一种用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组及其试剂盒的制作方法

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组及其试剂盒。


背景技术：

2.噪声性耳聋是由于暴露于工业、军事和娱乐等噪声环境下所致的一种获得性进行性感音神经性听力损伤，早期表现为听觉疲劳，离开噪声环境后可以逐渐恢复，久之则难以恢复，最终导致感音神经性聋。噪声性耳聋是全球普遍发生的一种职业病，严重影响公众健康。目前普遍认为，噪声性耳聋是环境-遗传交互的结果，暴露在相同噪声环境，个体听力损伤发生或危害程度不尽相同，提示个体遗传易感性对噪声性耳聋起着重要影响，而遗传易感性主要取决于个体遗传易感基因。噪声性耳聋易感性基因主要集中在氧化应激类基因、单基因耳聋基因、钾离子循环通道基因、热休克蛋白、钙黏蛋白通路基因、notch信号通路基因以及凋亡信号通路基因。
3.对于致病/易感基因的检测，可以通过逐一设计引物、pcr扩增、sanger测序并与标准序列比对的方法进行，费时费力且费用高，对遗传咨询及许多相关问题的解决造成了巨大的障碍。
4.高通量测序技术具有快速、准确、低成本的有点，科同时对多个基因的各种类型突变进行检测，已经被广泛应用于遗传缺陷的病因检测和分子遗传学诊断，然而目前市场上尚无专门针对噪音性耳聋的易感基因检测的高通量探针、芯片或试剂盒，使得相关领域从业者缺乏有效的防控意识，给患者和其家庭带来沉重的心理和经济负担。
5.综上，开发一种高效、准确、快速的噪声性耳聋相关基因检测试剂盒，用于易感基因筛查，在噪音相关职业人员筛选、职业防护等方面，意义重大。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组及其试剂盒，该探针组及其试剂盒针对52个噪音相关性耳聋基因，针对每个基因设计特异性捕获探针，进行外显子富集，可用于噪音性耳聋的预防与诊断，应用于相关产业工作人员的遴选以及噪音性耳聋的判定。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组，所述探针组包括能够同时特异性捕获以下52个噪声相关性耳聋易感基因的探针：casp9、gjb4、kcnq4、itga8、pcdh15、cdh23、kcnq1、cat、casp4、casp1、hotair、gjb2、apex1、xylt1、dnmt1、casp14、dnmt3a、gabpa(也称为nrf2)、sod1、grm7、atp2b2、casp3、pou4f3、hspa1a、hspa1b、gstt1、foxo3、eya4、sod2、gsdme(也称为dfna5)、pon2、grhl2、notch1、gjb1、kcne1、gstp1、hspa1l、casp5、casp6、casp8、casp10、kcnma1、myh14、ogg1、il6、wfs1、clcnkb、il1b、il4r、xpo5、gstm1、kcnj10。
8.7个氧化应激通路基因：cat、gstt1、pon2、sod1、gstm1、gstp1、sod2；
9.持续强噪音刺激可致内耳缺血、缺氧，抗氧化酶及自由基清除剂活性降低，产生氧化损伤信号，此时机体内氧化和抗氧化体系统平衡失调，引起氧化应激并产生大量活性氧(reactive oxygen species，ros)，而ros及其产物具有极强的破坏分子内部连接的作用，可损伤耳蜗细胞或组织，导致听力损失。
10.7个钾离子循环通路基因：gjb1、gjb2、gjb4、kcne1、kcnq1、kcnq4、kcnj10；
11.耳蜗内淋巴液中富含钾离子，参与维持内淋巴的高电位，转运大多数钠离子，以及毛细胞电转导时在细胞顶部发生去极化。钾离子循环通路异常，可导致内拎包电位异常，导致耳聋。
12.3个热休克蛋白通路基因：hspa1a、hspa1b、hspa1l；
13.热休克蛋白是一类功能相关性蛋白，生理应激噪声等刺激均可引起其在内耳等部位过表达。
14.2个钙黏蛋白通路基因：cdh23、pcdh15；
15.钙粘蛋白是一种钙离子依赖的细胞粘着糖蛋白，对胚胎发育的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官的构成具有重要作用。两者基因表达的多态性均与nihl易感性密切相关。
16.9个凋亡信号通路基因：casp1、casp3、casp4、casp9、casp14、casp5、casp6、casp8、casp10；
17.含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶，与细胞凋亡形态学特征变化密切相关，并参与细胞的生长分化。噪声暴露可以加速内耳中caspase蛋白酶的表达从而加剧细胞凋亡。
18.1个notch信号通路基因：notch1；
19.notch信号高度保守，可参与细胞增殖、分化等多项生命活动，并维持内环境动态平衡。噪声性耳聋发生后耳蜗感觉毛细胞大量损伤或者死亡，且无法再生。
20.23个nihl相关单基因：kcnma1、myh14、ogg1、il6、wfs1、clcnkb、il1b、il4r、xpo5、apex1、gsdme(dfna5)、dnmt1、dnmt3a、eya4、foxo3、grhl2、itga8、pou4f3、grm7、hotair、atp2b2、xylt1和gabpa(nrf2)。
21.优选地，捕获casp9基因的探针组包含9个寡核苷酸探针，所述9个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.1-9所示；
22.捕获gjb4基因的探针组包含35个寡核苷酸探针，所述35个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.10-44所示；
23.捕获kcnq4基因的探针组包含4个寡核苷酸探针，所述4个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.45-48所示；
24.捕获itga8基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.49-50所示；
25.捕获pcdh15基因的探针组包含48个寡核苷酸探针，所述48个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.51-98所示；
26.捕获cdh23基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.99-100所示；
27.捕获kcnq1基因的探针组包含50个寡核苷酸探针，所述50个寡核苷酸探针的碱基
序列如seq id no.101-150所示；
28.捕获cat基因的探针组包含42个寡核苷酸探针，所述42个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.151-192所示；
29.捕获casp4基因的探针组包含14个寡核苷酸探针，所述14个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.193-206所示；
30.捕获casp1基因的探针组包含5个寡核苷酸探针，所述5个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.207-211所示；
31.捕获hotair基因的探针组包含6个寡核苷酸探针，所述6个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.212-217所示；
32.捕获gjb2基因的探针组包含34个寡核苷酸探针，所述34个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.218-251所示；
33.捕获apex1基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.252-253所示；
34.捕获xylt1基因的探针组包含39个寡核苷酸探针，所述39个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.254-292所示；
35.捕获dnmt1基因的探针组包含8个寡核苷酸探针，所述8个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.293-300所示；
36.捕获casp14基因的探针组包含10个寡核苷酸探针，所述10个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.301-310所示；
37.捕获myh14基因的探针组包含8个寡核苷酸探针，所述8个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.311-318所示；
38.捕获dnmt3a基因的探针组包含7个寡核苷酸探针，所述7个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.319-325所示；
39.捕获gabpa(nrf2)基因的探针组包含13个寡核苷酸探针，所述13个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.326-338所示；
40.捕获sod1基因的探针组包含20个寡核苷酸探针，所述20个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.339-358所示；
41.捕获grm7基因的探针组包含28个寡核苷酸探针，所述28个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.359-386所示；
42.捕获atp2b2基因的探针组包含16个寡核苷酸探针，所述16个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.387-402所示；
43.捕获casp3基因的探针组包含4个寡核苷酸探针，所述4个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.403-406所示；
44.捕获pou4f3基因的探针组包含4个寡核苷酸探针，所述4个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.407-410所示；
45.捕获hspa1a基因的探针组包含79个寡核苷酸探针，所述79个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.411-489所示；
46.捕获hspa1b基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.490-491所示；
47.捕获gstt1基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.492-493所示；
48.捕获foxo3基因的探针组包含9个寡核苷酸探针，所述9个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.494-502所示；
49.捕获eya4基因的探针组包含27个寡核苷酸探针，所述27个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.503-529所示；
50.捕获sod2基因的探针组包含20个寡核苷酸探针，所述20个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.530-549所示；
51.捕获gsdme(dfna5)基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.550-551所示；
52.捕获pon2基因的探针组包含28个寡核苷酸探针，所述28个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.552-579所示；
53.捕获grhl2基因的探针组包含40个寡核苷酸探针，所述40个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.580-619所示；
54.捕获notch1基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.620-621所示；
55.捕获gjb1基因的探针组包含7个寡核苷酸探针，所述7个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.622-628所示；
56.捕获kcne1基因的探针组包含14个寡核苷酸探针，所述14个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.629-642所示；
57.捕获gstp1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.643所示；
58.捕获hspa1l基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.644所示；
59.捕获casp5基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.645所示；
60.捕获casp6基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.646所示；
61.捕获casp8基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.647所示；
62.捕获casp10基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.648所示；
63.捕获kcnma1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.649所示；
64.捕获myh14基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.650所示；
65.捕获ogg1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.651所示；
66.捕获il6基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列
如seq id no.652所示；
67.捕获wfs1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.653所示；
68.捕获clcnkb基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.654所示；
69.捕获il1b基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.655所示；
70.捕获il4r基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.656所示；
71.捕获xpo5基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.657所示；
72.捕获gstm1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.658所示；
73.捕获kcnj10基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.659所示。
74.本发明还提供了上述的用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组的试剂盒，所述试剂盒包括：
75.(1)用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组；
76.(2)富集缓冲液，所述富集缓冲液中含有引物、人cot-1dna、鲑鱼dna；
77.(3)杂交缓冲液，所述杂交缓冲液中含有sspe缓冲液、denhardt溶液、edta和sds；
78.所述杂交缓冲液由以下用量的原料组成：5倍浓度的sspe缓冲液、5倍浓度的denhardt溶液、5mm edta、0.1％sds；
79.(4)结合缓冲液，所述结合缓冲液中含有nacl，tris-hcl，edta；
80.1倍浓度的结合缓冲液由以下用量的原料组成：1m nacl、10mm tris-hcl(ph7.5)、1mm edta；
81.(5)漂洗液1，所述漂洗液1中含有ssc和sds；
82.所述漂洗液1由以下用量的原料组成：1倍浓度的sss、0.1％sds；
83.(6)漂洗液2，所述漂洗液2中含有ssc和sds；
84.所述漂洗液1由以下用量的原料组成：1倍浓度的sss、0.1％sds；
85.1倍浓度的sss配制方法为：nacl 175g，柠檬酸三钠88g，调ph至7.4，dh2o定容至1升；
86.(7)naoh溶液；所述naoh溶液的浓度为0.1m；
87.(8)tris-hcl缓冲液，ph 7.5；
88.(9)pcr反应液，所述pcr反应液中含有dntps，引物(正向引物p5的核苷酸序列为aatgatacggcgaccaccga*g；反向引物p7的核苷酸序列为caagcagaagacggcatacg*a；*表示中间有硫代修饰)，phusion缓冲液，hotstart phusion酶，dmso，dh2o；
89.所述pcr反应液由以下用量的原料组成：2μl dntps(每种10mm)，0.5μl引物，20μl 5倍浓度的phusion缓冲液，1μl hotstart phusion酶，5μl dmso，51μl dh2o；
90.(10)te缓冲液；
91.所述te缓冲液由以下用量的原料制成：10mm tris-hcl，1mm edta，调ph至8.0，水定容至500ml。
92.所用的常规试剂：20倍浓度的sspe缓冲液，购自amresco公司；50倍浓度的denhardt溶液，购自usb公司；edta溶液：0.5m，ph8.0，购自mediatech公司；5倍浓度的phusion缓冲液，购自new england biolab公司；hotstart phusion酶，购自new england biolabs公司。
93.本发明与现有技术相比具有以下优点：
94.本发明针对52个噪音相关性耳聋基因，针对每个基因设计特异性捕获探针，进行外显子富集，可用于噪音性耳聋的预防与诊断，应用于相关产业工作人员的遴选以及噪音性耳聋的判定。本发明是用二代测序的方法，通量高；性价比高，可进行大规模平行测序。
95.下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
96.实施例1
97.本实施例的用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组，所述探针组包括能够同时特异性捕获以下52个噪音相关性耳聋基因的探针：casp9、gjb4、kcnq4、itga8、pcdh15、cdh23、kcnq1、cat、casp4、casp1、hotair、gjb2、apex1、xylt1、dnmt1、casp14、dnmt3a、gabpa(也称为nrf2)、sod1、grm7、atp2b2、casp3、pou4f3、hspa1a、hspa1b、gstt1、foxo3、eya4、sod2、gsdme(也称为dfna5)、pon2、grhl2、notch1、gjb1、kcne1、gstp1、hspa1l、casp5、casp6、casp8、casp10、kcnma1、myh14、ogg1、il6、wfs1、clcnkb、il1b、il4r、xpo5、gstm1、kcnj10。
98.7个氧化应激通路基因：cat、gstt1、pon2、sod1、gstm1、gstp1、sod2；
99.持续强噪音刺激可致内耳缺血、缺氧，抗氧化酶及自由基清除剂活性降低，产生氧化损伤信号，此时机体内氧化和抗氧化体系统平衡失调，引起氧化应激并产生大量活性氧(reactive oxygen species，ros)，而ros及其产物具有极强的破坏分子内部连接的作用，可损伤耳蜗细胞或组织，导致听力损失。
100.7个钾离子循环通路基因：gjb1、gjb2、gjb4、kcne1、kcnq1、kcnq4、kcnj10；
101.耳蜗内淋巴液中富含钾离子，参与维持内淋巴的高电位，转运大多数钠离子，以及毛细胞电转导时在细胞顶部发生去极化。钾离子循环通路异常，可导致内拎包电位异常，导致耳聋。
102.3个热休克蛋白通路基因：hspa1a、hspa1b、hspa1l；
103.热休克蛋白是一类功能相关性蛋白，生理应激噪声等刺激均可引起其在内耳等部位过表达。
104.2个钙黏蛋白通路基因：cdh23、pcdh15；
105.钙粘蛋白是一种钙离子依赖的细胞粘着糖蛋白，对胚胎发育的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官的构成具有重要作用。两者基因表达的多态性均与nihl易感性密切相关。
106.9个凋亡信号通路基因：casp1、casp3、casp4、casp9、casp14、casp5、casp6、casp8、casp10；
107.含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)是一组存在于细胞质中具有类似结
构的蛋白酶，与细胞凋亡形态学特征变化密切相关，并参与细胞的生长分化。噪声暴露可以加速内耳中caspase蛋白酶的表达从而加剧细胞凋亡。
108.1个notch信号通路基因：notch1；
109.notch信号高度保守，可参与细胞增殖、分化等多项生命活动，并维持内环境动态平衡。噪声性耳聋发生后耳蜗感觉毛细胞大量损伤或者死亡，且无法再生。
110.23个nihl相关单基因：kcnma1、myh14、ogg1、il6、wfs1、clcnkb、il1b、il4r、xpo5、apex1、gsdme(dfna5)、dnmt1、dnmt3a、eya4、foxo3、grhl2、itga8、pou4f3、grm7、hotair、atp2b2、xylt1和gabpa(nrf2)；
111.捕获casp9基因的探针组包含9个寡核苷酸探针，所述9个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.1-9所示；
112.捕获gjb4基因的探针组包含35个寡核苷酸探针，所述35个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.10-44所示；
113.捕获kcnq4基因的探针组包含4个寡核苷酸探针，所述4个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.45-48所示；
114.捕获itga8基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.49-50所示；
115.捕获pcdh15基因的探针组包含48个寡核苷酸探针，所述48个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.51-98所示；
116.捕获cdh23基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.99-100所示；
117.捕获kcnq1基因的探针组包含50个寡核苷酸探针，所述50个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.101-150所示；
118.捕获cat基因的探针组包含42个寡核苷酸探针，所述42个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.151-192所示；
119.捕获casp4基因的探针组包含14个寡核苷酸探针，所述14个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.193-206所示；
120.捕获casp1基因的探针组包含5个寡核苷酸探针，所述5个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.207-211所示；
121.捕获hotair基因的探针组包含6个寡核苷酸探针，所述6个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.212-217所示；
122.捕获gjb2基因的探针组包含34个寡核苷酸探针，所述34个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.218-251所示；
123.捕获apex1基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.252-253所示；
124.捕获xylt1基因的探针组包含39个寡核苷酸探针，所述39个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.254-292所示；
125.捕获dnmt1基因的探针组包含8个寡核苷酸探针，所述8个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.293-300所示；
126.捕获casp14基因的探针组包含10个寡核苷酸探针，所述10个寡核苷酸探针的碱基
序列如seq id no.301-310所示；
127.捕获myh14基因的探针组包含8个寡核苷酸探针，所述8个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.311-318所示；
128.捕获dnmt3a基因的探针组包含7个寡核苷酸探针，所述7个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.319-325所示；
129.捕获gabpa(nrf2)基因的探针组包含13个寡核苷酸探针，所述13个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.326-338所示；
130.捕获sod1基因的探针组包含20个寡核苷酸探针，所述20个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.339-358所示；
131.捕获grm7基因的探针组包含28个寡核苷酸探针，所述28个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.359-386所示；
132.捕获atp2b2基因的探针组包含16个寡核苷酸探针，所述16个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.387-402所示；
133.捕获casp3基因的探针组包含4个寡核苷酸探针，所述4个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.403-406所示；
134.捕获pou4f3基因的探针组包含4个寡核苷酸探针，所述4个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.407-410所示；
135.捕获hspa1a基因的探针组包含79个寡核苷酸探针，所述79个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.411-489所示；
136.捕获hspa1b基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.490-491所示；
137.捕获gstt1基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.492-493所示；
138.捕获foxo3基因的探针组包含9个寡核苷酸探针，所述9个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.494-502所示；
139.捕获eya4基因的探针组包含27个寡核苷酸探针，所述27个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.503-529所示；
140.捕获sod2基因的探针组包含20个寡核苷酸探针，所述20个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.530-549所示；
141.捕获gsdme(dfna5)基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.550-551所示；
142.捕获pon2基因的探针组包含28个寡核苷酸探针，所述28个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.552-579所示；
143.捕获grhl2基因的探针组包含40个寡核苷酸探针，所述40个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.580-619所示；
144.捕获notch1基因的探针组包含2个寡核苷酸探针，所述2个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.620-621所示；
145.捕获gjb1基因的探针组包含7个寡核苷酸探针，所述7个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.622-628所示；
146.捕获kcne1基因的探针组包含14个寡核苷酸探针，所述14个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.629-642所示；
147.捕获gstp1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.643所示；
148.捕获hspa1l基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.644所示；
149.捕获casp5基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.645所示；
150.捕获casp6基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.646所示；
151.捕获casp8基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.647所示；
152.捕获casp10基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.648所示；
153.捕获kcnma1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.649所示；
154.捕获myh14基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.650所示；
155.捕获ogg1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.651所示；
156.捕获il6基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.652所示；
157.捕获wfs1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.653所示；
158.捕获clcnkb基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.654所示；
159.捕获il1b基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.655所示；
160.捕获il4r基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.656所示；
161.捕获xpo5基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.657所示；
162.捕获gstm1基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.658所示；
163.捕获kcnj10基因的探针组包含1个寡核苷酸探针，所述1个寡核苷酸探针的碱基序列如seq id no.659所示。
164.本实施例中的用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组的制备方法为：
165.pcr扩增体系：本实施例的用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组溶液5μl；正向引物(25um)2μl(正向引物的核苷酸序列为aatgatacggcgaccaccga*g，*表示中间有硫代修
biolabs公司。
188.所述用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组的试剂盒的使用方法为：
189.s1、dna提取及全基因组文库制备：
190.使用qiagen dna mini kit(250)(购自qiagen)试剂盒提取外周血中的dna，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳检测样本质量，完整的基因组dna电泳条带通常应不小于20kb，质检合格的dna将浓度调整到75ng/μl，总量3-5μg dna随机打断、扩增，从而建立全基因组文库。
191.s2、目标致病/易感基因片段的特异性捕获及测序
192.s201、制备以下混合体系：取1μg s1的构建好的全基因组文库、13μl富集缓冲液、实施例1的用于检测噪音相关性耳聋基因的探针溶液组5μl；置于pcr仪上：95℃，7min，之后65℃，2min，得到混合体系；
193.s202、取65℃预热的杂交缓冲液23μl加入到s201中得到的混合体系,然后于pcr仪上65℃杂交22小时，得到富集体系混合物；
194.s203、将myone c1链霉亲和素磁珠(购自invitrogen)漩涡震荡使磁珠充分悬浮，短暂离心，使磁珠离心至管底部，取50μl myone c1链霉亲和素磁珠到新的1.5ml的离心管；
195.s204、将装有50μlmyone c1链霉亲和素磁珠的1.5ml离心管漩涡震荡至少5s，使磁珠充分悬浮，短暂离心后放入磁力架上保持静止一分钟(不要旋转离心管)，小心吸弃上清；
196.s205、取下离心管，加入50μl的1倍浓度的结合缓冲液，旋窝震荡5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，小心吸弃上清，重复三次；
197.s206、取下离心管，加入100μl的2倍浓度的结合缓冲液，旋窝震荡5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟；
198.s207、将s202中得到的富集体系混合物加入到s206中的离心管中，旋窝震荡至少5s(不用离心)，置于旋转仪上室温以60转/分钟速率旋转1小时；
199.s208、利用漂洗液1室温清洗步骤s207中的myone c1链霉亲和素磁珠一次，15分钟，然后再用漂洗液2清洗3次，65℃，每次15分钟。
200.s209、将s208中的myone c1链霉亲和素磁珠用0.1m naoh溶液室温下洗脱10分钟，然后将洗脱液漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，然后将上清液转移到含有70μl tris-hcl缓冲液(1m，ph 7.5)的干净离心管中，得到dna溶液；
201.s210、采用qiagen minelute column(购自qiagen)对s209中得到的dna溶液进行纯化，其纯化步骤参照qiagen minelute kit的实验操作手册；
202.s211、将s210中纯化后的的dna加入pcr反应液，进行pcr扩增，得到pcr产物；
203.所述pcr反应液由以下用量的原料组成：2μl dntps(每种10mm)，0.5μl引物1(aatgatacggcgaccaccga*g，50pmol)，0.5μl引物2(caagcagaagacggcatacg*a，50pmol)，20μl 5倍浓度的phusion缓冲液，1μl hotstart phusion酶，5μl dmso，51μl dh2o；*表示中间有硫代修饰；
204.pcr扩增程序为:98℃、30s(1cycle)；98℃、25s，65℃、30s，72℃、30s(15cycles)；72℃、5min(1cycle)；
205.s212、利用agencourt ampure xp核酸纯化试剂盒(购自beckman coulter)，根据使用手册纯化s211中得到的pcr产物，得到dna产物；
206.s213、将步骤s212得到的dna产物在illumina nexseq 500测序仪上进行测序。
207.实施例3
208.本实施例为本发明探针组及试剂盒的使用效果验证：
209.利用本发明所述试剂盒检测10例样本，结果证实易感基因的捕获率满意，97.7％以上的原始短序列都能被比对回目标区域的参考序列，目标区域的平均有效测序数据量达到520.98mb，目标区域的平均测序深度为271x(见表1)，远远高于一般的遗传疾病诊断要求(一般为20x)。
210.表1易感基因测序数据质量
[0211][0212]
实施例4
[0213]
本实施例为本发明探针组及试剂盒的临床诊断实例：
[0214]
收集10例有噪声接触史引起听力下降的感音神经性耳聋患者，利用本发明试剂盒进行基因筛查。结果总结如表2。
[0215]
表2有噪声接触史引起听力下降的感音神经性耳聋患者的基因筛查
[0216][0217]
注：
“‑”
代表使用本发明没有检出有意义的变异位点。
[0218]
综上所述，本发明提供的用于检测噪音性耳聋易感基因的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，可以同时最多检测、明确52个易感基因的各种类型突变，因此本发明的探针组和试剂盒可应用于相关行业从业者的筛选，同时可对高危人群给予职业防护建议。本发明的使用可以尽早发现噪音性耳聋敏感个体，为患者采取正确、合理的干预、治疗措施提供依据，符合精准医疗的发展趋势。
[0219]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。