第一二向色滤光镜130布置和/或第一二向色滤光镜被配置(例如取向)为使得激发光束被第一二向色滤光镜130反射到物镜110。类似地，在一些这样的设计中，第一二向色滤光镜130被配置为透射来自样品的荧光发射，并且可能透射从光源输出的不意图到达样品的具有一个或多个波长的光。如将在下面讨论的那样，透射而不是反射荧光发射的设计可以潜在地减小检测到的发射中的波前误差和/或可能具有其他优点。在任何一种情况下，在各种实施方式中，第一二向色反射器130布置在第二光路中，以接收来自样品的荧光发射，其中至少一些继续到达检测通道120。
585.图10a和10b示出了图10a和10b的多通道荧光成像模块内的光路。在图10a和图10a中显示的示例中，检测通道120被布置为接收来自样品样本的荧光发射，其由物镜110透射并由第一二向色滤光镜130反射。如上文所提及且在下文中更详细地描述的，在一些设计中，检测通道120可以被布置为接收由第一二向色滤光镜透射而不是反射的发射光的一部分。在任一情况下，检测通道120可以包括用于接收至少一部分发射光的光学器件。例如，检测通道120可以包括一个或多个透镜，例如镜筒透镜，并且可以包括一个或多个图像传感器或检测器，例如用于成像或以其他方式基于接收到的光产生信号的光电检测器阵列(例如，ccd或cmos传感器阵列)。镜筒透镜可以例如包括一个或多个透镜元件，其被配置为将样品的图像形成到传感器或光电检测器阵列上以捕获其图像。下文和于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723中包含了检测通道的其他讨论，该申请的全部内容通过引用合并于本文。在一些情况下，结合适当的采样方案(包括过采样或欠采样)，使用具有相对较高的灵敏度、小像素和高像素计数的图像传感器可以实现改善的光学分辨率。
586.图10a和10b是示出图9a和9b的照明和成像模块100的光路的射线追迹图。图10a对应于照明和成像模块100的顶视图。图10b对应于照明和成像模块100的侧视图。这些图中示出的照明和成像模块100包括四个检测通道120。然而，将理解，所公开的照明和成像模块可以等同地在包括多于或少于四个检测通道120的系统中实现。例如，在不背离本公开的精神或范围的情况下，本文公开的多通道系统可以用少至一个检测通道120、或多达两个检测通道120、三个检测通道120、四个检测通道120、五个检测通道120、六个检测通道120、七个检测通道120、八个检测通道120或多于八个的检测通道120来实现。
587.图10a和10b中所示的成像模块100的非限制性示例包括四个检测通道120、第一二向色滤光镜130(其反射发射光束150)、第二二向色滤光镜(例如，二向色分束镜)135(其将光束150分成透射部分和反射部分)和两个通道特异性二向色滤光镜(例如，二向色分束镜)140(其进一步将光束150的透射和反射部分在各个检测通道120之间拆分)。示出了用于在检测通道之间拆分光束150的二向色分束镜135和140中的二向色反射表面相对于光束150的中心光束轴或成像模块的光轴成45度布置。但是，如下所述，可以采用小于45度的角度，并且可以提供诸如从通带到阻带的更陡峭过渡的优点。
588.不同的检测通道120包括成像设备124，成像设备124可以包括图像传感器或光电检测器阵列(例如ccd或cmos检测器阵列)。不同的检测通道120还包括光学器件126，例如透镜(例如，一个或多个镜筒透镜，各自包括一个或多个透镜元件)，其布置成将进入检测通道120的一部分发射光聚焦在与光电检测器阵列124平面重合的焦平面上。与物镜110组合的光学器件126(例如，镜筒透镜)被配置为将样品的图像形成在光电检测器阵列124上以捕获样品的图像，例如，在样品结合到流动池或其他样品载体结构上的表面后，所述表面的图像。因此，样品的这种图像可以包括在样品载体结构的空间范围内的其中样品正在发射荧光的多个荧光发射点或区域。物镜110与光学器件126(例如，镜筒透镜)一起可以提供包括样品的一部分或整个样品的视场(fov)。类似地，不同检测通道120的光电检测器阵列124可以被配置为捕获由物镜和镜筒透镜提供的全视场(fov)或其一部分的图像。在一些实施方式中，一些或所有检测通道120的光电检测器阵列124可以检测由布置在样品载体结构，例如流动池的表面或其一部分上的样品发射的发射光，并记录代表其图像的电子数据。在一些实施方式中，一些或所有检测通道120的光电检测器阵列124可以检测由样本发射的发射
光中的特征，而无需捕获和/或存储布置在流动池表面上的样品的图像和/或由物镜和光学器件126和/或122(例如镜筒透镜的元件)提供的全视场(fov)的图像。在一些实施方式中，所公开的成像模块(例如，由物镜110和光学器件126和/或122的组合所提供的)的fov可以在例如约1mm与5mm之间的范围内(例如在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)，如下所述。可以例如选择fov以提供成像模块的放大率和分辨率之间的平衡和/或基于图像传感器和/或物镜的一个或多个特性选择fov。例如，可以结合更小和更快的成像传感器来提供相对较小的fov以实现高通量。
589.再次参考图10a和10b，在一些实施方式中，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为减少使用光学器件126结合物镜110获取的图像中的光学像差。在一些包括用于以不同的发射波长成像的多个检测通道实施方式中，用于不同的检测通道的光学器件126(例如，镜筒透镜)具有不同的设计，以减少针对该特定通道被配置用于成像的各个发射波长的像差。在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为当对包括布置在其上的发荧光的样品的样品载体结构上的特定表面(例如，平面、物平面等)成像时，与其他位置(例如，对象空间中的其他平面)相比减小像差。类似地，在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为在对具有布置在其上的发荧光的样品位点的双表面样品载体结构(例如双表面流动池)上的第一表面和第二表面(例如第一平面和第二平面，第一物平面和第二物平面等)成像时，与其他位置(例如，对象空间中的其他平面)相比减小像差。例如，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被设计为与距物镜其他距离的其他深度或平面相关的像差相比，减小位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的像差。例如，与距物镜约1mm至约10mm的区域中的其他地方相比，用于成像第一表面和第二表面的光学像差可以更小。另外，在一些实施方案中，检测通道中的定制光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为补偿由于发射光穿过样品载体结构的一个或多个部分(诸如包括其上布置样品的表面中的一个的层以及可能的与其上布置样品的表面邻近并且接触的溶液)的透射而引起的像差。包括其上布置样品的表面中的一个的层可以包括例如玻璃、石英、塑料或其他具有折射率并且引入光学像差的透明材料。例如，在一些实施方式中，检测通道中的定制光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为补偿由样品载体结构(例如盖玻片或流动池壁)或其他样品载体结构组件以及可能的与布置样品的表面邻近并与其接触的溶液引起的光学像差。
590.在一些实施方式中，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)被配置为具有减小的放大率。检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为例如使得荧光成像模块具有小于例如10倍的放大率，如将在下面进一步讨论的。这种减小的放大率可以改变设计约束，使得可以实现其他设计参数。例如，光学器件126(例如镜筒透镜)也可以被配置为使得荧光成像模块具有例如至少1.0mm或更大(例如，直径、宽度、长度或最长尺寸方面)的大视场(fov)，如将在下面进一步讨论的。
591.在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得fov在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中具有小于0.15波的像差，如将在下面进一步讨论的。
592.再次参考图10a和10b，在各种实施方式中，样品位于物镜110的焦点位置112处或附近。如以上参考图9a和9b所述，诸如激光源的光源向样品提供激发光束以诱导荧光。物镜
110将荧光发射的至少一部分收集为发射光。物镜110将发射光朝向第一二向色滤光镜130透射，该第一二向色滤光镜130将一部分或全部发射光反射作为光束150，该光束150入射到第二二向色滤光镜135上并到达不同的检测通道，每个检测通道包括光学器件126，其将样品(例如，样品载体结构的表面上的多个发荧光的样品位点)的图像形成在光电检测器阵列124上。
593.如上所述，在一些实施方式中，样品载体结构包括流动池，例如双表面流动池，其具有两个表面(例如，两个内表面，第一表面和第二表面等)，所述两个表面包含发射荧光发射的样品位点。这两个表面可以沿着激发光束的中心轴和/或物镜的光轴的方向在纵向(z)方向上彼此分开一定距离。该分开可以例如对应于流动池内的流动通道。分析物或试剂可以流过该流动通道并与流动池的第一内表面和第二内表面接触，从而可以使其与结合组合物接触，使得使荧光发射从第一内表面和第二内表面上的多个位点发出。成像光学器件(例如，物镜110)可以被定位在距样品合适的距离(例如，对应于工作距离的距离)处，以在一个或多个检测器阵列124上形成样品的对焦图像。如上所述，在各种设计中，物镜110(可能与光学器件126组合)可具有至少与第一表面和第二表面之间的纵向间距一样大的景深和/或聚焦深度。因此，物镜110和(每个检测通道的)光学器件126可以同时在光电检测器阵列124上形成第一流动池表面和第二流动池表面两者的图像，并且这些第一表面和第二表面的图像都对焦并且具有相当的光学分辨率(或仅通过对物体进行较小的重新聚焦即可进行聚焦，以获取具有相当的光学分辨率的第一表面和第二表面的图像)。在各种实施方式中，补偿光学器件无需移入或移出成像模块的光路(例如，移入或移出第一光路和/或第二光路)以形成具有相当的光学分辨率的第一表面和第二表面的对焦图像。类似地，在各种实施方式中，与用于形成第二表面的对焦图像时成像模块(例如，物镜110或光学器件126)中的一个或多个光学元件(例如透镜元件)的位置相比，所述一个或多个光学元件不需要例如沿着第一光路和/或第二光路在纵向上移动以形成第一表面的对焦图像。在一些实施方式中，成像模块包括自动聚焦系统，其被配置为快速且顺序地将成像模块重新聚焦在第一表面和/或第二表面上，使得图像具有相当的光学分辨率。在一些实施方式中，物镜110和/或光学器件126被配置为使得第一流动池表面和第二流动池表面两者同时以相当的光学分辨率对焦，而无需将光学补偿器移入或移出第一光路和/或第二光路，且无需沿第一光路和/或第二光路纵向移动一个或多个透镜元件(例如，物镜110和/或光学器件126(例如镜筒透镜))。在一些实施方式中，使用本文公开的新颖的物镜和/或镜筒透镜设计顺序地(例如，通过在表面之间重新聚焦)或同时地(例如，无需在表面之间重新聚焦)获取的第一表面和/或第二表面的图像可以使用合适的图像处理算法来进一步处理，以增强图像的有效光学分辨率，使得第一表面和第二表面的图像具有相当的光学分辨率。在各种实施方式中，样品平面足够对焦以分辨第一流动池表面和/或第二流动池表面上的样品位点，样品位点在横向方向(例如，在x和y方向上)上紧密间隔。
594.如上所述，二向色滤光镜可以包括干涉滤光镜，其使用具有不同折射率和特定厚度的光学涂层来基于薄膜干涉原理选择性地透射和反射不同波长的光。因此，在多通道荧光成像模块内实现的二向色滤光镜的光谱响应(例如，透射和/或反射光谱)可以至少部分取决于激发光束和/或发射光束的光入射到二向色滤光镜上的入射角或入射角范围。关于检测光路的二向色滤光镜(例如，图10a和图10b的二向色滤光镜135和140)，这样的效果可
能特别显著。
595.在一些实施方式中，适于产生窄光束直径(具有导致更清晰的最小发散度)的物镜的焦距长度可以比荧光显微镜或成像系统中通常采用的那些焦距长度更长。例如，在一些实施方式中，物镜的焦距长度可以在20mm至40mm的范围内，如将在下面进一步讨论的。在一个示例中，具有36mm的焦距长度的物镜510可以产生光束550，其特征在于发散度足够小，使得光束550的整个直径上的光以中心光束轴的入射角的2.5度以内的角度入射到第二二向色滤光镜535上。
596.在所公开的成像模块的一些实施方式中，可以利用激发光束的偏振态来进一步改善本文所公开的多通道荧光成像模块的性能。返回参考图9a和图9b，例如，本文公开的多通道荧光成像模块的一些实施方式具有落射荧光配置，其中第一二向色滤光镜130合并激发光束和发射光束的光路，使得激发光和发射光都透射通过过物镜110。如上所述，照明源115可以包括光源，诸如激光或提供形成激发光束的光的其他光源。在一些设计中，光源包括线性偏振光源，并且激发光束可以是线性偏振的。在一些设计中，包括偏振光学器件以使光偏振和/或旋转光的偏振。例如，可以在激发光束的光路中包括偏振器(诸如线性偏振器)以使激发光束偏振。在一些设计中，可以包括延迟器(例如半波延迟器或多个四分之一波延迟器或具有其他延迟量的延迟器)，以旋转线性极化。
597.当线性偏振激发光束入射到任何二向色滤光镜或其他平面界面上时，它可以是p偏振的(例如，具有平行于入射平面的电场分量)、s偏振的(例如，具有垂直于入射平面的电场分量)，或者在光束内可以具有p偏振和s偏振状态的组合。可以通过选择照明源115和/或其一个或多个组件相对于第一二向色滤光镜130和/或相对于激发光束将与之相互作用的任何其他表面的取向来选择和/或改变激发光束的p偏振状态或s偏振状态。在光源输出线性偏振光的一些实施方式中，光源可以被配置为提供s偏振光。例如，光源可以包括诸如固态激光器或激光二极管的发射器，其可以围绕其光轴或光束的中心轴旋转以使从其输出的线性偏振光定向。可替代地或另外地，可以采用延迟器来使线性偏振绕光轴或光束的中心轴旋转。如上所述，在一些实施方式中，例如当光源不输出偏振光时，布置在激发光束的光路中的偏振器可使激发光束偏振。例如，在一些设计中，线性偏振器布置在激发光束的光路中。可以旋转该偏振器以提供线性偏振的适当取向，以提供s偏振光。
598.在一些设计中，将线性偏振绕光轴或光束的中心轴旋转，使得s偏振入射在二向色分束镜的二向色反射器上。当s偏振光入射到二向色分束镜的二向色反射器上时，通带和阻带之间的过渡更陡峭，这与p偏振光入射到二向色分束镜的二向色反射器上时相反。
599.如上所述，在一些实施方式中，可以使用偏振器(诸如线性偏振器)来使激发光束偏振。可以旋转该偏振器以提供与s偏振光相对应的线性偏振光的取向。同样如上所述，在一些实施方式中，可以使用其他旋转线性偏振光的方法。例如，光学延迟器(诸如半波延迟器或多种四分之一波延迟器)可以用于旋转偏振方向。其他设置也是可能的。
600.如本文其他地方所讨论的，减小荧光成像模块和/或物镜的数值孔径(na)可以增加景深，以使得能够对两个表面进行相当的成像。图11a-图11b，图11a-图11b和图13a-图13b示出了对于较小的数值孔径，相比于较大的数值孔径，在用1mm玻璃隔开的第一表面和第二表面上，mtf如何更相似。图11a和图11b示出了在第一(图11a)表面和第二(图11b)表面处对于na为0.3的mtf。图12a和图12b示出了在第一(图12a)表面和第二(图12b)表面处对于
na为0.5的mtf。图13a和图13b示出了在第一(图13a)表面和第二(图13b)表面处对于na为0.7的mtf。这些图的每一个中的第一表面和第二表面对应于例如流动池的顶表面和底表面。
601.图14a-图14b提供了用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的所计算的斯特列尔比(即，由光学系统聚焦或收集的峰值光强度与由理想光学系统和点光源聚焦或收集的峰值光强度之比)的图。图14a示出了对于不同物镜和/或光学系统数值孔径，作为中间流体层厚度(流体通道高度)的函数的用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的斯特列尔比的图。如图所示，斯特列尔比随着第一表面和第二表面之间的间隔增大而减小。因此，随着两个表面之间的间隔增加，这些表面中的一个将具有劣化的图像质量。与具有较大数值孔径的成像系统相比，对于具有较小数值孔径的成像系统，随着两个表面之间间隔距离的增加，第二表面成像性能的降低得以减小。图14b示出了针对通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像和厚度为0.1mm的中间水层，作为数值孔径的函数的斯特列尔比的图。在较高数值孔径下成像性能的损失可能归因于由用于第二表面成像的流体引起的光学像差增加。随着na的增加，由用于第二表面成像的流体引入的增加的光学像差会大大降低图像质量。但是，通常，减小光学系统的数值孔径会降低可达到的分辨率。通过提供增加的样品平面(或物平面)对比度噪声比，例如通过使用用于核酸测序应用的化学试剂(其增强经标记的核酸簇的荧光发射和/或降低背景荧光发射)，图像质量的损失可以至少部分抵消。在一些情况下，例如，可以使用包括亲水性基底材料和/或亲水性涂层的样品载体结构。在一些情况下，此类亲水性基底和/或亲水性涂层可降低背景噪声。可以在下面找到对样品载体结构、亲水性表面和涂层以及用于增强对比度噪声比的方法(例如用于核酸测序应用)的其他讨论。
602.在一些实施方式中，荧光成像系统、照明和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个被配置为具有减小的放大率，例如小于10倍的放大率，如以下将进一步讨论的。这种减小的放大率可以调整设计约束，使得可以实现其他设计参数。例如，荧光显微镜、照明和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个也可以被配置为使得荧光成像模块具有大的视场(fov)，例如，至少3.0mm或更大(例如，在直径、宽度、高度或最长尺寸方面)的视场，如以下将进一步讨论的。荧光成像系统、照明和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个可被配置为向荧光显微镜提供这种视场，该视场使得fov在至少80％的视场上具有小于例如0.1波的像差。类似地，荧光成像系统、照明和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个可以被配置为使得荧光成像模块具有这种fov并且是衍射受限的，或者在此fov上是衍射受限的。
603.如上所述，在各种实施方式中，所公开的光学系统提供了大视场(fov)。在一些实施方式中，通过使用较大的图像传感器或光电检测器阵列来部分地促进获得增加的fov。光电检测器阵列例如可以具有其中对角线至少为15mm或更大的有效区域，如将在下面进一步讨论的。如上所述，在一些实施方式中，所公开的光学成像系统提供减小的放大率，例如小于10倍的放大率，这可以促进大的fov设计。尽管放大率降低，但是成像模块的光学分辨率可仍然足够，因为可以使用具有小的像素尺寸或间距的检测器阵列。像素尺寸和/或间距例
如可以是约5μm或更小，如将在下面更详细地讨论的。在一些实施方式中，像素尺寸小于由光学成像系统(例如，物镜和镜筒透镜)提供的光学分辨率的两倍，以满足奈奎斯特定理。因此，图像传感器的像素尺寸和/或间距可以使得成像模块的空间采样频率至少是成像模块的光学分辨率的两倍。例如，光电检测器阵列的空间采样频率可以是荧光成像模块(例如，照明和成像模块、物镜和镜筒透镜、物镜和检测通道中的光学器件126、样品载体结构或平台(被配置用于支撑样品载体平台)和光电检测器阵列之间的成像光学器件)的光学分辨率的至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍，或者是这些值中的任何之间的范围内的任何空间采样频率。
604.尽管本文针对荧光成像模块讨论了广泛的特征，但是本文描述的任何特征和设计可以应用于其他类型的光学成像系统，包括但不限于明场和暗场成像，并且可以应用于发光或磷光成像。
605.用于较厚的盖玻片的改善或优化的物镜和/或镜筒透镜：现有的设计实践包括物镜的设计和/或使用常用的现成显微镜物镜来优化通过薄(例如《200μm厚)显微镜盖玻片获取图像时的图像质量。当用于在流体通道或流动池的两侧成像时，两个表面之间的间隙的额外高度(即，流体通道的高度；通常约为50μm至200μm)会在为流体通道的非最佳侧捕获的图像中引入光学像差，从而导致光学分辨率降低。这主要是因为与最佳盖玻片厚度相比，另外的间隙高度是显著的(典型的流体通道或间隙高度为50-200μm，相对于盖玻片厚度《200μm)。另一种常见的设计实践是，当要在流体通道或流动池的非最佳侧进行成像时，在光路中使用另外的“补偿”透镜。该“补偿”透镜和将其移入或移出光路所需的机构(以便可以对流动池的两侧进行成像)进一步增加了系统复杂性和成像系统停机时间，并可能由于振动等而降低图像质量。
606.在本公开中，成像系统被设计用于与包括较厚的盖玻片或流动池壁(厚度≥700μm)的流动池耗材兼容。可以针对等于真实盖玻片厚度加上有效间隙厚度的一半(例如，700μm 1/2*流体通道(空隙)高度)的盖玻片，改善或优化物镜设计。这种设计显著降低了间隙高度对流体通道两个表面的图像质量的影响，并且平衡了两个表面的图像的光学质量，因为间隙高度相对于盖玻片的总厚度较小，因此对光学质量的影响降低。
607.使用较厚的盖玻片的其他优点包括在制造过程中改善了对厚度公差误差的控制，并降低了盖玻片由于热应力和安装诱导应力产生变形的可能性。盖玻片的厚度误差和变形会对流动池的顶表面和底表面两者的成像质量产生不利影响。
608.为了进一步改善用于测序应用的双表面成像质量，我们的光学系统设计着重于在最适于成像和分辨小斑点或簇的中等空间频率至高空间频率范围内改善或优化mtf(例如，通过改善或优化物镜和/或镜筒透镜设计)。
609.改善或优化的镜筒透镜设计，用于与市售的现成物镜组合使用：对于低成本测序器设计，由于其价格相对较低，因此可优选使用市售的现成物镜。但是，如上所述，低成本的现成的物镜主要针对厚度约为170μm的薄盖玻片使用而进行了优化。在一些情况下，所公开的光学系统可以利用镜筒透镜设计，该镜筒透镜设计补偿较厚的流动池盖玻片，同时能够在双表面成像应用中针对流动池的两个内表面实现高图像质量。在一些情况下，本文公开的镜筒透镜设计能够在无需将光学补偿器移入或移出流动池和图像传感器之间的光路的情况下，在无需沿光路移动镜筒透镜的一个或多个光学元件或组件情况下，以及在无需将
镜筒透镜的一个或多个光学元件或组件移入或移出光路情况下，对流动池的两个内表面进行高质量成像。
610.图15提供了用于低光物镜设计的光学射线追迹图，所述低光物镜设计已进行了改善或优化，以对0.17mm厚的盖玻片的相对侧上的表面进行成像。该物镜的调制传递函数图(如图16所示)表示当与设计用于0.17mm厚的盖玻片一起使用时，近衍射受限的成像性能。
611.图17提供了当用于对0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图15中示出的相同物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。在约100条线/mm至约800条线/mm(或个周期/mm)的空间频率范围内，mtf值的相对较小的偏差表明，即使使用0.3mm厚的盖玻片时，所获得的图像质量仍然是合理的。
612.图18提供了当用于对与0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚的水性流体层的表面成像时(即，对于流动池的双面成像在对远表面进行成像时遇到的那种条件下)，图15中示出的相同物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。从图18的图中可以看出，在约50lp/mm至约900lp/mm的空间频率范围内，mtf曲线与理想的衍射受限情况的偏差表明成像性能下降。
613.图19和图20提供了当使用图15所示的物镜通过1.0mm厚的盖玻片成像时以及当上内表面和下内表面被0.1mm厚的水性流体层隔开时，流动池的上(或近)内表面(图19)和下(或远)内表面(图20)的随空间频率变化的调制传递函数的图。可以看出，两个表面的成像性能都大大降低。
614.图21提供了用于镜筒透镜设计的射线追迹图，如果与图15中示出的物镜结合使用，则所述镜筒透镜设计提供通过1mm厚的盖玻片的改善的双面成像。包括复合物镜(透镜元件702、703、704、705、706、707、708、709和710)和镜筒透镜(透镜元件711、712、713和714)的光学设计700得以改善或优化，用于与流动池(其包括厚盖玻片(或壁)，例如，厚度大于700μm，并且流体通道厚度至少为50μm)一起使用，并将来自流动池701的内表面的图像传输到图像传感器715，其中光学图像质量得到显著改善，并且cnr更高。
615.在一些情况下，镜筒透镜(或镜筒透镜组件)可包括至少两个光学透镜元件、至少三个光学透镜元件、至少四个光学透镜元件、至少五个光学透镜元件、至少六个光学透镜元件、至少七个光学透镜元件、至少八个光学透镜元件、至少九个光学透镜元件、至少十个光学透镜元件或更多，其中光学透镜元件的数量、每个元件的表面几何形状以及它们在组装件中的放置顺序得以改善或优化，以校正由流动池的厚壁引起的光学像差，并且在一些情况下，允许人们使用市售的现成物镜，同时仍保持高质量的双面成像能力。
616.在一些情况下，如图21所示，镜筒透镜组装件可依次包括第一不对称凸-凸透镜711、第二凸-平透镜712、第三不对称凹-凹透镜713和第四不对称凸-凹透镜714。
617.图22和图23提供了当使用物镜(针对0.17mm盖玻片校正)和图21所示的镜筒透镜组合通过1.0mm厚的盖玻片成像时以及当上内表面和下内表面被0.1mm厚的水性流体层隔开时，流动池的上(或近)内表面(图23)和下(或远)内表面(图23)的随空间频率变化的调制传递函数的图。可以看出，获得的成像性能几乎是对于衍射受限的光学设计所预期的。
618.特定于成像通道的镜筒透镜的适配或优化：在成像系统设计中，有可能针对所有成像通道在相同波长区域中改善或优化物镜和镜筒透镜两者。通常，相同的物镜由所有成像通道共享，并且每个成像通道或者使用相同的镜筒透镜，或者具有共享相同设计的镜筒
透镜。
619.在一些情况下，本文公开的成像系统还可包括用于每个成像通道的镜筒透镜，其中已经针对特定成像通道独立地改善或优化了镜筒透镜，以改善图像质量，例如，以减少或最小化畸变和场曲率，并改善每个通道的景深(dof)性能。由于每个特定成像通道的波长范围(或带通)比所有通道的组合波长范围窄得多，因此，所公开系统中使用的镜筒透镜的特定于波长或通道的适配或优化导致成像质量和性能方面的显著改善。这种特定于通道的适配或优化导致双面成像应用中流动池的顶表面和底表面的图像质量的改善。
620.在流动池中没有流体情况下的双面成像：为了使流动池的顶内表面和底内表面两者都有最佳的成像性能，通常需要运动致动的补偿器来校正由流动池中的流体(通常包括约50-200μm的流体层厚度)引起的光学像差。在所公开的光学系统设计的一些情况中，可以在流动池中存在流体的情况下对流动池的顶内表面进行成像。一旦测序化学循环完成，就可以从流动池中提取流体以对底内表面成像。因此，在一些情况下，即使不使用补偿器，也可以保持底表面的图像质量。
621.使用电光相位板补偿光学像差和/或振动：在一些情况下，通过将电光相位板(或其他矫正透镜)与物镜组合使用以消除由于流体的存在而引起的光学像差，可以在无需从流动池中去除流体的情况下改善双表面图像质量。在一些情况下，可以使用电光相位板(或透镜)来消除由运动致动的补偿器的机械运动引起的振动影响，并且可以为基因组测序应用提供更快的图像获取时间和测序循环时间。
622.改善的对比度噪声比(cnr)、视场(fov)、光谱分离和时序设计，以增加或最大化信息传输和通量：在为基因组学应用设计的成像系统中用于增加或最大化信息传输的另一种方法是增加视场(fov)的大小并减少对特定fov进行成像所需的时间。对于典型的大na光学成像系统，通常是获得面积近似为1mm2的视场的图像，其中在当前公开的成像系统设计中，指定了具有长工作距离的大fov物镜以实现对2mm2或更大的面积进行成像。
623.在一些情况下，所公开的成像系统设计用于与专有的低结合性基底表面和dna扩增方法组合使用，其减少由多种混杂信号(包括但不限于荧光染料对基底表面的非特异性吸附，非特异性核酸扩增产物(例如，在对应于核酸分子克隆扩增簇(即特异性扩增的克隆物)的斑点或特征之间的区域中出现在基底表面的核酸扩增产物)，可能会出现在扩增的克隆物、定相和定相前核酸链中的非特异性核酸扩增产物等)引起的荧光背景。与公开的光学成像系统组合使用低结合性基底表面和dna扩增方法(其降低荧光背景)可以显著减少对每个fov成像所需的时间。
624.当前公开的系统设计可以通过成像序列改善或优化进一步减少所需的成像时间，其中同时或以交叠的时序获取多个通道的荧光图像，并且其中荧光信号的光谱分离被设计为减少荧光检测通道之间以及激发光和荧光信号之间的串扰。
625.当前公开的系统设计可以通过改善或优化扫描运动序列来进一步减少所需的成像时间。在典型方法中，使用x-y平移台将目标fov移动到物镜下方的位置，执行自动聚焦步骤(其中确定最佳焦点位置)，然后将物镜沿z方向移动到确定的焦点位置，并获取图像。通过循环经过一系列目标fov位置来获取一系列的荧光图像。从信息传输占空比的角度来看，信息仅在该周期的荧光图像获取部分期间进行传输。在当前公开的成像系统设计中，执行其中所有轴(x-y-z)同时重新定位的单步运动，并且自动聚焦步骤用于检查焦点位置误差。
仅当焦点位置误差(焦平面位置和样品平面位置之间的差异)超过一定限度(例如指定误差阈值)时，才发出另外的z运动指令。结合高速x-y运动，此方法会增加系统的占空比，从而提高每单位时间的成像通量。
626.此外，通过将设计的光学收集效率、调制传递函数和图像传感器性能特征与输入激发光子通量预期的荧光光子通量、染料效率(与染料消光系数和荧光量子产率有关)匹配，同时考虑到背景信号和系统噪声特性，可以减少或最小化获取高质量(高对比度噪声比(cnr)图像)所需的时间。
627.有效的图像获取与改善或优化的平移台步长和稳定时间的组合导致了快速的成像时间(即每个视场所需的总时间)和更高通量的成像系统性能。
628.伴随着大的fov和快速的图像获取占空比，所公开的设计还可包括指定图像平面平坦度、荧光检测通道之间的色聚焦性能、传感器平坦度、图像畸变和聚焦质量规格。
629.通过将不同的荧光检测通道的图像传感器分别对准，使得每个检测通道的最佳焦平面重叠，可以进一步改善色聚焦性能。设计目标是确保相对于每个通道的最佳焦平面，在
±
100nm(或更小)内获取超过90％视场上的图像，从而增加或最大化单个点强度信号的传输。在一些情况下，所公开的设计还确保相对于每个通道的最佳焦平面，在
±
150nm(或更小)内获取99％视场上的图像，并确保相对于每个成像通道的最佳焦平面，在
±
200nm(或更小)内获取整个视场上的更多图像。
630.照明光路设计：用于改善信噪比(snr)、对比度噪声比(cnr)和/或增加通量的另一个因素是增加对于样品的照明功率密度。在一些情况下，所公开的成像系统可以包括照明路径设计，所述照明路径设计利用与液体光导耦合的高功率激光器或激光二极管。液体光导消除了相干光源(例如激光器和激光二极管)固有的光斑。此外，耦合光学器件被设计为用于底部填充液体光导的进入光圈。液体光导进入光圈的底部填充减小了进入物镜的照明光束的有效数值孔径，从而提高了通过物镜到样品平面上的光传输效率。通过这种设计创新，在大视场(fov)上，照明功率密度可以达到传统设计的3倍。
631.在一些情况下，通过利用s偏振和p偏振的角度依赖性判别，可以使照明光束偏振取向为，用于减少到达成像传感器的后向散射和后向反射的照明光的量。
632.评估图像质量：对于本文公开的光学成像设计的任何实施方案，可以使用本领域技术人员已知的多种性能指标中的任何一种来评估成像性能或成像质量。示例包括但不限于在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、对比度噪声比(cnr)或其任何组合下的调制传递函数(mtf)的测量。
633.在一些情况下，所公开的用于双面成像的光学设计(例如，所公开的物镜设计、镜筒透镜设计、将电光相板与物镜组合使用等，单独地或组合地)可以显著改善流动池的上(近)内表面和下(远)内表面的图像质量，使得对于上面列出的任何成像性能指标(无论是单独还是组合)，用于对流动池的上内表面和下内表面进行成像的成像性能指标之差小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
634.在一些情况下，所公开的用于双面成像的光学设计(例如，包括所公开的镜筒透镜设计、将电光相板与物镜组合使用等)可以显著改善图像质量，使得对于上面列出的任何成像性能指标(无论是单独还是组合)，与常规系统(其包括，例如，物镜、运动致动的补偿器(当对流动池的近内表面或远内表面成像时，其移出或移入光路)以及图像传感器)相比，用
于双面成像的图像质量性能指标提供在用于双面成像的成像性能指标方面的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或至少30％的改善。在一些情况中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，包括所公开的镜筒透镜设计中的一个或多个的荧光成像系统对于双面成像提供了至少相等或更加改善的成像性能指标。在一些情况中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，包括所公开的镜筒透镜设计中的一个或多个的荧光成像系统对于双面成像提供了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的成像性能指标改善。
635.成像模块规格：
636.激发光波长：在任何所公开的光学成像模块设计中，所公开的成像模块的光源可以产生可见光，例如绿光和/或红光。在一些情况下，光源单独或与一个或多个光学组件(例如，激发光学滤波器和/或二向色分束镜)组合可以产生约350nm、375nm、400nm、425nm、450nm、475nm、500nm、525nm、550m，575nm、600nm、625nm、650nm，675nm、700nm、725nm、750nm、775nm、800nm、825nm、850nm、875nm或900nm的激发光。本领域技术人员将认识到，激发波长可以具有在该范围内的任何值，例如约620nm。
637.激发光带宽：在任何所公开的光学成像模块设计中，光源单独或与一个或多个光学组件(例如，激发光学滤波器和/或二向色分束镜)组合可以在
±
2nm、
±
5nm、
±
10nm、
±
20nm、
±
40nm、
±
80nm或更大的带宽内以指定的激发波长产生光。本领域技术人员将认识到，激发带宽可以具有在该范围内的任何值，例如约
±
18nm。
638.光源功率输出：在任何所公开的光学成像模块设计中，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率范围可以约0.5w至约5.0w，或更大(如将在下面更详细地讨论的)。在一些情况下，光源的输出和/或从其获得的激发光束的功率可以是至少0.5w、至少0.6w、至少0.7w、至少0.8w、至少1w、至少1.1w、至少1.2w、至少1.3w、至少1.4w、至少1.5w、至少1.6w、至少1.8w、至少2.0w、至少2.2w、至少2.4w、至少2.6w、至少2.8w、至少3.0w、至少3.5w、至少4.0w、至少4.5w或至少5.0w。在一些实施方式中，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率可以是至多5.0w、至多4.5w、至多4.0w、至多3.5w、至多3.0w、至多2.8w、至多2.6w、至多2.4w、至多2.2w、至多2.0w、至多1.8w、至多1.6w、至多1.5w、至多1.4w、至多1.3w、至多1.2w、至多1.1w、至多1w、至多0.8w、至多0.7w、至多0.6w或至多0.5w。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率的范围可以为约0.8w至约2.4w。本领域技术人员将认识到，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率可以具有该范围内的任何值，例如，约1.28w。
639.光源输出功率和cnr：在所公开的光学成像模块设计的一些实施方式中，一个或多个光源的输出功率和/或从其获得的一个或多个激发光束(包括复合激发光束)的功率，与适当的样品组合，足以在由照明和成像模块获取的图像中提供至少5、至少10、至少15、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40或至少50或更大的对比度噪声比(cnr)，或在由这些值中的任何形成的任何范围内的任何cnr。
640.荧光发射带：在一些情况下，所公开的荧光光学成像模块可以被配置为检测由本领域技术人员已知的各种荧光团中的任何一种产生的荧光发射。用于例如基因分型和核酸
测序应用(例如，通过缀合核苷酸、寡核苷酸或蛋白质)的合适的荧光染料的示例包括但不限于荧光素、若丹明、香豆素、花青、及其衍生物，包括花青衍生物花青染料3(cy3)、花青染料5(cy5)、花青染料7(cy7)等。
641.荧光发射波长：在任何所公开的光学成像模块设计中，所公开的光学系统的检测通道或成像通道可以包括一个或多个光学组件，例如发射光学滤波器和/或二向色分束镜，其被配置为在约350nm、375nm、400nm、425nm、450nm、475nm、500nm、525nm、550m、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm、725nm、750nm、775nm、800nm、825nm、850nm、875nm或900nm处收集发射光。本领域技术人员将认识到，发射波长可以具有在该范围内的任何值，例如，约825nm。
642.荧光发射光带宽：在任何所公开的光学成像模块设计中，检测通道或成像通道可以包括一个或多个光学组件，例如，发射光学滤波器和/或二向色分束镜，其被配置为在
±
2nm、
±
5nm、
±
10nm、
±
20nm、
±
40nm、
±
80nm或更大带宽内收集指定发射波长的光。本领域技术人员将认识到，激发带宽可以具有在该范围内的任何值，例如，约
±
18nm。
643.数值孔径：在一些情况下，在任何所公开的光学系统设计中，物镜和/或光学成像模块(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)的数值孔径可以在约0.1至约1.4的范围内。在一些情况下、数值孔径可以为至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3或至少1.4。在一些情况下，数值孔径可以为至多1.4、至多1.3、至多1.2、至多1.1、至多1.0、至多0.9、至多0.8、至多0.7、至多0.6、至多0.5、至多0.4、至多0.3、至多0.2或至多0.1。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，数值孔径的范围可以为约0.1至约0.6。本领域技术人员将认识到，数值孔径可以具有在该范围内的任何值，例如约0.55。
644.光学分辨率：在一些情况下，根据物镜和/或光学系统(例如包括物镜和/或镜筒透镜)的数值孔径，通过任何所公开的光学系统设计实现的样品平面处的最小可分辨光斑(或特征)间隔距离的范围可以为约0.5μm至约2μm。在一些情况下，在样品平面处的最小可分辨光斑间隔距离可以是至少0.5μm、至少0.6μm、至少0.7μm、至少0.8μm、至少0.9μm、至少1.0μm、至少1.2μm、至少1.4μm、至少1.6μm、至少1.8μm或至少1.0μm。在一些情况下，最小可分辨光斑间隔距离可以是至多2.0μm、至多1.8μm、至多1.6μm、至多1.4μm、至多1.2μm、至多1.0μm、至多0.9μm、至多0.8μm、至多0.7μm、至多0.6μm或至多0.5μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，最小可分辨光斑间隔距离可以在约0.8μm至约1.6μm的范围内。本领域技术人员将认识到，最小可分辨光斑间隔距离可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.95μm。
645.在不同深度的第一表面和第二表面的光学分辨率：在一些情况下，在本文公开的任何光学模块或系统中，本文公开的新颖物镜和/或镜筒透镜设计的使用可以在获取第一表面和第二表面的图像之间需要或不需要重新聚焦情况下赋予第一表面和第二表面(例如流动池上内表面和下内表面)相当的光学分辨率。在一些情况下，由此获得的第一表面和第二表面的图像的光学分辨率可以具有彼此的20％、18％、16％、14％、12％、10％、8％、6％、4％、2％或1％，或在此范围内的任何值内。
646.放大率：在一些情况下，在任何所公开的光学配置中的物镜和/或镜筒透镜、和/或
光学系统(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)的放大率可以在约2倍至约20倍的范围内。在一些情况下，光学系统放大率可以是至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。在一些情况下，光学系统放大率可以是至多20倍、至多15倍、至多10倍、至多9倍、至多8倍、至多7倍、至多6倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍或至多2倍。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，光学系统放大率可以在约3倍至约10倍的范围内。本领域技术人员将认识到，光学系统放大率可以具有在该范围内的任何值，例如，约7.5倍。
647.物镜焦距长度：在公开的光学设计的一些实施方式中，物镜的焦距长度可以在20mm至40mm的范围内。在一些情况下，物镜的焦距长度可以是至少20mm、至少25mm、至少30mm、至少35mm或至少40mm。在一些情况下，物镜的焦距可以是至多40mm、至多35mm、至多30mm、至多25mm或至多20mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，物镜的焦距长度可以在25mm至35mm的范围内。本领域技术人员将认识到，物镜的焦距长度可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约37mm。
648.物镜工作距离：在所公开的光学设计的一些实施方式中，物镜的工作距离可以在约100μm至30mm的范围内。在一些情况下，工作距离可以是至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm，至少1mm、至少2mm、至少4mm、至少6mm、至少8mm、至少10mm、至少15mm、至少20mm、至少25mm或至少30mm。在一些情况下，工作距离可以是至多30mm、至多25mm、至多20mm、至多15mm、至多10mm、至多8mm、至多6mm、至多4mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，物镜的工作距离可以在500μm至2mm的范围内。本领域技术人员将认识到，物镜的工作距离可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约1.25mm。
649.针对通过厚盖玻片成像而优化的物镜：在所公开的光学设计的一些情况下，可以针对不同流动池厚度的盖玻片来改善或优化物镜的设计。例如，在一些情况下，可以将物镜设计成针对厚度为约200μm至约1,000μm的盖玻片具有最佳的光学性能。在一些情况下，可以将物镜设计成针对厚度是至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm或至少1,000μm的盖玻片具有最佳性能。在一些情况下，可将物镜设计为针对厚度为至多1,000μm、至多为900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm或至多200μm的盖玻片具有最佳性能。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，可以将物镜设计为针对厚度为约300μm至约900μm的盖玻片具有最佳光学性能。本领域技术人员将认识到，可以将物镜设计成针对如下盖玻片具有最佳光学性能：该盖玻片可以具有在该范围内的任何值，例如，约725μm。
650.景深和焦深：在一些情况下，任何所公开的成像模块(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)设计的景深和/或焦深的范围可以是约10μm至约800μm，或更大。在一些情况下，景深和/或焦深可以为至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少125μm、至少150μm、至少175μm、至少200μm、至少250μm、至少300μm、至少300μm、至少400
μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm或至少800μm，或更大。在一些情况下，景深和/或焦深是至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多250μm、至多200μm、至多175μm、至多150μm、至多125μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多40μm、至多30μm、至多20μm、至多10μm，或更小。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，景深和/或焦深的范围可以为约100μm至约175μm。本领域技术人员将认识到，景深和/或焦深可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约132μm。
651.视场(fov)：在一些实施方式中，任何所公开的成像模块设计(例如，由物镜和检测通道光学器件(例如镜筒透镜)的组合所提供)的fov可以在例如约1mm至约5mm的范围内(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。在一些情况下，fov可以是至少1.0mm、至少1.5mm、至少2.0mm、至少2.5mm、至少3.0mm、至少3.5mm、至少4.0mm、至少4.5mm或至少5.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。在一些情况下，fov可以是至多5.0mm、至多4.5mm、至多4.0mm、至多3.5mm、至多3.0mm、至多2.5mm、至多2.0mm、至多1.5mm或至多1.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，fov的范围可以为约1.5mm至约3.5mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。本领域技术人员将认识到，fov可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约3.2mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。
652.视场(fov)面积：在所公开的光学系统设计的一些情况下，视场的面积可以在约2mm2至约5mm2的范围内。在一些情况下，视场的面积可以是至少2mm2、至少3mm2、至少4mm2或至少5mm2。在一些情况下，视场面积可以是至多5mm2、至多4mm2、至多3mm2或至多2mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，视场的面积可以在约3mm2至约4mm2范围内。本领域技术人员将认识到，视场的面积可以具有在该范围内的任何值，例如，2.75mm2。
653.物镜和/或镜筒透镜mtf的优化：在一些情况下，所公开的成像模块和系统中的物镜和/或至少一个镜筒透镜的设计被配置为在中等空间频率至高空间频率范围内优化调制传递函数。例如，在一些情况下，所公开的成像模块和系统中的物镜和/或至少一个镜筒透镜的设计被配置为在样品平面中在如下空间频率范围内优化调制传递函数：500个周期/mm至900个周期/mm、700个周期/mm至1100个周期/mm、800个周期/mm至1200个周期/mm、或600个周期/mm至1000个周期/mm。
654.光学像差和衍射受限成像性能：在本文公开的任何光学成像模块设计的一些实施方式中，物镜和/或镜筒透镜可被配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得fov在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.15波的像差。在一些实施方式中，可将物镜和/或镜筒透镜配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得fov在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.1波的像差。在一些实施方式中，可将物镜和/或镜筒透镜配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得fov在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.075波的像差。在一些实施方式中，物镜和/或镜筒透镜可以被配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得fov在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上是衍射受限的。
655.光束在二向色反射器、分束镜和合束镜上的入射角：在所公开的光学设计的一些
情况下，光束入射在二向色反射器、分束镜或合束镜上的入射角的范围可以为约20度至约45度。在一些情况下，入射角可以是至少20度、至少25度、至少30度、至少35度、至少40度或至少45度。在一些情况下，入射角可以是至多45度、至多40度、至多35度、至多30度、至多25度或至多20度。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，入射角可以在约25度至约40度的范围内。本领域技术人员将认识到，入射角可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约43度。
656.图像传感器(光电检测器阵列)尺寸：在一些情况下，所公开的光学系统可以包括具有有效区域的图像传感器，所述有效区域的对角线在约10mm至约30mm或更大的范围内。在一些情况下，图像传感器的有效区域的对角线是至少10mm、至少12mm、至少14mm、至少16mm、至少18mm、至少20mm、至少22mm、至少24mm、至少26mm、至少28mm或至少30mm。在一些情况下，图像传感器的有效区域的对角线是至多30mm、至多28mm、至多26mm、至多24mm、至多22mm、至多20mm、至多18mm、至多16mm、至多14mm、至多12mm或至多10mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，图像传感器可以具有对角线范围为约12mm至约24mm的有效区域。本领域技术人员将认识到，一个或多个图像传感器可以具有对角线具有在以上指定的值的范围内的任何值(例如，约28.5mm)的有效区域。
657.图像传感器像素尺寸和间距：在一些情况下，针对在所公开的光学系统设计中使用的图像传感器所选择的像素尺寸和/或间距可以在至少一维中在约1μm至约10μm的范围内。在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以是至少1μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm、至少5μm、至少6μm、至少7μm、至少8μm、至少9μm或至少10μm。在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以是至多10μm、至多9μm、至多8μm、至多7μm、至多6μm、至多5μm、至多4μm、至多3μm、至多2μm或至多1μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以在约3μm至约9μm的范围内。本领域技术人员将认识到，像素尺寸和/或间距可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.4μm。
658.过采样：在所公开的光学设计的一些情况下，利用空间过采样方案，其中空间采样频率是光学分辨率x(lp/mm)的至少2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
659.最大平移台速度：在所公开的光学成像模块的一些情况下，在任何一个轴上的最大平移台速度可以在约1mm/s至约5mm/s的范围内。在一些情况下，最大平移台速度可以是至少1mm/s、至少2mm/s、至少3mm/s、至少4mm/s或至少5mm/s。在一些情况下，最大平移台速度可以是至多5mm/s、至多4mm/s、至多3mm/s、至多2mm/s或至多1mm/s。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最大平移台速度可以在约2mm/s至约4mm/s的范围内。本领域技术人员将认识到，最大平移台速度可以具有在该范围内的任何值，例如，约2.6mm/s。
660.最大平移台加速度：在所公开的光学成像模块的一些情况下，在任何一个运动轴上的最大加速度可以在约2mm/s2至约10mm/s2范围内。在一些情况下，最大加速度可以是至少2mm/s2、至少3mm/s2、至少4mm/s2、至少5mm/s2、至少6mm/s2、至少7mm/s2、至少8mm/s2、至少9mm/s2或至少10mm/s2。在一些情况下，最大加速度可以是至多10mm/s2、至多9mm/s2、至多8mm/s2、至多7mm/s2、至多6mm/s2、至多5mm/s2、至多4mm/s2、至多3mm/s2或至多2mm/s2。该段
落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最大加速度可以在约2mm/s2至约8mm/s2的范围内。本领域技术人员将认识到，最大加速度可以具有在该范围内的任何值，例如，约3.7mm/s2。
661.平移台定位重复性：在所公开的光学成像模块的一些情况下，对于任何一个轴的定位的可重复性可以在约0.1μm至约2μm的范围内。在一些情况下，定位的可重复性可以是至少0.1μm、至少0.2μm、至少0.3μm、至少0.4μm、至少0.5μm、至少0.6μm、至少0.7μm、至少0.8μm、至少0.9μm、至少1.0μm、至少1.2μm、至少1.4μm、至少1.6μm、至少1.8μm或至少2.0μm。在一些情况下，定位的可重复性可以是至多2.0μm、至多1.8μm、至多1.6μm、至多1.4μm、至多1.2μm、至多1.0μm、至多0.9μm、至多0.8μm、至多0.7μm、至多0.6μm、至多0.5μm、至多0.4μm、至多0.3μm、至多0.2μm或至多0.1μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，定位的可重复性可以在约0.3μm至约1.2μm的范围内。本领域技术人员将认识到，定位的可重复性可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.47μm。
662.fov重新定位时间：在所公开的光学成像模块的一些情况下，相对于光学器件重新定位样品平面(视场)或者反之亦然所需的最长时间，可以在约0.1秒至约0.5秒的范围内。在一些情况下，最长重新定位时间(即，扫描台步长和稳定时间)可以是至少0.1秒、至少0.2秒、至少0.3秒、至少0.4秒或至少0.5秒。在一些情况下，最长重新定位时间可以是至多0.5秒、至多0.4秒、至多0.3秒、至多0.2秒或至多0.1秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最长重定位时间可以在约0.2秒至约0.4秒的范围内。本领域技术人员将认识到，最长重新定位时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.45秒。
663.自动对焦校正的误差阈值：在所公开的光学成像模块的一些示例中，用于触发自动聚焦校正的指定误差阈值可以在约50nm至约200nm的范围内。在一些情况下，误差阈值可以是至少50nm、至少75nm、至少100nm、至少125nm、至少150nm、至少175nm或至少200nm。在一些情况下，误差阈值可以是至多200nm、至多175nm、至多150nm、至多125nm、至多100nm、至多75nm或至多50nm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些情况下，误差阈值可以在约75nm至约150nm的范围内。本领域技术人员将认识到，误差阈值可以具有在该范围内的任何值，例如，约105nm。
664.图像获取时间：在所公开的光学成像模块的一些情况下，图像获取时间可以在约0.001秒至约1秒的范围内。在一些情况下，图像获取时间可以是至少0.001秒、至少0.01秒、至少0.1秒或至少1秒。在一些情况下，图像获取时间可以是至多1秒、至多0.1秒、至多0.01秒或至多0.001秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，图像获取时间可以在约0.01秒至约0.1秒的范围内。本领域技术人员将认识到，图像获取时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.250秒。
665.每个fov的成像时间：在一些情况下，每个视场的成像时间可以在约0.5秒至约3秒的范围内。在一些情况下，每个fov的成像时间可以是至少0.5秒、至少1秒、至少1.5秒、至少2秒、至少2.5秒或至少3秒。在一些情况下，每个fov的成像时间可以是至多3秒、至多2.5秒、至多2秒、至多1.5秒、至多1秒或至多0.5秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，成像时间可以在约1秒至约2.5秒的范
围内。本领域技术人员将认识到，成像时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.85秒。
666.视场平坦度：在一些情况下，在相对于每个荧光(或其他成像模式)检测通道的最佳焦平面
±
200nm、
±
175nm、
±
150nm、
±
125nm、
±
100nm、
±
75nm或
±
50nm内获取视场的80％、90％、95％、98％、99％或100％上的图像。
667.用于基因组学和其他应用的分析系统和系统组件：如上所述，在一些实施方式中，所公开的光学成像模块可以用作被配置用于执行例如基因组学应用(例如，基因测试和/或核酸测序应用)或其他化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的较大系统(例如：分析系统)的模块、组件、子组装件或子系统。除了本文所公开的一个、两个、三个、四个或多于四个的成像模块(每个成像模块可以包括一个或多个照明光路和/或一个或多个检测光路(例如，一个或多个检测通道，其被配置用于将特定波长范围内的荧光发射成像到图像传感器上))，此类系统可以包括一个或多个x-y平移台、一个或多个x-y-z平移台、流动池或盒、流体学系统和流体流量控制模块、温度控制模块、流体分配机器人、盒和/或微孔板处理(拾放)机器人、不透光外壳和/或环境控制腔室、一个或多个处理器或计算机、数据存储模块、数据通信模块(例如，蓝牙、wifi、内联网或因特网通信硬件和相关软件)、显示模块、一个或多个基于本地和/或基于云的软件包(例如，仪器/系统控制软件包、图像处理软件包、数据分析软件包)等，或其任何组合。
668.平移台：在本文公开的成像和分析系统(例如，核酸测序系统)的一些实施方式中，所述系统可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个)高精度x-y(或在某些情况下为x-y-z)平移台，用于相对于一个或多个成像模块重新定位一个或多个样品载体结构(例如，一个或多个流动池)，例如，从而平铺一个或多个图像(每个图像对应于成像模块的视场)，以重建整个流动池表面的一个或多个复合图像。在本文公开的成像系统和基因组分析系统(例如，核酸测序系统)的一些实施方式中，所述系统可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个)高精度x-y(或在某些情况下为x-y-z)平移台，用于相对于一个或多个样品载体结构(例如，流动池)重新定位一个或多个成像模块，例如，从而平铺一个或多个图像(每个图像对应于成像模块的视场)，以重建整个流动池表面的一个或多个复合图像。
669.合适的平移台可从许多供应商，例如parker hannifin商购获得。精度平移台系统通常包括多个组件的组合，包括但不限于线性致动器、光学编码器、伺服和/或步进电动机以及电动机控制器或驱动单元。对于本文公开的系统和方法，需要平台移动的高精度和可重复性，以在散布试剂递送和光学检测的重复步骤时，确保例如荧光信号的准确和可再现的定位和成像。
670.因此，本文公开的系统可以包括指定平移台被配置为相对于照明和/或成像光学器件定位样品载体结构(或反之亦然)的精度。在本公开的一方面，一个或多个平移台的精度在约0.1μm至约10μm之间。在其他方面，平移台的精度是约10μm或更小、约9μm或更小、约8μm或更小、约7μm或更小、约6μm或更小、约5μm或更小、约4μm或更小、约3μm或更小、约2μm或更小、约1μm或更小、约0.9μm或更小、约0.8μm或更小、约0.7μm或更小、约0.6μm或更小、约0.5μm或更小、约0.4μm或更小、约0.3μm或更小、约0.2μm或更小、约0.1μm或更小。本领域技术人员将理解，在一些情况下，平移台的定位精度可以落入由这些值中的任何两个值限定的任何范围内(例如，约0.5μm至约1.5μm)。在一些情况下，平移台的定位精度可以具有在该
段所包括的值的范围内的任何值，例如，约0.12μm。
671.流动池、微流体装置和盒：如上所述，在一些情况下，用于所公开的成像模块的样品载体结构可以被配置为流动池装置，其包括例如一个、两个、三个、四个或多于四个样品载体表面(或简单的表面)，细胞、组织切片或源自其的核酸分子可以被拴系或固定在样品载体表面(或简单的表面)上。本文公开的流动池装置和流动池盒可以用作被设计用于多种化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的分析系统的组件。通常，此类分析系统可以包括一个或多个所公开的单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置、毛细管流动池盒和/或本文所述的微流体装置和盒中的一个或多个。所公开的流动池装置和盒的另外的描述可以在pct专利申请公开wo 2020/118255中找到，其全部内容通过引用合并于本文。
672.在一些情况下，本文公开的系统可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个的单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置、毛细管流动池盒和/或微流体装置和盒。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的固定组件。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的可移除的、可更换的组件。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的一次性或可消耗组件。
673.在一些实施方式中，所公开的单个毛细管流动池装置(或单个毛细管流动池盒)包括单个毛细管，例如，玻璃或熔融石英毛细管，其内腔形成试剂或溶液可以流过的流体流动路径，并且其内表面可以形成样品载体结构，目标样品被结合或拴系该样品载体结构上。在一些实施方式中，本文公开的多毛细管毛细管流动池装置(或多毛细管流动池盒)可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个毛细管，其被配置用于执行分析技术，该分析技术还包括成像作为检测方法。
674.在一些情况下，可以将一个或多个毛细管包装在底座内以形成便于操作的盒，结合了用于进行外部流体连接的适配器或连接器，并且可以任选地包括另外的集成功能件，例如试剂储存器、废物储存器、阀门(例如，微型阀门)、泵(例如，微型泵)等或其任何组合。
675.图24图示了单个玻璃毛细管流动池装置的一个非限制性示例，该装置包括两个流体适配器(一个固定在一件式玻璃毛细管的每一端)，该流体适配器被设计为与标准od流体管配合，以提供与外部流体流动控制系统的方便、可交换的流体连接。可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种将流体适配器附接至毛细管，所述技术包括但不限于压配、粘合剂结合、溶剂结合、激光焊接等，或其任何组合。
676.通常，在所公开的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒中使用的毛细管将具有至少一个内部轴向对齐的流体流动通道(或“内腔”)，其在毛细管的整个长度上延伸。在一些情况下，毛细管可具有两个、三个、四个、五个或多于五个的内部轴向对齐的流体流动通道(或“内腔”)。
677.用于合适的毛细管(或其内腔)的多个指定的横截面几何形状与本文中的公开内容一致，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、圆角正方形、圆角矩形或圆角三角形横截面几何形状。在一些情况下，毛细管(或其内腔)可以具有任何指定的横截面尺寸或尺寸组。例如，在一些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸(例如，如果内腔是圆形的则
为直径，或者如果内腔是正方形或矩形的则为对角线)可以在约10μm至约10mm的范围内。在一些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以是至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、至少1mm、至少2mm、至少3mm、至少4mm至少5mm、至少6mm、至少7mm、至少8mm、至少9mm或至少10mm。在一些方面，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以是至多10mm、至多9mm、至多8mm、至多7mm、至多6mm、至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多25μm或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以在约100μm至约500μm的范围内。本领域技术人员将认识到，毛细血管内腔的最大横截面尺寸可以具有该范围内的任何值，例如，约124μm。
678.在一些情况下，例如，其中流动池装置或盒中的一个或多个毛细管的内腔具有正方形或矩形横截面，第一内表面(例如，顶表面或上表面)和第二内表面(例如，底表面或下表面)之间的距离(其限定流体流动通道的间隙高度或厚度)的范围可以为约10μm至约500μm。在一些情况下，间隙高度可以是至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm、至少100μm、至少125μm、至少150μm、至少175μm、至少200μm、至少225μm、至少250μm、至少275μm、至少300μm、至少325μm、至少350μm、至少375μm、至少400μm、至少425μm、至少450μm、至少475μm或至少500μm。在一些情况下，间隙高度可以是至多500μm、至多475μm、至多450μm、至多425μm、至多400μm、至多375μm、至多350μm、至多325μm、至多300μm、至多275μm、至多250μm、至多225μm、至多200μm、至多175μm、至多150μm、至多125μm、至多100μm、至多90μm、至多80μm、至多70μm、至多60μm、至多50μm、至多40μm、至多30μm、至多20μm或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，间隙高度可以在约40μm至约125μm的范围内。本领域技术人员将认识到，间隙高度可以具有在该段的值的范围内的任何值，例如，约122μm。
679.在一些情况下，用于制造所公开的毛细管流动池装置或流动池盒的一个或多个毛细管的长度可以在约5mm至约5cm或更大的范围内。在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以小于5mm、至少5mm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm或至少5cm。在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以是至多5cm、至多4.5cm、至多4cm、至多3.5cm、至多3cm、至多2.5cm、至多2cm、至多1.5cm、至多1cm或至多5mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以在约1.5cm至约2.5cm的范围内。本领域技术人员将认识到，一个或多个毛细管的长度可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.85cm。在一些情况下，装置或盒可以包括多个两个或更多个相同长度的毛细管。在一些情况下，装置或盒可包括多个两个或更多个不同长度的毛细管。
680.用于构造所公开的毛细管流动池装置或毛细管流动池盒的毛细管可以由本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)、熔融石英(石英)、聚合物(例如聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hdpe)、环烯烃聚合物(cop)、环烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚二甲基硅氧烷(pdms)
等)、聚醚酰亚胺(pei)和全氟弹性体(ffkm)作为化学惰性更高的替代品，或其任何组合。就成本和化学兼容性而言，pei在聚碳酸酯和peek之间。ffkm也称为kalrez。
681.用于制造毛细管的一种或多种材料通常是光学透明的，以利于与基于光谱或基于成像的检测技术一起使用。在一些情况下，整个毛细管将是光学透明的。可替代地，在一些情况下，仅毛细管的一部分(例如，光学透明的“窗口”)将是光学透明的。
682.可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来制造用于构造所公开的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒的毛细管，其中制造技术的选择通常取决于材料的选择，反之亦然。合适的毛细管制造技术的示例包括但不限于挤出、拉制、精密计算机数控(cnc)机械加工和镗削、激光烧蚀等。
683.在一些实施方式中，在所公开的毛细管流动池装置和盒中使用的毛细管可以是现成的商业产品。提供精密毛细管的商业供应商的示例包括accu-glass(st.louis,mo；精密玻璃毛细管)，polymicro technologies(phoenix,az；精密玻璃和熔融石英毛细管)，friedrich&dimmock，inc.(millville,nj；定制精密玻璃毛细管)和drummond scientific(broomall,pa；oem玻璃和塑料毛细管)。
684.附接于本文公开的毛细管流动池装置和盒的毛细管的流体适配器，以及毛细管流动池装置或盒的其他组件，可以使用多种合适的技术中的任一种(例如挤压成型、注射成型、压制成型、精密cnc加工等)和材料(例如玻璃、熔融石英、陶瓷、金属、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hdpe)、环烯烃聚合物(cop)、环烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)等)来制造，其中制造技术的选择还是通常取决于所用材料的选择，反之亦然。
685.图25提供了毛细管流动池盒的非限制性示例，其包括两个玻璃毛细管、流体适配器(在此示例中，每个毛细管两个)以及与毛细管和/或流体适配器匹配的盒底座，从而将毛细管相对于盒保持在固定的取向。在一些情况下，流体适配器可以与盒底座集成在一起。在一些情况下，盒可以包括与毛细管和/或毛细管流体适配器匹配的另外适配器。如本文其他地方所述，在一些情况下，盒可以包括另外的功能组件。在一些情况下，毛细管永久安装在盒中。在一些情况下，将盒底座设计为允许流动池盒的一个或多个毛细管可互换地移除和更换。例如，在一些情况下，盒底座可以包括铰接的“翻盖”构造，该构造允许其被打开，从而可以去除和更换一个或多个毛细管。在一些情况下，盒底座被配置成安装在例如荧光显微镜的载物台上或安装在本公开的荧光成像模块或仪器系统的盒保持器内。
686.在一些情况下，所公开的流动池装置可以包括微流体装置(或“微流体芯片”)和盒，其中微流体装置通过在一层或多层合适材料中形成流体通道来制造，并且包括一个或多个流体通道(例如，“分析”通道)，其被配置用于执行分析技术，该技术还包括成像作为检测方法。在一些实施方式中，本文公开的微流体装置或盒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个流体通道(例如，“分析”流体通道)，其被配置用于执行分析技术，该技术还包括成像作为检测方法。在一些情况下，所公开的微流体装置还可以包括另外的流体通道(例如，用于试剂的稀释或混合)、试剂储存器、废物储存器、用于进行外部流体连接的适配器等，以提供装置内集成的“芯片实验室”功能。
687.微流体流动池盒的非限制性示例包括：具有在芯片上形成的两个或更多个平行玻
璃通道的芯片、与芯片联接的流体适配器、以及与芯片和/或流体适配器匹配的盒底座，以使芯片相对于盒以固定的取向放置。在一些情况下，流体适配器可以与盒底座集成在一起。在一些情况下，盒可以包括与芯片和/或流体适配器匹配的附加适配器。在一些情况下，芯片被永久地安装在盒中。在一些情况下，将盒底座设计为允许流动池盒中的一个或多个芯片可互换地移除和更换。在一些情况下，盒底座可以包括铰接的“翻盖”构造，该构造允许其被打开，从而可以去除和更换一个或多个芯片。在一些情况下，盒底座被配置成安装在例如显微镜系统的载物台上或成像系统的盒保持器内。即使在非限制性示例中仅描述一个芯片，也应当理解，在微流体流动池盒中可以使用多于一个的芯片。本公开的流动池盒可包括单个微流体芯片或多个微流体芯片。在一些情况下，本公开内容的流动池盒可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或超过20个微流体芯片。在盒内包装一个或多个微流体装置可以有利于易于操作并在光学成像系统中正确定位装置。
688.所公开的微流体装置和盒内的流体通道可具有多种横截面几何形状，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、圆角正方形、圆角矩形或圆角三角形横截面几何形状。在一些情况下，流体通道可具有任何指定的横截面尺寸或尺寸组。例如，在一些情况下，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸(例如，如果流体通道具有正方形、圆角正方形、矩形或圆角矩形横截面则为对角线)可以在约10μm至约10mm范围内。在一些方面，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以是至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、至少1mm、至少2mm、至少3mm、至少4mm、至少5mm、至少6mm、至少7mm、至少8mm、至少9mm或至少10mm。在一些方面，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以是至多10mm、至多9mm、至多8mm、至多7mm、至多6mm、至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多25μm或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以在约20μm至约200μm范围内。本领域技术人员将认识到，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以具有在该范围内的任何值，例如，约122μm。
689.在一些情况下，所公开的微流体装置和盒中的流体通道的长度可以在约5mm至约10cm或更大的范围内。在一些情况下，流体通道的长度可以是小于5mm、至少5mm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm、至少5cm、至少6cm、至少7cm、至少8cm、至少9cm或至少10cm。在一些情况下，流体通道的长度可以是至多10cm、至多9cm、至多8cm、至多7cm、至多6cm、至多5cm、至多4.5cm、至多4cm、至多3.5cm、至多3cm、至多2.5cm、至多2cm、至多1.5cm、至多1cm或至多5mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，流体通道的长度可以在约1.5cm至约2.5cm的范围内。本领域技术人员将认识到，流体通道的长度可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.35cm。在一些情况下，微流体装置或盒可以包括多个相同长度的流体通道。在一些情况下，微流体装置或盒可包括多个长度不同的流体通道。
690.所公开的微流体装置将包括具有在其中形成一个或多个流体通道的材料的至少一个层。在一些情况下，微流体芯片可包括结合在一起以形成一个或多个流体通道的两个
层。在一些情况下，微流体芯片可以包括结合在一起以形成一个或多个流体通道的三个层或更多个层。在一些情况下，微流体通道可以具有敞开的顶部。在一些情况下，微流体通道可以被制造在一个层(例如，底层的顶表面)内，并且可以通过将底层的顶表面结合到材料的顶层的底表面来密封。在一些情况下，微流体通道可以被制造在一个层内，例如作为图案化通道，所述图案化通道的深度延伸穿过该层的整个厚度，然后被夹在两个非图案化层之间并结合到其上以密封流体通道。在一些情况下，通过去除基底表面上的牺牲层来制造微流体通道。所述方法不需要将本体基底(例如，玻璃或硅晶片)蚀刻掉。相反，流体通道位于基底的表面上。在一些情况下，微流体通道可以在基底的表面内或表面上制造，然后通过在基底的表面上沉积保形膜或层来密封以在芯片中形成次表面或埋设的流体通道。
691.可以使用微制造工艺的组合来制造微流体芯片。因为装置是微制造的，所以通常将基于它们与已知的微制造技术(例如，光刻、湿法化学蚀刻、激光烧蚀、激光辐照、空气磨蚀技术、注射成型、压花和其他技术)的兼容性来选择基底材料。通常还选择基底材料以使其与微流体装置可能暴露的整个条件范围兼容，所述整个条件范围包括ph极端值、温度、盐浓度以及电磁场(例如，光)或电场的施加。
692.所公开的微流体芯片可以由本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种制成，包括但不限于玻璃(例如硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)、石英玻璃(石英)、硅、聚合物(例如聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hdpe)、环烯烃聚合物(cop)、环烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚二甲基硅氧烷(pdms)等)、聚醚酰亚胺(pei)和全氟弹性体(ffkm)(作为化学惰性更高的替代品)，或其任何组合。在一些优选的情况下，基底材料可以包括基于二氧化硅的基底，如硼硅酸盐玻璃和石英，以及其他合适的材料。
693.可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来制造所公开的微流体装置，其中制造技术的选择通常取决于所用材料的选择，反之亦然。芯片上的微流体通道可以使用适于在基底表面上形成微结构或微图案的技术来构造。在一些情况下，流体通道通过激光辐照形成。在一些情况下，微流体通道通过聚焦的飞秒激光辐射形成。在一些情况下，微流体通道通过光刻和蚀刻形成，包括但不限于化学蚀刻、等离子体蚀刻或深反应离子蚀刻。在一些情况下，使用激光蚀刻形成微流体通道。在一些情况下，使用直写光刻技术形成微流体通道。直写光刻的示例包括电子束直写和聚焦离子束研磨。
694.在另外的优选示例中，基底材料可以包括聚合物材料，例如，塑料(例如聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(teflon
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)、聚氯乙烯(pvc)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚砜等)。使用诸如上述的可用微制造技术，可以容易地对此类聚合物基底进行图案化或微加工。在一些情况下，微流控芯片可以使用众所周知的成型技术(例如，注射成型、压花、压模、或通过在模具中使聚合物前体材料聚合(参见，例如，美国专利号5,512,131))由聚合物材料制成，例如由微加工的母盘(master)制成。在一些情况下，此类聚合物基底材料是优选的，因为它们易于制造、成本低且具有可处置性，以及它们对大多数极端反应条件的一般惰性。如同由其他材料(例如，玻璃)制成的流动池装置一样，例如，由这些聚合材料制成的流动池装置可以包括经过处理的表面(例如，衍生化或涂覆的表面)，以增强其在微流体系统中的效用，在下面将更详细地讨论。
695.通常使用上述微制造技术将微流体装置的流体通道和/或流体腔室作为微尺度通
道(例如，凹槽，凹口等)制造到第一基底的上表面中。第一基底包括具有第一平坦表面的顶侧和底侧。在根据本文描述的方法制备的微流体装置中，多个流体通道(例如，凹槽和/或凹口)形成在第一平坦表面上。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，凹槽和/或凹口)(在结合到第二基底之前)具有底壁和侧壁，其中顶部保持敞开。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，凹槽和/或凹口)(在结合到第二基底之前)具有底壁和侧壁，并且顶部保持封闭。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，凹槽和/或凹口)(在结合到第二基底之前)仅具有侧壁，而没有顶表面或底表面(即，流体通道跨越第一基底的整个厚度)。
696.流体通道和腔室可通过将第一基底的第一平坦表面放置成与第二基底的平坦表面接触并与其结合来密封，以形成装置的位于这两个组件的接界处的通道和/或腔室(例如，内部)。在一些情况下，在将第一基底结合到第二基底之后，可以将结构进一步放置成与第三基底接触并结合到第三基底。在一些情况下，第三基底可以被放置成与第一基底的不与第二基底接触的一侧接触。在一些情况下，第一基底被放置在第二基底和第三基底之间。在一些情况下，第二基底和第三基底可以覆盖和/或密封在第一基底上形成的凹槽、凹口或孔口，以在这些组件的接界处形成装置的通道和/或腔室(例如，内部)。
697.该装置可以具有开口，该开口被取向为使得它们与形成在该装置的内部中的流体通道和/或流体腔室中的至少一个流体连通，从而形成流体入口和/或流体出口。在一些情况下，开口形成在第一基底上。在一些情况下，开口形成在第一基底和第二基底上。在一些情况下，开口形成在第一基底、第二基底和第三基底上。在一些情况下，开口位于装置的顶侧。在一些情况下，开口位于装置的底侧。在一些情况下，开口位于装置的第一端和/或第二端，并且通道沿着从第一端到第二端的方向延伸。
698.本领域技术人员通常广泛地理解可将基底结合在一起的条件，并且基底的这种结合通常通过多种方法中的任何一种来进行，其选择可根据使用的基底材料的性质而变化。例如，可以将基底的热结合应用于许多基底材料，包括例如，基于玻璃或二氧化硅的基底以及一些基于聚合物的基底。这样的热结合技术通常包括在升高的温度和在某些情况下施加外部压力的条件下使待结合的基底表面配合。所使用的精确温度和压力通常将根据所用基底材料的性质而变化。
699.例如，对于基于二氧化硅的基底材料，即，玻璃(硼硅酸盐玻璃、pyrex
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、钠钙玻璃等)、熔融石英(石英)等，通常在约500℃至约1400℃，并且优选约500℃至约1200℃范围的温度下对基底进行热结合。例如，钠钙玻璃通常在约550℃的温度下结合，而硼硅酸盐玻璃通常在800℃或接近800℃的温度下热结合。另一方面，石英基底通常在1200℃或接近1200℃的温度下热结合。这些结合温度通常是通过将要结合的基底放入高温退火炉中来实现。
700.另一方面，热结合的聚合物基底通常将使用比基于二氧化硅的基底更低的温度和/或压力，以防止基底过度熔化和/或变形，例如装置的内部(即流体通道或腔室)变平。通常，用于结合聚合物基底的此类升高的温度将从约80℃至约200℃变化，这取决于所使用的聚合物材料，并且优选在约90℃至约150℃之间。由于结合聚合物基底所需的温度大大降低，因此通常可以进行这种结合而无需用于结合基于二氧化硅的基底的高温烘箱。如下文更详细地描述的，这允许将热源并入单个集成的结合系统中。
701.结合剂也可以用于根据众所周知的方法将基底结合在一起，所述方法通常包括在
要结合的基底之间施加一层结合剂并将它们压在一起直至结合剂固化。根据这些方法，可以使用各种结合剂，包括例如可商购的uv可固化结合剂。根据本发明，也可以使用可替选方法将基底结合在一起，包括例如对聚合物部件的声波或超声波焊接和/或溶剂焊接。
702.通常，将例如使用“晶片级”制造同时制造多个所述微流体芯片或装置。例如，可将聚合物基底压印或模制成大的可分离片，然后将其配对并结合在一起。然后可以通过切割或切块将单个装置或结合的基底从较大的片分离。类似地，对于基于二氧化硅的基底，可以由更大的基底晶片或板来制造单个装置，从而允许更高的制造工艺产量。具体地，可以在第一基底晶片或板上制造多个流体通道结构，然后将其用第二基底晶片或板覆盖并与其结合，并且任选地，进一步用第三基底晶片或板覆盖并与其结合。然后，使用已知的方法例如锯切、划片和断裂等，将各个装置从较大的基底上分割下来。
703.如上所述，顶部或第二基底覆盖在底部或第一基底上以密封各种通道和腔室。在根据本公开的方法进行结合过程中，第一基底和第二基底结合可以使用真空和/或压力来执行以保持两个基底表面处于最佳接触。特别地，可以通过例如使底部基底的平坦表面与顶部基底的平坦表面匹配并通过经穿过顶部基底设置的孔施加真空来保持底部基底与顶部基底的最佳接触。通常，通过将顶部基底放置在真空卡盘上来进行向顶部基底中的孔施加真空，该真空卡盘通常包括具有集成真空源的安装台或表面。在基于二氧化硅的基底的情况下，使结合的基底经受高温以产生初始结合，从而可以然后将结合的基底转移到退火炉中，其中相对彼此之间没有任何偏移。
704.用于与本文描述的装置结合的可替选的结合系统包括例如粘合剂分配系统，用于在基底的两个平坦表面之间施加粘合剂层。这可以通过在匹配基底之前施加粘合剂层，或通过在相邻基底的一个边缘放置一定量的粘合剂，并允许两个配对基底的芯吸作用将粘合剂吸引到两个基底之间的空间上来完成。
705.在某些情况下，整个结合系统可以包括用于将顶部和底部基底放置在安装表面上并对齐它们以进行后续结合的自动化系统。通常，此类系统包括用于使安装表面或顶部和底部基底得一个或多个相对于彼此移动的平移系统。例如，机器人系统可用于将顶部和底部基底中的每一个依次提升、平移并将其放置在安装台上，并放置在对齐结构内。在结合过程之后，此类系统还可以从安装表面上移走成品，并将这些配对的基底转移到后续操作中，例如分离或切块操作、基于二氧化硅的基底的退火炉等，然后再在其上放置其他基底以进行结合。
706.在一些情况下，微流体芯片的制造包括将两个或更多个层的基底(例如，图案化和非图案化的聚合物片)层叠或层压，以生产芯片。例如，在微流体装置中，该装置的微流体特征通常通过激光辐照、蚀刻或以其他方式将特征部制造到第一层的表面中来产生。然后将第二层层压或结合到第一层的表面以密封这些特征部并提供装置的流体元件，例如，流体通道。
707.如上所述，在一些情况下，可将一个或多个毛细管流动池装置或微流体芯片安装在盒底座中以形成毛细管流动池盒或微流体盒。在一些情况下，毛细管流动池盒或微流体盒可还包括与盒集成的附加组件，以为特定应用提供增强的性能。可以集成到盒中的附加组件的示例包括但不限于用于与系统其他组件进行流体连接的适配器或连接器、流体流量控制组件(例如，微型阀、微型泵、混合歧管等)、温度控制组件(例如，电阻加热元件、用作热
源或散热器的金属板、用于加热或冷却的压电(珀耳帖)装置、温度传感器)或光学组件(例如，光学透镜、窗口、滤光镜、反射镜、棱镜、光纤和/或发光二极管(led)或其他微型光源，这些微型光源可共同用于促进一个或多个毛细管或流体流动通道的光谱测量和/或成像。
708.流体适配器、盒底座和其他盒组件可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种连接至毛细管、毛细管流动池装置、微流体芯片(或芯片内的流体通道)，所述技术包括但不限于压配合、粘合剂结合、溶剂结合、激光焊接等或其任何组合。在一些情况下，微流体芯片中的微流体通道的入口和/或出口是芯片顶表面上的孔口，并且流体适配器可以附接到或联接至芯片内微流体通道的入口和/或出口。在一些情况下，盒可以包括与芯片和/或流体适配器配合并帮助将芯片定位在盒内的附加适配器(即，除了流体适配器之外)。可以使用与上文针对流体适配器概述的制造技术和材料相同的制造技术和材料来构造这些适配器。
709.盒底座(或“外壳”)可以由金属和/或聚合物材料制成，例如铝、经阳极氧化的铝、聚碳酸酯(pc)、丙烯酸类(pmma)或ultem(pei)，而其他材料也与本公开一致。外壳可以使用cnc机加工和/或模制技术来制造，并且被设计为使得一个、两个或多于两个的毛细管或微流体芯片以固定的取向被底座约束以产生一个或多个独立的流动通道。可以使用例如压配设计或通过与由硅酮或含氟弹性体制成的可压实适配器配合而将毛细管或芯片安装在底座中。在一些情况下，使用例如螺钉、夹子、钳子或其他紧固件来组装盒底座的两个或更多个组件(例如，上半部和下半部)，使得这两个半部是可分离的。在一些情况下，使用例如粘合剂、溶剂结合或激光焊接来组装盒底座的两个或更多个组件，使得两个或更多个组件被永久地附接。
710.流动池表面涂层：在一些情况下，可使用本文其他地方描述的各种表面改性技术或聚合物涂层中的任何一种来涂覆所公开的流动池装置(例如，单个或多个毛细管流动池、流动池盒、微流体装置或微流体盒)中的毛细管腔或微流体通道的一个或多个内表面。在一些情况下，可以配制涂层以增加或最大化一个或多个内表面上的可用结合位点(例如，拴系的寡核苷酸衔接子/引物序列)的数量，以增大或最大化前景信号，例如，由与拴系的寡核苷酸衔接子/引物序列杂交的经标记的核酸分子产生的荧光信号。在一些情况下，可以配制涂层以减少或最小化荧光团与其他小分子或经标记或未标记的核苷酸、蛋白质、酶、抗体、寡核苷酸或核酸分子(例如，dna、rna、等)的非特异性结合，以减少或最小化背景信号，例如由经标记的生物分子的非特异性结合或样品载体结构的自发荧光产生的背景荧光。在一些情况下可以通过使用所公开的涂层来实现的增大的前景信号和减小的背景信号的组合因此可以在光谱测量中提供改善的信噪比(snr)或在成像方法中提供改善的对比度噪声噪比(cnr)。
711.流体学系统和流体流量控制模块：在一些实施方式中，所公开的成像和/或分析系统可以提供流体流量控制能力，以将样品或试剂输送到连接到系统一个或多个流动池装置或流动池盒(例如，单个毛细管流动池装置或微流体通道流动池装置)。试剂和缓冲液可以储存在瓶子、试剂和缓冲液盒或其他合适的容器中，这些容器通过管道和阀门歧管连接到流动池入口。所公开的系统还可以包括用于收集毛细管流动池装置或毛细管流动池盒下游流体的以瓶子、盒或其他合适的容器形式的处理过的样品和废物储存器。在一些实施方案中，流体流量(或“流体学”)控制模块可以提供不同源之间的流量的可编程切换，所述不同
源例如，位于仪器中的样品或试剂储存器或瓶子，以及中心区域(例如，毛细管流动池或微流体装置，或大流体腔室(例如微流体装置内的大流体腔室))的一个或多个入口。在一些情况下，流体流量控制模块可以提供来自中心区域(例如，毛细管流动池或微流体装置)的一个或多个出口与连接到系统的不同的收集点(例如，处理过的样品储存器、废物储存器等)之间的流量的可编程切换。在一些情况下，可以将样品、试剂和/或缓冲液储存在与流动池盒或微流体盒本身集成在一起的储存器中。在一些情况下，可以将处理过的样品、用过的试剂和/或使用过的缓冲液储存在与流动池盒或微流体装置盒本身集成在一起的储存器中。
712.在一些实施方式中，一种或多种流体流量控制模块可以被配置为控制流体到一个或多个毛细管流动池、毛细管流动池盒、微流体装置、微流体盒或其任何组合的输送。在一些情况下，一种或多种流体学控制器可以被配置为控制一种或多种流体或试剂的体积流速、一种或多种流体或试剂的线性流速、一种或多种流体或试剂的混合比或其任何组合。通过所公开的系统的流体流量的控制通常将使用泵(或其他流体致动机构)和阀(例如，可编程泵和阀)来执行。合适的泵的示例包括但不限于注射泵、可编程注射泵、蠕动泵、隔膜泵等。合适的阀的示例包括但不限于止回阀、机电两通或三通阀、气动两通和三通阀等。在一些情况下，可通过对试剂和缓冲液容器的一个或多个入口或并入流动池盒(例如，毛细管流动池或微流体盒)的一个或多个入口施加正气压来控制通过系统的流体流量。在一些实施方案中，可通过在废物储存器的一个或多个出口处或并入流动池盒(例如，毛细管流动池或微流体盒)中的一个或多个出口处抽真空来控制通过系统的流体流量。
713.在一些情况下，在测定或分析程序中的不同点使用不同的流体流量控制模式，例如正向流动(相对于给定毛细管流动池装置的入口和出口)、反向流动、振荡或脉动流动或其组合。在一些应用中，例如，在分析洗涤/冲洗步骤期间，可以采用振荡或脉动流动，以促进一个或多个流动池装置或流动池盒(例如，毛细管流动池装置或盒和微流体装置或盒)内流体的完全或有效交换。
714.类似地，在一些情况下，可以在流动池装置内的不同位置或测定或分析过程工作流程中的不同点使用不同的流体流速，例如，在一些情况下，体积流速可以从-100ml/s至 100ml/s变化。在一些实施方式中，体积流速的绝对值可以为至少0.001ml/秒、至少0.01ml/秒、至少0.1ml/秒、至少1ml/秒、至少10ml/秒或至少100ml/秒。在一些实施方式中，体积流速的绝对值可以是至多100ml/秒、至多10ml/秒、至多1ml/秒、至多0.1ml/秒、至多0.01ml/秒或至多0.001ml/秒。在流动池装置给定位置或给定时间点的体积流速可以具有此范围内的任何值，例如正向流速为2.5ml/s，反向流速为-0.05ml/s，或值为0ml/s(即，停止流动)。
715.在一些实施方式中，流体学系统可以被设计成使执行例如，基因组分析应用所需的关键试剂(例如，昂贵的试剂)的消耗最小化。例如，在一些实施方式中，所公开的流体学系统可以包括容纳第一试剂或溶液的第一储存器、容纳第二试剂或溶液的第二储存器以及中心区域(例如，中心毛细管流动池或微流体装置)，其中第一储存器的出口和第二储存器的出口通过至少一个阀流体联接到中心毛细管流动池或微流体装置的入口，使得从第一储存器的出口到中心毛细管流动池或微流体装置的入口每单位时间流动的第一试剂或溶液的体积小于从第二储存器的出口到中心区域的入口每单位时间流动的第二试剂或溶液的体积。在一些实施方式中，第一储存器和第二储存器可以被集成到毛细管流动池盒或微流体盒中。在一些情况下，至少一个阀也可以集成到毛细管流动池盒或微流体盒中。
716.在一些情况下，第一储存器通过第一阀流体联接至中心毛细管流动池或微流体装置，第二储存器通过第二阀流体联接至中心毛细管流动池或微流体装置。在一些情况下，第一和/或第二阀可以是例如隔膜阀、夹管阀、闸阀或其他合适的阀。在一些情况下，第一储存器被定位成紧邻中心毛细管流动池或微流体装置的入口，以减少用于输送第一试剂溶液的死体积。在一些情况下，第一储存器比第二储存器放置更靠近中心毛细管流动池或微流体装置的入口。在一些情况下，第一储存器被定位为紧邻第二阀，以便相对于用于从多个“第二”储存器(例如，两个，三个，四个、五个或六个或更多个“第二”储存器)输送多种“第二”试剂(例如，两种、三种、四种、五种或六种或更多种“第二”试剂)的死体积，减小用于输送第一试剂的死体积。
717.上述的第一储存器和第二储存器可以用于容纳相同或不同的试剂或溶液。在一些情况下，容纳在第一储存器中的第一试剂不同于容纳在第二储存器中的第二试剂，并且第二试剂包括至少一种试剂，其被在中心毛细管流动池或微流体装置中发生的多个反应共同使用。在一些情况下，例如，在被配置用于在中心毛细管流动池或微流体装置内执行核酸测序化学的流体学系统中，第一试剂包括选自由以下组成的组中的至少一种试剂：聚合酶、核苷酸和核苷酸类似物。在一些情况下，第二试剂包括低成本试剂，例如溶剂。
718.在一些情况下，可以基于要执行的特定应用(例如，核酸测序)来调节中心区域(例如，中心毛细管流动池盒或包括一个或多个流体通道或流体腔室的微流体装置)的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对真核基因组测序的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对原核基因组测序的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对病毒基因组测序的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对转录组测序的内部体积。例如，在一些实施方案中，中心区域的内部体积可包括小于0.05μl、在0.05μl至0.1μl之间、在0.05μl至0.2μl之间、在0.05μl至0.5μl之间、在0.05μl至0.8μl之间、在0.05μl至1μl之间、在0.05μl至1.2μl之间、在0.05μl至1.5μl之间、在0.1μl至1.5μl之间、在0.2μl至1.5μl之间，在0.5μl至1.5μl之间、在0.8μl至1.5μl之间、在1μl至1.5μl之间、在1.2μl至1.5μl之间或大于1.5μl或上述任何两个定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于0.5μl、在0.5μ1至1μl之间、在0.5μl至2μl之间、在0.5μl至5μl之间、在0.5μl至8μl之间、在0.5μl至10μl之间、在0.5μl至12μl之间、在0.5μl至15μl之间、在1μl至15μl之间、在2μl至15μl之间、在5μl至15μl之间、在8μl至15μl之间、在10μl至15μl之间、在12μl至15μl之间或大于15μl或由前述任何两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于5μl、在5μl至10μl之间、在5μl至20μl之间、在5μl至500μl之间、在5μl至80μl之间、在5μl至100μl之间、在5μl至120μl之间、在5μl至150μl之间、在10μl至150μl之间、在20μl至150μl之间、在50μl至150μl之间、在80μl至150μl之间、在100μl至150μl之间、在120μl至150μl之间或大于150μl或由前述任何两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于50μl、在50μl至100μl之间、在50μl至200μl之间、在50μl至500μl之间、在50μl至800μl之间、在50μl至1000μl之间、在50μl至1200μl之间、在50μl至1500μl之间、在100μl至1500μl之间、在200μl至1500μl之间、在500μl至1500μl之间、在800μl至1500μl之间、在1000μl至1500μl之间、在1200μl至1500μl之间或大于1500μl或由前述任何两个定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于500μl、在500μl至1000μl之间、在500μl至2000μl之间、在500μl至5ml之间、在
500μl至8ml之间、在500μl至10ml、在500μl至12ml之间、在500μl至15ml之间、在1ml至15ml之间、在2ml至15ml之间、在5ml至15ml之间、在8ml至15ml之间、在10ml至15ml之间、在12ml至15ml之间或大于15ml或上述任何两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于5ml、在5ml至10ml之间、在5ml至20ml之间、在5ml至50ml之间、在5ml至80ml之间、在5ml至100ml之间、在5ml至120ml之间、在5ml至150ml之间、在10ml至150ml之间、在20ml至150ml之间、在50ml至150ml之间、在80ml至150ml之间、在100ml至150ml之间、在120ml至150ml之间或大于150ml，或由前述任何两个所定义的范围的体积。在一些实施方案中，本文描述的系统包括流动池装置或系统的阵列或集合，其包括多个离散的毛细管、微流体通道、流体通道、腔室或内腔区域，其中组合的内部体积为，包含或包括本文公开范围内的一个或多个值。
719.在一些情况下，用于将第一试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速与用于将第二试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速的比率可以小于1:20、小于1:16、小于1:12、小于1:10、小于1:8、小于1:6或小于1:2。在一些情况下，用于将第一试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速与用于将第二试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速的比率可以具有在这些值跨越的范围内的任何值，例如小于1:15。
720.如所指出的，与通过例如其他测序装置和系统，特别是在各种测序化学步骤中对于各种使用的昂贵试剂所实现的相比，本文公开的流动池装置和/或流体学系统可以被配置为实现对试剂的更有效使用。在一些情况下，第一试剂包括比第二试剂更昂贵的试剂。在一些情况下，第一试剂包括反应特异性试剂，第二试剂包括对在中心毛细管流动池或微流体装置区域中进行的所有反应共用的非特异性试剂，并且其中反应特异性试剂比非特异性试剂更昂贵。.
721.在一些情况下，利用本文所公开的流动池装置和/或流体学系统可以在减少昂贵试剂的消耗方面传达优势。在一些情况下，与操作例如当前的市售核酸测序系统时遇到的试剂消耗相比，例如，利用本文公开的流动池装置和/或流体学系统可导致试剂消耗减少至少5％、至少7.5％、至少10％、至少12.5％、至少15％、至少17.5％、至少20％、至少22.5％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
722.图26示出了简单的流体学系统的非限制性示例，其包括连接到各种流体流量控制组件的单个毛细管流动池，其中该单个毛细管是光可进入的并且与安装在显微镜载物台或定制成像仪器中兼容，用于各种成像应用中。多个试剂储存器与单个毛细管流动池装置的入口端流体联接，其中在任何给定时间点流经毛细管的试剂均通过可编程的旋转阀进行控制，该可编程的旋转阀允许使用者控制试剂流动的定时和持续时间。在该非限制性示例中，借助于可编程的注射泵来控制流体流量，该可编程注射泵提供对体积流体流量和流体流速的精确控制和定时。
723.温度控制模块：在一些实施方式中，所公开的系统将包括温度控制功能，以促进测定或分析结果的准确性和可重复性。可以并入仪器系统(或毛细管流动池盒)设计中的温度控制组件的示例包括但不限于电阻加热元件、红外光源、珀耳帖加热或冷却装置、散热器、热敏电阻、热电偶等等。在一些情况下，温度控制模块(或“温度控制器”)可以在执行特定的测定或分析步骤之前的指定的可调时间提供可编程的温度变化。在一些情况下，温度控制
器可以在指定的时间间隔内提供可编程的温度变化。在一些实施方式中，温度控制器可以进一步提供具有指定频率和缓变率的两个或更多个设定温度之间的温度循环，从而可以执行用于扩增反应的热循环。
724.流体分配机器人：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括自动化的可编程的流体分配(或液体分配)系统，用于将试剂或其他溶液分配到例如微板、毛细管流动池装置和盒、微流体装置和盒等中。合适的自动化的可编程的流体分配系统可从许多供应商，例如beckman coulter、perkin elmer、tecan、velocity 11和许多其他供应商购得。在所公开的系统的优选方面，流体分配系统还包括多通道分配头，例如4通道、8通道、16通道、96通道或384通道分配头，用于同时将可编程体积的液体(例如，范围为约1微升至几毫升)输送到流动池盒或微流体盒上的多个孔或位置。
725.盒和/或微板处理(拾放)机器人：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括盒和/或微板处理机器人系统，用于相对于光学成像系统自动更换和定位微板、毛细管流动池盒或微流体装置盒，或者用于任选地在光学成像系统和流体分配系统之间移动微板、毛细管流动池盒或微流体装置盒。合适的自动化的可编程微板处理机器人系统可从许多供应商处购得，包括beckman coulter、perkin elmer、tecan、velocity 11和许多其他供应商。在所公开的系统的优选方面，自动化的微板处理机器人系统被配置为将包含样品和/或试剂的微孔板的集合移入和移出例如冷藏储存单元。
726.光谱或成像模块：如上所述，在一些实施方式中，所公开的分析系统将包括光学成像能力，并且还可以包括其他光谱测量能力。例如，所公开的成像模块可以被配置为以本领域技术人员已知的多种成像模式中的任何一种进行操作，包括但不限于，明场、暗场、荧光、发光或磷光成像。在一些情况下，流体学子系统的一个或多个毛细管流动池或微流体装置包括窗口，其允许每个流动池或微流体装置中的一个或多个毛细管或一个或多个流体通道的至少一部分被照射并成像。
727.在一些实施方式中，可以执行单波长激发和发射荧光成像。在一些实施方式中，可以执行双波长激发和发射(或多波长激发或发射)荧光成像。在一些情况下，成像模块被配置为获取视频图像。成像模式的选择可以影响流动池装置或盒的设计，因为所有或部分毛细管或盒在所关注的光谱范围内都必须是光学透明的。在一些情况下，毛细管流动池盒中的多个毛细管可在单个图像内以其整体成像。在一些情况下，毛细管流动池盒内的仅单个毛细管或毛细管子集或其部分可在单个图像内成像。在一些情况下，一系列图像可以被“平铺”以创建盒内的一个、两个、几个或全部多个毛细管的单个高分辨率图像。在一些情况下，微流体芯片内的多个流体通道可在单个图像内以其整体成像。在一些情况下，微流体芯片内的仅单个流体通道或流体通道的子集或其部分可以在单个图像内成像。在一些情况下，一系列图像可以被“平铺”以创建盒内一个、两个、几个或全部多个流体通道的单个高分辨率图像。
728.光谱学或成像模块可以包括例如配备有ccd照相机的cmos的显微镜。在一些情况下，光谱学或成像模块可以包括例如被配置为执行所关注的特定光谱学或成像技术的定制仪器，例如一种本文所述的成像模块。通常，与光谱学或成像模块关联的硬件可以包括光源、检测器和其他光学组件，以及处理器或计算机。
729.光源：可以使用多种光源中的任何一种来提供成像或激发光，包括但不限于钨丝
灯、钨卤素灯、弧光灯、激光器、发光二极管(led)或激光二极管。在一些情况下，一个或多个光源与其他光学组件(例如透镜、滤光器、光阑、光圈、反射镜等)的组合可被配置为照明系统(或子系统)。
730.检测器：各种图像传感器均可以用于成像目的，包括但不限于光电二极管阵列、电荷耦合装置(ccd)照相机或互补金属-氧化物半导体(cmos)图像传感器。如本文所使用的，“图像传感器”可以是一维(线性)或二维阵列传感器。在许多情况下，一个或多个图像传感器与其他光学组件(例如透镜、滤光器、光阑、光圈、反射镜等)的组合可被配置为成像系统(或子系统)。在一些情况下，例如，在由系统执行光谱学测量而不是成像的情况下，合适的检测器可以包括但不限于光电二极管、雪崩光电二极管和光电倍增管。
731.其他光学组件：光谱学测量或成像模块的硬件组件可还包括用于操控、整形、过滤或聚焦通过系统的光束的各种光学组件。合适的光学组件的示例包括但不限于透镜、反射镜、棱镜、光阑、衍射光栅、有色玻璃滤波器、长通滤波器、短通滤波器、带通滤波器、窄带干涉滤波器、宽带干涉滤波器、二向色性反射器、光纤、光波导等。在一些情况下，如上文所述，光谱学测量或成像模块还可以包括一个或多个平移台或其他运动控制机构，以相对于照明和/或检测/成像子系统移动毛细管流动池装置和盒，或者反之亦然。
732.全内反射：在一些情况下，可以将光学模块或子系统设计为将流动池装置和盒中的毛细管或微流体通道的全部或部分的光学透明壁用作波导，以通过全内反射将激发光传输至毛细管或通道内腔。当入射的激发光以相对于表面法线的大于临界角(由毛细管或通道壁材料以及毛细管或通道内的水性缓冲液的相对折射率确定)的角度入射到毛细管或通道内腔的表面时，在表面发生全内反射，并且光沿着毛细管或通道的长度传播通过毛细管或通道壁。全内反射在内腔表面产生隐失波，该隐失波穿透管腔内部非常短的距离，并且可以用于选择性激发表面处的荧光团，例如通过固相引物延伸反应已通过聚合酶掺入到正在生长的寡核苷酸中的经标记的核苷酸。
733.不透光外壳和/或环境控制腔室：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括不透光的外壳，以防止杂散的环境光产生强光并遮蔽例如相对微弱的荧光信号。在一些实施方式中，所公开的系统可以包括环境控制腔室，其能够使系统在严格控制的温度、湿度水平等下运行。
734.处理器和计算机：在一些情况下，所公开的系统可以包括一个或多个处理器或计算机。处理器可以是硬件处理器，例如中心处理单元(cpu)、图形处理单元(gpu)、通用处理单元或计算平台。处理器可以由各种合适的集成电路、微处理器、逻辑装置、现场可编程门阵列(fpga)等中的任何一个组成。在一些情况下，处理器可以是单核或多核处理器，或者可以将多个处理器配置用于并行处理。尽管参考处理器描述了本公开，但是也可以应用其他类型的集成电路和逻辑装置。处理器可以具有任何合适的数据操作能力。例如，处理器可以执行512位、256位、128位、64位、32位或16位数据操作。
735.处理器或cpu可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置中。指令可以针对cpu，其随后可以对cpu进行编程或以其他方式配置cpu以实现例如本公开的系统控制方法。cpu执行的操作的示例可以包括获取、解码、执行和回写。
736.一些处理器可以包括计算机系统的处理单元。该计算机系统可以实现基于云的数
据存储和/或计算。在一些情况下，计算机系统可以借助于通信接口可操作地耦合到计算机网络(“网络”)。该网络可以是互联网、内联网和/或外联网，与互联网通信的内联网和/或外联网或局域网(lan)。在一些情况下，该网络是电信和/或数据网络。该网络可以包括一个或多个计算机服务器，其可以启用分布式计算，例如基于云的计算。
737.计算机系统还可包括计算机存储器或存储器位置(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口(例如，网络适配器)以及外围装置(例如缓存、其他存储器单元、数据存储单元和/或电子显示适配器)。在一些情况下，通信接口可以允许计算机与一个或多个附加装置进行通信。该计算机可能够从耦合的装置接收输入数据以进行分析。存储器单元、存储单元、通信接口和外围装置可以通过例如可并入主板中的通信总线(实线)与处理器或cpu进行通信。存储器或存储单元可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。存储器或存储单元可以存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储器或存储单元可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。
738.本文所述的系统控制、图像处理和/或数据分析方法可以通过存储在计算机系统的电子存储位置(例如，存储器或电子存储单元)中的机器可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器执行。在一些情况下，可以从存储单元检索代码并将其存储在存储器中，以供处理器随时访问。在一些情况下，可以去掉电子存储单元，将机器可执行指令存储在存储器中。
739.在一些情况下，代码可以被预编译并配置为与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用。在一些情况下，可以在运行时期间编译代码。可以以编程语言提供代码，可以选择该编程语言以使该代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。
740.本文提供的系统和方法的一些方面可以用软件来体现。该技术的各个方面可被视为“产品”或“制品”，其通常为在一种类型的机器可读介质上携载或在该一种类型的机器可读介质中体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘上。“存储”类型的介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，例如可随时提供用于软件编程的非暂时性存储的各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等。软件的全部或部分有时可以通过互联网或其他各种电信网络进行通信。这样的通信例如可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括诸如跨本地装置之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的光波、电波和电磁波。携载此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所使用，除非限制于非暂时性、有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
741.在一些情况下，本公开的系统控制、图像处理和/或数据分析方法可以通过一种或多种算法来实现。可以在中心处理单元执行时通过软件来实现算法。
742.系统控制软件：在一些情况下，系统可以包括计算机(或处理器)和计算机可读介质，该计算机可读介质包括代码，所述代码用于提供用户界面以及对所有系统功能的手动、
半自动或全自动控制(例如，控制流体流量控制模块、温度控制模块和/或光谱学或成像模块)，以及其他数据分析和显示选项。系统计算机或处理器可以是系统的集成组件(例如，嵌入仪器中的微处理器或主板)，也可以是独立模块，例如大型计算机、个人计算机或便携式计算机。由系统控制软件提供的流体流量控制功能的示例包括但不限于体积流体流量、流体流速、样品和试剂添加的时机和持续时间、缓冲液添加和冲洗步骤。系统控制软件提供的温度控制功能的示例包括但不限于指定温度设定点以及控制温度变化的时机、持续时间和缓变速率。系统控制软件提供的光谱学测量或成像控制功能的示例包括但不限于自动聚焦能力，照明或激发光曝光时间和强度的控制，图像采集速率、曝光时间的控制以及数据存储选项。
743.图像处理软件：在一些情况下，系统还可以包括计算机(或处理器)和计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于提供图像处理和分析能力的代码。可由软件提供的图像处理和分析能力的示例包括但不限于手动、半自动或全自动图像曝光调整(例如，白平衡、对比度调整、信号平均和其他降噪能力等)、自动边缘检测和对象鉴定(例如，用于鉴定毛细管流动池装置内腔表面上经荧光标记的寡核苷酸的克隆扩增簇)、自动化统计分析(例如，用于确定每单位面积的毛细管内腔表面鉴定的寡核苷酸的克隆扩增簇的数量，或用于核酸测序应用中的自动核苷酸碱基判定)以及手动测量能力(例如，用于测量簇或其他对象之间的距离等)。任选地，仪器控制和图像处理/分析软件可以编写为单独的软件模块。在一些实施方式中，仪器控制和图像处理/分析软件可以被结合到集成包中。
744.本领域技术人员已知的多种图像处理方法中的任何一种都可以用于图像处理/预处理。示例包括但不限于canny边缘检测方法、canny-deriche边缘检测方法、一阶梯度边缘检测方法(例如，sobel运算子)、二阶差分边缘检测方法、相位一致性(相位相干性)边缘检测方法、其他图像分割算法(例如，强度阈值化、强度聚类方法、基于强度直方图的方法等)、特征和模式识别算法(例如用于检测任何形状的广义霍夫变换、圆形霍夫变换，等)和数学分析算法(例如傅里叶变换、快速傅里叶变换、小波分析、自相关法等)或其任何组合。
745.核酸测序系统和应用：核酸测序，例如细胞可寻址核酸测序提供了所公开的流动池装置(例如，毛细管流动池装置或盒以及微流体装置和盒)和成像系统的应用的一个非限制性示例。本文公开的流动池装置设计的改善(例如，包括亲水性涂覆表面，该亲水性涂覆表面使例如布置在其上的经荧光标记核酸簇的前景信号最大化，同时使背景信号最小化)与通过改善的物镜和/或套筒透镜设计(提供更大的景深和更大的视场)实现的用于快速双表面流通池成像(包括对内流通池表面的同时或近乎同时成像)的光学成像系统设计的改善相结合，可以引起改善用于碱基判定目的的图像的cnr，并且减少试剂消耗(通过改善的流动池设计实现)可引起显著提高碱基判定准确度、缩短成像周期时间、缩短总体测序反应周期时间以及在对于每个碱基降低的成本下提高通量核酸测序。
746.在一些情况下，与本文公开的光学成像系统组合使用的所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置可为核酸测序系统带来以下一项或多项另外优势：(i)减少了流体洗涤时间(由于减少了非特异性结合，因此测序周期时间更快)，(ii)减少成像时间(因此测定读数和测序周期的周转时间更快)，(iii)减少了总体工作流程时间要求(由于减少了周期时间)，(iv)降低了检测仪器成本(由于cnr的改善)，(v)提高了读数(碱基判定)的准确性(由于cnr的改善)，(vi)提高了试剂的稳定性并降低了试剂的使用要求(从而降低了试剂成
本)，以及(vii)由于核酸扩增失败而导致的运行失败更少。
747.被配置用于测序的流动池装置：在一些情况下，根据本公开的一个或多个流动池装置可以被配置用于核酸测序应用，例如，其中两个或更多个内流动池装置表面包含亲水性聚合物涂层，如本文其他部分所述，其还包含一种或多种捕获寡核苷酸，例如本文其他部分公开的衔接子/引物寡核苷酸或任何其他寡核苷酸。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可以包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于对真核生物基因组测序。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可以包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于对原核生物基因组或其部分测序。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于对病毒基因组或其部分测序。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于对转录组测序。
748.在一些情况下，本公开的流动池装置可包括以大体上面向流动通道的内部的取向的第一表面、以大体上面向流动通道的内部并且还大体上面向或平行于第一表面的取向的第二表面、大体上面向第二流动通道的内部的第三表面和大体上面向第二流动通道的内部并且与第三表面相对或平行的第四表面；其中所述第二表面和第三表面可以位于大体上平坦的基底(其可以是反射、透明或半透明基底)的相对侧或附接到其上。在一些情况下，流动池内的一个或多个成像表面可以位于流动池的中心内，或者位于流动池的两个子单元或子分区之间的分区内或作为其一部分，其中，所述流动池可以包括顶表面和底表面，其中的一个或两者对于可以使用的此类检测模式可以是透明的；并且其中可以将包含拴系到一个或多个聚合物涂层的寡核苷酸衔接子/引物的表面放置或插入流动池的内腔内。在一些情况下，顶表面和/或底表面不包含附接的寡核苷酸衔接子/引物。在一些情况下，顶表面和/或底表面确实包含附接的寡核苷酸衔接子/引物。在一些情况下，所述顶表面或所述底表面可包含附接的寡核苷酸衔接子/引物。放置或插入流动池内腔内的一个或多个表面可以位于或附接到大体上平坦的基底(其可以是反射、透明或半透明基底)的一侧、相对侧或两侧。
749.经亲水性聚合物涂覆的流动池装置表面的荧光成像：所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置(包括例如布置在其上的经标记靶核酸分子的克隆簇)可用于各种核酸分析应用中的任何一种，例如核酸碱基鉴别、核酸碱基分类、核酸碱基判定、核酸检测应用、核酸测序应用以及基于核酸的(遗传和基因组)诊断应用。在许多这些应用中，荧光成像技术可用于监测在低结合性载体上进行的杂交、扩增和/或测序反应。荧光成像可以使用本文公开的任何光学成像模块以及各种荧光团、荧光成像技术和本领域技术人员已知的其他荧光成像仪器进行。
750.核酸测序系统性能：在一些情况下，所公开的核酸测序系统包括一个或多个与一个或多个所公开的光学成像系统结合使用的所公开的流动池装置，并且任选地利用一种新兴的测序生物化学，例如美国专利第10,655,176b2号中描述的“核苷酸结合测序”方法，和美国专利第10,768,173b2号中描述的“亲和力测序”方法代替了更传统的核苷酸掺入测序方法，可在以下方面提供改善的核酸测序性能：例如，减少样品输入要求，减少图像获取周期时间，减少测序反应周期时间，减少测序运行时间，提高碱基判定的准确性，减少试剂消耗和成本，提高测序通量，并降低测序成本。
751.核酸样品输入(pm)：在一些情况下，由于使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置和成像系统，可以获得改善的杂交和扩增效率，并且可以获取用于碱基判定的高cnr图像，因此可以显著降低所公开系统的样品输入要求。在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约1pm至约10,000pm的范围内。在一些情况下，核酸样品输入要求可以是至少1pm、至少2pm、至少5pm、至少10pm、至少20pm、至少50pm、至少100pm、至少200pm、至少500pm、至少1,000pm、至少2,000pm、至少5,000pm、至少10,000pm。在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以是至多10,000pm、至多5,000pm、至多2,000pm、至多1,000pm、至多500pm、至多200pm、至多100pm、至多50pm、至多20pm、至多10pm、至多5pm、至多2pm或至多1pm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约5pm至约500pm的范围内。本领域技术人员将认识到，核酸样品输入要求可以具有在该范围内的任何值，例如，约132pm。在一个示例性情况下，约100pm的核酸样品输入足以产生用于可靠碱基判定的信号。
752.核酸样品输入(纳克)：在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约0.05纳克至约1,000纳克的范围内。在一些情况下，核酸样品输入要求是至少0.05纳克、至少0.1纳克、至少0.2纳克、至少0.4纳克、至少0.6纳克、至少0.8纳克、至少1.0纳克、至少2纳克、至少4纳克、至少6纳克、至少8纳克、至少10纳克、至少20纳克、至少40纳克、至少60纳克、至少80纳克、至少100纳克、至少200纳克、至少400纳克、至少600纳克、至少800纳克或至少1,000纳克。在一些情况下，核酸样品输入要求可以是至多1,000纳克、至多800纳克、至多600纳克、至多400纳克、至多200纳克、至多100纳克、至多80纳克、至多60纳克、至多40纳克、至多20纳克、至多10纳克、至多8纳克、至多6纳克、至多4纳克、至多2纳克、至多1纳克、至多0.8纳克、至多0.6纳克、至多0.4纳克、至多0.2纳克、至多0.1纳克或至多0.05纳克。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求的范围可以为约0.6纳克至约400纳克。本领域技术人员将认识到，核酸样品输入要求可以具有在该范围内的任何值，例如，约2.65纳克。
753.#平铺流动池所需的fov图像：在一些情况下，所公开的光学成像模块的视场(fov)足够大，以至于本公开的多通道(或多泳道)流动池(即其流体通道部分)可以通过平铺约10个fov图像(或“帧”)至约1,000个fov图像(或“帧”)来成像。在一些情况下，整个多通道流动池的图像可需要平铺至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950或至少1,000个fov图像(或“帧”)。在一些情况下，整个多通道流动池的图像可需要平铺至多1,000、至多950、至多900、至多850、至多800、至多750、至多700、至多650、至多600、至多550、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多150、至多100、至多90、至多80、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20或至多10个fov图像(或“帧”)。该段落中描述的任何下限值和上限值都可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，整个多通道流动池的图像可需要平铺约30个至约100个fov图像。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，所需的fov图像的数量可以具有在该范围内的任何值，例如，约54个fov图像。
754.成像周期时间：在一些情况下，大的fov、图像传感器响应灵敏度和/或快速的fov
平移时间的组合使得能够缩短成像周期时间(即，获取足够数量的fov图像以平铺整个多通道流动池(或其流体通道部分)所需的时间)。在一些情况下，成像周期时间可以在约10秒至约10分钟的范围内。在一些情况下，成像周期时间可以是至少10秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟或至少10分钟。在一些情况下，成像周期时间可以是至多为10分钟、至多9分钟、至多8分钟、至多7分钟、至多6分钟、至多5分钟、至多4分钟、至多3分钟、至多2分钟、至多1分钟、至多50秒、至多40秒、至多30秒、至多20秒或至多10秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，成像周期时间可以在约20秒至约1分钟的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，成像周期时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约57秒。
755.测序周期时间：在一些情况下，缩短的测序反应步骤(例如，由于减少了所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池的洗涤时间要求)可导致缩短整个测序周期时间。在一些情况下，所公开系统的测序周期时间可以在约1分钟至约60分钟的范围内。在一些情况下，测序周期时间可以是至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟或至少60分钟。在一些情况下，测序反应周期时间可以是至多60分钟、至多55分钟、至多50分钟、至多45分钟、至多40分钟、至多35分钟、至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟、至多9分钟、至多8分钟、至多7分钟、至多6分钟、至多5分钟、至多4分钟、至多3分钟、至多2分钟或至多1分钟。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序周期时间可以在约2分钟至约15分钟的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序周期时间可具有在该范围内的任何值，例如，约1分钟12秒。
756.测序读取长度：在一些情况下，增强的cnr图像可以通过使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置与所公开的成像系统组合来实现，并且在一些情况下，使用较温和的测序生物化学法可以使得能够针对公开的系统实现更长的测序读取长度。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以在约50bp至约500bp的范围内。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以是至少50bp、至少100bp、至少150bp、至少200bp、至少250bp、至少300bp、至少350bp、至少400bp、至少450bp或至少500bp。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以是至多500bp、至多450bp、至多400bp、至多350bp、至多300bp、至多250bp、至多200bp、至多150bp、至多100bp或至多50bp。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以在约100bp至约450bp的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以具有在该范围内的任何值，例如，约380bp。
757.测序运行时间：在一些情况下，所公开的核酸测序系统的测序运行时间可以在约8小时至约20小时的范围内。在一些情况下，测序运行时间是至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时、至少16小时、至少18小时或至少20小时。在一些情况下，测序运行时间是至多20小时、至多18小时、至多16小时、至多14小时、至多12小时、至多10小时、至多9小时或至多8小时。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开
中包括的范围，例如，在一些情况下，测序运行时间可以在约10小时至约16小时的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序运行时间可以具有该范围内的任何值，例如，约7小时35分钟。
758.平均碱基判定准确度：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以在测序运行过程中提供至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少有98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％的平均碱基判定准确度。在一些情况下，所公开的核酸测序系统每判定1,000个碱基、10,0000个碱基、25,000个碱基、50,000个碱基、75,000个碱基或100,000个碱基可以提供至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％正确的平均碱基判定准确度。
759.平均q得分：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以提供更准确的碱基读出。例如，在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以提供针对测序运行中的碱基判定准确度的平均q得分，其范围为约20至约50。在一些情况下，平均q得分可以是至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。本领域技术人员将认识到，平均q得分可以具有在该范围内的任何值，例如约32。
760.q得分相对于鉴定的核苷酸％：在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于30的q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于35的q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于40的q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于45的q得分。在一些情况下，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于50的q得分。
761.试剂消耗：在一些情况下，由于例如使用使流体通道体积和死体积最小化的所公开的流动池装置和流体系统，所以所公开的核酸测序系统可以具有较低的试剂消耗率和成本。因此，在一些情况下，与illumina miseq测序仪消耗的试剂相比，所公开的核酸测序系统每gbase测序可需要的试剂按体积计平均减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
762.测序通量：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可提供的测序通量在约50gbase/运行至约200gbase/运行范围内。在一些情况下，测序通量可以是至少50gbase/运行、至少75gbase/运行、至少100gbase/运行、至少125gbase/运行、至少150gbase/运行、至少175gbase/运行或至少200gbase/运行。在一些情况下，测序通量可以是至多200gbase/运行、至多175gbase/运行、至多150gbase/运行、至多125gbase/运行、至多100gbase/运行、至多75gbase/运行或至多50gbase/运行。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序通量的范围可以为约75gbase/运行至约
150gbase/运行。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序通量可以具有在该范围内的任何值，例如，约119gbase/运行。
763.测序成本：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以以每gbase约5美元至每gbase约30美元的成本提供核酸测序。在一些情况下，测序成本可以是每gbase至少5美元、每gbase至少10美元、每gbase至少15美元、每gbase至少20美元、每gbase至少25美元或每gbase至少30美元。在一些情况下，测序成本可以是每gbase至多30美元、每gbase至多25美元、每gbase至多20美元、每gbase至多15美元、每gbase至多10美元、或者每gbase至多30美元。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序成本可以在每gbase约10美元至每gbase约15美元的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序成本可以具有在该范围内的任何值，例如每gbase约7.25美元。
764.在美国专利申请第16/363,842号中、如在美国专利申请第17/016,349号、美国专利申请第17/016,350号和美国专利申请第17/016,353号中公开的杂交方法中进一步提供了光学系统的启用，出于所有目的，特此通过引用明确并入其内容。i.定义
765.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为代表与本领域通常理解的含义具有实质性差异。
766.通常，本文所述的与分子生物学、核酸化学、蛋白质化学、遗传学、微生物学、转基因细胞生产和杂交技术有关的术语是本领域已知和常用的术语。本文所述的技术和程序通常根据本领域公知的常规方法执行，并如整个本说明书中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述。例如，参见sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual(第三版,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.2000)。还参见ausubel等人，current protocols in molecular biology,greene publishing associates(1992)。本文所述的与之相关的术语以及实验室程序和技术是本领域已知且常用的。
767.遍及整个申请，可以范围格式呈现各个实施方案。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应理解为对本公开范围的非灵活性限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
768.如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式的“a(一个)”、“an(一种)”和“the(所述)”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一个样品”包括多个样品，包括其混合物。
769.在本文中使用的术语“和/或”应被理解为具有或不具有另一个的指定的特征或组件中的每个的具体公开。例如，本文中诸如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括：“a和b”；“a或b”；“a”(单独的a)；和“b”(单独的b)。以类似的方式，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个方面：“a、b和c”；“a、b或c”；“a或c”；“a或b”；“b或c”；“a和b”；“b和c”；“a和c”；“a”(单独的a)；“b”(单独的b)；和“c”(单独的c)。
770.如本文和所附权利要求中所使用的，本文中所使用的术语“包括”、“包括有”、“具有”和“包含”及其语法变体旨在是非限制性的，以便列表中的一个项目或多个项目不排除可替换或添加到所列项目中的其他项目。应理解，在任何情况下，还提供了在本文中以语言“包括”描述的方面，在其他方面根据“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的类似方面。
771.术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”在本文中通常互换使用，指的是测量形式。这些术语包括确定元素是否存在(例如，检测)。这些术语可以包括定量、定性或定量和定性测定。评估可以是相对的，或者是绝对的。“检测
…
的存在”除了根据上下文确定存在或不存在之外，还可以包括确定存在的某物的量。
772.术语“对象”、“个体”或“患者”在本文中通常互换使用。“对象”可以是包含表达的遗传材料的生物实体。生物实体可以是植物、动物或微生物，包括例如，细菌、病毒、真菌和原生动物。对象可以是体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。对象可以是哺乳动物。哺乳动物可以是人。对象可被诊断或怀疑处于疾病的高风险中。在一些情况下，对象不一定被诊断或怀疑处于该疾病的高风险中。
773.术语“体内”用于描述在对象体内发生的事件。
774.术语“离体”用于描述在对象体外发生的事件。不在对象上进行“离体”测定。相反，它是在与对象分开的样品上进行的。对样品进行的“离体”测定的示例是“体外”测定。
775.术语“体外”用于描述在容纳实验室试剂的容器中发生的事件，从而使其与从中获得材料的生物源分离。体外测定可以包括基于细胞的测定，其中使用活细胞或死细胞。体外测定还可以包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。
776.如本文所用，术语“约”和“大约”是指由本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其部分地取决于该值或组成是如何测量或确定的，例如测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”或“大约”可以表示在1个或大于1的标准偏差之内。或者，“约”或“大约”可意指高达10％(即，
±
10％)或更大的范围，这取决于测量系统的限制。例如，约5mg可包括4.5mg至5.5mg的任何数字。此外，特别地关于生物系统或过程，这些术语可意指高达一个数量级或高达值的5倍。当在本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“大约”的含义应假定在该特定值或组成的可接受误差范围内。此外，在提供了值的范围和/或子范围的情况下，范围和/或子范围可以包括范围和/或子范围的端点。
777.如本文所用，术语“聚合酶”及其变体包括一种酶，该酶包含结合核苷酸(或核苷)的结构域，其中聚合酶可以形成具有模板核酸和互补核苷酸的复合物。聚合酶可具有一种或多种活性，包括但不限于碱基类似物检测活性、dna聚合活性、逆转录酶活性、dna结合、链置换活性以及核苷酸结合和识别。聚合酶可以是能够催化核苷酸(包括其类似物)聚合成核酸链的任何酶。通常，但不一定，这种核苷酸聚合可以模板依赖性方式发生。通常，聚合酶包含一个或多个活性位点，在这些活性位点上可以发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合的催化。在一些实施方案中，聚合酶包括其他酶活性，诸如例如3’至5
′
核酸外切酶活性或5
′
至3’核酸外切酶活性。在一些实施方案中，聚合酶具有链置换活性。聚合酶可包括但不限于天然存在的聚合酶及其任何亚单元和截短物，突变聚合酶，变体聚合酶，重组、融合或以其他方式
工程化的聚合酶，化学修饰的聚合酶，合成分子或组装体，以及任何类似物，保留催化核苷酸聚合能力的其衍生物或片段(例如，催化活性片段)。聚合酶包括催化惰性聚合酶、催化活性聚合酶、逆转录酶和包含核苷酸结合结构域的其他酶。在一些实施方案中，可以从细胞中分离聚合酶，或使用重组dna技术或化学合成方法生成聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可在原核生物、真核生物、病毒或噬菌体生物体中表达。在一些实施方案中，聚合酶可以是翻译后修饰的蛋白质或其片段。聚合酶可以来源于原核生物、真核生物、病毒或噬菌体。聚合酶包括dna定向dna聚合酶和rna定向dna聚合酶。
778.如本文所用，术语“链置换”是指聚合酶局部分离双链核酸链并以基于模板的方式合成新链的能力。链置换聚合酶从模板链置换互补链并催化新链合成。链置换聚合酶包括嗜温和嗜热聚合酶。链置换聚合酶包括野生型酶，以及包括核酸外切酶阴性突变体、突变体版本、嵌合酶和截短酶的变体。链置换聚合酶的示例包括phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶的大片段、bsu dna聚合酶的大片段(外-)、bca dna聚合酶(外-)、大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段、t5聚合酶、m-mulv逆转录酶、hiv病毒逆转录酶、deep vent dna聚合酶和kod dna聚合酶。phi29 dna聚合酶可以是野生型phi29 dna聚合酶(例如，来自expedeon的magniphi)、或变体equiphi29 dna聚合酶(例如，来自thermo fisher scientific)或嵌合型qualiphi dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
779.如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”以及其他相关术语可以互换使用，并指核苷酸的聚合物，且不限于任何特定长度。核酸包括重组和化学合成形式。核酸可被分离。核酸包括dna分子(例如，cdna或基因组dna)、rna分子(例如，mrna)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸(pna)和非天然存在的核苷酸类似物)生成的dna或rna的类似物，以及包含dna和rna的嵌合体形式。核酸可以是单链的或双链的。核酸包括核苷酸的聚合物，其中核苷酸包括天然或非天然碱和/或糖。核酸包括天然存在的核苷间键，例如磷酸二酯键。核酸可缺少磷酸基团。核酸包括非天然的核苷间键，包括硫代磷酸键、硫醇代磷酸键(phosphorothiolate)或肽核酸(pna)键。在一些实施方案中，核酸包含一种类型的多核苷酸或两种或更多种不同类型的多核苷酸的混合物。
780.本文使用的术语“引物”及相关术语是指能够与dna和/或rna多核苷酸模板杂交以形成双链体分子的寡核苷酸。引物包括天然核苷酸和/或核苷酸类似物。引物可以是重组核酸分子。引物可以具有任何长度，但通常范围为4-50个核苷酸。典型的引物包括5’端和3’端。引物的3’端可包括3’oh部分，其在聚合酶催化的引物延伸反应中充当核苷酸聚合起始位点。或者，引物的3’端可以缺少3’oh部分，或者可以包括末端3’封闭基团，其在聚合酶催化反应中抑制核苷酸聚合。沿着引物长度的任何一个核苷酸或多于一个核苷酸都可以用可检测的报告部分进行标记。引物可以在溶液中(例如，可溶性引物)或固定在载体上(例如，捕获引物)。
781.可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种，从细胞或生物样品中提取目标核酸。例如，典型的dna提取程序包括(i)收集要提取dna的细胞样品或组织样品，(ii)破坏细胞膜(即，细胞裂解)以释放dna和其他细胞质组分，(iii)用浓缩盐溶液处理裂解样品以沉淀蛋白质、脂质和rna，然后离心分离出沉淀的蛋白质、脂质和rna，以及(iv)从上清液中纯化dna，以去除细胞膜裂解过程中使用的洗涤剂、蛋白质、盐或其他试剂。多种合适的商用核酸提取和纯化试剂盒与本文的公开内容一致。示例包括但不限于来自qiagen
(germantown,md)的qiaamp试剂盒(用于从人类样品中分离基因组dna)和dnaeasy试剂盒(用于从动物或植物样品中分离基因组dna)、或来自promega(madison,wi)的和reliaprep
tm
系列的试剂盒。
782.术语“模板核酸”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”、“模板链”和其他变体是指用作本文所述任何分析方法(例如，扩增和/或测序)的基础核酸分子的核酸链。模板核酸可以是单链或双链，或者模板核酸可以具有单链或双链部分。模板核酸可从天然来源、重组形式或化学合成获得以包括任何类型的核酸类似物。模板核酸可以是线性、环状或其他形式。模板核酸可以包含具有插入序列的插入部分。模板核酸还可以包含至少一个衔接子序列。插入部分可以任何形式分离，包括染色体、基因组、细胞器(例如线粒体、叶绿体或核糖体)、重组分子、克隆物、扩增物、cdna、rna(如前体mrna或mrna)、寡核苷酸、全基因组dna，获自经新鲜冷冻石蜡包埋的组织、针刺活检、循环肿瘤细胞、无细胞循环dna、或者任何类型的核酸文库。插入部分可以从任何来源分离，包括从诸如原核生物、真核生物(例如人类、植物和动物)的生物体、真菌、病毒细胞、组织、正常或患病的细胞或组织、体液(包括血液、尿液、血清、淋巴液)、肿瘤、唾液、肛门和阴道分泌物、羊水样品、汗液、精液、环境样品、培养样品、或使用重组分子生物学或化学合成方法制备的合成核酸分子。插入部分可从任何器官分离，包括头部、颈部、大脑、乳房、卵巢、子宫颈、结肠、直肠、子宫内膜、胆囊、肠、膀胱、前列腺、睾丸、肝、肺、肾、食道、胰腺、甲状腺、垂体、胸腺、皮肤、心脏、喉部或其他器官。可以对模板核酸进行核酸分析，包括测序和组成分析。
783.术语“衔接子”及相关术语是指可操作地连接到靶多核苷酸的寡核苷酸，其中衔接子赋予共同连接的衔接子-靶分子功能。衔接子包括dna、rna、嵌合dna/rna或其类似物。衔接子可以包含至少一个核糖核苷残基。衔接子可以是单链、双链或具有单链和/或双链部分。衔接子可以被配置为线性、茎环、发夹或y形形式。衔接子可以是任何长度，包括4-100个核苷酸或更长。衔接子可以有钝端、突出端或两者的组合。突出端包括5’突出端和3’突出端。单链衔接子的5’端或双链衔接子的一个链可具有5’磷酸基团或缺少5’磷酸基团。衔接子可以包括不与靶多核苷酸杂交的5’尾(例如，带尾衔接子)，或者衔接子可以是无尾的。衔接子可以包括与引物的至少一部分互补的序列，例如扩增引物、测序引物或捕获引物(例如，可溶性或固定的捕获引物)。衔接子可以包括随机序列或简并序列。衔接子可以包括至少一个肌苷残基。衔接子可以包括至少一个硫代磷酸酯、硫醇代磷酸酯和/或氨基磷酸酯键。衔接子可包括条形码序列，该条形码序列可用于在多重分析中区分来自不同样品源的多核苷酸(例如，插入序列)。衔接子可包括独特鉴定序列(例如，独特分子索引，umi；或独特分子标签)，其可用于独特鉴定衔接子所附加至的核酸分子。在一些实施方案中，独特鉴定序列可用于增加纠错和准确性、降低假阳性变体判定率和/或增加变体检测的灵敏度。衔接子可以包含至少一个限制性内切酶识别序列，包括选自i型、ii型、iii型、iv型、hs型或iib型的任何一个或两个或更多个的任何组合。
784.在一些实施方案中，扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、靶捕获序列、环化锚定序列、样品条形码序列、空间条形码序列或锚定区序列中的任何一个的长度可为约3-50个核苷酸，或长度为约5-40个核苷酸，或长度为约5-25个核苷酸。
785.术语“通用序列”及相关术语是指核酸分子中在两个或更多个多核苷酸分子之间共同的序列。例如，具有通用序列的衔接子可操作地连接到多个多核苷酸，使得共同连接的
分子群携带相同的通用衔接子序列。通用衔接子序列的示例包括扩增引物序列、测序引物序列或捕获引物序列(例如，可溶性或固定的捕获引物)。
786.当关于核酸分子使用时，术语“杂交”或其他相关术语是指两种不同核酸之间的氢键，以形成双链体核酸。杂交还包括单个核酸分子的两个不同区之间的氢键，以形成具有双链体区的自杂交分子。杂交可以包括watson-crick或hoogstein结合以形成双链体双链核酸或核酸分子内的双链区。双链核酸，或单个核酸的两个不同区可以完全互补或部分互补。互补核酸链不需要在其整个长度上彼此杂交。互补碱基配对可以是标准的a-t或c-g碱基配对，或者可以是其他形式的碱基配对相互作用。双链体核酸可以包括配错的碱基配对核苷酸。
787.当关于核酸使用时，术语“延伸”和其他变体是指将一个或多个核苷酸掺入核酸分子。核苷酸掺入包括一个或多个核苷酸聚合到核酸链的末端3’oh端，导致核酸链的延伸。核苷酸掺入可通过天然核苷酸和/或核苷酸类似物进行。通常，但不一定，核苷酸掺入以模板依赖性方式发生。可以使用延伸核酸分子的任何合适方法，包括由dna聚合酶或rna聚合酶催化的引物延伸。
788.在一些实施方案中，扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列(捕获寡核苷酸)、靶捕获序列、环化锚定序列、样品条形码序列、空间条形码序列或锚定区序列中的任何一个的长度可为约3-50个核苷酸，或长度为约5-40个核苷酸，或长度为约5-25个核苷酸。
789.术语“核苷酸”或“核酸”及相关术语是指包含芳香族碱、五碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸基团的分子。规范或非规范核苷酸与该术语的用法一致。在一些实施方案中，磷酸包括单磷酸、二磷酸或三磷酸，或相应的磷酸类似物。术语“核苷”是指包含芳香族碱和糖的分子。核苷酸和核苷可以不经标记，或者可以用可检测的报告部分标记。核酸或核苷酸的“衍生物”可以是从该核苷酸衍生的基本相似的核苷酸(诸如例如在扩增反应中)。
790.核苷酸(和核苷)通常包含杂环碱，包括在核酸中常见的取代或未取代的含氮母体杂芳香族环，包括天然存在的、取代的、修饰的或工程化的变体，或其类似物。核苷酸(或核苷)的碱基能够与适当的互补碱基形成watson-crick和/或hoogstein氢键。示例性碱基包括但不限于嘌呤和嘧啶，例如：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、腺嘌呤(a)、亚乙烯基腺嘌呤、n
6-δ
2-异戊烯基腺嘌呤(6ia)、n
6-δ
2-异戊烯基-2-甲基硫代腺嘌呤(2ms6ia)、n
6-甲基腺嘌呤、鸟嘌呤(g)、异鸟嘌呤、n
2-二甲基鸟嘌呤(dmg)、7-甲基鸟嘌呤(7mg)、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤(6sg)、次黄嘌呤和o
6-甲基鸟嘌呤；7-脱氮-嘌呤如7-脱氮腺嘌呤(7-脱氮-a)和7-脱氮鸟嘌呤(7-脱氮-g)；嘧啶，如胞嘧啶(c)、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、胸腺嘧啶(t)、4-硫代胸腺嘧啶(4st)、5,6-二氢胸腺嘧啶、o
4-甲基胸腺嘧啶、尿嘧啶(u)、4-硫代尿嘧啶(4su)和5,6-二氢尿嘧啶(二氢尿嘧啶；d)；吲哚，如硝基吲哚和4-甲基吲哚；吡咯，如硝基吡咯；水粉蕈素；肌苷；羟甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；碱基(y)；以及甲基化、糖基化和酰化碱基部分等。另外的示例性碱基可以在fasman,1989，在“practical handbook of biochemistry and molecular biology”,第385-394页,crc press,boca raton,fla.中找到。
791.核苷酸(和核苷)通常包含糖部分，例如碳环部分(ferraro和gotor 2000 chem.rev.,100:4319-48)、非环部分(martinez等人,1999 nucleic acids research 27:
handbook,(eugene,oreg.)第6版；lakowicz,principles of fluorescence spectroscopy,第2版,plenum press new york(1999)或hermanson,bioconjugate techniques,第2版中描述的那些，或其衍生物，或其任何组合。花青染料可以磺化或非磺化形式存在，并且由被两个氮原子之间的聚甲炔桥隔开的两个假吲哚(indolenin)、苯并吲哚鎓、吡啶鎓、噻唑鎓和/或喹啉鎓基团组成。市售花青荧光团包括，例如，cy3(其可包含1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-1,3-二氢-2h-吲哚-2-亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3h-吲哚鎓或1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-5-磺基-1,3-二氢-2h-吲哚-2-亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3h-吲哚鎓-5-磺酸酯)、cy5(其可包含1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1e,3e)-5-((e)-1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-鎓或1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1e,3e)-5-((e)-1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-磺基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-鎓-5-磺酸酯)和cy7(其可包含1-(5-羧基戊基)-2-[(1e,3e,5e,7z)-7-(1-乙基-1,3-二氢-2h-吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3h-吲哚鎓或1-(5-羧基戊基)-2-[(1e,3e,5e,7z)-7-(1-乙基-5-磺基-1,3-二氢-2h-吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3h-吲哚鎓-5-磺酸酯)，其中“cy”代表“花青”，且第一个数字表示两个假吲哚基团之间的碳原子数。cy2是噁唑衍生物而不是假吲哚，且苯并衍生的cy3.5、cy5.5和cy7.5是此规则的例外。
[0795]
在一些实施方案中，报告部分可以是fret对，使得可以在单个激发和成像步骤下进行多个分类。如本文所用，fret可包括激发交换(forster)转移或电子交换(dexter)转移。
[0796]
术语“连接的(linked)”、“接合的(joined)”、“附接的(attached)”、“附加的(appended)”及其变体包括具有足够的稳定性以承受在特定程序中的使用的化合物或分子的任何组合之间的任何类型的融合、结合、粘合或缔合。该程序可包括但不限于：核苷酸结合；核苷酸掺入；去封闭(例如，移除链终止部分)；洗涤；去除；流动；检测；成像和/或鉴定。这种键可以包括例如，共价键、离子键、氢键、偶极-偶极键、亲水性键、疏水性键或亲和键合、涉及范德华力的键或缔合、机械结合等。在一些实施方案中，这种键在分子内发生，例如将单链或双链线性核酸分子的末端连接在一起以形成环状分子。在一些实施方案中，这种键可在不同分子的组合之间，或分子与非分子之间发生，包括但不限于：核酸分子与固体表面之间的键；蛋白质和可检测报告部分之间的键；核苷酸和可检测报告部分之间的键等。键的一些示例可以例如，在hermanson,g.，“bioconjugate techniques”,第二版(2008)；aslam,m.,dent,a.,“bioconjugation:protein coupling techniques for the biomedical sciences”,london:macmillan(1998)；aslam,m.,dent,a.,“bioconjugation:protein coupling techniques for the biomedical sciences”,london:macmillan(1998)中找到。
[0797]
当关于核酸使用时，术语“扩增”和其他相关术语包括产生原始多核苷酸模板分子的多个拷贝，其中拷贝包括与模板序列互补的序列，或拷贝包括与模板序列相同的序列。在
一些实施方案中，拷贝包括与模板序列基本上相同的序列，或与和模板序列互补的序列基本上相同的序列。
[0798]
如本文所用，术语“载体”是指设计用于沉积用于测定和/或分析的生物分子或生物样品的基底。待沉积到载体上的生物分子的示例包括核酸(例如，dna、rna)、多肽、糖、脂质、单细胞或多个细胞。生物样品的示例包括但不限于唾液、痰、粘液、血液、血浆、血清、尿液、粪便、汗液、泪液和来自组织或器官的液体。
[0799]
在一些实施方案中，载体为固体、半固体或两者的组合。在一些实施方案中，载体为多孔、半多孔、非多孔或多孔性的任何组合。在一些实施方案中，载体可以基本上是平面的、凹的、凸的或其任何组合。在一些实施方案中，载体可以是圆柱形的，例如包括毛细管或毛细管的内表面。
[0800]
在一些实施方案中，载体的表面可以基本上光滑。在一些实施方案中，载体可以被规则或不规则地纹理化，包括凸起、蚀刻、孔隙、三维支架或其任何组合。
[0801]
在一些实施方案中，载体包括具有任何形状的珠粒，任何形状包括球形、半球形、圆柱形、桶形、环形、盘形、棒状、圆锥形、三角形、立方体形、多边形、管状或线状。
[0802]
载体可由任何材料制造，包括但不限于玻璃、熔融石英、硅、聚合物(例如，聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hdpe)、环烯烃聚合物(cop)、环烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet))，或其任何组合。还预期玻璃和塑料基底两者的各种组合物。
[0803]
载体可具有固定在其上的多个(例如，两个或更多个)核酸模板。多个固定的核酸模板具有相同序列或具有不同序列。在一些实施方案中，将多个核酸模板中的单个核酸模板分子固定到载体上的不同位点。在一些实施方案中，将多个核酸模板中的两个或更多个单个核酸模板分子固定到载体上的位点。
[0804]
当关于载体使用时，术语“特征部”是指载体上的区域。在一些实施方案中，特征部是层叠在载体上的涂层上的区域。在一些实施方案中，特征部是层叠在载体上的低非特异性结合涂层上的区域。载体或涂层可具有多个区域(例如，特征部)，其位于载体或涂层上不同的预定位置(图3，右)。载体上的不同特征部可放置在载体上的非重叠位置或重叠位置。特征部可被配置为具有任何形状，例如圆形、卵形、正方形、矩形或多边形。特征部可以布置成具有行和列的网格模式，或者可以布置成行或列。在一些实施方案中，任何给定特征部包含固定到载体或涂层上的多个捕获寡核苷酸和/或多个环化寡核苷酸。多个特征部包括至少第一和第二特征部。
[0805]
术语“阵列”是指如下载体：其包括位于载体上预定位置处的多个位点，以形成位点阵列。位点可以是离散的，并由间隙区隔开。在一些实施方案中，载体上的预定位点可以一维布置成行或列，或者以二维布置成行和列。在一些实施方案中，多个预定位点以有组织的方式布置在载体上。在一些实施方案中，多个预定位点以任何有组织的图案布置，包括直线、六边形图案、网格图案、具有反射对称性的图案、具有旋转对称性的图案等。不同位点对之间的间距可以相同，或者可以不同。在一些实施方案中，载体包括至少102个位点、至少103个位点、至少104个位点、至少105个位点、至少106个位点、至少107个位点、至少108个位点、至少109个位点、至少10
10
个位点、至少10
11
个位点、至少10
12
个位点、至少10
13
个位点、至少10
14
个位点、至少10
15
个位点或更多，其中位点位于载体上预定的位置处。在一些实施方案中，使
载体上的多个预定位点(例如，102–
10
15
个位点或更多)固定有核酸模板，以形成核酸模板阵列。在一些实施方案中，通过与固定的表面捕获引物杂交而将核酸模板固定在多个预定位点，或将核酸模板共价附接到表面捕获引物。在一些实施方案中，将核酸模板固定在多个预定位点处，例如固定在10
2-10
15
个位点或更多位点处。在一些实施方案中，将固定的核酸模板克隆扩增以在多个预定位点生成固定的核酸簇。在一些实施方案中，单个固定的核酸簇包含线性簇，或包含单链或双链多联体。
[0806]
在一些实施方案中，包含位于载体上随机位置的多个位点的载体在本文中称为其上具有随机定位的位点的载体。载体上的随机定位的位点的位置不是预定的。多个随机定位的位点以无序和/或不可预测的方式布置在载体上。在一些实施方案中，载体包括至少102个位点、至少103个位点、至少104个位点、至少105个位点、至少106个位点、至少107个位点、至少108个位点、至少109个位点、至少10
10
个位点、至少10
11
个位点、至少10
12
个位点、至少10
13
个位点、至少10
14
个位点、至少10
15
个位点或更多，其中位点随机定位在载体上。在一些实施方案中，使载体上的多个随机定位的位点(例如，102–
10
15
个位点或更多)固定有核酸模板，以形成固定有核酸模板的载体。在一些实施方案中，将核酸模板通过与固定的表面捕获引物杂交而固定在多个随机定位的位点，或将核酸模板共价附接到表面捕获引物。在一些实施方案中，将核酸模板固定在多个随机定位的位点处，例如固定在10
2-10
15
个位点或更多个位点处。在一些实施方案中，将固定的核酸模板克隆扩增以在多个随机定位的位点处生成固定的核酸簇。在一些实施方案中，单个固定的核酸簇包含线性簇，或包含单链或双链多联体。
[0807]
在一些实施方案中，载体上的多个固定的表面捕获引物彼此流体连通，以允许试剂(例如，核酸模板分子、可溶性引物、酶、核苷酸、二价阳离子、缓冲液等)的溶液流动到载体上，使得载体上的多个固定的表面捕获引物可基本上以大规模并行的方式与试剂同时反应。在一些实施方案中，多个固定的表面捕获引物的流体连通可用于基本上同时在多个固定的表面捕获引物上进行核酸扩增反应(例如，rca、mda、pcr和桥扩增)。
[0808]
在一些实施方案中，载体上的多个固定的核酸簇彼此流体连通，以允许试剂(例如，酶、核苷酸、二价阳离子、缓冲液等)的溶液流动到载体上，使得载体上的多个固定的核酸簇可基本上以大规模并行的方式与试剂同时反应。在一些实施方案中，多个固定的核酸簇的流体连通可用于基本上同时对多个固定的核酸簇进行核苷酸结合测定和/或进行核苷酸聚合反应(例如，引物延伸或测序)，且任选地进行检测和成像以用于大规模并行测序。
[0809]
当关于固定的酶使用时，术语“固定的”及相关术语是指通过共价键或非共价相互作用附接到载体上、或附接到载体上的涂层上、或埋设在由载体上的涂层形成的基质内的酶(例如，聚合酶)。
[0810]
当关于固定的核酸使用时，术语“固定的”及相关术语是指通过共价键或非共价相互作用附接到载体上、或附接到载体上的涂层上、或埋设在由载体上的涂层形成的基质内的核酸分子，其中核酸分子包括表面捕获引物、核酸模板分子和捕获引物的延伸产物。捕获引物的延伸产物包括核酸多联体(例如，核酸簇)。
[0811]
在一些实施方案中，将一个或多个核酸模板固定在载体上，例如固定在载体上的位点处。在一些实施方案中，将一个或多个核酸模板进行克隆扩增。在一些实施方案中，将一个或多个核酸模板克隆扩增离开载体(例如在溶液中)，然后沉积到载体上并固定在载体
上。在一些实施方案中，在载体上进行一个或多个核酸模板的克隆扩增反应，导致在载体上的固定。在一些实施方案中，使用核酸扩增反应，包括以下各项的任何一个或任何组合对一个或多个核酸模板进行克隆扩增(例如，在溶液中或在载体上)：聚合酶链反应(pcr)、多重置换扩增(mda)、转录介导的扩增(tma)、基于核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)、实时sda、桥式扩增、等温桥式扩增、滚环扩增(rca)、环-环扩增、解旋酶依赖性扩增、重组酶依赖性扩增和/或单链结合(ssb)蛋白质依赖性扩增。
[0812]
术语“表面捕获引物”、“捕获寡核苷酸”及相关术语是指固定在载体上的单链寡核苷酸，且其包含可与核酸模板分子的至少一部分杂交的序列。表面捕获引物可用于通过杂交将模板分子固定到载体上。表面捕获引物可以如下方式固定到载体上：防止在流动、洗涤、抽吸，以及温度、ph、盐、化学和/或酶条件变化期间去除引物。通常，但不一定，可以将表面捕获引物的5’端固定到载体上。或者，可以将表面捕获引物的内部部分或3’端固定到载体上。
[0813]
表面捕获引物序列可以沿着其长度与核酸模板分子的至少一部分完全或部分互补。载体可包含具有相同序列或具有两个或更多个不同序列的多个固定的表面捕获引物。表面捕获引物可以是任何长度，例如4-50个核苷酸，或50-100个核苷酸，或100-150个核苷酸，或更长的长度。
[0814]
表面捕获引物可具有末端3’核苷酸，其具有可延伸用于核苷酸聚合(例如，聚合酶催化的聚合)的糖3’oh部分。表面捕获引物可具有末端3’核苷酸，其3’糖位置连接到抑制核苷酸聚合的链终止部分。可使用去封闭剂去除3’链终止部分(例如，去封闭)，以将3’端转化为可延伸的3’oh端。链终止部分的示例包括烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮基、胺基、酰胺基、酮基、异氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基、碳酸酯基、脲基或甲硅烷基。叠氮化物型链终止部分，包括叠氮化物、叠氮基和叠氮基甲基。去封闭剂的示例包括膦化合物，例如三(2-羧基乙基)膦(tcep)和双磺基三苯基膦(bs-tpp)，用于链终止基叠氮化物、叠氮基和叠氮基甲基。去封闭剂的示例包括四(三苯基膦)钯(0)(pd(pph3)4)与哌啶或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(ddq)，用于链终止基团烷基、烯基、炔基和烯丙基。去封闭剂的示例包括用于链终止基团芳基和苄基的pd/c。去封闭剂的示例包括膦、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(dtt)，用于链终止基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫基和二硫化物。去封端剂的示例包括在meoh中的碳酸钾(k2co3)、在吡啶中的三乙胺和在乙酸(acoh)中的zn，用于碳酸酯链终止基团。去封闭剂的示例包括四丁基氟化铵、吡啶-hf与氟化铵以及三乙胺三氢氟酸盐，用于链终止基团脲和甲硅烷基。
[0815]
术语“支化聚合物”及相关术语是指具有多个官能团的聚合物，所述官能团有助于缀合诸如核苷酸的生物活性分子，并且所述官能团可以位于聚合物的侧链上或直接附接至聚合物的中心核心或中心骨架。支化聚合物可具有线性主链，其中一个或多个官能团从主链脱离以进行缀合。支化聚合物也可以是具有一个或多个侧链的聚合物，其中侧链具有适于缀合的位点。官能团的示例包括但不限于羟基、酯、胺、碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、酰肼、硫醇、链烷酸、酰卤、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯(tresylate)。
[0816]
当关于低结合表面涂层使用时，多层表面涂层的一层或多层可包括支化聚合物或
可以是线性的。合适的支化聚合物的示例包括但不限于，支化peg、支化聚乙烯醇(支化pva)、支化聚(乙烯基吡啶)、支化聚(乙烯基吡咯烷酮)(支化pvp)、支化聚(丙烯酸)(支化paa)、支化聚丙烯酰胺、支化聚(n-异丙基丙烯酰胺)(支化pnipam)、支化聚(甲基丙烯酸甲酯)(支化pma)、支化聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(支化phema)、支化聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(支化poegma)、支化聚谷氨酸(支化pga)、支化聚赖氨酸、支化聚葡萄糖甘和右旋糖酐。
[0817]
在一些实施方案中，用于产生本文公开的任何多层表面的一层或多层的支化聚合物可包含至少4个分支、至少5个分支、至少6个分支、至少7个分支、至少8个分支、至少9个分支、至少10个分支、至少12个分支、至少14个分支、至少16个分支、至少18个分支、至少20个分支、至少22个分支、至少24个分支、至少26个分支、至少28个分支、至少30个分支、至少32个分支、至少34个分支、至少36个分支、至少38个分支或至少40个分支。
[0818]
用于产生本文公开的任何多层表面的一层或多层的线性、支化或多支化聚合物可具有至少500、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000或至少50,000道尔顿的分子量。
[0819]
在一些实施方案中，例如，其中多层表面的至少一层包含支化聚合物，所沉积的层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以在每个分子约1个共价键至每个分子约32个共价键的范围内。在一些实施方案中，新层的支化聚合物分子和前一层的分子之间的共价键的数量可以是每个分子至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30，或至少32个共价键。
[0820]
在材料层偶联到表面后保留的任何反应性官能团可以任选地通过使用高产率偶联化学偶联小的惰性分子来封闭。例如，在使用胺偶联化学将新材料层附接到前一层的情况下，任何残留的胺基随后可以通过与诸如甘氨酸的小氨基酸偶联而被乙酰化或灭活。
[0821]
沉积在表面上的低非特异性结合材料例如亲水性聚合物材料的层数可以在1至约10的范围内。在一些实施方案中，层数为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。在一些实施方案中，层数可为至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些实施方案中，层数可在约2至约4的范围内。在一些实施方案中，所有层可以包含相同的材料。在一些实施方案中，每层可包含不同的材料。在一些实施方案中，多个层可以包含多种材料。在一些实施方案中，至少一层可包含支化聚合物。在一些实施方案中，所有层都可以包含支化聚合物。
[0822]
在一些情况下，可使用极性质子溶剂、极性溶剂或极性非质子溶剂、非极性溶剂或其任何组合，将一层或多层低非特异性结合材料沉积在基底表面上和/或缀合到基底表面。在一些实施方案中，用于层沉积和/或偶联的溶剂可包含醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇等)、另一种有机溶剂(例如，乙腈、二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)等)、水、水性缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、3-(n-吗啉代)丙烷磺酸(mops)等)，或其任何组合。在一些实施方案中，所使用的溶剂混合物的有机组分可占总量的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、
98％或99％，其中余量由水或水性缓冲溶液组成。在一些实施方案中，所使用的溶剂混合物的水性组分可占总量的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，其中余量由有机溶剂组成。所使用的溶剂混合物的ph可小于6、约6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或大于ph 9。
[0823]
术语“持续时间”及相关术语是指在靶核酸、聚合酶、缀合或未缀合的核苷酸之间形成的结合复合物保持稳定而没有任何结合组分从结合复合物解离的时长。持续时间指示结合复合物的稳定性和结合相互作用的强度。持续时间可以通过观察结合复合物的开始和/或持续时间来测量，例如通过观察来自结合复合物的标记组分的信号。例如，经标记的核苷酸或包含一个或多个核苷酸的经标记的试剂可存在于结合复合物中，从而允许在结合复合物的持续时间期间检测来自标记的信号。一个示例性标签是荧光标签。
[0824]
本文所述的杂交缓冲液包含第一和第二极性非质子溶剂、ph缓冲体系和拥挤剂。包含在本文所述的杂交组合物中的极性溶剂是包含一种或多种特征在于存在永久偶极矩的分子的溶剂或溶剂体系，即具有电荷密度的空间不均匀分布的分子。极性溶剂的特征在于介电常数为20、25、30、35、40、45、50、55、60，或者特征在于具有任何上述值的值或值范围。如本文所述的极性溶剂可包括极性非质子溶剂。如本文所述的极性非质子溶剂还可在分子中不包含可电离的氢。此外，在本公开的组合物的上下文中，极性溶剂或极性非质子溶剂可以优选地用强极化官能团例如腈、羰基、硫醇、内酯、砜、亚硫酸酯和碳酸酯基团取代，使得基础溶剂分子有偶极矩。极性溶剂和极性非质子溶剂可以脂肪族和芳香族或环状形式存在。在一些实施方案中，极性溶剂是乙腈。
[0825]
本文所述的极性溶剂或极性非质子溶剂可具有与乙腈相同或接近的介电常数。极性溶剂或极性非质子溶剂的介电常数可在约20-60、约25-55、约25-50、约25-45、约25-40、约30-50、约30-45或约30-40的范围内。极性溶剂或极性非质子溶剂的介电常数可大于20、25、30、35或40。极性溶剂或极性非质子溶剂的介电常数可小于30、40、45、50、55或60。极性溶剂或极性非质子溶剂的介电常数可为约35、36、37、38或39。
[0826]
本文所述的极性溶剂或极性非质子溶剂可具有与乙腈相同或接近的极性指数。极性溶剂或极性非质子溶剂的极性指数可以在约2-9、2-8、2-7、2-6、3-9、3-8、3-7、3-6、4-9、4-8、4-7或4-6的范围内。极性溶剂或极性非质子溶剂的极性指数可大于约2、3、4、4.5、5、5.5或6。极性溶剂或极性非质子溶剂的极性指数可低于约4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或10。极性溶剂或极性非质子溶剂的极性指数可为约5.5、5.6、5.7或5.8。
[0827]
极性溶剂或极性非质子溶剂的一些示例包括但不限于，乙腈、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲亚砜(dmso)、乙酰苯胺、n-乙酰基吡咯烷酮、4-氨基吡啶、苯甲酰胺、苯并咪唑、1,2,3-苯并三唑、二氧化丁二烯、2,3-丁烯碳酸酯、γ-丁内酯、己内酯(ε)、氯代马来酸酐、2-氯环己酮、氯代乙烯碳酸酯、氯硝基甲烷、柠康酸酐、巴豆酰内酯、5-氰基-2-硫脲嘧啶、环丙腈、硫酸二甲酯、二甲基砜、3-二甲基-5-四唑、1,5-二甲基四唑、1,2-二硝基苯、2,4-二硝基甲苯、二苯炔基砜(dipheynyl sulfone)、1,2-二硝基苯、2,4-二硝基甲苯、二苯炔基砜、ε-己内酰胺、乙磺酰氯、乙基次膦酸乙酯(ethyl ethyl phosphinate)、n-乙基四唑、碳酸乙烯酯、三硫代碳酸乙烯酯、乙二醇硫酸酯、乙二醇亚硫酸酯、糠醛、2-糠腈、2-咪唑、靛红、异噁唑、丙二腈、4-甲氧基苄腈、l-甲氧基-2-硝基苯、甲基α溴4-羟乙酰乙酸内酯、1-甲基咪唑、n-甲基咪唑、3-甲基异噁唑、n-甲基吗啉-n-氧化物、甲基苯基砜、n-甲基吡咯烷酮、甲基
环丁砜、4-甲苯磺酸甲酯、3-硝基苯胺、硝基苯并咪唑、2-硝基呋喃、l-亚硝基-2-吡咯烷酮、2-硝基噻吩、2-噁唑烷酮、9,10-菲醌、n-苯基悉尼酮、邻苯二甲酸酐、皮考啉腈(2-氰基吡啶)、1,3-丙烷磺内酯、β-丙内酯、碳酸丙烯酯、4h-吡喃-4-硫酮、4h-吡喃-4-酮(γ-吡喃酮)、哒嗪、2-吡咯烷酮、糖精、琥珀腈、磺胺、环丁砜、2,2,6,6-四氯环己酮、四氢噻喃氧化物、四亚甲基砜(环丁砜)、噻唑、2-硫脲嘧啶、3,3,3-三氯丙烯、1,1,2-三氯丙烯、1,2,3-三氯丙烯、硫化环丙烷二氧化物和亚硫酸环丙烷酯。
[0828]
极性溶剂或极性非质子溶剂的量以有效使双链核酸变性的量存在。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，极性溶剂或极性非质子溶剂的量以体积计大于约10％。基于制剂的总体积，极性溶剂或极性非质子溶剂的量以体积计为约或大于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或更高。基于制剂的总体积，极性溶剂或极性非质子溶剂的量以体积计为小于约15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或更高。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，极性溶剂或极性非质子溶剂的量以体积计在约10％至90％的范围内。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，极性溶剂或极性非质子溶剂的量以体积计在约25％至75％的范围内。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，极性溶剂或极性非质子溶剂的量以体积计在约10％至95％、10％至85％、20％至90％、20％至80％、20％至75％、或30％至60％的范围内。
[0829]
在一些实施方案中，公开的杂交缓冲液制剂可以包括添加有机溶剂。合适溶剂的示例包括但不限于，以不同百分比(通常》5％)的乙腈、乙醇、dmf和甲醇，或其任何组合。在一些实施方案中，杂交缓冲液中包含的有机溶剂的百分比(以体积计)可以在约1％至约20％的范围内。在一些实施方案中，有机溶剂的以体积计的百分比可为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％或至少20％。在一些实施方案中，有机溶剂的以体积计的百分比可为至多20％、至多15％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，有机溶剂的以体积计的百分比可以在约4％至约15％的范围内。本领域技术人员将认识到，有机溶剂的以体积计的百分比可具有该范围内的任何值，例如，约7.5％。
[0830]
杂交速率的改善：在一些实施方案中，本文公开的优化缓冲液制剂的使用(任选地，与低非特异性结合表面组合使用)产生为常规杂交方案的范围为约2倍至约20倍快的相对杂交速率。在一些实施方案中，相对杂交速率可为常规杂交方案的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍或至少20倍。
[0831]
杂交效率(或产率)的改善是通常与互补序列杂交的固体表面上总可用拴系衔接子序列、引物序列或寡核苷酸序列的百分比的量度。在一些实施方案中，与常规杂交方案相比，使用本文公开的优化缓冲液制剂(任选地，与低非特异性结合表面组合使用)产生改善的杂交效率。在一些实施方案中，在上文指定的任何杂交反应时间中可实现的杂交效率优于80％、85％、90％、95％、98％或99％。
[0832]
杂交特异性的改善是对通常仅能与完全互补的序列正确杂交的栓系衔接子序列、引物序列或寡核苷酸序列的能力的一种量度。在一些实施方案中，与常规杂交方案的杂交特异性相比，使用本文公开的优化的缓冲液制剂(任选地，与低非特异性结合表面组合使
用)产生改善的杂交特异性。在一些实施方案中，可实现的杂交特异性优于10次杂交事件中有1个碱基错配、100次杂交事件中有1个碱基错配、1,000次杂交事件中有1个碱基错配或10,000次杂交事件中有1个碱基错配。
[0833]
术语“聚合物-核苷酸缀合物”或“多价分子”及相关术语通常是指包含(a)核心和(b)多个核苷酸臂的分子，其中每个核苷酸臂包含(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头和(iv)核苷酸单元。在一些实施方案中，聚合物核心苷酸缀合物包含附接到多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，间隔子附接到接头，其中接头附接到核苷酸单元。多价包含聚合物-核苷酸缀合物，其包含附接到颗粒的相同核苷酸的多个拷贝，其中多个核苷酸为核苷酸臂的每一部分。参见例如，图5a-图5d和图6a-图6b。当核苷酸与靶核酸互补时，聚合物-核苷酸缀合物与聚合酶和靶核酸形成结合复合物，并且该结合复合物比使用单个未缀合或未栓系的核苷酸形成的结合复合物表现出增加的稳定性和更长的持续时间。2019年9月23日提交的u.s.16/579,794中描述了用于制备和使用多价分子的组合物和方法，其全部内容通过引用明确并入本文。
[0834]
术语“多价结合复合物”及相关术语通常是指聚合物-核苷酸缀合物与靶核酸序列的两个或更多个拷贝中的两个或更多个核苷酸基本上同时形成的复合物(诸如例如，在单核苷酸结合反应中)。靶核酸序列的两个或更多个拷贝可以位于同一靶核酸分子(例如，多联体)或不同的靶核酸分子上。
[0835]
术语“拥挤剂”及相关术语是指改变溶液中其他分子性质的化合物。拥挤剂通常具有高分子量和/或大体积结构。溶液中的拥挤剂可增加溶液中其他分子的浓度。拥挤剂可以减少溶液中其他分子可用的溶剂体积，这可形成分子拥挤环境。溶液中的拥挤剂可为溶液中的分子产生拥挤的环境。拥挤剂可以改变反应的速率或平衡常数。拥挤剂的示例包括聚乙二醇(例如，peg)、聚蔗糖、葡聚糖、糖原、聚乙烯醇、三嵌段聚合物(例如，普朗尼克)、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟乙基甲基纤维素(hemc)、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟基甲基纤维素。在一些实施方案中，拥挤剂包括线性或支化peg。在一些实施方案中，拥挤剂包括peg 400、peg 1500、peg 2000、peg 3400、peg 3350、peg 4000、peg 6000或peg 8000。在一些实施方案中，溶液可包括至少一种基于溶液体积为约1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％或更高百分比的拥挤剂。在一些实施方案中，溶液可用于核酸扩增，包括滚环扩增和/或多重置换扩增反应。
[0836]
组合物中合适量的拥挤剂允许、增强或促进分子拥挤。基于制剂的总体积，拥挤剂的量以体积计为约或大于约1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％或更高。在一些情况下，基于制剂的总体积，分子拥挤剂的量以体积计大于5％。基于制剂的总体积，拥挤剂的量以体积计小于约3％、5％、10％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些情况下，基于制剂的总体积，分子拥挤剂的量以体积计可小于30％。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，极性溶剂或极性非质子溶剂的量以体积计在约25％至75％的范围内。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，极性溶剂或极性非质子溶剂的量以体积计在约1％至40％、1％至35％、2％至50％、2％至40％、2％至35％、2％至30％、2％至25％、2％至20％、2％至10％、5％至50％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％的范围内。在一些情况下，基于制剂的
总体积，分子拥挤剂的量以体积计可以在约5％至约20％的范围内。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，拥挤剂的量以体积计在约1％至30％的范围内。
[0837]
在一些实施方案中，公开的杂交缓冲液制剂可以包括添加分子拥挤剂或体积排阻剂。分子拥挤剂或体积排阻剂通常为大分子(例如，蛋白质)，当其以高浓度加入到溶液中时，可以通过减少其他分子可用的溶剂体积来改变溶液中其他分子的性质。在一些实施方案中，包含在杂交缓冲液制剂中的分子拥挤剂或体积排阻剂的体积百分比可以在约1％至约50％的范围内。在一些实施方案中，分子拥挤剂或体积排阻剂的体积百分比可为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些实施方案中，分子拥挤剂或体积排阻剂的体积百分比可为至多50％、至多45％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多5％或至多1％。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，分子拥挤剂或体积排阻剂的体积百分比可以在约5％至约35％的范围内。本领域技术人员将认识到，分子拥挤或体积排阻剂的体积百分比可具有在该范围内的任何值，例如，约12.5％。
[0838]
本文所述的杂交缓冲液包含将组合物的ph维持在适于杂交过程的范围内的ph缓冲体系。ph缓冲体系可以包含一种或多种选自tris、hepes、taps、tricine、bicine、bis-tris、naoh、koh、tes、epps、mes和mops的缓冲剂。ph缓冲体系还可包含溶剂。优选的ph缓冲体系包括mops，mes，taps，与甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、dmf、dmso或其中的任何组合组合的磷酸盐缓冲液。
[0839]
杂交缓冲液包含有效地将制剂的ph维持在适于杂交的范围内的量的ph缓冲体系。在一些实施方案中，ph可为至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。在一些实施方案中，ph可为至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4或至多3。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，杂交缓冲液的ph可以在约4至约8的范围内。本领域技术人员将认识到杂交缓冲液的ph可具有该范围内的任何值，例如约ph7.8。在一些情况下，ph范围为约3至约10。在一些实施方案中，公开的杂交缓冲液制剂可包括在约ph 3至ph 10的范围内调节ph，具有5-9的优选缓冲范围。
[0840]
本文所述的杂交缓冲液包含用于控制核酸的解链温度的添加剂(例如，极性非质子溶剂)，其可根据组合物中使用的其他试剂而变化。基于制剂的总体积，用于控制核酸的解链温度的添加剂的量以体积计为约或大于约1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％或更高。在一些情况下，基于制剂的总体积，用于控制核酸的解链温度的添加剂的量以体积计为大于约2％。在一些情况下，基于制剂的总体积，用于控制核酸的解链温度的添加剂的量以体积计为大于5％。在一些情况下，基于制剂的总体积，用于控制核酸的解链温度的添加剂的量以体积计小于约3％、5％、10％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，用于控制核酸的解链温度的添加剂的量以体积计在约1％至40％、1％至35％、2％至50％、2％至40％、2％至35％、2％至30％、2％至25％、2％至20％、2％至10％、5％至50％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％的范围内。在一些实施方案中，基于制剂的总体积，用于控制核酸的解链温度的添加剂的量以体积计在约2％至20％的范围内。在一些情况下，基于制剂的总体积，用于控制核酸的解链温度的添加剂的量以体积
计在约5％至10％的范围内。
[0841]
在一些实施方案中，公开的杂交缓冲液制剂可以包括添加改变核酸双链体解链温度的添加剂。可用于改变核酸解链温度的合适添加剂的示例包括但不限于甲酰胺。在一些实施方案中，杂交缓冲液制剂中包含的解链温度添加剂的体积百分比可在约1％至约50％的范围内。在一些实施方案中，解链温度添加剂的体积百分比可为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些实施方案中，解链温度添加剂的体积百分比可为至多50％、至多45％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多5％或至多1％。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，解链温度添加剂的体积百分比可以在约10％至约25％的范围内。本领域技术人员将认识到，解链温度添加剂的体积百分比可具有该范围内的任何值，例如，约22.5％。
[0842]
在一些实施方案中，本文所述杂交缓冲液包含影响dna水合的添加剂：在一些实施方案中，公开的杂交缓冲液制剂可以包括添加影响核酸水合的添加剂。示例包括但不限于，甜菜碱、脲、甘氨酸甜菜碱或其任何组合。在一些实施方案中，杂交缓冲液制剂中包含的水合添加剂的体积百分比可在约1％至约50％的范围内。在一些实施方案中，水合添加剂的体积百分比可为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些实施方案中，水合添加剂的体积百分比可为至多50％、至多45％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多5％或至多1％。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，水合添加剂的体积百分比可以在约1％至约30％的范围内。本领域技术人员将认识到，解链温度添加剂的体积百分比可具有该范围内的任何值，例如，约6.5％。
[0843]
术语“测序”及相关术语是指用于从核酸分子获得核苷酸序列信息的方法，通常通过确定核酸分子内至少一些核苷酸(包括它们的核碱基组分)的身份。在一些实施方案中，核酸分子的给定区域的序列信息包括鉴定已进行了测序的区域内的每个核苷酸。在一些实施方案中，测序信息仅确定区域中的一些核苷酸，而一些核苷酸的身份仍然未被确定或未正确确定。可以使用任何合适的测序方法。在示例性实施方案中，测序可包括无标签或基于离子的测序方法。在一些实施方案中，测序可包括经标记的或含有染料的核苷酸或基于荧光的核苷酸测序方法。在一些实施方案中，测序可包括基于簇的测序或桥式测序方法。
[0844]
在一些实施方案中，在任何测序步骤中，可使用通过合成测序、杂交测序或结合测序程序来进行。大规模并行合成测序程序的示例包括聚合酶克隆(polony)测序、焦磷酸测序(例如，来自454life sciences；美国专利号7,211,390、7,244,559和7,264,929)、链终止子测序(例如，来自illumina；美国专利号7,566,537；bentley 2006current opinion genetics and development 16:545-552；以及bentley等人，2008nature456:53-59)、离子敏感测序(例如，来自ion torrent)、探针锚连接测序(例如，complete genomics)、dna纳米球测序、纳米孔dna测序。单分子测序的示例包括heliscope单分子测序和单分子实时(smrt)测序。杂交测序的示例包括solid测序(例如，来自life technologies；wo 2006/084132)。结合测序的示例包括omniome测序(例如，美国专利号10,246,744)。
[0845]
如本文所用，“双端”信息是指与双链核酸分子或核酸片段的正向和反向链有关的遗传序列信息。因此，双端读取或双端测序是指确定正向和反向链的序列。该确定可以直接
进行，并且在一些实施方案中可以在不参考已知互补链的序列的情况下进行。
[0846]
如本文中所使用的，短语“成像模块”、“成像单元”、“成像系统”、“光学成像模块”、“光学成像单元”和“光学成像系统”可以互换使用，并且可以包括较大系统的组件或子系统，所述较大系统还可以包括，例如，流体学模块、温度控制模块、平移台、机器人流体分配和/或微板处理、处理器或计算机、仪器控制软件、数据分析和显示软件等。
[0847]
如本文中所使用的，术语“检测通道”是指光学系统内的光路(和/或其中的光学组件)，其被配置为将从样品产生的光信号传递至检测器。在一些情况下，检测通道可以被配置为用于执行光谱学测量，例如使用检测器(例如光电倍增管)来监测荧光信号或其他光信号。在一些情况下，“检测通道”可以是“成像通道”，即光学系统内的光路(和/或其中的光学组件)，其被配置为捕获图像并将图像传递至图像传感器。
[0848]
如本文所用，“可检测标记”可以指本领域技术人员已知的多种可检测标记或标签中的任何一种。示例包括但不限于发色团、荧光团、量子点、上转换磷光体、发光或化学发光分子、放射性同位素、磁性纳米颗粒、质量标签等。在一些情况下，优选的标记可以包括荧光团。
[0849]
如本文所用，术语“激发波长”是指用于激发荧光指示剂(例如，荧光团或染料分子)并产生荧光的光的波长。尽管典型地将激发波长指定为单个波长，例如620nm，但是本领域技术人员将理解，该说明书是指以指定波长为中心的波长范围或激发滤光镜带通。例如，在一些情况下，指定激发波长的光包括指定波长
±
2nm、
±
5nm、
±
10nm、
±
20nm、
±
40nm、
±
80nm或更大的光。在一些情况下，所使用的激发波长可以与或可以不与荧光指示剂的最大吸收峰一致。
[0850]
如本文所用，术语“发射波长”是指由荧光指示剂(例如，荧光团或染料分子)在由适当波长的光激发后发射的光的波长。尽管典型地将发射波长指定为单个波长，例如670nm，但是本领域技术人员将理解，该说明书是指以指定波长为中心的波长范围或发射滤光镜带通。在一些情况下，指定发射波长的光包括指定波长
±
2nm、
±
5nm、
±
10nm、
±
20nm、
±
40nm、
±
80nm或更大的光。在一些情况下，所使用的发射波长可以与或可以不与荧光指示剂的最大发射峰一致。
[0851]
如本文所用，如果荧光源自退火或以其他方式拴系于表面的荧光团，例如具有与表面上的寡核苷酸衔接子的相应区段反向互补的区域并退火至所述相应区段的经荧光标记的核酸序列，那么该荧光是“特异性的”。这种荧光与源自没有通过这样的退火拴系到表面上的荧光团的荧光，或者在一些情况下与表面的背景荧光形成对比。
[0852]
术语“简单细胞培养基”或相关术语是指在培养中通常缺乏支持细胞生长和/或增殖的成分的细胞培养基。简单细胞培养基可用于例如洗涤、悬浮或稀释细胞生物样品。简单细胞培养基可与某些成分混合，以制备可在培养中支持细胞生长和/或增殖的细胞培养基。简单细胞培养基包括缓冲液、磷酸盐化合物、钠化合物、钾化合物、钙化合物、镁化合物和/或葡萄糖中的任何一种或两种或两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中，简单细胞培养基包括pbs(磷酸盐缓冲盐水)、dpbs(杜氏磷酸盐缓冲盐水)、hbss(汉克斯平衡盐溶液)、dmem(杜氏改良伊格尔培养基)、emem(伊格尔极限必需培养基)和/或ebss。在一些实施方案中，在进行本文所述的任何核酸方法的步骤之前或期间可将细胞生物样品或单细胞置于简单细胞培养基中。
[0853]
术语“复杂细胞培养基”或相关术语是指可用于在培养中支持细胞生长和/或增殖而无需补充或添加剂的细胞培养基。复杂细胞培养基可包含缓冲体系(例如，hepes)、无机盐(多种)、氨基酸(多种)、蛋白质(多种)、多肽(多种)、碳水化合物(多种)、脂肪酸(多种)、脂质(多种)、嘌呤(多种)及其衍生物(例如，次黄嘌呤)、嘧啶(多种)及其衍生物和/或微量元素(多种)中的两种或更多种的任何组合。复杂细胞培养基包括从生物流体或组织提取物中获得的流体。复杂细胞培养基包括人工细胞培养基。在一些实施方案中，复杂细胞培养基可以是含血清的培养基，例如，复杂细胞培养基包括生物流体，例如胎牛血清、血浆、血清、淋巴液、人胎盘脐带血清和羊水。在一些实施方案中，复杂细胞培养基可以是无血清培养基，其通常(但不一定)是定义的细胞培养基。在一些实施方案中，复杂细胞培养基可以是化学定义的培养基，其通常(但不一定)包括重组多肽和超纯无机和/或有机化合物。在一些实施方案中，复杂细胞培养基可以是无蛋白质培养基，其包括例如mem(最低必需培养基)和rpmi-1640(roswell park memorial institute)。在一些实施方案中，复杂细胞培养基包括imdm(iscove改良杜氏培养基)。在一些实施方案中，复杂细胞培养基包括dmem(杜氏改良伊格尔培养基)。在一些实施方案中，在进行本文所述的任何核酸方法的步骤之前或期间可将细胞生物样品或单细胞置于复杂细胞培养基中。
[0854]
术语“锁式探针”指通常包含线性单寡核苷酸链的核酸探针，其设计用于通过杂交捕获靶核酸分子。杂交复合物可为环状的，并且对于单重或多重分子检测方法，可以对环状分子进行滚环扩增反应。锁式探针在其5’末端和3’末端包括与靶核酸分子的连续区域互补的靶捕获序列。锁式探针还可以包括两个或更多衔接子序列的任何一个或任何组合，衔接子序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、固定化序列和/或样品索引序列。各种衔接子序列可以位于任何区域，例如锁式探针的内部部分。锁式探针的5’和3’端可以与靶核酸分子上的相邻位置杂交，以形成开放的环状分子，其中在杂交的5’和3’端之间有断口。可以将断口连接以生成共价闭合的环状分子。或者，锁式探针的5’和3’端可以与靶核酸分子上的相邻位置杂交，以形成开放的环状分子，其中在杂交的5’和3’端之间有缺口。可以对缺口进行聚合酶介导的填充反应以形成断口，且可将断口连接以生成共价闭合的环状分子。可对共价闭合的环状分子进行滚环扩增反应以生成具有包含靶序列的串联重复区的多联体。在靶分子和非靶分子的混合物中捕获靶分子的特异性是由对如下的要求提供的：5’和3’端与目标靶分子的相邻位置的特异性杂交以形成断口，以及只有在锁式探针的5’和3’端与靶分子具有正确的碱基互补性时才可能实现的酶促闭合断口。区分匹配端和错配端的连接酶可用于确保序列特异性杂交。因此，如果靶核酸存在于被测样品中，则形成共价闭合的环状分子。
[0855]
2020年7月31日提交的u.s.63/059,723中描述了用于基于锁式探针的滚环扩增反应的组合物和使用该组合物的方法，其内容通过引用以其整体明确并入本文。
[0856]
术语滚环扩增通常是指一种扩增方法，其使用包含目标靶序列、扩增引物结合序列和任选的一个或多个衔接子序列(例如，测序引物结合序列)和/或条形码的环状核酸模板分子。滚环扩增反应可以在等温扩增条件下进行，并且包括环状核酸模板分子、扩增引物、链置换聚合酶和多个核苷酸，以生成包含环状模板分子的串联重复序列和原始环状核酸模板分子中存在的任何衔接子序列的多联体。多联体可以自塌缩以形成核酸纳米球。纳米球的形状和大小可以通过在环状模板分子中包含一对反向重复序列，或通过与一个或多
个压实寡核苷酸进行滚环扩增反应来进一步压实。使用滚环扩增为测序工作流程生成克隆扩增子的优点之一是，可以同时对纳米球中靶序列的重复拷贝进行测序，以增加信号强度。
[0857]
试剂盒.本文提供了用于使用本文公开的系统和组合物进行本文公开的方法的试剂盒。试剂盒可包含可检测的聚合物-核苷酸缀合物，其包含：(i)聚合物核心；以及(ii)连接到所述聚合物核心的两个或更多个核苷酸部分。本文所述试剂盒可具有至少一种、两种、三种或四种不同类型的可检测聚合物-核苷酸缀合物，例如，其中每种类型的可检测聚合物-核苷酸缀合物具有不同的核苷酸部分。试剂盒可以具有基底，该基底包括表面，该表面上偶联有适于将生物样品或其衍生物固定到所述表面的聚合物层。在一些试剂盒中，试剂盒中包含生物样品(例如，细胞或组织)。在一些试剂盒中，试剂盒中不包含生物样品。试剂盒可包含本文公开的杂交缓冲液，其例如，包含(i)介电常数不大于40且极性指数为4-9的第一极性非质子溶剂；和/或(ii)介电常数小于或等于115的第二极性非质子溶剂。任选地，试剂盒中包含捕获寡核苷酸或其组分、原位扩增试剂(例如，缓冲液、引物、可检测标签)或其组合。
[0858]
可在本文所述试剂盒中提供说明书，包括将所述靶核酸序列的至少一部分与偶联到所述表面的捕获寡核苷酸的至少一部分杂交的说明书。试剂盒还可包含用于以下的说明书：在足以在所述两个或更多个核苷酸部分和所述靶核酸序列之间形成多价结合复合物的条件下，通过使所述可检测的聚合物-核苷酸缀合物与所述生物样品或其衍生物(例如，含有靶核酸分子)接触来鉴定生物样品或其衍生物内的靶核酸序列的至少一部分。
[0859]
试剂盒还可包含用于以下的说明书：在足以在所述两个或更多个核苷酸部分和所述亚细胞组分之间形成多价结合复合物的条件下，通过使所述可检测得聚合物-核苷酸缀合物与所述亚细胞组分接触来原位鉴定细胞或组织内的亚细胞组分的至少一部分。
[0860]
任选地，试剂盒还包含其他有用的组分，例如稀释剂、缓冲液、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂抹器、移液或测量工具、绷带包扎材料或其他有用的器具。组装在试剂盒中的材料或组分可以保持其可操作性和实用性的任何方便和适当的储存方式提供给从业人员。例如，组分可以是溶解的、脱水的或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。组分通常被包含在合适的包装材料(多种)中。如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒的内容物例如组合物等的一个或多个物理结构。包装材料通过众所周知的方法制造，优选用于提供无菌、无污染的环境。试剂盒中使用的包装材料通常是用于基因表达测定和施用治疗中的那些。如本文所用，术语“包装物”是指能够容纳单个试剂盒组分的适当固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装物可以是玻璃小瓶或预填充注射器，用于容纳适当数量的药物组合物。包装材料具有外部标签，其指示试剂盒及其组分的内容物和/或用途。
[0861]
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。ii.示例性实施方案
[0862]
在示例性实施方案中：1.一种载体，包括：(a)用至少一种亲水性聚合物涂层涂覆的基底，其水接触角不大于45度；(b)第一特征部，其包括亲水性涂层的第一区，所述亲水性涂层在其上固定有(1)可与多个第一靶核酸分子杂交的第一多个捕获寡核苷酸，和任选的(2)可使捕获的第一靶
核酸分子环化的第一多个环化寡核苷酸；以及任选的(c)第二特征部，其包括亲水性涂层的第二区，所述亲水性涂层在其上固定有(1)可与多个第二靶核酸分子杂交的第二多个捕获寡核苷酸，和(2)可使捕获的第二靶核酸分子环化的第二多个环化寡核苷酸。2.如实施方案1所述的载体，其中所述载体还包括被放置为与第一和第二特征部接触的生物样品，其中所述生物样品包括组织、多个细胞或单细胞。3.如实施方案2所述的载体，其中所述单细胞、所述组织中的细胞或所述多个细胞可以是完整的、透化的或裂解的。4.如实施方案1-2所述的载体，其中所述载体还包括在所述第一特征部中与第一靶捕获区杂交的第一靶核酸分子，以及在所述第二特征部中与第二靶捕获区杂交的第二靶核酸分子。5.如实施方案4所述的载体，其中所述第一和第二靶核酸分子包括dna或rna。6.如实施方案1-5所述的载体，其中所述载体的荧光图像表现出至少20的对比度噪声比(cnr)。7.如实施方案1-6所述的载体，其中所述亲水性聚合物涂层可包括包含选自以下的分子的至少一个亲水性聚合物涂层：聚乙二醇(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(phema)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素和葡聚糖。8.如实施方案7所述的载体，其中至少一层亲水性聚合物涂层包含聚乙二醇(peg)。9.如实施方案1-8所述的载体，其中所述基底涂覆有第二亲水性聚合物涂层。10.如实施方案1-9所述的载体，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含具有至少1,000道尔顿的分子量的聚合物。11.如实施方案1-10所述的载体，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含具有至少4个分支的支化亲水性聚合物。12.如实施方案1-11所述的载体，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包括：(a)第一层，其包括栓系到所述表面的聚合物分子的第一单层；(b)第二层，其包括栓系到所述聚合物分子的第一单层的聚合物分子的第二单层；和(c)第三层，其包括栓系到所述聚合物分子的第二单层的聚合物分子的第三单层，其中第一层、第二层或第三层的聚合物分子包含支化聚合物分子。13.如实施方案1-12所述的载体，其中所述载体可以是玻璃或塑料。14.如实施方案1-13所述的载体，其中所述载体可以是平面载体或珠粒。15.如实施方案1-14所述的载体，其中所述第一特征部中的第一多个捕获寡核苷酸和第一多个环化寡核苷酸，以及所述第二特征部中的第二多个捕获寡核苷酸和第二多个环化寡核苷酸彼此流体连通，使得所述第一和第二捕获寡核苷酸以及所述第一和第二环化寡核苷酸以大规模并行方式与试剂(例如，包括聚合酶的酶、聚合物-核苷酸缀合物、核苷酸和/或二价阳离子)反应。16.如实施方案1-15所述的载体，其中所述载体还包括杂交缓冲液，所述杂交缓冲
液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其介电常数不大于40且极性指数为4-9；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于所述杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲体系，其将所述杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8的范围内；和(iv)足以增强或促进分子拥挤的量的拥挤剂。17.如实施方案16所述的载体，其中所述第一极性非质子溶剂包含以杂交缓冲液的体积计为25-50％的乙腈。18.如实施方案16-17所述的载体，其中所述第二极性非质子溶剂包含以杂交缓冲液的体积计为5-10％的甲酰胺。19.如实施方案16-18所述的载体，其中所述ph缓冲体系包含2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph为5-6.5。20.如实施方案16-19所述的载体，其中所述拥挤剂包含以所述杂交缓冲液体积计为5-35％的聚乙二醇(peg)。21.如实施方案16-20所述的载体，其中所述杂交缓冲液还包含甜菜碱。22.如实施方案1-21所述的载体，其中所述载体还包含至少一种聚合物-核苷酸缀合物，所述聚合物-核苷酸缀合物包含通过接头连接到核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体。23.如实施方案22所述的载体，其中所述聚合物-核苷酸缀合物包含：(a)核心；和(b)多个核苷酸臂，其包括：(i)核心附接部分；(ii)包含peg部分的间隔子；(iii)接头；和(iv)核苷酸单元。24.如实施方案1-23所述的载体，其中所述第一多个捕获寡核苷酸包含：(a)与第一靶核酸分子的至少一部分杂交的第一靶捕获区；(b)第一通用序列区，其包括第一空间条形码序列和任选的第一样品条形码序列；(c)第一环化锚定序列；或(d)第一可切割区，并且第一特征部固定在其上，或其任何组合。25.如实施方案1-24所述的载体，其中所述第二多个捕获寡核苷酸包含：(a)与第二靶核酸分子的至少一部分杂交的第二靶捕获区；(b)第二通用序列区，其包括第二空间条形码序列和任选的第二样品条形码序列和第二环化锚定序列；和(c)第二可切割区，并且第二特征部固定在其上。26.如实施方案1-25所述的载体，其中所述第二多个环化寡核苷酸包括：(a)第二均聚物区，以及(b)第二通用序列区，其包括第二测序引物结合序列和第二环化锚定结合序列。27.如实施方案1-26所述的载体，其中所述第一多个环化寡核苷酸包括：
(a)第一均聚物区，以及(b)第一通用序列区，其包括第一测序引物结合序列和第一环化锚定结合序列。28.如实施方案24-27所述的载体，其中所述第一和第二捕获寡核苷酸的第一和第二靶捕获区各自包含随机核苷酸序列或靶特异性核苷酸序列。29.如实施方案24-28所述的载体，其中所述第一特征部中的第一靶捕获区与所述第二特征部中的第二靶捕获区具有相同的序列。30.如实施方案24-29所述的载体，其中所述第一特征部中的第一空间条形码序列与所述第二特征部中的第二空间条形码序列相比具有不同的序列。31.如实施方案24-30所述的载体，其中所述第一特征部中的第一样品条形码序列与所述第二特征部中的第二样品条形码序列具有相同的序列。32.如实施方案24-30所述的载体，其中所述第一特征部中的第一环化锚定序列与所述第二特征部中的第二环化锚定序列具有相同的核苷酸序列。33.如实施方案24-32所述的载体，其中所述第一特征部中的所述第一可切割区可通过酶、化合物、光或热进行切割。34.如实施方案24-33所述的载体，其中所述第一可切割区可使用与所述第二特征部中的第二可切割区相同的条件切割。35.如实施方案24-34所述的载体，其中所述第一特征部中的第一环化寡核苷酸的第一均聚物区与所述第二特征部中的第二环化寡核苷酸的第二均聚物区具有相同的序列。36.如实施方案24-35所述的载体，其中所述第一特征部中的第一测序引物结合序列与所述第二特征部中的第二测序引物结合序列具有相同的序列。37.如实施方案24-36所述的载体，所述第一特征部中的第一环化锚定结合序列与所述第二特征部中的第二环化锚定结合序列具有相同的序列。38.如实施方案24-37所述的载体，还包含从所述第一靶捕获区延伸的第一引物延伸产物，其中所述第一延伸产物包含所述第一靶核酸分子的至少一部分的互补序列。39.如实施方案24-37所述的载体，还包含从所述第二靶捕获区延伸的第二引物延伸产物，其中所述第二延伸产物包含所述第二靶核酸分子的至少一部分的互补序列。40.如实施方案23-39所述的载体，其中核心附接到多个核苷酸臂。41.如实施方案23-40所述的载体，其中所述间隔子附接到接头。42.如实施方案23-41所述的载体，其中所述接头附接到核苷酸单元。43.如实施方案23-42所述的载体，其中所述核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团。44.如实施方案23-43所述的载体，其中所述接头通过所述碱基附接到核苷酸单元。45.如实施方案23-44所述的载体，其中所述接头包括脂肪族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链具有2-6个亚基，并且任选地，接头包含芳香族部分。46.如实施方案23-45所述的载体，其中所述多个核苷酸臂具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的相同类型的核苷酸单元。47.如实施方案23-45所述的载体，其中所述多个核苷酸臂具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的两种或更多种不同类型的核苷酸。
48.如实施方案23-47所述的载体，其中所述核苷酸单元在糖2’位置、糖3’位置、或糖2’和3’位置具有链终止部分(例如，封闭部分)。49.如实施方案48所述的载体，其中所述链终止部分选自3
’‑
脱氧核苷酸、2’,3
’‑
双脱氧核苷酸、3
’‑
甲基、3
’‑
叠氮基、3
’‑
叠氮基甲基、3
’‑
o-叠氮基烷基、3
’‑
o-乙炔基、3
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o-氨基烷基、3
’‑
o-氟烷基、3
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氟甲基、3
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二氟甲基、3
’‑
三氟甲基、3
’‑
磺酰基、3
’‑
丙二酰基、3
’‑
氨基、3
’‑
o-氨基、3
’‑
巯基、3
’‑
氨基甲基、3
’‑
乙基、3’丁基、3
’‑
叔丁基、3
’‑
芴基甲氧基羰基、3
’‑
叔丁氧基羰基、3
’‑
o-烷基羟基氨基、3
’‑
硫代磷酸酯和3-o-苄基或其衍生物。50.如实施方案49所述的载体，其中所述链终止部分可从核苷酸臂上切割/去除。51.如实施方案23-50所述的载体，其中所述心核用可检测报告部分标记。52.如实施方案51所述的载体，其中所述可检测报告部分包含荧光团。53.如实施方案23-52所述的载体，其中所述核心包含类亲和素部分，且所述核心附接部分包含生物素。54.一种用于进行细胞可寻址测序和分析来自生物样品的核酸的方法，包括：(a)提供包含低非特异性结合涂层的载体，其适于用于捕获/杂交靶核酸分子的寡核苷酸与其附接；(b)在适于允许寡核苷酸捕获靶核酸分子的缓冲条件下，使靶核酸分子与寡核苷酸接触；(c)任选地，扩增所述靶核酸分子以形成包含线性单链核酸分子的扩增的核酸产物，所述线性单链核酸分子包含所述靶核酸序列的两个或更多个拷贝；(d)使扩增的核酸产物与两种或更多种聚合酶和两种或更多种与扩增的核酸产物的一个或多个区杂交的测序引物接触；(e)在适于在扩增的核酸产物与聚合物-核苷酸缀合物之间形成结合复合物的条件下，使扩增的核酸产物与包括聚合物-核苷酸缀合物的聚合物-核苷酸缀合物接触，其中所述聚合物-核苷酸缀合物包含核苷酸的两个或更多个拷贝和(任选的)一个或多个可检测的报告部分；和(f)检测结合复合物，从而鉴定靶核酸分子中的核苷酸碱基，其中靶核酸分子来源于生物组织，并且其中以保存与靶核酸分子的细胞来源位置相关的信息的方式在载体上捕获靶核酸分子。55.如实施方案54所述的方法，其中所述寡核苷酸包括捕获寡核苷酸，所述捕获寡核苷酸包含：(a)与靶核酸分子的至少一部分杂交的靶捕获区；(b)通用序列区，其包括空间条形码序列；(c)环化锚定序列，其被配置为与环化寡核苷酸结合；和(d)可切割区。56.如实施方案55所述的方法，其中所述环化寡核苷酸包含：(a)均聚物区；(b)通用序列区，其包含测序引物结合序列；和(c)环化锚定结合序列；和57.如实施方案54-56所述的方法，其中所述低非特异性结合涂层包括至少一种亲
水性聚合物涂层，其水接触角不大于45度。58.如实施方案54-57所述的方法，其中(b)中的接触包括使靶核酸分子的至少一部分与固定的捕获寡核苷酸的靶捕获区杂交，从而形成固定的核酸双链体。59.如实施方案54-58所述的方法，其中(c)中的任选地进行扩增包括：(a)使用所述杂交的靶核酸分子作为模板，在所述固定的核酸双链体上进行引物延伸反应，从而形成固定的靶延伸产物；(b)在适于将均聚物尾部附加到靶延伸产物上的条件下，在固定的靶延伸产物上进行非模板加尾反应，从而形成固定的加尾靶延伸产物；(c)切割所述固定的加尾靶延伸产物，以从所述低结合涂层释放所述固定的加尾靶延伸产物，从而形成可溶性加尾靶延伸产物；(d)在适于将可溶性加尾靶延伸产物的附加的均聚物尾与固定的环化寡核苷酸的均聚物区杂交和适于使可溶性加尾靶延伸产物的环化锚定序列与固定的环化寡核苷酸的环化锚定结合序列杂交的条件下，将可溶性加尾靶延伸产物与固定至低结合涂层的环化寡核苷酸中的一个结合，从而形成带缺口的开放环状靶延伸产物；(e)在开放的环状靶延伸产物上进行缺口填充引物延伸反应和连接反应，从而形成封闭的环状靶延伸产物，其与包含具有3’可延伸端的均聚物区的固定的环化寡核苷酸杂交；和(f)在适于形成具有包括测序引物结合序列、靶序列和空间条形码序列的串联重复区的固定的多联体分子的条件下，使用均聚物区的3’可延伸端进行滚环扩增反应。60.如实施方案62所述的方法，其中确定固定的多联体分子的序列包括对靶序列和空间条形码序列进行测序。61.如实施方案54-60所述的方法，其中所述靶核酸序列是rna。62.如实施方案54-60所述的方法，其中所述靶核酸序列是dna。63.一种用于分析来自生物样品的核酸的方法，包括：(a)提供载体，其包含固定多个捕获寡核苷酸的低非特异性结合涂层，其中所述多个捕获寡核苷酸包含(i)靶捕获区(例如，具有均聚物序列，例如聚-t)，其与靶rna分子的至少一部分杂交，(ii)包含空间条形码序列的通用序列区，以及(iii)可切割区，并且其中低非特异性结合涂层包括至少一个亲水性聚合物层，所述亲水性聚合物层具有不大于45度的水接触角；(b)在适于使靶核酸分子的至少一部分与固定的捕获寡核苷酸中的一个的靶捕获区杂交的条件下(例如，杂交缓冲液)，使低非特异性结合涂层与靶核酸分子接触，从而形成固定的核酸双链体；(c)使用所述杂交的靶核酸分子作为模板，在所述固定的核酸双链体上进行引物延伸反应(例如，反转录)，从而形成固定的靶延伸产物；(d)将核酸衔接子附加到固定的靶延伸产物，从而形成固定的衔接子-靶延伸产物，其中所述核酸衔接子包括测序引物结合序列；(e)在适于将至少一种可溶性环化寡核苷酸靠近固定的衔接子-靶延伸产物固定到低非特异性结合涂层的条件下，使所述低非特异性结合涂层与多个可溶性环化寡核苷酸接触，其中，所述多个可溶性环化寡核苷酸中的每一个包含(i)衔接子结合区(例如，具有测
序引物结合序列和任选的扩增引物结合序列)，(ii)均聚物区，(iii)锚定区，和(iv)锚定部分；(f)使固定的衔接子-靶延伸产物的靶捕获区(例如，均聚物聚-t)与固定的环化寡核苷酸的均聚物区杂交，从而形成均聚物双链体区，并且使述固定的衔接子-靶延伸产物的附加的衔接子序列与所述固定的环化寡核苷酸的衔接子结合区杂交，从而形成固定的环状靶延伸产物；(g)在适于释放均聚物双链体区的条件下切割固定的环状靶延伸产物(例如，在可切割区)，同时保留固定的环化寡核苷酸的衔接子-杂交区；(h)使衔接子-靶延伸产物的均聚物区与固定的环化寡核苷酸的均聚物区杂交，从而形成具有断口或缺口的开放的环状衔接子-靶延伸产物；(i)在开放的环状衔接子-靶延伸产物上进行缺口填充引物延伸反应和连接反应来闭合缺口和/或断口，从而形成封闭的环状靶延伸产物，其与包含具有3’可延伸端的衔接子结合区的固定的环化寡核苷酸杂交；和(j)在适于形成具有包括测序引物结合序列、靶序列和空间条形码序列的串联重复区的固定的多联体分子的条件下，使用衔接子结合区的3’可延伸端进行滚环扩增反应。64.如实施方案54-63所述的方法，其中所述载体的荧光图像表现出至少20的对比度噪声比(cnr)。65.如实施方案54-64所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含选自以下的分子：聚乙二醇(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(phema)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素和葡聚糖。66.如实施方案65所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含聚乙二醇(peg)。67.如实施方案54-66所述的方法，其中所述基底涂覆有第二亲水性聚合物涂层。68.如实施方案54-67所述的方法，所述至少一个亲水性聚合物涂层包含具有至少1,000道尔顿的分子量的聚合物。69.如实施方案54-68所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含具有至少4个分支的支化亲水性聚合物。70.如实施方案54-69所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含：(a)第一层，其包括栓系到所述表面的聚合物分子的第一单层；(b)第二层，其包括栓系到所述聚合物分子的第一单层的聚合物分子的第二单层；和(c)第三层，其包括栓系到所述聚合物分子的第二单层的聚合物分子的第三单层，其中第一层、第二层或第三层的聚合物分子包含支化聚合物分子。71.如实施方案54-70所述的方法，其中所述载体包括玻璃或塑料。72.如实施方案54-71所述的方法，其中所述载体包括平面载体或珠粒。73.如实施方案54-72所述的方法，其中所述靶核酸分子源自生物样品，所述生物样品被置于固定在所述载体上的低结合涂层上的多个捕获寡核苷酸上。74.如实施方案54-73所述的方法，其中所述靶核酸分子以保留所述靶核酸分子在
所述生物样品中的空间位置信息的方式被杂交(捕获)在所述载体上。75.如实施方案54-74所述的方法，其中适于使靶核酸分子的至少一部分与固定的捕获寡核苷酸中的一个的靶捕获区杂交的条件包括使低非特异性结合涂层与靶核酸分子和杂交缓冲液接触，所述杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其介电常数不大于40且极性指数为4-9；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于所述杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲体系，其将所述杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8的范围内；和(iv)足以增强或促进分子拥挤的量的拥挤剂。76.如实施方案54-75所述的方法，其中所述杂交缓冲液包含第一极性非质子溶剂，所述第一极性非质子溶剂包含以所述杂交缓冲液的体积计为25-50％的乙腈。77.如实施方案54-76所述的方法，其中所述第二极性非质子溶剂包含以杂交缓冲液的体积计为5-10％的甲酰胺。78.如实施方案54-77所述的方法，其中所述ph缓冲体系包含2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph为5-6.5。79.如实施方案54-78所述的方法，其中所述拥挤剂包含以所述杂交缓冲液的体积计为5-35％的聚乙二醇(peg)。80.如实施方案54-79所述的方法，其中所述杂交缓冲液还包含甜菜碱。81.如实施方案63-80所述的方法，还包括：通过以下确定所述固定的多联体分子的序列：(a)在适于将至少一种聚合酶和至少一种测序引物结合到固定的多联体分子的一部分以及适于在与固定的多联体分子中的互补核苷酸相反的位置处将聚合物-核苷酸缀合物的至少一个核苷酸部分结合到测序引物的3’端的条件下，使所述固定的多联体分子与(i)多个聚合酶，(ii)至少一个聚合物-核苷酸缀合物，其包含通过接头连接到核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，以及(iii)与测序引物结合序列杂交的多个测序引物接触，其中结合的核苷酸部分不掺入测序引物中；(b)检测和鉴定聚合物-核苷酸缀合物的结合核苷酸部分，从而确定固定的多联体分子的序列；(c)任选地将步骤(a)和(b)重复至少一次；(d)在适于将至少一种聚合酶结合到固定的多联体分子的至少一部分和适于在与固定的多联体分子中的互补核苷酸相反的位置处将来自多个核苷酸的至少一个核苷酸结合到杂交的测序引物的3’端的条件下，使固定的多联体分子与(i)多个聚合酶和(ii)多个核苷酸接触，其中结合的核苷酸掺入到杂交的测序引物中；(e)任选地检测掺入的核苷酸；(f)任选地鉴定所述掺入核苷酸，从而确定或确认所述固定的多联体的序列；和(g)将步骤(a)-(f)重复至少一次。在一些实施方案中，确定固定的多联体分子的序列包括对靶序列和空间条形码序列进行测序。82.如实施方案63-80所述的方法，还包括：通过以下确定所述固定的多联体分子的序列：(a)在适于将至少一种聚合酶和至少一种测序引物结合到固定的多联体分子的一
部分以及适于在与固定的多联体分子中的互补核苷酸相反的位置处将至少一个核苷酸结合到测序引物的3’端的条件下，使固定的多联体分子与(i)多个聚合酶、(ii)多个核苷酸和(iii)与测序引物结合序列杂交的多个测序引物接触，其中结合的核苷酸掺入测序引物的3’端；(b)检测和识别所述掺入的核苷酸，从而确定所述固定的多联体分子的序列；和(c)任选地将步骤(a)和(b)重复至少一次。在一些实施方案中，确定固定的多联体分子的序列包括对靶序列和空间条形码序列进行测序。83.一种用于核酸序列确定的方法，包括：(a)将包含靶核酸分子的生物样品固定到基底表面；和(b)在足以允许在核苷酸部分和所述靶核酸分子之间形成复合物的条件下，使所述表面与包含可检测标记的核苷酸部分接触，其中当在非信号饱和条件下在所述表面浸入缓冲液中的同时使用倒置显微镜和相机获得所述表面的图像时，所述表面的所述图像表现出大于或等于约5的对比度噪声比，并且其中所述可检测标记为荧光染料。84.一种用于核酸序列确定的方法，包括：(a)将包含靶核酸分子的生物样品固定到基底的表面；(b)在足以允许在聚合物-核苷酸缀合物与所述靶核酸分子之间形成多价结合复合物的条件下使所述表面与所述聚合物-核苷酸缀合物接触，其中所述聚合物-核苷酸缀合物包含核苷酸和可检测标记；和(c)在固定到所述表面的生物样品存在下检测所述多价结合复合物，从而确定所述核苷酸在靶核酸分子中的身份。
[0863]
提供了本发明的其他实施方案：1.一种用于分析来自细胞生物样品的生物分子的方法，其中细胞生物样品的细胞包含细胞核酸和多肽，并且其中样品中的至少一个细胞包含编码靶多肽的靶核酸，所述方法包括以下一般步骤：a)提供载体，其包含固定多个捕获寡核苷酸和任选的多个环化寡核苷酸的低非特异性结合涂层，其中所述多个固定的捕获寡核苷酸包含(i)靶捕获区，其与靶核酸分子的至少一部分杂交，以及(ii)空间条形码序列，其中低非特异性结合涂层包括至少一个亲水性聚合物层，所述亲水性聚合物层具有不大于45度的水接触角；b)在适于促进靶核酸分子从细胞生物样品迁移到固定的捕获寡核苷酸中的一个的条件下，在高效杂交缓冲液存在下，使低非特异性结合涂层与细胞生物样品接触，从而形成固定的靶核酸双链体，其中靶核酸分子以保留靶核酸分子在细胞生物样品中的空间位置信息的方式固定到低非特异性结合涂层；c)在固定的靶核酸双链体上进行引物延伸反应，从而形成固定的靶延伸产物；d)使用固定的环化寡核苷酸形成开放的环状靶分子，或者，如果低非特异性结合涂层尚未包括固定的环化寡核苷酸，则将可溶性环化寡核苷酸靠近固定的靶延伸产物固定到低非特异性结合涂层上，并使用现在固定的环化寡核苷酸形成开放的环状靶分子；e)形成共价闭合的环状靶分子，其被固定到低非特异性结合涂层上；f)在固定的共价闭合的环状靶分子上进行滚环扩增反应，以形成具有包含靶序列和空间条形码序列的串联重复区的固定的核酸多联体分子；以及
g)对核酸多联体的至少一部分进行测序，包括对靶序列和空间条形码序列进行测序，以确定靶核酸在细胞生物样品中的空间位置。2.如实施方案1所述的方法，其中步骤(g)包括：使用光学成像系统对核酸多联体的至少一部分进行测序，该光学成像系统包括大于1.0mm2的视场(fov)。3.如实施方案1所述的方法，其中所述靶核酸包括rna。4.如实施方案3所述的方法，其中靶rna在所述细胞生物样品中的空间位置对应于表达编码靶多肽的靶rna的细胞生物样品中的至少一个细胞的空间位置。5.如实施方案1所述的方法，其中步骤(c)的所述引物延伸反应包括逆转录反应。6.如实施方案1所述的方法，其中所述高效杂交缓冲液包含：(i)第一极性非质子溶剂，其介电常数不大于40且极性指数为4-9；(ii)第二极性非质子溶剂，其介电常数不大于115，并且以有效使双链核酸变性的量存在于所述高效杂交缓冲液制剂中；(iii)ph缓冲体系，其将所述高效杂交缓冲液制剂的ph保持在约4-8的范围内；和(iv)足以增强或促进分子拥挤的量的拥挤剂。7.如实施方案6所述的方法，其中所述高效杂交缓冲液还包含甜菜碱。8.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(g)的滚环扩增反应包括在适于产生至少一种核酸多联体的条件下，使共价闭合的环状靶分子(例如，环状核酸模板分子(多个))与dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。9.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(g)的滚环扩增反应包括：a)使所述共价闭合的环状靶分子(例如，环状核酸模板分子(多个))与dna聚合酶、多个核苷酸和至少一种不促进聚合酶催化的核苷酸掺入3’可延伸端的非催化性二价阳离子接触，其中所述非催化性二价阳离子包括锶或钡；和b)在适于生成至少一种核酸多联体的条件下，使所述共价闭合的环状靶分子与至少一种催化性二价阳离子接触，其中至少一种催化性二价阳离子包括镁或锰。10.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(f)的滚环扩增反应可在室温至约70℃范围的恒定温度(例如等温)下进行。11.如实施方案1所述的方法，还包括：在步骤(g)之前进行多重置换扩增(mda)反应，其中所述mda反应包括(1)使至少一个核酸多联体与至少一个包含随机序列的扩增引物、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸以及包括镁或锰的催化性二价阳离子接触，或其中mda反应包括(2)将至少一个核酸多联体与dna引发酶-聚合酶、具有链置换活性的dna聚合酶、多个核苷酸和包括镁或锰的催化性二价阳离子接触。12.如实施方案9所述的方法，还包括在步骤(f)的滚环扩增之后且步骤(g)之前进行以下步骤：a)通过使核酸多联体与选自甲酰胺、乙腈、乙醇、盐酸胍、脲、碘化钾和/或多胺的一种或两种或更多种化合物的组合接触，形成核酸松弛反应混合物，以生成松弛的核酸多联体，其中，形成核酸松弛反应混合物是在温度斜升、松弛温育温度和温度斜降的情况下进行的；b)洗涤松弛的多联体；
c)通过使松弛的多联体与链置换dna聚合酶、多个核苷酸、催化性二价阳离子(在没有添加扩增引物的情况下)接触来形成弯曲扩增反应混合物，以生成双链多联体，其中形成弯曲扩增反应混合物是在温度斜升、弯曲温育温度和温度斜降的情况下进行的；d)洗涤双链多联体；和e)将步骤(a)-(d)重复至少一次。13.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(g)的测序包括监测所述多联体的模板链中经标记的核苷酸的顺序结合(例如，通过结合测序)。14.如实施方案13所述的方法，其中所述步骤(g)的测序还包括监测经标记的核苷酸在多联体的模板链中的掺入(例如，通过合成测序)。15.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(g)的测序包括检测在聚合酶和所述多联体的引发模板链之间形成的复合物，其中所述聚合酶任选地被标记。16.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(g)的测序包括：使所述多个核酸多联体与多个测序引物、多个聚合酶和多个多价分子接触，其中每个所述多价分子包含通过接头连接到核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体。17.如实施方案16所述的方法，其中所述多价分子包括：a)核心；和b)多个核苷酸臂，其包含(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔子，(iii)接头，以及(iv)核苷酸单元，其中所述核心附接到所述多个核苷酸臂，其中所述间隔子附接到所述接头，其中所述接头附接到所述核苷酸单元，其中所述核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团，且其中所述接头通过所述碱基附接到所述核苷酸单元，其中所述接头包括脂肪族链或低聚乙二醇链，其中两种接头链具有2-6个亚基，并且任选地，所述接头包含芳香族部分。18.如实施方案16所述的方法，其中所述多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，并且其中多个核苷酸臂具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的相同类型的核苷酸单元。19.如实施方案16所述的方法，其中所述多价分子还包含多个多价分子，其包括多价分子的混合物，所述多价分子具有选自datp、dgtp、dctp、dttp和dutp的两种或更多种不同类型的核苷酸。20.如实施方案16所述的方法，其中所述多价分子包含附接到多个核苷酸臂的核心，其中所述核心用可检测的报告部分标记。21.如实施方案16所述的方法，其中所述可检测的报告部分包含荧光团。22.如实施方案16所述的方法，其中所述核心包含类亲和素部分，且所述核心附接部分包含生物素。23.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(h)的测序包括：a)在适于将至少一种聚合酶和至少一种测序引物结合到核酸多联体分子中的一个的一部分，以及适于在与所述多联体分子中的互补核苷酸相反的位置处将多价分子的至
少一个核苷酸部分结合到测序引物的3’端的条件下，使所述多个核酸多联体与(i)多个聚合酶，(ii)至少一个多价分子，所述多价分子包含通过接头连接到核心的核苷酸部分的两个或更多个重复体，以及(iii)与所述多联体的一部分杂交的多个测序引物接触，其中所结合的核苷酸部分未掺入测序引物中；b)检测和鉴定所述多价分子的结合核苷酸部分，从而确定所述多联体分子的序列；c)任选地将步骤(a)和(b)重复至少一次；d)在适于将至少一种聚合酶结合到多联体分子的至少一部分和适于在与多联体分子中的互补核苷酸相反的位置处将来自多个核苷酸的至少一个核苷酸结合到杂交的测序引物的3’端的条件下，使多联体分子与(i)多个聚合酶和(ii)多个核苷酸接触，其中结合的核苷酸掺入到杂交得测序引物中；e)任选地检测掺入的核苷酸；f)任选地鉴定所述掺入的核苷酸，从而确定或确认所述多联体的序列；和g)将步骤(a)-(f)重复至少一次。iii.实施例
[0864]
包括以下实施例仅用于说明目的而不旨在限制本发明的范围。实施例1：原位测序a.制备组织样品
[0865]
将动物或人类对象的新鲜冷冻组织样品包埋在石蜡或oct(最佳切割温度)中，并以约10微米的厚度进行冷冻切片。将包埋的组织切片放置在缺乏捕获寡核苷酸的载体上。例如，将组织切片放置在载玻片上(例如，superfrost plus显微镜载玻片，例如来自fisher scientific目录号12-550-15)，并在-80℃下储存，备用。
[0866]
将载玻片从-80℃取出并解冻至室温。通过将在depc-pbs中的3％(w/v)多聚甲醛溶液涂抹到组织切片上，将组织样品固定，并在室温下温育约5分钟。将组织切片用depc-pbs冲洗至少两次。通过在室温下将载玻片浸入0.1m hcl的溶液中约5分钟，在酸性条件下使组织透化。在室温下将载玻片用depc-pbs洗涤至少1分钟。将载玻片在乙醇系列中脱水：(1)在室温下70％乙醇中约1分钟；(2)在室温下100％乙醇中约1分钟。将载玻片风干。用secureseal杂交室(例如，来自grace bio labs)将杂交室安装在载玻片上的组织切片上。将组织切片用depc-pbs-t再水化，然后用depc-pbs再水化。b.原位逆转录酶反应
[0867]
通过将逆转录酶(例如，transcriptme逆转录酶，其是来自cytogen的m-mulv逆转录酶)、逆转录酶缓冲液、dntp(500um)、随机引物(例如，十聚体，5um)、rnase抑制剂(1u/ul)、bsa(0.2ug/ul)和depc-水添加到室中，准备逆转录酶反应。示例性逆转录酶缓冲液可包括：50mm tris-hcl(ph 8.3)；75mm kcl；3mm mgcl2；和10mm dtt。将室密封，并将载玻片置于湿度室中，并在37℃下温育至少6小时。将逆转录酶试剂去除。将组织切片在室温下用3％(w/v)多聚甲醛固定约30分钟。将组织切片用dpec-pbs-t洗涤数次。c.滚环扩增
[0868]
锁式探针的长度为70
–
100个核苷酸，在其5’端被磷酸化，并且包括：与靶序列杂交的末端靶区(5’臂和3’臂)，各自的长度为15个核苷酸；包括id序列(长度为约6-20个核苷
酸)和任选的锚定结合序列(长度为约6-20个核苷酸)的骨架区。在一些实施方案中，锁式探针的末端靶区包含随机序列。通过向组织切片中添加锁式探针(例如，约10nm的每种类型的锁式探针)、1x tth连接酶缓冲液、kcl(0.05m)、甲酰胺(20％)、bsa(0.2ug/ul)、tth连接酶(0.5u/ul)和rnaseh(0.4u/ul)，原位进行锁式探针杂交和连接。示例性连接酶缓冲液包含20mm tris-hcl(ph 8.3)、25mm kcl、10mm mgcl2、0.5mm nad和0.01％triton x-100。将锁式探针杂交反应在约37℃下进行约30分钟，然后在约45℃下进行约1.5至2小时。用depc-pbs-t将载玻片洗涤数次。
[0869]
进行两步滚环扩增，以在组织切片的细胞中产生多联体。
[0870]
步骤一：向组织切片中加入非催化性溶液：10mm aces ph 7.4、dntp(10um)、1mm乙酸锶、0.01％吐温-20、50mm硫酸铵和10mm dtt。将室密封，并在室温或35℃在湿度室中温育15分钟。将非催化性溶液从室中取出。
[0871]
步骤二：向组织切片中加入催化性溶液：50mm aces ph 7.4、100mm乙酸钾、10mm mgso4、dntp(2mm)、10mm dtt、0.01％吐温-20、50mm硫酸铵和10mm dtt。任选地，包含以10-200nm的压实寡核苷酸。将室密封并放置在湿度室中。在室温或35℃下进行滚环扩增反应，持续的不同时间范围为5分钟至2小时。用含有50mm tris-hcl ph 8、750mm nacl、0.1mm edta和0.02％吐温-20的缓冲液洗涤组织切片。d1.用可溶性随机引物进行多重置换扩增
[0872]
在滚环扩增反应后进行多重置换扩增(mda)，以生成支化多联体。通过将以下添加到组织切片进行mda反应：50mm tris ph7.5、75mm nacl、10mm mgcl2、1mm dtt、2.5％甘油、0.1mg/ml bsa、1.5-2mm dntp、1-10um随机序列六聚体(核酸外切酶抗性)以及链置换dna聚合酶。被测试的链置换dna聚合酶包括phi29(野生型)、equiphi29(例如，thermo fisher scientific，目录号a39390)、qualiphi(例如，来自4basebio，目录号510025)、bst dna聚合酶核酸外切酶阴性的大片段(例如，lucigen，目录号30027-1)以及bsu dna聚合酶核酸外切酶阴性的大片段(例如，new england biolabs，目录号ms330s)。dna聚合酶通常以150nm添加。可替选mda制剂可包括：市售缓冲液，其包括：phi29 10x反应缓冲液(thermo fisher，目录号b62)，补充有1-20mm dtt和0.5-4mm dntp；equiphi29 10x反应缓冲液(thermo fisher scientific，目录号b39)，补充有1-20mm dtt和0.5-4mm dntp；和trueprime试剂盒缓冲液(例如lucigen，目录号syg370025)，补充有0.5-4mm dntp。将室置于湿度室中以进行多重置换扩增反应。测试不同的温育条件，包括：范围为30-45℃的温度，持续30-90分钟。用含有(1)50mm tris-hcl ph 8、750mm nacl、0.1mm edta、0.02％吐温-20的缓冲液；或(2)3x ssc缓冲液，然后是含有50mm tris ph 8、100mm nacl、0.1mm edta和0.01％吐温-20的缓冲液洗涤室。d2.用dna引发酶-聚合酶进行多重置换扩增
[0873]
在滚环扩增反应之后，使用dna引发酶-聚合酶并且不使用任何引物进行可替选mda反应，生成支化多联体。测试不同的mda制剂。mda制剂中的一个含有50mm tris ph7.5、75mm nacl、10mm mgcl2、1mm dtt、2.5％甘油、0.1mg/ml bsa、1.5-2mm dntp、链置换dna聚合酶和dna引发酶-聚合酶。其他mda制剂可包括：市售缓冲液，其包括：phi29 10x反应缓冲液(thermo fisher，目录号b62)，补充有1-20mm dtt和0.5-4mm dntp；equiphi29 10x反应缓冲液(thermo fisher scientific，目录号b39)，补充有1-20mm dtt和0.5-4mm dntp；和
dna聚合酶(例如，来自4basebio)。
[0885]
例如，测试bst dna聚合酶的大片段。将弯曲扩增反应缓冲液沉积在组织切片上：bst dna聚合酶(400nm)、20mm tris ph 8.5、50mm kcl、5mm mgso4、0.1％吐温-20、1.5m甜菜碱和0.25mm dntp(总计)。
[0886]
可以在湿度室内进行测试不同的弯曲扩增温度循环曲线。例如，单个弯曲扩增温度循环曲线可包括：t1初始温度，t2温度斜升，用于弯曲扩增反应的温育，t3温度斜降。温度循环可重复2-50次或更多。
[0887]
示例性弯曲扩增温度循环曲线可包括：t1初始温度为25℃；t2温度斜升至63℃，其中温度梯度为 1℃/秒；在63℃下温育55秒；t3温度斜降至25℃，其中温度梯度为-1℃/秒。松弛阶段和弯曲扩增阶段代表一个循环。循环可重复5-15次。
[0888]
在最后弯曲t3温度斜降后，洗涤室以去除松弛缓冲液。洗涤缓冲液可含有1x ssc和0.1mm六氨合钴。e.用多价分子的测序
[0889]
包含附接到多个核苷酸臂的经荧光标记的链霉亲和素核心的多价分子(参见图5a、5b和5d)用于对组织切片细胞中的多联体进行测序。可使非催化性缓冲液流到组织切片上，其中非催化缓冲液包含20nm klenow聚合酶(或其他合适的聚合酶)、测序引物、2.5mm锶和经标记的多价分子(例如，以2.5um)。可以获得与经标记的多价分子结合的聚合酶的荧光图像(其中多价分子未掺入的三元复合物)。可通过添加具有10mm tris ph 8.0、0.5mm edta、50mm nacl、0.016％triton x100(但不含锶)的洗涤缓冲液来解离多价分子。可使催化性缓冲液流入组织切片上，其中催化性缓冲液可包含20nm klenow聚合酶(或其他合适的聚合酶)、镁、任选的测序引物以及经标记或未标记的核苷酸。核苷酸可以具有2’或3’链终止部分，诸如例如叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。核苷酸可以掺入到测序引物中以延伸引物。如果掺入的核苷酸被标记，则可以获得图像。可使用适当的试剂(例如，膦化合物)去除掺入的核苷酸中的链终止部分。可以进行重复循环，其包括与多价分子的非催化性结合、对结合的多价分子进行成像、核苷酸的催化性掺入，以及任选地对掺入的核苷酸进行成像。实施例2：原位单细胞测序
[0890]
可以从动物或人类获得单细胞，并且可以将其在简单或复杂细胞培养基中放置至少15分钟。简单细胞培养基可为pbs(磷酸盐缓冲盐水)、dpbs(杜氏磷酸盐缓冲盐水)、hbss(汉克斯平衡盐溶液)、dmem(杜氏改良伊格尔培养基)、emem(伊格尔极限必需培养基)和/或ebss。复杂细胞培养基可为胎牛血清、血浆或血清。
[0891]
可将单细胞包埋在石蜡或oct(最佳切割温度)中，并按照上述如实施例1-a所述进行冷冻切片。可以按照上述实施例1-a中所述将切片进行固定。可以将单细胞的切片放置在玻璃载体上，该玻璃载体用低非特异性结合涂层钝化，并且不具有固定的捕获寡核苷酸。当将经切片的单细胞放置在钝化的载体上时，可如上述实施例1-a中所述对经切片的单细胞进行透化、脱水和再水化。
[0892]
如上述实施例案1-b所述，可对单细胞的切片进行逆转录酶处理。
[0893]
如上述实施例1-c所述，可对单细胞的切片进行滚环扩增，以生成多联体。
[0894]
在滚环扩增之后，可以使用随机引物对单细胞的切片进行多重置换扩增，以生成支化多联体，如上述实施例1-d1所述，或者可以使用dna引发酶-聚合酶对其进行多重置换
扩增，以生成支化多联体，如上述实施例1-d2所述。或者，在滚环扩增之后，可对单细胞的切片进行松弛条件和弯曲扩增，以生成高度压实多联体，如上述实施例1-d3所述。
[0895]
如上述实施例1-e中所述，可使用多价分子对多联体进行测序。实施例3：低非特异性结合涂层上的生物分子捕获a.制备组织样品
[0896]
将动物或人类对象的新鲜冷冻组织样品包埋在石蜡或oct(最佳切割温度)中，并以约10微米的厚度进行冷冻切片。将组织切片放置在载体上，该载体用包含固定到涂层上的捕获寡核苷酸的低非特异性结合涂层钝化。该涂层任选地还包含固定的环化寡核苷酸(图2)。可将载体上的组织切片在-80℃下储存，备用。
[0897]
低非特异性结合涂层可具有一系列表面特征部(例如，形状为斑点，图3)，其中特征部各自具有固定在其上的约100,000或更多个捕获寡核苷酸。捕获寡核苷酸包含靶捕获区、空间条形码序列(例如，图2)和任选的测序引物结合序列。不同的特征部包含具有不同空间条形码序列的捕获寡核苷酸。不同的特征部包含具有相同或不同靶捕获区序列的捕获寡核苷酸。
[0898]
将载玻片从-80℃取出并解冻至室温。通过将在depc-pbs中的3％(w/v)多聚甲醛涂抹到组织切片上，将组织样品固定，并在室温下温育约5分钟。b.靶核酸的表面捕获
[0899]
将组织切片用depc-pbs冲洗至少两次。通过在室温下在组织切片上流过0.1m hcl的酸性溶液，将组织切片中的细胞透化。使高效杂交溶液流到组织切片上，以允许来自组织的核酸从组织迁移到钝化载体上的捕获寡核苷酸上。高效杂交溶液包括：(i)以高效杂交缓冲液的体积计为25-50％的乙腈；(ii)以高效杂交缓冲液的体积计为5-10％的甲酰胺；(iii)2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph值为5-6.5；以及(iv)以高效杂交缓冲液的体积计为5-35％的聚乙二醇(peg)(例如，peg 4000)。将组织切片在约55℃下温育约3分钟，然后在37℃下温育约3分钟，然后在室温下温育约3分钟。将组织切片在室温下用depc-pbs洗涤。c.逆转录酶反应
[0900]
通过向组织切片中加入以下来准备逆转录酶反应：逆转录酶(例如，作为来自cytogen的m-mulv逆转录酶的transcriptme逆转录酶)、逆转录酶缓冲液、dntp(500um)、5um逆转录引物(例如，靶特异性引物或随机序列十聚体)、rnase抑制剂(1u/ul)、bsa(0.2ug/ul)和depc-水。示例性逆转录酶缓冲液可包含：50mm tris-hcl(ph 8.3)；75mm kcl；3mm mgcl2；和10mm dtt。将组织切片置于湿度室中，并在37℃下温育至少6小时或过夜。通过在室温下用depc-pbs洗涤去除逆转录酶试剂。将组织切片在室温下用3％(w/v)多聚甲醛固定约30分钟。将组织切片用dpec-pbs-t洗涤数次。
[0901]
用胶原酶、中性分散酶蛋白酶和/或嗜热菌蛋白酶(如释放酶(liberase))酶促移出组织切片的细胞。d.滚环扩增
[0902]
进行两步滚环扩增，以在组织切片的细胞中产生多联体。
[0903]
步骤一：向组织切片中加入非催化性溶液：10mm aces ph 7.4、dntp(10um)、1mm乙酸锶、0.01％吐温-20、50mm硫酸铵和10mm dtt。将室密封，并在室温或35℃在湿度室中温育15分钟。将非催化性溶液从室中去除。
[0904]
步骤二：向组织切片中加入催化性溶液：50mm aces ph 7.4、100mm乙酸钾、10mm mgso4、dntp(2mm)、10mm dtt、0.01％吐温-20、50mm硫酸铵和10mm dtt。任选地，以10-200nm包含压实寡核苷酸。将室密封并放置在湿度室中。在室温或35℃下进行滚环扩增反应，持续的不同时间范围为5分钟至2小时。用含有50mm tris-hcl ph8、750mm nacl、0.1mm edta和0.02％吐温-20的缓冲液洗涤组织切片。e1.用可溶性随机引物进行多重置换扩增
[0905]
使用如上述实施例1-d1中所述的方案，在滚环扩增反应后进行多重置换扩增(mda)，以生成支化多联体。e2.用dna引发酶-聚合酶进行多重置换扩增
[0906]
使用如上述实施例1-d2中所述的方案，在滚环扩增反应之后，使用dna引发酶-聚合酶并且不使用任何引物进行替代mda反应，生成支化多联体。e3.松弛条件和弯曲扩增
[0907]
使用如上述实施例1-d3中所述的方案，代替在滚环扩增之后进行多重置换扩增反应，将组织切片进行松弛条件然后进行弯曲扩增反应，以生成高度压实多联体。f.用多价分子进行测序
[0908]
如上述实施例1-e所述，使用多价分子和核苷酸对多联体进行测序。实施例4：将来自单细胞的核酸捕获到低非特异性结合涂层上
[0909]
可以从动物或人类获得单细胞，并且可以将其在简单或复杂细胞培养基中放置至少15分钟。简单细胞培养基可为pbs(磷酸盐缓冲盐水)、dpbs(杜氏磷酸盐缓冲盐水)、hbss(汉克斯平衡盐溶液)、dmem(杜氏改良伊格尔培养基)、emem(伊格尔极限必需培养基)和/或ebss。复杂细胞培养基可为胎牛血清、血浆或血清。
[0910]
可将单细胞包埋在石蜡或oct(最佳切割温度)中，并如上述实施例1-a所述进行冷冻切片。可以如上述实施例1-a中所述将切片进行固定。
[0911]
将组织切片放置在载体上，该载体用包含固定到涂层上的捕获寡核苷酸的低非特异性结合涂层钝化。该涂层任选地还包含固定的环化寡核苷酸(图2)。可将载体上的组织切片在-80℃下储存，备用。
[0912]
低非特异性结合涂层可具有一系列表面特征部(例如，形状为斑点，图3)，其中特征部各自具有固定在其上的约100,000或更多个捕获寡核苷酸。捕获寡核苷酸包含靶捕获区、空间条形码序列(例如，图2)和任选的测序引物结合序列。不同的特征部包含具有不同空间条形码序列的捕获寡核苷酸。不同的特征部包含具有相同或不同靶捕获区序列的捕获寡核苷酸。
[0913]
将载玻片从-80℃取出并解冻至室温。通过将在depc-pbs中的3％(w/v)多聚甲醛涂抹到组织切片上，将组织样品固定，并在室温下温育约5分钟。
[0914]
使用如上述实施例3-b中所述的高效杂交溶液，可通过涂层上的固定的捕获寡核苷酸捕获来自包埋的单细胞的核酸(例如，rna)。
[0915]
可对捕获的rna进行逆转录反应以生成cdna，随后进行固定和酶促细胞移出，如上述实施例3-c所述。
[0916]
如上述实施例3-d所述，可对cdna进行两步滚环扩增反应。
[0917]
如上述实施例3-e1所述，在滚环扩增之后，可以使用随机引物对单细胞的切片进
行多重置换扩增，以生成支化多联体，或者如上述实施例3-e2所述，可以使用dna引发酶-聚合酶进行多重置换扩增，以生成支化多联体。或者，在滚环扩增之后，可对单细胞的切片进行松弛条件和弯曲扩增，以生成高度压实多联体，如上述实施例3-e3所述。
[0918]
如上述实施例3-f中所述，可使用多价分子对多联体进行测序。实施例5-用于基因组学应用的荧光成像模块的设计规格
[0919]
在表1中提供了本公开的荧光成像模块的设计规格的非限制性示例。
[0920]
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员将是显而易见的是，仅通过示例的方式来提供此类实施方案。在不脱离本发明的情况下，本领
域技术人员现在将想到许多变型、改变和替代。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同方案。
再多了解一些
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