水稻株型的分子标记及其应用

1.本发明涉及水稻株型的分子标记及其应用。具体涉及水稻株型的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.水稻株型是决定水稻产量的重要因素之一，植株的高矮、叶子的宽窄、穗的形状、分蘖角度等都决定了水稻的株型，水稻株型也是水稻育种的目标之一。
3.水稻叶片是光合作用的主要器官，因而其大小和形状对于产量影响很大。nal1基因调控水稻叶的大小，其突变后叶片变窄，说明此基因在叶片的横向生长中发挥重要作用；同时其突变体的节间变短，叶脉数目维管束的数目减少，植株矮化，节间细胞数目减少。进一步研究发现，此基因在维管组织中高表达，与野生型相比，突变体中的数目和排列方式发生了改变，维管组织系统发育不良。说明维nal1调节管束排列模式，在叶片的横向生长中发挥重要作用；nal1突变体的节间细胞数目减少，节间变短，株高矮化，说明nal1还影响水稻节间细胞分裂(qi et al,2008fujita et al,2013)。
4.株型的紧凑与松散限制了种植的密度，控制这一性状的主效基因为tac1基因。此基因由四个内含子和5个外显子组成，编码259个氨基酸。主要的变化是tac1内含子的3'拼接点处由"agga"突变为"ggga"，使此内含子不能正常的被剪辑，poly(a)提前加上了，结果造成tac1与tac1 cdna编码相同的氨基酸序列，但3'非翻译区却完全不同。这些变化使tac1的mrna的稳定性降低，从而分蘖角度变小(yu et al,2007；jiang et al,2012)。
5.成熟时水稻穗型也是重要农艺性状之一，dep1是我国科学家鉴定的一个直立穗基因，它编码与磷脂酰乙醇胺结合蛋白的蛋白。dep1突变能够调控细胞分裂，使枝梗叔增加、穗粒数增加，从而增加水稻产量。进一步研究表明，目前我国种植的水稻品种中，许多都含有dep1的突变基因型，表明dep1已经在我国的水稻育种中发挥了重要作用(huang et al.,2009)。除此之外，dep1还与氮吸收有关，直立穗的基因型氮不敏感，也就是多用氮肥不能让植株快速营养生长，造成徒长(sun et al.2014)。
6.针对上述基因的分子标记尚无报道，因此本领域仍需找到鉴别上述基因的基因型的分子标记，从而能在早期快速锁定水稻基因型，加速选育优良水稻品种的育种速度。


技术实现要素：

7.本发明提出了一种与水稻株型相关、能够有效用于水稻株型检测的snp标记，利用该snp标记设计高效灵敏的水稻株型特异性引物和探针，对样本dna进行检测，从而实现对水稻株型判断，有效地解决了快速选育后代水稻的难题。
8.本发明第一方面中，提供一种分离的来自水稻nal1基因的核酸分子，其含有第一snp标记，其中第一snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:1和2作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第124位核苷酸，其为a或c。
9.在一个或多个实施方案中，所述核酸分子是水稻nal1基因的长度至少5bp的片段。
在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度至少10bp、15bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1kb。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度为10bp-600bp、50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
10.在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列包括seq id no:3所示的序列。
11.本发明第一方面中还提供用于检测水稻基因组中的第一snp标记的引物，其中，第一snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:1和2作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第124位核苷酸，其为a或c。
12.在一个或多个实施方案中，所述引物能扩增出由seq id no:1和2作为引物扩增得到的序列或其片段，所述片段包含seq id no:3自5’末端起第124位核苷酸。
13.在一个或多个实施方案中，所述引物的扩增产物包含由seq id no:1和2作为引物扩增得到的序列或其片段，所述片段包含seq id no:3自5’末端起第124位核苷酸。
14.在一个或多个实施方案中，所述引物的扩增产物包含seq id no:3或其片段，所述片段包含seq id no:3自5’末端起第124位核苷酸。
15.在一个或多个实施方案中，所述引物在严谨条件下与seq id no:3杂交。
16.在一个或多个实施方案中，所述引物选自：(1)seq id no:1和2所示的序列或在严谨条件下与seq id no:3杂交的序列，(2)与(1)有至少90％相同性的序列；和(3)(1)和(2)所述序列的混合物。
17.本发明第一方面中还提供用于检测水稻基因组第一snp标记的探针，其中，其中，第一snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:1和2作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第124位核苷酸，其为a或c。
18.在一个或多个实施方案中，探针包括
19.(1)识别seq id no:3或其片段的探针，所述片段包含seq id no:3自5’端起第124位碱基，和/或
20.(2)(1)的互补序列。
21.在一个或多个实施方案中，探针包括：
22.(a1)识别seq id no:3或其片段的探针，所述片段包含seq id no:3自5’端起第124位碱基，所述第124位碱基是a，和/或
23.(a2)(a1)的互补序列。
24.在一个或多个实施方案中，探针还包括：
25.(b1)识别seq id no:3或其片段的探针，所述片段包含seq id no:3自5’端起第124位碱基，所述第124位碱基是c，和/或
26.(b2)(b1)的互补序列。
27.本发明第一方面中还提供一种试剂盒，其含有用于检测水稻基因组中的第一snp标记的试剂，第一snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:1和2作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第124位核苷酸，其为a或c。
28.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含
29.(1)检测第一snp标记的引物，和
30.任选的(2)检测第一snp标记的探针，和
31.任选的(3)具有第一snp标记的核酸分子。
32.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：本文第一方面中任一实施方案所述的引物，任选的本文第一方面中任一实施方案所述的探针和任选的本文第一方面中任一实施方案所述的核酸分子。
33.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：
34.(i)(1)seq id no:1和2所示的序列或在严谨条件下与seq id no:3杂交的序列，(2)与(1)有至少90％相同性的序列；和(3)(1)和(2)所述序列的混合物，和
35.任选的(ii)(a1)识别seq id no:3或其片段的探针，所述片段包含seq id no:3自5’端起第124位碱基，所述第124位碱基是a，和/或(a2)(a1)的互补序列；和任选的(b1)识别seq id no:3或其片段的探针，所述片段包含seq id no:3自5’端起第124位碱基，所述第124位碱基是c，和/或(b2)(b1)的互补序列，和
36.任选的(iii)包括seq id no:3所示序列的核酸分子。
37.本发明第一方面还提供鉴定水稻株型或nal1基因型的方法，所述株型是叶的宽窄，所述方法包括，
38.(1)检测水稻基因组中的第一snp标记，其中，第一snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:1和2作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第124位核苷酸，
39.(2)根据所述第一snp标记鉴定水稻株型，其中，第一snp标记为aa则鉴定为窄叶，第一snp标记为cc则鉴定为宽叶，第一snp标记为ac则鉴定为杂合株型。
40.在一个或多个实施方案中，所述检测包含pcr，更优选地，所述检测是荧光定量pcr、hrm检测或测序。
41.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的检测包括使用seq id no:1和2作为引物对水稻基因组进行pcr扩增。
42.本发明第一方面还提供一种选育水稻的方法，所述方法包括，
43.(1)检测水稻基因组中的第一snp标记，其中，第一snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:1和2作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第124位核苷酸，
44.(2)根据所述第一snp标记鉴定水稻株型，其中，
45.若第一snp标记为aa则获得窄叶水稻，
46.若第一snp标记为cc则获得宽叶水稻，
47.若第一snp标记为ac则获得杂合株型并进行步骤(3)，
48.任选的(3)将杂合株型进行自交并对后代水稻进行步骤(1)和(2)以获取第一snp标记为aa(窄叶)或cc(宽叶)的水稻。
49.在一个或多个实施方案中，所述扩增是荧光定量pcr、hrm检测或测序。
50.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的检测包括使用seq id no:1和2作为引物对水稻基因组进行pcr扩增。
51.本发明第一方面还提供检测水稻基因组中的第一snp标记的试剂在鉴定水稻株型、鉴定nal1基因型或选育水稻中的用途，或在制备用于鉴定水稻株型、鉴定nal1基因型或
选育水稻的试剂盒中的用途，其中，第一snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:1和2作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第124位核苷酸。
52.在一个或多个实施方案中，所述第124位核苷酸为a或c。
53.在一个或多个实施方案中，所述试剂包含本文第一方面中任一实施方案所述的引物和任选的本文第一方面中任一实施方案所述的探针和任选的本文第一方面中任一实施方案所述的核酸分子。
54.在一个或多个实施方案中，根据检测到的第一snp标记鉴定水稻株型或选育水稻，其中，窄叶水稻的第一snp标记为aa，宽叶水稻的第一snp标记为cc。
55.本发明第二方面中，提供一种分离的来自水稻tac1基因的核酸分子，其含有第二snp标记，其中第二snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:4和5作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第179位核苷酸，其为a或g。
56.在一个或多个实施方案中，所述核酸分子是水稻tac1基因的长度至少5bp的片段。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度至少10bp、15bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1kb。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度为10bp-600bp、50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
57.在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列包括seq id no:6所示的序列。
58.本发明第二方面中还提供用于检测水稻基因组中的第二snp标记的引物，其中，第二snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:4和5作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第179位核苷酸，其为a或g。
59.在一个或多个实施方案中，所述引物能扩增出由seq id no:4和5作为引物扩增得到的序列或其片段，所述片段包含seq id no:6自5’末端起第179位核苷酸。
60.在一个或多个实施方案中，所述引物的扩增产物包含由seq id no:4和5作为引物扩增得到的序列或其片段，所述片段包含seq id no:6自5’末端起第179位核苷酸。
61.在一个或多个实施方案中，所述引物的扩增产物包含seq id no:6或其片段，所述片段包含seq id no:6自5’末端起第179位核苷酸。
62.在一个或多个实施方案中，所述引物在严谨条件下与seq id no:6杂交。
63.在一个或多个实施方案中，所述引物选自：(1)seq id no:4和5所示的序列或在严谨条件下与seq id no:6杂交的序列，(2)与(1)有至少90％相同性的序列；和(3)(1)和(2)所述序列的混合物。
64.本发明第二方面中还提供用于检测水稻基因组第二snp标记的探针，其中，其中，第二snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:4和5作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第179位核苷酸，其为a或g。
65.在一个或多个实施方案中，探针包括
66.(1)识别seq id no:6或其片段的探针，所述片段包含seq id no:6自5’端起第179位碱基，和/或
67.(2)(1)的互补序列。
68.在一个或多个实施方案中，探针包括：
69.(a1)识别seq id no:6或其片段的探针，所述片段包含seq id no:6自5’端起第179位碱基，所述第179位碱基是a，和/或
70.(a2)(a1)的互补序列。
71.在一个或多个实施方案中，探针还包括：
72.(b1)识别seq id no:6或其片段的探针，所述片段包含seq id no:6自5’端起第179位碱基，所述第179位碱基是g，和/或
73.(b2)(b1)的互补序列。
74.本发明第二方面中还提供一种检测水稻株型或鉴定tac1基因型的试剂盒，其含有用于检测水稻基因组中的第二snp标记的试剂，第二snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:4和5作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第179位核苷酸，其为a或g。所述水稻株型是分蘖角度大小。
75.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含
76.(1)检测第二snp标记的引物，和
77.任选的(2)检测第二snp标记的探针，和
78.任选的(3)具有第二snp标记的核酸分子。
79.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：本文第二方面中任一实施方案所述的引物，任选的本文第二方面中任一实施方案所述的探针和任选的本文第二方面中任一实施方案所述的核酸分子。
80.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：
81.(i)(1)seq id no:4和5所示的序列或在严谨条件下与seq id no:6杂交的序列，(2)与(1)有至少90％相同性的序列；和(3)(1)和(2)所述序列的混合物，和
82.任选的(ii)(a1)识别seq id no:6或其片段的探针，所述片段包含seq id no:6自5’端起第179位碱基，所述第179位碱基是a，和/或(a2)(a1)的互补序列；和任选的(b1)识别seq id no:6或其片段的探针，所述片段包含seq id no:6自5’端起第179位碱基，所述第179位碱基是g，和/或(b2)(b1)的互补序列，和
83.任选的(iii)包括seq id no:6所示序列的核酸分子。
84.本发明第二方面还提供鉴定水稻株型或鉴定tac1基因型的方法，所述株型是分蘖角度大小，所述方法包括，
85.(1)检测水稻基因组中的第二snp标记，其中，第二snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:4和5作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第179位核苷酸，
86.(2)根据所述第二snp标记鉴定水稻株型，其中，第二snp标记为aa则鉴定为分蘖角度大，第二snp标记为gg则鉴定为分蘖角度小，第二snp标记为ag则鉴定为杂合株型。
87.在一个或多个实施方案中，所述检测包含pcr，更优选地，所述检测是荧光定量pcr、hrm检测或测序。
88.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的检测包括使用seq id no:4和5作为引物对水稻基因组进行pcr扩增。
89.本发明第二方面还提供一种选育水稻的方法，所述方法包括，
90.(1)检测水稻基因组中的第二snp标记，其中，第二snp标记为：以水稻基因组dna为
模板，采用seq id no:4和5作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第179位核苷酸，
91.(2)根据所述第二snp标记鉴定水稻株型，其中，
92.若第二snp标记为aa则获得分蘖角度大的水稻，
93.若第二snp标记为gg则获得分蘖角度小的水稻，
94.若第二snp标记为ag则获得杂合株型并进行步骤(3)，
95.任选的(3)将杂合株型进行自交并对后代水稻进行步骤(1)和(2)以获取第二snp标记为aa(分蘖角度大)或gg(分蘖角度小)的水稻。
96.在一个或多个实施方案中，所述扩增是荧光定量pcr、hrm检测或测序。
97.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的检测包括使用seq id no:4和5作为引物对水稻基因组进行pcr扩增。
98.本发明第二方面还提供检测水稻基因组中的第二snp标记的试剂在鉴定水稻株型、鉴定tac1基因型或选育水稻中的用途，或在制备用于鉴定水稻株型、鉴定tac1基因型或选育水稻的试剂盒中的用途，其中，第二snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:4和5作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第179位核苷酸。
99.在一个或多个实施方案中，所述第179位核苷酸为a或g。
100.在一个或多个实施方案中，所述试剂包含本文第二方面中任一实施方案所述的引物和任选的本文第二方面中任一实施方案所述的探针和任选的本文第二方面中任一实施方案所述的核酸分子。
101.在一个或多个实施方案中，根据检测到的第二snp标记鉴定水稻株型或选育水稻，其中，分蘖角度大的水稻的第二snp标记为aa，分蘖角度小的水稻的第二snp标记为gg。
102.本发明第三方面中，提供一种分离的来自水稻dep1基因的核酸分子，其含有第三snp标记，其中第三snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:7和8作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第144位核苷酸，其为t或g。
103.在一个或多个实施方案中，所述核酸分子是水稻dep1基因的长度至少5bp的片段。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度至少10bp、15bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1kb。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度为10bp-600bp、50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
104.在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列包括seq id no:9所示的序列。
105.本发明第三方面中还提供用于检测水稻基因组中的第三snp标记的引物，其中，第三snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:7和8作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第144位核苷酸，其为t或g。
106.在一个或多个实施方案中，所述引物能扩增出由seq id no:7和8作为引物扩增得到的序列或其片段，所述片段包含seq id no:9自5’末端起第144位核苷酸。
107.在一个或多个实施方案中，所述引物的扩增产物包含由seq id no:7和8作为引物扩增得到的序列或其片段，所述片段包含seq id no:9自5’末端起第144位核苷酸。
108.在一个或多个实施方案中，所述引物的扩增产物包含seq id no:9或其片段，所述
片段包含seq id no:9自5’末端起第144位核苷酸。
109.在一个或多个实施方案中，所述引物在严谨条件下与seq id no:9杂交。
110.在一个或多个实施方案中，所述引物选自：(1)seq id no:7和8所示的序列或在严谨条件下与seq id no:9杂交的序列，(2)与(1)有至少90％相同性的序列；和(3)(1)和(2)所述序列的混合物。
111.本发明第三方面中还提供用于检测水稻基因组第三snp标记的探针，其中，其中，第三snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:7和8作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第144位核苷酸，其为t或g。
112.在一个或多个实施方案中，探针包括
113.(1)识别seq id no:9或其片段的探针，所述片段包含seq id no:9自5’端起第144位碱基，和/或
114.(2)(1)的互补序列。
115.在一个或多个实施方案中，探针包括：
116.(a1)识别seq id no:9或其片段的探针，所述片段包含seq id no:9自5’端起第144位碱基，所述第144位碱基是t，和/或
117.(a2)(a1)的互补序列。
118.在一个或多个实施方案中，探针还包括：
119.(b1)识别seq id no:9或其片段的探针，所述片段包含seq id no:9自5’端起第144位碱基，所述第144位碱基是g，和/或
120.(b2)(b1)的互补序列。
121.本发明第三方面中还提供一种检测水稻株型或鉴定dep1基因型的试剂盒，其含有用于检测水稻基因组中的第三snp标记的试剂，第三snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:7和8作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第144位核苷酸，其为t或g。所述水稻株型是穗型。
122.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含
123.(1)检测第三snp标记的引物，和
124.任选的(2)检测第三snp标记的探针，和
125.任选的(3)具有第三snp标记的核酸分子。
126.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：本文第三方面中任一实施方案所述的引物，任选的本文第三方面中任一实施方案所述的探针和任选的本文第三方面中任一实施方案所述的核酸分子。
127.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：
128.(i)(1)seq id no:7和8所示的序列或在严谨条件下与seq id no:9杂交的序列，(2)与(1)有至少90％相同性的序列；和(3)(1)和(2)所述序列的混合物，和
129.任选的(ii)(a1)识别seq id no:9或其片段的探针，所述片段包含seq id no:9自5’端起第144位碱基，所述第144位碱基是t，和/或(a2)(a1)的互补序列；和任选的(b1)识别seq id no:9或其片段的探针，所述片段包含seq id no:9自5’端起第144位碱基，所述第144位碱基是g，和/或(b2)(b1)的互补序列，和
130.任选的(iii)包括seq id no:9所示序列的核酸分子。
131.本发明第三方面还提供鉴定水稻株型或鉴定dep1基因型的方法，所述株型是穗型，所述方法包括，
132.(1)检测水稻基因组中的第三snp标记，其中，第三snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:7和8作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第144位核苷酸，
133.(2)根据所述第三snp标记鉴定水稻株型，其中，第三snp标记为gg则鉴定为穗下垂，第三snp标记为tt则鉴定为穗直立，第三snp标记为tg则鉴定为杂合株型。
134.在一个或多个实施方案中，所述检测包含pcr，更优选地，所述检测是荧光定量pcr、hrm检测或测序。
135.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的检测包括使用seq id no:7和8作为引物对水稻基因组进行pcr扩增。
136.本发明第三方面还提供一种选育水稻的方法，所述方法包括，
137.(1)检测水稻基因组中的第三snp标记，其中，第三snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:7和8作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第144位核苷酸，
138.(2)根据所述第三snp标记鉴定水稻株型，其中，
139.若第三snp标记为tt则获得穗直立的水稻，
140.若第三snp标记为gg则获得穗下垂的水稻，
141.若第三snp标记为tg则获得杂合株型并进行步骤(3)，
142.任选的(3)将杂合株型进行自交并对后代水稻进行步骤(1)和(2)以获取第三snp标记为tt(穗直立)或gg(穗下垂)的水稻。
143.在一个或多个实施方案中，所述扩增是荧光定量pcr、hrm检测或测序。
144.在一个或多个实施方案中，步骤(1)的检测包括使用seq id no:7和8作为引物对水稻基因组进行pcr扩增。
145.本发明第三方面还提供检测水稻基因组中的第三snp标记的试剂在鉴定水稻株型、鉴定dep1基因型或选育水稻中的用途，或在制备用于鉴定水稻株型、鉴定dep1基因型或选育水稻的试剂盒中的用途，其中，第三snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:7和8作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第144位核苷酸。
146.在一个或多个实施方案中，所述第144位核苷酸为t或g。
147.在一个或多个实施方案中，所述试剂包含本文第三方面中任一实施方案所述的引物和任选的本文第三方面中任一实施方案所述的探针和任选的本文第三方面中任一实施方案所述的核酸分子。
148.在一个或多个实施方案中，根据检测到的第三snp标记鉴定水稻株型或选育水稻，其中，穗直立水稻的第三snp标记为tt，穗下垂水稻的第三snp标记为gg。
149.本发明第四方面中还提供一种检测水稻株型的试剂盒，其含有用于检测水稻基因组中的选自第一、第二和第三snp标记中一种、两种或三种的试剂，其中，
150.第一snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:1和2作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第124位核苷酸，其为a或c，
151.第二snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:4和5作为引物进行pcr
扩增得到的扩增产物的自5’末端起第179位核苷酸，其为a或g，
152.第三snp标记为：以水稻基因组dna为模板，采用seq id no:7和8作为引物进行pcr扩增得到的扩增产物的自5’末端起第144位核苷酸，其为t或g。
153.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：
154.(1)检测选自第一、第二和第三snp标记中一种、两种或三种的引物，和
155.任选的(2)检测选自第一、第二和第三snp标记中一种、两种或三种的探针，和
156.任选的(3)具有选自第一、第二和第三snp标记中一种、两种或三种的核酸分子。
157.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：选自本文第一、第二和第三方面中任意实施方案所述的引物，任选的选自本文第一、第二和第三方面中任意实施方案所述的探针和任选的选自本文第一、第二和第三方面中任意实施方案所述的核酸分子。
具体实施方式
158.发明人通过对水稻多品种的研究，比对出水稻株型的特异序列，通过不同株型水稻的特异位点核酸序列的检测，来鉴定水稻株型、快速选育所需株型的水稻。
159.具体地，本发明涉及与水稻株型相关的snp标记，用于检测所述snp标记的引物和试剂盒，所述snp标记、引物、试剂盒在水稻株型检测中的用途，以及检测水稻株型的方法。
160.本文中，snp(single nucleotide polymorphism，snp，即单核苷酸多态性)是一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。snp表现出的多态性通常仅涉及到单个碱基的变异，例如转换、颠换、插入和缺失等。
161.发明人发现第一snp标记与水稻叶片的宽窄相关。具体地，第一snp标记是seq id no:3所示核苷酸序列自5’端起第124位碱基a或c。窄叶水稻的第一snp标记为aa，宽叶水稻的第一snp标记为cc。
162.发明人还发现第二snp标记与水稻分蘖角度相关。具体地，第二snp标记是seq id no:6所示核苷酸序列自5’端起第179位碱基a或g。分蘖角度大的水稻的第二snp标记为aa，分蘖角度小的水稻的第二snp标记为gg。
163.发明人还发现第三snp标记与水稻分蘖角度相关。具体地，第三snp标记是seq id no:9所示核苷酸序列自5’端起第144位碱基t或g。穗下垂水稻的第三snp标记为gg，穗直立水稻的第三snp标记为tt。
164.本文所述“样品”是来自对象的任意类型的含多核苷酸的样品。优选地，本文所述样品来自或包含水稻植物器官、组织、细胞、核酸或包含水稻植物器官、组织、细胞、核酸的产品，包括但不限于水稻叶片、根、茎、花、果实、种子、细胞、dna、rna、大米、碎米、米糠、稻壳、加工或未加工的大米食物例如米粉、米线。dna可以是基因组dna。
165.术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(dna)或核糖核苷酸聚合物(rna)，及其互补物。核酸含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式。本文考虑的多核苷酸的示例包括单链和双链dna，单链和双链rna，以及具有单链和双链dna和rna的混合物的杂合分子。dna可以是编码链或非编码链。在一个或多个实施方案中，所述样品包含经片段化的基因组dna。获取基因组dna并片段化的方法本领域周知。
166.dna基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。每个脱
氧核糖核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基组成。dna的碱基(bp)主要有腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)。在双链dna的双螺旋结构中，a与t经氢键配对，g与c经氢键配对。dna形式包括cdna、基因组dna、片段化dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以为任意长度，例如50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
167.本文所述“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，引导合成的一种具有特定核苷酸序列的核酸分子。引物组合物包含一种或多种引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条dna模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条dna模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(pcr)、qpcr、测序和探针合成等。引物可以为任意长度，例如5-200bp，10-100bp，20-800bp或25-50bp。
168.本发明引物用于检测snp。所述引物可以是识别seq id no:3、6、9中任一的核酸分子。示例性地，所述引物包括选自以下的一种或多种：(1)能扩增出由seq id no:1和2作为引物扩增得到的片段的引物，(2)能扩增出由seq id no:4和5作为引物扩增得到的片段的引物，(3)能扩增出由seq id no:7和8作为引物扩增得到的片段的引物。在一个或多个实施方案中，所述引物的扩增产物包含选自以下的一种或多种：(1)由seq id no:1和2作为引物扩增得到的片段，(2)由seq id no:4和5作为引物扩增得到的片段，(3)由seq id no:7和8作为引物扩增得到的片段。在一个或多个实施方案中，所述引物的扩增产物包含选自以下的一种或多种：(1)seq id no:3或其片段，所述片段包含seq id no:3自5’末端起第124位核苷酸，(2)seq id no:6或其片段，所述片段包含seq id no:6自5’末端起第179位核苷酸，(3)seq id no:9或其片段，所述片段包含seq id no:9自5’末端起第144位核苷酸。
169.在一些实施方式中，引物具有(1)seq id no:1、2、4、5、7、8中任一项所示的核苷酸序列或与之具有至少70％序列相同性的突变体，或(2)(1)的互补序列。在一个或多个实施方案中，引物是引物对，引物对分别具有seq id no:1和2所示序列或seq id no:4和5或seq id no:7和8所示序列。在讨论引物时，本文所述“识别”指引物与模板序列在严谨或高度严谨条件下杂交，并且成对引物所扩增的片段涵盖seq id no:3自5’端起第124位碱基，或涵盖seq id no:6自5’端起第179位碱基，或涵盖seq id no:9自5’端起第144位碱基。
170.本文所述核酸杂交的严谨条件本领域技术人员已知。优选地，所述条件是使得序列彼此至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％同源，通常保持彼此杂交。严谨杂交条件的非限制性实例是在含有6xssc、50mm tris-hcl(ph7.5)、1m medta、0.02％pvp、0.02％ficolll、0.02％bsa和500mg/ml变性鲑鱼精子dna的高盐缓冲剂中在65℃杂交，和任选的在0.2xssc、0.01％bsa中50℃洗涤一次或两次。
171.本发明也可采用探针来检测本发明所述的snp。本文所述“探针”是识别目的序列(与目的序列互补)的核酸序列(dna或rna)。探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，从而显示目的基因。探针可以包括整个目的序列，也可以是目的序列的片段。探针可以是dna，也可以是由之转录而来的rna。通常，探针带有检测标记，例如荧光标记。所述荧光标记包括但不限于fam、cy5和vic。本领域知晓适用于本文探针的荧光标记以及将其与探针连接的方法。
172.本文中，探针包括识别选自seq id no:3、6和9中任意或其片段的探针，所述片段包含seq id no:3自5’端起第124位碱基，或包含seq id no:6自5’端起第179位碱基，或包
含seq id no:9自5’端起第144位碱基。
173.示例性地，探针包括选自以下的一种或多种：(1)识别seq id no:3或其片段的探针，所述片段包含seq id no:3自5’端起第124位碱基，所述碱基是a；和/或识别seq id no:3或其片段的探针，所述片段包含seq id no:3自5’端起第124位碱基，所述碱基是c，(2)识别seq id no:6或其片段的探针，所述片段包含seq id no:6自5’端起第179位碱基，所述碱基是a；和/或识别seq id no:6或其片段的探针，所述片段包含seq id no:6自5’端起第179位碱基，所述碱基是g，(3)识别seq id no:9或其片段的探针，所述片段包含seq id no:9自5’端起第144位碱基，所述碱基是t；和/或识别seq id no:9或其片段的探针，所述片段包含seq id no:9自5’端起第144位碱基，所述碱基是g。
174.本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸杂交能力的多核苷酸。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列(如本文所述的seq id no:1-12)具有至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性的核苷酸序列。可采用例如ncbi的blastn计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在参照序列的和核苷酸序列中具有一个或多个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代可以是嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸之间的取代，也可以是嘌呤核苷酸之间或嘧啶核苷酸之间的取代。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的核苷酸进行保守性取代时，通常不会改变多核苷酸的稳定性和功能。保守性取代例如嘌呤核苷酸之间的(a与g)的互换，嘧啶核苷酸之间的(t或u与c)的互换。因此，在本发明多核苷酸中用来自同一残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。当提及与本发明所述的引物(如seq id no:1-2、4-5、7-8)或探针具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％序列相同性的突变体时，优选地，这些突变体在高严谨条件下可与包含seq id no:3、6、9的相对应的dna序列杂交。所述高严谨条件可为在0.1
×
sspe(或0.1
×
ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
175.本发明另一方面提供检测样品中水稻株型的方法，包括通过对待测样品进行本文所述的snp标记的检测，确定或定量水稻株型。所述方法进一步包括：(1)提取待测样品的dna；(2)利用本文所述的引物和/或探针，确定或定量所述dna中的本文所述snp标记的基因型；和(3)基于(2)的结果，确定或定量水稻株型。其中，第一snp标记为aa的水稻是窄叶水稻，第一snp标记为cc的水稻是宽叶水稻；第二snp标记为aa的水稻是分蘖角度大的水稻，第二snp标记为gg的水稻是分蘖角度小的水稻；第三snp标记为gg的水稻是穗下垂水稻，第三snp标记为tt的水稻是穗直立水稻。
176.用本领域检测snp的常规方法即可检测并鉴定水稻株型，例如荧光定量探针法或hrm高分辨率溶解曲线法或dna测序，这些方法的过程和所用试剂本领域周知。dna测序包括一代、二代、三代测序。
177.本文中，提取样品中dna的方法不受特别限制，本领域周知适用于本文的dna提取方法。
178.本领域周知适用于本文的snp标记检测方法，包括但不限于：测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(pcr single strand conformation polymorphism，pcr-sscp)、实时荧
光定量pcr与高分辨率熔解曲线分析(hrm)、荧光探针法定量pcr、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(pcr-restriction fragment length polymorphism，pcr-rflp)及飞行时间质谱等。本领域知晓snp标记检测方法中所需的除引物和/或探针以外的其他试剂。
179.根据本发明的一些具体示例，通过对待测样品进行本文所述的snp标记的检测来确定或定量水稻株型的方法，进一步包括：提取样品中的dna；利用引物seq id no:1-2、4-5、7-8，进行dna的pcr，获得扩增产物；对所述扩增产物进行hrm分析或dna测序分析(例如3730测序仪测序)，获得所述dna中的本文所述snp标记的基因型；以及基于所述snp标记的基因型，确定或定量水稻株型。
180.本发明还提供一种试剂盒，其含有用于检测本发明所述的水稻基因组中的一种或多种snp标记的试剂。所述试剂可以是本文任一实施方案所述的引物和/或探针。任选地，该试剂盒还包括本发明所述的核酸分子(即扩增产物)，该核酸分子可用作内标或阳性对照。优选地，所述引物选自以下一组或多组：(1)seq id no:1和2所示的序列或与其有至少90％相同性的序列；(2)seq id no:4和5所示的序列或与其有至少90％相同性的序列；(3)seq id no:7和8所示的序列或与其有至少90％相同性的序列。优选地，所述探针具有荧光标记，如分别被fam荧光、vic荧光和cy5荧光标记。试剂盒中还可含有实施pcr所需的各种试剂，如缓冲液、酶、dntp等。在一优选的实施方案中，本发明的试剂盒含有：seq id no:1和2、或4和5、或7和8所示的引物序列。
181.本发明snp标记及其应用的优点：
182.本发明利用分子生物学方法检测与水稻株型相关的分子标记，通过这些分子标记可以确定水稻后代是否含有我们所需要的基因型和表型，根据基因型和表型选育含有优良等位基因的后代。从而在苗期就可以鉴定基因型和表型，有助于快速筛选所需要后代，提高育种效率。
183.下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中未具体描述的材料、试剂和方法，均未本领域常规的材料、试剂和方法。
184.实施例
185.实施例1，nal1基因的分子标记：
186.我们测序了25个水稻材料nal1基因，11个窄叶基因型，14个宽叶基因型。nal1基因的分子标记筛选包括以下步骤：
187.1)提取待测水稻植株的基因组dna；
188.2)用以下引物对水稻基因组dna进行pcr扩增；
189.所选用的引物：
190.引物名称引物序列(5'-3')nal1-snp2fggcagttgtgccatacattgnal1-snp2rgaacgaaaagatggaatc
191.3)对于snp分子标记。pcr产物进行纯化，然后进行测序反应，3730测序仪测序。确定含有相应的基因。
192.4)pcr反应体系以20μl计为：10x pcr反应缓冲液2μ1，25mm mgso
4 0.8μ1，2mm dntp 2μ1，5μm引物f和r各1.2μ1，基因组dna 20ng，kod-plus聚合酶0.4μ1，加ddh20补足至
20μ1。
193.pcr反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性15秒，55℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共35个循环；68℃保温5分钟。
194.含有snp的序列以及不同品种水稻的检测结果如下，结果表明，该snp在不同品种中均可以很好地区分窄叶和宽叶性状。
195.含有snp的序列：
196.ggcagttgtgccatacattgatacagatggatcatattcttcgtacaaccggattggagtatgctcgatctgtcatccgtggagaacccgaaattcagattgcttttgttttgcgtggctctc(c/a)tttgcagttcttgcgggaacctattcccccaagaatatcatgctactccacatcttgttgtttattctactgattccatcttttcgttc
197.表1：25份材料的nal1基因型及所用引物的snp
[0198][0199][0200]
实施例2，tac1基因的分子标记
[0201]
我们测序了33个水稻材料tac1基因，24个紧凑性、分蘖角度小的；14个松散型的、分蘖角度大的。tac1基因分子标记筛选包括以下步骤:
[0202]
1)提取待测水稻植株的基因组dna；
[0203]
2)用选自下表的引物，对水稻基因组dna进行pcr扩增；
[0204]
所选用的引物：
[0205]
引物名称引物序列(5'-3')tac1-snp1fcagatgtcgagtatctcataaagtac1-snp1rttcaaagtcagcaaacatcagtc
[0206]
3)对于snp分子标记。pcr产物进行纯化，然后进行测序反应，3730测序仪测序。确定含有相应的基因。
[0207]
4)pcr反应体系以20μl计为:10x pcr反应缓冲液2μ1，25mm mgso4 0.8μ1，2mm dntp 2μ1，5μm引物f和r各1.2μ1,基因组dna 20ng，kod-plus聚合酶0.4μ1，加ddh20补足至20μ1。
[0208]
pcr反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性15秒，58℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共35个循环；68℃保温5分钟。
[0209]
含有snp的序列以及不同品种水稻的检测结果如下，结果表明，该snp在不同品种中均可以很好地区分分蘖角度大性状。
[0210]
含有snp序列：
[0211]
cagatgtcgagtatctcataaagtaatggctttcaatttaagcctgagtcttgatacttgcttaatctggaacaaatcttggcactcggtctaatcatgtctatatgggaatgcacatactcttccatgctatttgatataagtttgcccaatattacacaccaatttgacctgatcc(g/a)ttctgtcagtggggccccaacttgcacatgtaataggccacatttcggtggttggaatttttctgaatcattccctacctggtgtgattagtgactgatgtttgctgactttgaa
[0212]
表2：33份材料的tac1基因型及所用引物的snp
[0213]
品种分蘖角度大小snpur28小ghp11小ggp677小ggp567小ggp669小ghp98小ghp308小ghp390小ggp551小gxa384小ggp536小g空育131小g越光小g龙粳31小ggp39小ghp44小ghp103小g
hp341小ggp51小ggp688小ghp38小ghp48小ghp45小ggp77小ggp3大agp62大agp124大ahp486大ahp274大ahp327大ahp383大ahp119大ahp407大a
[0214]
实施例3，对于dep1基因的分子标记
[0215]
我们测序了43个水稻材料dep1基因，22个直立穗，21个穗下垂。dep1基因的分子标记筛选包括以下步骤：
[0216]
1)提取待测水稻植株的基因组dna；
[0217]
2)用选自下表的引物对水稻基因组dna进行pcr扩增；
[0218]
所选择的引物：
[0219]
引物名称引物序列(5'-3')dep1-snp1fcgtacgtcgtcgtcgcatacctcdep1-snp1rgtaccactcctttcatcgcaag
[0220]
3)对于snp分子标记。pcr产物进行纯化，然后进行测序反应，3730测序仪测序。确定含有相应的基因。
[0221]
4)pcr反应体系以20μl计为:10x pcr反应缓冲液2μ1，25mm mgso
4 0.8μ1，2mm dntp 2μ1，5μm引物f和r各1.2μ1，基因组dna 20ng，kod-plus聚合酶0.4μ1，加ddh20补足至20μ1。
[0222]
pcr反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性15秒，55℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共35个循环；68℃保温5分钟。
[0223]
含有snp的序列以及不同品种水稻的检测结果如下，结果表明，该snp在不同品种中均可以很好地区分穗型性状。
[0224]
含有snp序列：
[0225]
cgtacgtcgtcgtcgcatacctcggtcgcgtccctgtcaaagccggccatcgctgccggctgctcaatttattcccttgctgtttcatttcgtacgtactccgcgctcgggatgcggccatagccatatcgccatatatctcg(t/g)gcaggcaccgtcacgctcgctcggcaactgtacgtgccgtctcaggacgcggcagtcaatgcggagttggtacaaacttgcgatgaaaggagtggtac
[0226]
表3：43份材料的dep1基因型及所用引物的snp
[0227][0228]