一种灭活病毒保存液及其配制方法与流程

1.本发明涉及一种配制方法，特别是涉及一种灭活病毒保存液及其配制方法，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.病毒的核酸检测需要经过采样、运输、提取核酸，rt-qpcr检测这些步骤才能最终获得检测结果，每一个步骤都可能出问题而导致结果不准确，如何控制这些环节的出错率，提升检测的准确性和灵敏度，是亟待解决的问题。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题的至少之一，本发明提供一种灭活病毒保存液及其配制方法。
4.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
5.设计一种灭活病毒保存液及其配制方法，材料包括：
6.异硫氰酸胍180～220g/l；
7.柠檬酸钠1.5～4g/l；
8.十二烷基肌氨酸钠1～2.5g/l；
9.hac-naac缓冲液50～70ml/l；
10.二茂铁－谷胱甘肽8～31mg/l；
11.酸碱指示剂29～60mg/l；
12.柠檬酸钠的终浓度为9mm～39mm；
13.蛋白酶k的终浓度为40～850μg/m；
14.乙二胺四乙酸的终浓度为4mm～55mm。
15.优选的，所述hac-naac缓冲液的ph为3～5。
16.优选的，二茂铁－谷胱甘肽的制备方法为：
17.s1、将二茂铁甲酸溶于水和丙酮的体积比为3:8的混合溶剂中，冷却至4℃后依次滴加三乙胺的丙酮溶液和氯甲酸乙酯的丙酮溶液，搅拌30min后再滴加叠氮化钠水溶液，搅拌反应90min后萃取有机相并干燥后得到叠氮羰基二茂铁；其中二茂铁甲酸、三乙胺、氯甲酸乙酯和叠氮化钠的添加量之比为0.8g:0.3ml:0.3ml:0.3g；
18.s2、将叠氮羰基二茂铁加入叔丁醇中，叠氮羰基二茂铁与叔丁醇的质量体积比为18mg:1ml；70℃回流反应2h，将反应液蒸干后得到叔丁基氧－氨基二茂铁；
19.s3、将叔丁基氧－氨基二茂铁溶于乙酸乙酯中，3℃下通干燥的hcl气体60min，然后在室温下反应60min，将反应液蒸干后得到氨基修饰的二茂铁；
20.s4、将二碳酸二叔丁酯的二氧己环溶液与饱和碳酸氢钠溶液混合，然后加入还原型谷胱甘肽，二碳酸二叔丁酯、碳酸氢钠与还原型谷胱甘肽的质量比为1:1:1，搅拌反应12h后分离油相并干燥得到氨基保护的还原型谷胱甘肽；
21.s5、将氨基保护的还原型谷胱甘肽加入二氯甲烷中溶解，降温至 4℃下加入三乙
胺，再加入hbtu，保温反应90min后加入氨基修饰的二茂铁，氨基保护的还原型谷胱甘肽、三乙胺、hbtu和氨基修饰的二茂铁的添加量之比为300mg:0.6ml:250mg:200mg；继续保温反应2h，再升温至30℃反应14h，反应结束后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸和水洗涤，分离油相并干燥后得到叔丁基氧－二茂铁－谷胱甘肽；
22.s6、将叔丁基氧－二茂铁－谷胱甘肽溶于乙酸乙酯中，2℃下通干燥的hcl气体60min，然后在室温下反应60min，将反应液蒸干后得到所述二茂铁－谷胱甘肽。
23.一种灭活病毒保存液配制方法，包括以下步骤：
24.s1、将的柠檬酸钠溶液加入上述异硫氰酸胍和二茂铁－谷胱甘肽的混合溶液中混匀，再加入十二烷基肌氨酸钠溶液混匀，搅匀时间为 30～120min；
25.s2、向s1中搅拌均匀的溶液添加一定量的浓硫酸，将溶液的ph 调至4.5～5.8；
26.s3、将所述s2中混合后的溶液用灭菌水定容；
27.s4、最后用滤膜过滤除菌，分装保存得到所述灭活型病毒样本保存液；
28.s5、将s4中得到的灭活型病毒样本保存液放入灭菌箱内进行最后的灭菌，灭菌温度110～130℃，灭菌时间30～50min。
29.优选的，所述s4中滤膜的孔径为0.15μm～0.35μm，所述灭菌水为无酶无菌水。
30.优选的，病毒样本核酸保存液室温保存病毒样本核酸稳定的时限为5～8天。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明不仅使用简单，而可在常温下进行储存，并且能够在大规模的采集中节省大量的时间，能够有效的灭活病毒，保护医护人员的安全，可以抵御细菌真菌生长，不易造成污染，可以长期保存和病毒检测，使病毒不具有传染性，避免了使运输和检测人员处于被感染风险中，具有广泛的应用前景，通过采用hac-naac缓冲液作为缓冲稳定溶液能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的ph值相对稳定。
32.参照后文的说明和附图，详细公开了本发明的特定实施方式，指明了本发明的原理可以被采用的方式。应该理解，本发明的实施方式在范围上并不因而受到限制。在所附权利要求的精神和条款的范围内，本发明的实施方式包括许多改变、修改和等同。
附图说明
33.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
34.图1为按照本发明的灭活病毒保存液的一优选实施例的配比图；
35.图2为按照本发明的灭活病毒保存液配制方法的一优选实施例的流程图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.如图1所示，本实施例提供的灭活病毒保存液及其配制方法，材料包括：
38.异硫氰酸胍180～220g/l；
39.柠檬酸钠1.5～4g/l；
40.十二烷基肌氨酸钠1～2.5g/l；
41.hac-naac缓冲液50～70ml/l；
42.二茂铁－谷胱甘肽8～31mg/l；
43.酸碱指示剂29～60mg/l；
44.柠檬酸钠的终浓度为9mm～39mm；
45.蛋白酶k的终浓度为40～850μg/m；
46.乙二胺四乙酸的终浓度为4mm～55mm。
47.具体的，所述hac-naac缓冲液的ph为3～5。
48.具体的，二茂铁－谷胱甘肽的制备方法为：
49.s1、将二茂铁甲酸溶于水和丙酮的体积比为3:8的混合溶剂中，冷却至4℃后依次滴加三乙胺的丙酮溶液和氯甲酸乙酯的丙酮溶液，搅拌30min后再滴加叠氮化钠水溶液，搅拌反应90min后萃取有机相并干燥后得到叠氮羰基二茂铁；其中二茂铁甲酸、三乙胺、氯甲酸乙酯和叠氮化钠的添加量之比为0.8g:0.3ml:0.3ml:0.3g；
50.s2、将叠氮羰基二茂铁加入叔丁醇中，叠氮羰基二茂铁与叔丁醇的质量体积比为18mg:1ml；70℃回流反应2h，将反应液蒸干后得到叔丁基氧－氨基二茂铁；
51.s3、将叔丁基氧－氨基二茂铁溶于乙酸乙酯中，3℃下通干燥的hcl气体60min，然后在室温下反应60min，将反应液蒸干后得到氨基修饰的二茂铁；
52.s4、将二碳酸二叔丁酯的二氧己环溶液与饱和碳酸氢钠溶液混合，然后加入还原型谷胱甘肽，二碳酸二叔丁酯、碳酸氢钠与还原型谷胱甘肽的质量比为1:1:1，搅拌反应12h后分离油相并干燥得到氨基保护的还原型谷胱甘肽；
53.s5、将氨基保护的还原型谷胱甘肽加入二氯甲烷中溶解，降温至 4℃下加入三乙胺，再加入hbtu，保温反应90min后加入氨基修饰的二茂铁，氨基保护的还原型谷胱甘肽、三乙胺、hbtu和氨基修饰的二茂铁的添加量之比为300mg:0.6ml:250mg:200mg；继续保温反应 2h，再升温至30℃反应14h，反应结束后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸和水洗涤，分离油相并干燥后得到叔丁基氧－二茂铁－谷胱甘肽；
54.s6、将叔丁基氧－二茂铁－谷胱甘肽溶于乙酸乙酯中，2℃下通干燥的hcl气体60min，然后在室温下反应60mi n，将反应液蒸干后得到所述二茂铁－谷胱甘肽。
55.如图2所示，一种灭活病毒保存液配制方法，包括以下步骤：
56.s1、将的柠檬酸钠溶液加入上述异硫氰酸胍和二茂铁－谷胱甘肽的混合溶液中混匀，再加入十二烷基肌氨酸钠溶液混匀，搅匀时间为 30～120min；
57.s2、向s1中搅拌均匀的溶液添加一定量的浓硫酸，将溶液的ph 调至4.5～5.8；
58.s3、将所述s2中混合后的溶液用灭菌水定容；
59.s4、最后用滤膜过滤除菌，分装保存得到所述灭活型病毒样本保存液；
60.s5、将s4中得到的灭活型病毒样本保存液放入灭菌箱内进行最后的灭菌，灭菌温度110～130℃，灭菌时间30～50min。
61.具体的，所述s4中滤膜的孔径为0.15μm～0.35μm，所述灭菌水为无酶无菌水。
62.具体的，病毒样本核酸保存液室温保存病毒样本核酸稳定的时限为5～8天。
63.配制0.6mol/l的柠檬酸钠溶液：将206.87g二水合柠檬酸三钠加入190ml无酶无菌
水溶解，调整溶液ph值≥6，再加无酶无菌水定容至1l，得到0.7mol/l的柠檬酸钠溶液，放入贴好标签，2～10℃保存；
64.配制8wt％十二烷基肌氨酸钠溶液：将80g十二烷基肌氨酸钠加入无酶无菌水中溶解，定容到1l，得到8wt％的十二烷基肌氨酸钠溶液，放入贴好标签，3～9℃保存；
65.配制ph＝4.0的hac-naac缓冲液：配制2.0mol/l醋酸钠溶液：将299.37g三水醋酸钠加入无酶无菌水中溶解，定容到1l，得到 2.0mol/l的醋酸钠溶液；
66.配制2.0mol/l醋酸溶液：将118ml冰醋酸加入无酶无菌水中溶解，定容到1l，得到2.0mol/l的醋酸溶液；将9ml2.0mol/l的醋酸钠溶液与41ml，2.0mol/l的醋酸溶液混合，搅拌均匀得到ph＝4.0 的hac-naac缓冲液；
67.配制异硫氰酸胍和二茂铁－谷胱甘肽的混合溶液：将190g异硫氰酸胍和30mg二茂铁－谷胱甘肽加入800ml无酶无菌水中溶解，得到异硫氰酸胍和二茂铁－谷胱甘肽的混合溶液；
68.实施例一
69.将11ml含量为1.5g/l的柠檬酸钠溶液加入上述异硫氰酸胍和二茂铁－谷胱甘肽的混合溶液中混匀，再加入20ml含量为1g/l的十二烷基肌氨酸钠溶液混匀；再加入55mlph＝3.0的hac-naac缓冲液混匀，加入甲基红，用无酶无菌水定容至1l并进行过滤将过滤后的溶液置于120℃灭菌35min，得到灭活型病毒保存液。
70.实施例二
71.将5ml含量为4g/l的柠檬酸钠溶液加入上述异硫氰酸胍和二茂铁－谷胱甘肽的混合溶液中混匀，再加入15ml含量为2.5g/l的十二烷基肌氨酸钠溶液混匀；再加入45mlph＝5.0的hac-naac缓冲液混匀，加入甲基红，用无酶无菌水定容至1l并进行过滤将过滤后的溶液置于130℃灭菌30min，得到灭活型病毒保存液。
72.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。