一种肝素酶III及其编码核苷酸序列、包括该核苷酸序列的重组载体和宿主细胞以及应用的制作方法

一种肝素酶iii及其编码核苷酸序列、包括该核苷酸序列的重组载体和宿主细胞以及应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程和发酵工程领域，特别涉及一种肝素酶iii及其编码核苷酸序列、包括该核苷酸序列的重组载体和宿主细胞以及应用。


背景技术：

2.肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素(heparin)或者硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)的多糖裂解酶，存在于多种微生物中，其中来自肝素黄杆菌的肝素酶最为常见。来自肝素黄杆菌的肝素酶只有三种，分别为肝素酶i(ec 4.2.2.7)、肝素酶ii(no ec code)和肝素酶iii(ec 4.2.2.8)(robert j.linhardt et al.purification and characterization of heparin lyases from flavobacterium heparinum jbc 1992vol.267：24347-24355)。
3.肝素酶iii主要作用于硫酸乙酰肝素，分子量为73kda。相比于其他两种肝素酶，研究表明肝素酶iii能够作用于胞外基质中的类肝素，产生具有活性的肝素小分子，其能够抑制毛细血管上皮细胞的增殖，从而抑制肿瘤细胞的生长并且减少癌细胞的转移和扩散(liu df,prjasek k,shriver z,et al.heparinase iii and uses thereof：united states,us 6869789b2[p].205-5-22)。


技术实现要素：

[0004]
目前肝素酶iii稳定性差，很少有通过基因工程手段研究开发出一种在保证酶催化活性的基础上提高酶稳定性的肝素酶iii。
[0005]
针对上述缺陷，本发明的目的在于提供一种肝素酶iii及其编码核苷酸序列、包括该核苷酸序列的重组载体和宿主细胞。
[0006]
本发明提供的一种肝素酶iii，所述肝素酶iii包括如seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列。
[0007]
肝素酶iii原始氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0008]
seq id no.2表示氨基酸序列为seq id no.1中85、114、403、547位的q谷氨酰胺全部替换为a丙氨酸。
[0009]
seq id no.3表示氨基酸序列为seq id no.1中403位q谷氨酰胺替换为v缬氨酸，85、114、547位的q谷氨酰胺处替换为a丙氨酸。
[0010]
本发明的另一目的为提供一种编码上述肝素酶iii的核苷酸序列。
[0011]
进一步地，所述核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.5所示，其中，seq id no.4为编码seq id no.2所述肝素酶iii的核苷酸序列，seq id no.5为编码seq id no.3所述肝素酶iii的核苷酸序列。
[0012]
本发明的又一目的为提供一种重组载体，所述重组载体包含至少一个上述核苷酸序列。
[0013]
进一步地，所述重组载体为真核细胞重组载体。
[0014]
更进一步地，所述真核细胞重组载体为ppink-hc、ppiczaa、ppicz a中的任意一种。
[0015]
优选地，所述真核细胞重组载体为ppink-hc。
[0016]
本发明的又一目的为提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述任一重组载体。
[0017]
进一步地，所述宿主细胞为毕赤酵母。
[0018]
更进一步地，所述毕赤酵母为x33。
[0019]
本发明还提供了一种肝素酶iii的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0020]
(a)、合成编码上述肝素酶iii的核苷酸序列
[0021]
(b)、将(a)中的核苷酸序列与真核细胞重组表达载体结合，得到重组载体；
[0022]
(c)、将(b)中的重组载体导入宿主细胞，随后培养诱导表达，经纯化得到肝素酶iii。
[0023]
优选地，所述步骤(c)使用buffer w对srep-tactin柱进行纯化。
[0024]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0025]
本发明对现有肝素酶iii的氨基酸序列(如seq id no.1所示)中可能影响肝素酶iii稳定性的蛋白酶酶切位点进行改造，具体地，将现有肝素酶iii的氨基酸序列中第85、114、403、547位的q谷氨酰胺定点突变为a丙氨酸或v缬氨酸，可以提高肝素酶iii的稳定性，尤其是热稳定性，酶活半衰期提高，当原始氨基酸序列中85、114、403、547位替换为a丙氨酸，稳定性提升显著，在最适反应温度30℃的酶活半衰期达到47小时左右，当原始氨基酸序列中85、114、547位替换为a丙氨酸，403位替换为v缬氨酸，稳定性提升更显著，在最适反应温度30℃的酶活半衰期更长。
[0026]
本发明提供的核苷酸序列用于编码上述肝素酶iii，本发明采用稀有密码子优化法，按照毕赤酵母的密码子使用偏好进行dna序列优化，优化后的序列在毕赤酵母的表达效率得到了显著的提高。
[0027]
本发明提供的重组载体和宿主细胞包括上述核苷酸序列，可以用于上述肝素酶iii的表达。
附图说明
[0028]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0029]
图1为本发明实施例8sds-page电泳图
[0030]
图2为本发明实施例10肝素酶iii改造前后的稳定性测定曲线。
具体实施方式
[0031]“氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何单体单元。如本文所用，术语“氨基酸”包括以下20种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(ala或a)、精氨酸(arg或r)、天冬酰胺(asn或n)、天冬氨酸(asp或d)、半胱氨酸(cys或c)、谷氨酰胺(gln或q)、谷氨酸(glu或e)、
甘氨酸(gly或g)、组氨酸(his或h)、异亮氨酸(ile或i)、亮氨酸(leu或l)、赖氨酸(lys或k)、甲硫氨酸(met或m)、苯丙氨酸(phe或f)、脯氨酸(pro或p)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、色氨酸(trp或w)、酪氨酸(tyr或y)和缬氨酸(val或v)。在其中“x”残基未定义的情况下，这些应该定义为“任何氨基酸”。这些20种天然氨基酸的结构显示于例如stryer等人,biochemistry,第5版,freeman and company(202)。额外的氨基酸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸也能够被遗传编码(stadtman(1996)“selenocysteine,”annu revbiochem.65:83-100和ibba等人.(202)“genetic code:introducing pyrrolysine,”curr biol.12(13):r464-r466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如，具有修饰的侧链和/或骨架)和氨基酸类似物。(参见，例如，zhang等人(204)“selectiveincorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,”proc.natl.acad.sci.u.s.a.11(24):8882-8887,anderson等人(204)“an expandedgenetic code with a functional quadruplet codon”proc.natl.acad.sci.u.s.a.11(20):7566-7571,ikeda等人(203)“synthesis of a novel histidineanalogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,”proteineng.des.sel.16(9):699-706,chin等人(203)“an expanded eukaryotic geneticcode,”science 31(5635):964-967,james等人(201)“kinetic characterizationof ribonuclease s mutants containing photoisomer-izable phenylazophenylalanineresidues,”protein eng.des.sel.14(12):983-991,kohrer等人(201)“importof amber and ochre suppressor trnas into mammalian cells:a general approachto site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,”proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(25):14310-14315,bacher等人(201)“selection andcharacterization of escherichia coli variants capable of growth on anotherwise toxic tryptophan analogue,”j.bacteriol.183(18):5414-5425,hamano-takaku等人(2000)“a mutant escherichia coli tyrosyl-trna synthetaseutilizes the unnatural amino acid azatyrosine more efficiently thantyrosine,”j.biol.chem.275(51):4324-4328,以及budisa等人(201)“proteins with{beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophoresand pharmaceutically active amino acids,”protein sci.10(7):1281-1292。
[0032]
为了进一步举例说明，氨基酸通常为包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一种或多种侧链或基团，或这些基团的任一种的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其他代表性的氨基酸包括，但不限于，包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、包含金属的氨基酸、含新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解的和/或光可裂解的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个毒性部分的氨基酸。
[0033]
本发明中肝素酶iii的原始氨基酸序列(如seq id no.1所示)是来自于ncbi数据库中已经公布的肝素酶iii的序列。
[0034]
然后在该氨基酸序列的基础上，根据表达宿主细胞对于密码子使用的偏好性，对该氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化，目的是为了提高目标序列在宿主细胞发酵过程中的翻译效率，以便尽可能获得更多的目标蛋白。
[0035]
目标序列经过目标公司合成后，在该序列的基础上进行目标氨基酸的突变，通过片段pcr扩增产物后的gibson反应，将各片段连接起来构成突变后的载体。
[0036]
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)是利用一段dna为模板，在dna聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段dna扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析。pcr检测方法在临床上快速诊断细菌性传染病等方面具有极为重要的意义。
[0037]
pcr原理用于扩增位于两段已知序列之间的dna片段，类似于天然dna的复制过程。以拟扩增的dna分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端互补的寡核苷酸片段为引物，在dna聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的dna合成，重复这一过程，即可使目的dna片段得到扩增。
[0038]
gibson组装最早由daniel gibson博士和他的同事j.craig venter在2009年提出。gibson组装非常适合用于拼接多个线性dna片段，同时也用于将目标dna插入载体中。首先，需要在dna片段的末端加上同源片段(通过pcr法加上)；然后，将这些dna片段和一种master mix(含有三种酶)混合孵育一个小时就可以了。
[0039]
其中master mix含有三种不同类型的酶：
[0040]
一种外切酶，从5’端开始对dna进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合；
[0041]
一种聚合酶，用于修补缝隙；
[0042]
一种dna连接酶，实现无痕拼接，形成完整的dna分子。
[0043]
在突变氨基酸位点附近设计引物，变更氨基酸密码子包含在引物中，同时序列中还包含相邻片段连接所需的同源序列，对上述pcr产物进行扩增后的纯化，通过gibson反应试剂，将上述pcr扩增片段进行连接，得到指定位置氨基酸突变的肝素酶iii重组表达载体序列。
[0044]
最终得到优化后的如seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列。另外，seq id no.2表示氨基酸序列为seq id no.1中85、114、403、547位的q谷氨酰胺全部替换为a丙氨酸。seq id no.3表示氨基酸序列为seq id no.1中403位q谷氨酰胺替换为v缬氨酸，85、114、547位的q谷氨酰胺处替换为a丙氨酸。
[0045]
编码序列：本文所用术语“编码序列”包括核苷酸序列，它直接表明其蛋白产物的氨基酸序列。所述编码序列的边界通常由开放阅读框架来确定，它通常从atg起始密码子开始。所述编码序列通常包括dna，cdna和重组的核苷酸序列。
[0046]
术语“核苷酸”，除了是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体以外，本文中还应当理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其关于使用该核苷酸的具体上下文在功能上是等效的，除非上下文明确另外指明。
[0047]
术语“密码子优化的”、“密码子-优化的(codon-optimized)”、“密码子-优化的(codon-optimised)”或“密码子使用偏好”是指以使得根据需要优化或定制表达的方式选
择密码子(即密码子使用)的实践(即，通过增加目标基因的翻译效率来改进生物体中蛋白表达的技术)。换句话说，密码子优化是一种调整密码子以匹配宿主trna丰度的方法，并且传统上已用于表达异源基因。用于优化异源表达的新策略考虑全局核苷酸含量，诸如局部mrna折叠、密码子对偏倚、密码子斜坡(codon ramp)或密码子相关性。密码子优化是可能的，因为密码子的简并性是固有的。因为存在比可编码的氨基酸更多的密码子，导致简并性。因此，绝大多数氨基酸由多个密码子编码，这意味着存在多种携带任何给定氨基酸的trna(具有不同的反-密码子环)。因此，可以使用不同的密码子，而不改变编码的氨基酸序列。也就是说，可以突变/改变(或从头合成)核酸的基因或片段以改变用于编码特定氨基酸的密码子，而不改变多肽/蛋白本身的氨基酸序列。例如，稀有密码子可以用更丰富的密码子替换，同时保持氨基酸序列不变。
[0048]
术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物生物体(例如细菌、酵母和放线菌)以及当在细胞培养物中生长时来自高等植物或者动物的单细胞。“宿主细胞”可以为动物宿主细胞、植物宿主细胞、酵母宿主细胞、真菌宿主细胞、原生动物宿主细胞和原核宿主细胞。
[0049]
例如所述宿主细胞选自：巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、安格斯毕赤酵母(pichia angusta)(多形汉逊酵母(hansenula polymorpha))、芬兰毕赤酵母(pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichia trehalophila)、pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(ogataea minuta、pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(pichia salictaria)、栎毕赤酵母(pichia guercuum)、皮杰普毕赤酵母(pichia pijperi)、树干毕赤酵母(pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、鲁氏接合酵母(zygosaccharomyces rouxii)、拜氏接合酵母(zygosaccharomyces bailii)、西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)、马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、黑曲霉(aspergillus niger)、arxula adeninivorans、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、温特曲霉(aspergillus wentii)、金黄曲霉(aspergillus aureus)、黄曲霉(aspergillus flavus)、棉阿舒囊霉(ashbya gossypii)、甲基营养型嗜甲基菌(methylophilus methylotrophus)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、博伊丁假丝酵母(candida boidinii)、产朊假丝酵母(candida utilis)、米根霉(rhizopus oryzae)、汉逊德巴利酵母(debaromyces hansenii)和酿酒酵母。在本发明的一个实施方式中，宿主细胞可以为毕赤酵母或酿酒酵母。在本发明的一个实施方式中，宿主细胞为酿酒酵母属(saccharomyces cerevisiae)。在本发明的一个优选实施方式中，宿主细胞为毕赤酵母属(pichia)，使用毕赤酵母(pichia pastorid)表达系统。与原核表达系统相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有如下特点：首先，酵母是真核生物，可以使某些蛋白的糖基化更加稳定，进行翻译后修饰，例如正确的二硫键的形成和信号肽的去除，n—结合和o—结合的糖基化修饰；其次，酵母具有单细胞微生物结构，具有细菌系统的快速生长和易于基因工程操作等优点；与大肠杆菌相比，酵母没有内毒素，没有溶源性病毒，且酵母和人类关系密切，无致病性，长久以来被用于面包和制酒工业。酵母也是一个理想的分泌表达系统。通常酵母培养基中没有蛋白质的加入，正常的酵母分泌蛋白仅为酵母细胞总蛋白的0.5％；它还能把产生
的外源蛋白质分泌到培养基中，便于产品的分离纯化，这能在很大程度上降低成本。对于那些需要翻译后正确折叠、自然分泌的蛋白质，以及胞内不稳定或有毒性的外源蛋白，很适合在此种分泌型的表达系统中表达。
[0050]
毕赤酵母系统具有以下几个优点：(1)极高的表达产量，该系统采用甲醇诱导的启动子，单拷贝乙醇氧化酶基因在该启动子驱动下可产生细胞总可溶性蛋白量的30％乙醇氧化酶，将该启动子引入表达载体以驱动外源基因的表达。(2)高密度生长，在70年代，毕赤酵母用于制备单细胞蛋白，由此产生毕赤酵母的发酵技术，可达每升培养物100克干细胞。(3)高水平分泌在无蛋白培养基中，该表达载体带有酿酒酵母a因子信号肽，能将表达产物分泌到胞外。用于表达培养基包括一些无机盐、微量元素、生物素和碳源，且无毒素和致热源，这样，分泌的表达产物极易纯化。(4)毕赤酵母的糖基化形式更加接近于哺乳动物，表达产物n-结合的甘露糖一般只有(8～14)个，而酿酒酵母中多达(50～150)。而且这些产物不像酿酒酵母中包含末端a-1,3-甘露糖的结合，这种修饰会造成免疫遗传性。(5)质粒稳定性好，毕赤酵母本身并无质粒，允许表达组件串联重复，而且适于整合到染色体上表达外源基因。(6)分泌产物通透性好，酿酒酵母中由于过度糖基化，造成每个n—结合的寡糖链上均有很多的甘露糖残基，进一步影响到通透性。一般分子量超过20kda的外源蛋白都不能分泌到培养液中，毕赤酵母则不存在此现象，其体内具有一套和真核生物极其相似的分泌途径，从内质网经高尔基体、囊泡分泌到体外。分子量超过50kda的转向酶和人血清蛋白均能分泌到胞外，且表达量都在1g/l的水平。
[0051]
在本发明的一个优选实施方式中，根据表达毕赤酵母对于密码子使用的偏好性，对上述氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化，将肝素酶iii的蛋白质序列录入密码子偏爱性分析软件中，例如为南京金斯瑞生物科技有限公司自主研发的gensmart
tm
codon optimization序列优化软件进行序列优化(https://www.genscript.com/tools/gensmart-codon-optimization)；在保证肝素酶iii的蛋白质序列不变，只利用密码子的简并性的前提下，将在毕赤酵母中使用频率较低、会影响翻译过程中核糖体通过效率的密码子用使用频率较高的密码子进行替换，得到密码子优化后的核苷酸序列，如序列表中seq id no.4或seq id no.5所示。其中，seq id no.4为编码seq id no.2所述肝素酶iii的核苷酸序列，seq id no.5为编码seq id no.3所述肝素酶iii的核苷酸序列。
[0052]
表达：本文上下文中术语“表达”包括多肽生产涉及的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0053]
术语“载体”指一段dna，通常是双链的，其可以已经向其中插入一段外源dna。载体可以是例如质粒来源的。载体含有在宿主细胞中促进载体的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源dna被定义为异源dna，其为在宿主细胞中天然未发现的dna，其例如复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或编码转基因。载体用于将外源的或异源的dna转运入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，所述载体可以独立于宿主染色体dna复制或与宿主染色体dna同时复制，并且可以生成几个拷贝的载体及其插入的dna。另外，载体还可以含有允许插入的dna转录为mrna分子或者以其他方式引起插入的dna复制为多拷贝的rna的必要元件。一些表达载体另外含有插入的dna附近的序列元件，其增加表达的mrna的半衰期，和/或允许所述mrna翻译为蛋白分子。因此，可以迅速地合成插入的dna编码的mrna和多肽的许多分子。
[0054]
表达载体：本文上下文中术语“表达载体”包括线性或环状的dna分子，其包含编码本发明多肽的片段，并且该片段可以可操作地连接到使其转录的其它片段上。
[0055]
所述重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，它可以方便地用重组dna方法处理，并可表达所述核苷酸序列。选择载体通常取决于所述载体与所述载体被引入的宿主细胞的相容性。所述载体可以是线性的或闭合环状质粒。
[0056]
所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒，染色体外元件，微型染色体，或人工染色体的复制。
[0057]
所述载体可包含任何确保自身复制的工具(means)。或者，所述载体可以在引入所述宿主细胞时，被整合进入基因组并与它所整合进入的染色体一起复制。另外，可用单个载体或质粒，或者总共包含要引入所述宿主细胞的基因组的全部dna的两个或多个载体或质粒，或可用转座子。
[0058]
在本发明的一个实施方式中，重组载体包括编码seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列的核苷酸序列，优选的，当宿主细胞选自毕赤酵母时，所述重组载体包括seq id no.4或seq id no.5所示的核苷酸序列。
[0059]
在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为真核细胞重组载体。所述重组载体采用的表达载体可以为ppink-hc，ppiczaa，ppicz a，ppicz，ppiczα，pgapz，pgapz，phbm905a，ppic9k，ppic9k-his，ppic3.5k，ppic9，ppiczαa，pao815，ppic9k-his，phil-s1，pgadt7，pgbkt7，pwb980，pt3等；优选为ppink-hc、ppiczaa和ppicz a，特别优选为ppink-hc。上述载体均可商业购得。
[0060]
在本发明的一个优选实施方案中，所述真核细胞重组载体为ppink-hc。在本发明的另一个优选实施方案中，所述真核细胞重组载体为ppiczaa。
[0061]
在本发明的另一个优选实施方案中，所述真核细胞重组载体为ppicz a。
[0062]
在本发明的一个实施方式中，根据毕赤酵母对于密码子使用的偏好性，对上述氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化，将肝素酶iii的蛋白质序列录入密码子偏爱性分析软件南京金斯瑞生物科技有限公司自主研发的gensmart
tm
codon optimization序列优化软件进行序列优化(https://www.genscript.com/tools/gensmart-codon-optimization)；在保证肝素酶iii的蛋白质序列不变，只利用密码子的简并性的前提下，将在毕赤酵母中使用频率较低、会影响翻译过程中核糖体通过效率的密码子用使用频率较高的密码子进行替换，得到编码seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0063]
在本发明的一个优选实施方式中，密码子优化后的核苷酸序列为seq id no.4或seq id no.5所示的核苷酸序列。
[0064]
在本发明的一个实施方式中，将上述核苷酸序列与真核细胞重组载体结合得到重组载体。例如，将上述核苷酸序列与ppink-hc结合得到ppink-hc重组载体。
[0065]
在本发明的一个实施方式中，将上述重组载体导入宿主细胞，如ppink-hc重组载体导入毕赤酵母中。
[0066]
在本发明的一个实施方式中，将上述核苷酸序列与ppiczaa结合得到ppiczaa重组载体。
[0067]
在本发明的一个实施方式中，将上述重组载体导入宿主细胞，如ppiczaa重组载体
导入毕赤酵母中。
[0068]
在本发明的一个实施方式中，将上述核苷酸序列与ppicz a结合得到ppicz a重组载体。
[0069]
在本发明的一个实施方式中，将上述重组载体导入宿主细胞，如ppicz a重组载体导入毕赤酵母中。
[0070]
用于纯化重组蛋白的方式是本领域中众所周知的，并且可以包括澄清(例如，过滤或离心)，亲和色谱，免疫亲和色谱，蛋白a(或g)色谱，离子交换(即，阳离子和/或阴离子)色谱，大小排阻色谱，吸附色谱，疏水相互作用色谱，反相色谱，超速离心，沉淀，免疫沉淀，萃取，相分离等。
[0071]
本文所述的方法包括在经工程改造以具有至少一种标记的宿主细胞蛋白(hcp)的宿主细胞系中表达重组蛋白，其中所述至少一种标记的hcp用至少一种纯化标签标记。通常，标记的hcp是这样的蛋白，其高度丰富，在下游纯化过程期间难以除去，和/或影响产品质量(例如，残余的蛋白酶可能降解生物治疗产品，由此降低其效力)。具有这些特征的hcp被称为“有问题的”hcp。通常，标记的hcp是对于细胞存活和/或细胞功能必需的蛋白(且因此，不是基因敲除策略的良好候选物)。它们可在分离方法(例如分离柱)中捕获。此类附加结构域的非限制性实施方案包括称为myc标签、hat标签、ha标签、tap标签、gst标签、几丁质结合结构域(cbd标签)、麦芽糖结合蛋白(mbp标签)、flag标签、strep标签及其变体(例如，strepll标签)和his标签的肽基序。
[0072]
在一些实施方案中，所公开的多肽包含strep标签，例如strepll标签。在肝素酶iii的c端添加strepii标签序列，细胞粗提物可以通过脱硫生物素纯化柱，使用buffer w对srep-tactin柱进行纯化，借助strepii标签与生物素之间的相互作用，实现目标蛋白肝素酶iii的纯化。
[0073]
在本发明的一个实施方式中，在纯化之前进行破碎预处理，具体地如下：
[0074]
(a)取诱导表达的菌体发酵液进行低温离心；
[0075]
(b)收集上清，使用buffer w进行悬浮；
[0076]
(c)在冰水混合物上超声破碎细胞；
[0077]
(d)对上述悬浮液进行离心处理。
[0078]
优选的，裂解液如粘稠，可加入rnase a(10ug/ml)和dnase i(5ug/ml)，并在冰上孵育。
[0079]
在本发明的一个实施方式中，肝素酶iii的纯化步骤如下：
[0080]
(a)使用buffer w清洗srep-tactin柱，然后进行上柱操作；
[0081]
(b)使用buffer w洗柱，收集洗脱液；
[0082]
(c)加入buffer e并收集洗脱液。
[0083]
(d)使用buffer r分次去除d-硫酸生物素，完全脱除后，使用buffer w清洗柱子。
[0084]
实施例
[0085]
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0086]
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述dna序列优化由苏州金唯智生物技术有限公司完成。(毕赤酵母购自thermo fisher公司，产品货号a11152。pichiapink
tm
载体试剂盒购自thermo fisher公司，产品货号a11152。ppink-hc购自thermo fisher公司，产品货号a11152(表达载体、菌株均包含在试剂盒中)。
[0087]
实施例1氨基酸iii序列的合成和筛选
[0088]
肝素酶iii的原始氨基酸序列是来自于ncbi数据库中已经公布的肝素酶iii的序列。
[0089]
然后在该氨基酸序列的基础上，根据表达宿主毕赤酵母对于密码子使用的偏好性，对该氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化，目的是为了提高目标序列在毕赤酵母发酵过程中的翻译效率，以便尽可能获得更多的目标蛋白。
[0090]
目标序列经过苏州金唯智生物技术有限公司合成后，在该序列的基础上进行目标氨基酸的突变，通过片段pcr扩增产物后的gibson反应，将各片段连接起来构成突变后的载体。
[0091]
在突变氨基酸位点附近设计引物，变更氨基酸密码子包含在引物中，同时序列中还包含相邻片段连接所需的同源序列，对上述pcr产物进行扩增后的纯化，通过gibson反应试剂，将上述pcr扩增片段进行连接，得到指定位置氨基酸突变的肝素酶iii重组表达载体序列。
[0092]
得到如seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列。
[0093]
实施例2肝素酶iii核苷酸序列的合成并构建重组表达载体
[0094]
(a)来自肝素黄杆菌的肝素酶iii编码区序列中含有大量的稀有密码子，在以毕赤酵母为宿主细胞进行表达时会影响蛋白翻译效率，所以要进行密码子优化。将肝素酶iii的蛋白质序列录入密码子偏爱性分析软件中，南京金斯瑞生物科技有限公司自主研发的gensmart
tm
codon optimization序列优化软件进行序列优化(https://www.genscript.com/tools/gensmart-codon-optimization)；
[0095]
(b)按照毕赤酵母密码子使用偏爱性数据表中毕赤酵母的密码子使用偏好，使用上述软件对实施例1中经初筛的肝素酶iii的编码区序列进行优化，在保证肝素酶iii的蛋白质序列不变，只利用密码子的简并性的前提下，将在毕赤酵母中使用频率较低、会影响翻译过程中核糖体通过效率的密码子用使用频率较高的密码子进行替换，得到密码子优化后的核苷酸序列，得到的序列如序列表中seq id no.4或seq id no.5所示；
[0096]
然后通过分子生物学常规手段将上述得到的肝素酶iii的密码子-优化的核苷酸序列与ppink-hc真核细胞表达载体连接，构建ppink-hc-肝素酶iii重组表达载体。
[0097]
实施例3真核细胞表达载体为ppiczaa，其他操作步骤如实施例2所示，构建ppiczaa-肝素酶iii重组表达载体。
[0098]
实施例4真核细胞表达载体为ppicz a，其他操作步骤如实施例2所示，构建ppicz a-肝素酶iii重组表达载体
[0099]
实施例5肝素酶iii的表达
[0100]
取实施例2、实施例3、实施例4的重组表达载体，感受态的制备及电转化、菌体培养基诱导表达参照pichiapink
tm
载体试剂盒说明书进行操作。
[0101]
实施例6肝素酶iii的破碎预处理
[0102]
(a)取实施例5诱导表达的菌体发酵液进行低温离心，4500g、5摄氏度离心15min；
[0103]
(b)收集上清，每100ml的上述(a)得到的菌体用1ml buffer w悬浮，如有需要可加入适量的蛋白酶抑制剂；
[0104]
(c)在冰水混合物上超声破碎细胞；
[0105]
(d)对步骤(c)得到的悬浮液进行离心处理，4摄氏度13000rpm离心15min。
[0106]
优选的，悬浮液如粘稠，可加入rnase a(10ug/ml)和dnase i(5ug/ml)，并在冰上孵育10-15min。
[0107]
实施例7肝素酶iii的纯化
[0108]
(a)使用2cvs的buffer w清洗srep-tactin柱，然后将实施例6得到的悬浮液进行上柱操作；
[0109]
(b)使用5cv的buffer w洗柱，收集洗脱液；
[0110]
(c)加入6倍的0.5cvs的buffer e并在每0.5cv收集。
[0111]
(d)使用15cvs的buffer r分3次去除d-硫酸生物素，完全脱除后，使用8cvs buffer w清洗柱子。
[0112]
实施例8肝素酶iii的sds-page检测
[0113]
收集实施例7中经buffer e处理的样品，并取20ul进行肝素酶iii sds-page验证，结果如图1所示，肝素酶iii分子量大约是73.36kda。通过采用胶密度扫描软件bandscan 5.0分析后，seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列对应的目标肝素酶iii的蛋白纯度可以达到85％以上。
[0114]
实施例9酶活性分析
[0115]
扫描波长为232nm，时间为3min。反应缓冲液(20mm tris，200mm nacl，ph＝7.4)与酶溶液共1000ul(比例根据酶液活力大小进行调节)，500ul底物溶液(17mm tris，44mm nacl，3.5mm cacl2,25g/l肝素钠ph＝7.4)于石英比色皿，混匀后放入分光光度计进行扫描(反应缓冲液与底物溶液在水浴中预热至30℃)，扫描时间为70s，取40-60s时间段的数据，计算曲线的斜率k(min-1
)，肝素酶iii的酶活(iu/l)计算公式如下(v为反应体系中加入酶溶液体积)：
[0116][0117]
经测定，改造后的肝素酶iii(seq id no.3)酶活为473.68iu/l，催化活性没有下降。
[0118]
实施例10稳定性分析
[0119]
纯化后的肝素酶iii置于30℃恒温培养箱中，定时吸取一定的酶液，按照实施例9所述方法测定酶活，与未改造的肝素酶iii的酶活进行对比，结果如图2所示。图2中，序列1酶表示原始氨基酸组成的蛋白，序列2酶表示序列表中seq id no.2组成的蛋白，序列3酶表示序列表中seq id no.3组成的蛋白。
[0120]
通过对比可以看出，改造后的肝素酶iii的稳定性显著上升，与序列1酶相比，对于序列2酶对应的肝素酶iii的酶活半衰期由原来的30h左右提高至47h左右，突变序列3酶对应的肝素酶iii的稳定性提高更为明显。
[0121]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0122][0123]
[0124]
[0125]