一种以农林废弃物为原料的粉红螺旋聚孢霉固体发酵方法

1.本发明属于农业领域，具体涉及一种以农林废弃物为原料的粉红螺旋聚孢霉固体发酵方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.在农林生产中，每年果园因修剪、病虫害的侵染危害产生大量的枯枝落叶等大量废弃物，北方这些农林废弃物主要通过运出、填埋和焚烧等方式对农林枝条类废弃物进行处理，不仅费工费时，还造成了环境污染，同时为病虫害提供了传播源和栖息地，给果园安全高效生产带来极大的威胁，开发果园病虫害的绿色防控措施，合理利用果园废弃物使其转化为有用的有机肥或者为其他生防菌的培养提供底物，变废为宝，实现农林废弃物的循环利用和果品安全生产，将极大降低了果园安全生产成本，为果园绿色安全生产提供了一种新路径。
4.果园病虫害的生物防控是一项重要的绿色防控措施，开发利用生防制剂是生物防控的重要内容，生防菌可以有效发酵农林固态废弃物并可循环利用，我国北方苹果园栽植面积大，产生大量果园修剪和病虫危害废弃物，前期研究结果表明，生防菌粉红螺旋聚孢霉对多种病原菌都有有效的抑菌效果,因此，利用农林废弃物作为基质发酵培养粉红螺旋聚孢霉，可以大大降低粉红螺旋聚孢霉生产成本。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种以农林废弃物为原料的粉红螺旋聚孢霉固体发酵方法。本发明以生防效果稳定的寄生菌粉红螺旋聚孢霉为菌株，采用价廉易得的苹果木屑、麦麸等农林废弃物作为生物菌肥的基础培养基原料，成本低，发酵过程产生的活菌体、代谢产物及发酵基质能够被有效利用，无废液及废弃物排放。
6.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
7.本发明的第一个方面，提供了一种以农林废弃物为原料的粉红螺旋聚孢霉固体发酵方法，包括：
8.以苹果木屑、麦麸为原料，制成基础培养基；
9.采用固体发酵法对粉红螺旋聚孢霉进行培养，二次发酵，即得。
10.本发明以生防效果稳定的寄生菌粉红螺旋聚孢霉为菌株，采用价廉易得的苹果木屑、麦麸等农林废弃物作为生物菌肥的基础培养基原料，成本低，发酵过程产生的活菌体、代谢产物及发酵基质能够被有效利用，无废液及废弃物排放，不仅可以保护环境，节约资源，显著降低生物菌肥的生产成本，此外，使用固体基质能够有效降低污染率，并节省空间和劳动力，同时促进农业生态环境的可持续发展。
11.本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的寄生菌粉粉红螺旋聚孢霉。
12.本发明主要以苹果园废弃物为基质，研究了其固体发酵工艺，通过发酵条件的优化大幅度降低了生产成本，有效利用了农林废弃物，为提高粉红螺旋聚孢霉的产孢量和生物防效奠定了基础。
13.本发明的第三个方面，提供了上述的寄生菌粉在制备生物菌肥中的应用。
14.本发明的有益效果在于：
15.(1)本发明以生防效果稳定的寄生菌粉红螺旋聚孢霉为菌株，采用价廉易得的苹果木屑、麦麸等农林废弃物作为生物菌肥的基础培养基原料，成本低，发酵过程产生的活菌体、代谢产物及发酵基质能够被有效利用，无废液及废弃物排放。同时本发明对固体发酵培养基的优化，有效提高了粉红螺旋聚孢霉的孢子量，为后续微生物菌肥产品提高货架期奠定了实验基础。
16.(2)为了获得较优的固体发酵效果，本发明在长期系统研究粉红螺旋聚孢霉发酵特点的基础上，选取了不同的试验材料，经过试验，综合表明选取苹果木屑最合适。
17.(3)本技术的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
18.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。
19.图1为本发明实施例1中粉红螺旋聚孢霉一次发酵的现场图；
20.图2为本发明实施例1中粉红螺旋聚孢霉二次发酵的现场图。
具体实施方式
21.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本技术使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
22.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
23.一种以农林废弃物为原料的粉红螺旋聚孢霉的固体发酵方法，包括：
24.以苹果木屑、麦麸为原料，制成基础培养基；
25.采用固体发酵法对粉红螺旋聚孢霉进行培养，二次发酵，即得。
26.在一些实施例中，所述基础培养基还包括：腐殖酸、补充碳源、补充氮源、补充无机盐。
27.在一些实施例中，所述基础培养基中，苹果木屑：麦麸：腐殖酸的质量比为60:35～40:5～10。
28.在一些实施例中，所述基础培养基中，补充碳源为可溶性淀粉，优选地，用量为5～6％。
29.在一些实施例中，补充氮源为蛋白胨，优选地，用量为2～3％。
30.在一些实施例中，补充无机盐为kh2po4，优选地，用量为0.5～0.6％。
31.在一些实施例中，所述最优培养条件为初始ph值7.0～7.1，初始含水量50～52％，接种量5～6％。
32.在一些实施例中，固体发酵中，一次发酵14～15d，二次浅盘发酵5～6d。
33.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
34.以下实施例中，粉红螺旋聚孢霉获自重庆巫溪县尖山镇大包村核桃树枝干溃疡病病斑部。
35.实施例1：
36.粉红螺旋聚孢霉固体发酵的最适基础培养基为苹果木屑：麦麸：腐殖酸＝60:35:5，含水量为50％；按照最佳基础培养基质量分别加入5％可溶性淀粉为补充碳源，2％蛋白胨为补充氮源；0.5％kh2po4为补充无机盐。初始ph值7.0，初始含水量50％，接种量5％为最优培养条件，在最优培养基配方和发酵条件下培养15d。
37.分装于500ml广口瓶里面，每瓶200g，含水量50％，高温灭菌后在超净工作台内接入五个菌饼，置于25℃的恒温培养箱中发酵15d(一次发酵)后，将发酵料平铺在报纸上面，上面用报纸覆盖，并洒一些水保持湿润状态，进行二次发酵，浅盘发酵时间为5d，通过血球计数板测定产孢量，每一组处理进行3次重复计数。
38.粉红螺旋聚孢霉孢子量具体测定方法：固体发酵物经过二次发酵晾干后，称取1g培养物加20ml无菌水于离心管内混匀并定容，在显微镜下用血球计数板计算粉红螺旋聚孢霉的孢子浓度。
39.实验例
40.一、供试培养基配方
41.供试燕麦培养基(oa)：燕麦30g，琼脂17g，蒸馏水1000ml；制作方法：燕麦片加水1000ml，加热1小时，纱布过滤后加水补足1000ml，加琼脂搅拌均匀后分装灭菌(121℃，20min)，冷却后贮存备用。
42.不同ph的pda培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水1000ml，0.1mol/l hcl 0.1mol/l naoh；制作方法：用0.1mol/l hcl和0.1mol/l naoh将马铃薯葡萄糖琼脂培养基的ph调为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。
43.不同玉米面浓度的pda培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，玉米粉(2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g)，蒸馏水1000ml；制作方法同pda培养基，仅分别多加入玉米面2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g。
44.不同麦麸浓度的pda培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，麦麸(2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g)，蒸馏水1000ml；制作方法同pda培养基，仅分别多加入玉米面2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g。
45.不同vc浓度的pda培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，维生素c(0.25g、0.5g、0.75g、1.0g、1.25g)，蒸馏水1000ml；制作方法同pda培养基，仅分别多加入维生素c 0.25g、0.5g、0.75g、1.0g、1.25g。
46.不同nacl浓度的pda培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉17g，nacl(0.005g、0.010g、0.015g、0.020g、0.025g)，蒸馏水1000ml；制作方法同pda培养基，仅分别多加入
nacl 0.005g、0.010g、0.015g、0.02g、0.025g。
47.苹果枝条培养基：马铃薯200g，苹果枝条200g，葡萄糖20g，琼脂粉17g，蒸馏水1000ml；制作方法：称取200g苹果枝条加水煮30min后用纱布过滤，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20-30分钟，马铃薯块能被玻璃棒戳破即可)，用纱布过滤，加热，依次加入17g琼脂和20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装锥形瓶，加塞、包扎，高温灭菌后取出，冷却后贮存备用。
48.樱花枝条培养基：马铃薯200g，樱花枝条200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水1000ml；制作方法同苹果枝条培养基，仅需要将苹果枝条换为樱花枝条。
49.苹果叶片培养基：马铃薯200g，苹果叶片200g，葡萄糖20g，琼脂17g,，蒸馏水1000ml；制作方法同苹果枝条培养基，仅需要将苹果枝条换为樱花叶片。
50.二、研究方法
51.以pda作为对照，设置9组不同营养条件的培养基，不同营养条件培养基参照供试培养基。每个处理接种5个平板，每个培养皿中心接种一个菌饼。定期观察粉红螺旋聚孢霉的生长情况，每隔三天测量其生长速率。
52.选择适合粉红螺旋聚孢霉的最适基础物料为苹果，将继续探索苹果不同部位的促生效果。将粉红螺旋聚孢霉分别接种在特制的苹果枝条培养基和苹果叶片培养基，每隔三天记录一次粉红螺旋聚孢霉的生长速率观察其生长情况。
53.三、实验结果
54.3.1玉米面的浓度对粉红螺旋聚孢霉的影响
55.表1粉红螺旋聚孢霉在不同玉米面浓度下的生长速率
[0056][0057]
在最优培养基中，当玉米面的浓度为2.5g/l的时侯，粉红螺旋聚孢霉的生长速率最快，为0.57cm/d(表1)，故粉红螺旋聚孢霉最佳发酵初始玉米面的浓度为2.5g/l。
[0058]
3.2麦麸的浓度对粉红螺旋聚孢霉的影响
[0059]
表2粉红螺旋聚孢霉在不同麦麸浓度下的生长速率
[0060][0061]
在最优培养基中，当麦麸的浓度为2.5g/l的时侯，粉红螺旋聚孢霉的生长速率最快，为0.57cm/d(表2)，故粉红螺旋聚孢霉最佳发酵初始麦麸的浓度为2.5g/l。
[0062]
3.3nacl的浓度对粉红螺旋聚孢霉的影响
[0063]
表3粉红螺旋聚孢霉在不同nacl浓度下的生长速率
[0064][0065]
上述结果表明：nacl条件下生长情况都不好，含量越高生长速度越慢，当nacl的浓度为0.100g/l的时侯，粉红螺旋聚孢霉的生长速率最慢，为0.37cm/d(表3)，说明nacl对粉红螺旋聚孢霉有抑制作用，该菌不耐盐。
[0066]
3.4维生素c的浓度对粉红螺旋聚孢霉的影响
[0067]
表4粉红螺旋聚孢霉在不同vc浓度下的生长速率
[0068][0069]
在最优培养基中，当维生素c的浓度为0.5g/l的时侯，粉红螺旋聚孢霉的生长速率最快，为0.35cm/d(表4)，故粉红螺旋聚孢霉最佳发酵初始麦麸的浓度为2.5g/l。
[0070]
3.5燕麦、苹果木屑与樱花木屑的浓度对粉红螺旋聚孢霉的影响
[0071]
表5粉红螺旋聚孢霉在不同燕麦、苹果木屑与樱花木屑的浓度下的生长速率
[0072][0073]
研究表明：燕麦对粉红螺旋聚孢霉的促生效果明显，平均生长速率为0.39cm/d，苹果材料次之，平均生长速率为0.33cm/d，由于燕麦成本较高，故在接下来的试验中选择苹果材料进行筛选。
[0074]
表6粉红螺旋聚孢霉在苹果枝条、苹果叶片下的生长速率
[0075][0076][0077]
研究表明：差异不显著，苹果枝条与苹果叶片对于pda相较而言有较好的促进作用,所以将粉红螺旋聚孢霉生物菌肥的基础物料定为苹果木屑，大大降低了发酵的成本。
[0078]
四、基础培养基筛选
[0079]
选择价格低廉的苹果木屑、樱花木屑、麦麸、玉米面、豆粕、黄粉虫及白星花金龟虫粪沙作为候选物料进行发酵。
[0080]
配方如下：
[0081]
(1)苹果木屑：麦麸：腐殖酸＝60:35:5
[0082]
(2)樱花木屑：麦麸：腐殖酸＝60:35:5
[0083]
(3)黄粉虫虫粪沙：苹果木屑：腐殖酸：麦麸＝20:55:20:5
[0084]
(4)白星花金龟虫粪沙：苹果木屑：腐殖酸：麦麸＝20:55:20:5
[0085]
分装于500ml广口瓶里面，每瓶200g，含水量50％，高温灭菌后在超净工作台内接入五个菌饼，置于25℃的恒温培养箱中发酵15d后，将发酵料平铺在报纸上面，上面用报纸覆盖，并洒一些水保持湿润状态，进行二次发酵(5d)，然后用粉碎机粉碎成粉末状，通过血球计数板测定产孢量，每一组处理进行3次重复计数。
[0086]
粉红螺旋聚孢霉孢子量具体的测定方法：固体发酵物经过二次发酵晾干后，称取1g培养物加20ml无菌水于离心管内混匀并定容，在显微镜下用血球计数板计算粉红螺旋聚孢霉的孢子浓度。
[0087]
结果：
[0088]
不同营养条件的基础培养基配方对粉红螺旋聚孢霉的产孢量具有明显的区别。其中苹果木屑：麦麸：腐殖酸＝60:35:5显著比其他的处理组产孢量高，达9.25
×
108cfu/g。其次是樱花木屑：麦麸：腐殖酸＝60:35:5，该培养基的产孢量为8.5
×
108cfu/g。而剩余两组培养基发酵不彻底，没有达到理想的发酵效果。因此，可以确定粉红螺旋聚孢霉固体发酵的最适基础培养基为苹果木屑：麦麸：腐殖酸＝60:35:5，含水量为50％。
[0089]
五、固体发酵培养基的优化
[0090]
实验室研究的粉红螺旋聚孢霉固体发酵配方苹果木屑：麦麸：腐植酸＝60：35：5，此外，初始ph值7.0，初始含水量50％，接种量5％为最优培养条件，在最优培养基配方和发酵条件下培养14d～15d，二次浅盘发酵5d。
[0091]
以本实验室研究的粉红螺旋聚孢霉固体发酵配方为基础，进行固体发酵优化。在此基础上优化。按照最佳基础培养基质量的5％分别加入可溶性淀粉、玉米粉、葡萄糖等为补充碳源；按最佳基础培养基质量的2％分别加入酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等为补充氮源；按最佳基础培养基质量的0.5％分别加入kh2po4、nacl、feso4为添加无机盐，以基础培养基配方为对照，进行单因素试验，筛选最佳补充碳源、氮源及无机盐，20d后调查各处理产孢量。
[0092]
表7不同固体发酵培养基处理下粉红螺旋聚孢霉孢子量
[0093][0094][0095]
综上，粉红螺旋聚孢霉固体发酵最优培养基配方为：苹果木屑：麦麸：腐植酸＝60：35：5，此外，初始ph值7.0，初始含水量50％，接种量5％为最优培养条件，在此基础上添加5％可溶性淀粉，2％蛋白胨，0.5％kh2po4，孢子量可以达到3.59
×
109。
[0096]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。