一种尿液外泌体提取试剂管及制作方法与流程

1.本发明涉及外泌体提取技术领域，特别涉及一种尿液外泌体提取试剂管及制作方法。


背景技术：

2.外泌体最早见于1981年，egtrams等在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现了有膜结构的小囊泡，并命名为exosome。对于外泌体的作用，当时推测为细胞排泄废物的一种方式。1996年graposo等发现类似于b淋巴细胞的免疫细胞也会分泌抗原呈递外泌体(antigenpresentingvesicle)，所分泌的外泌体可以直接刺激效应cd4 细胞的抗肿瘤反应。2007年hvaladi等进一步发现细胞之间可以通过外泌体中rna交换遗传物质。随着有关外泌体研究越来越多，研究者发现它广泛参与了机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤生长于侵袭等各种生物过程中。
3.几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。外泌体所携带核酸(microrna、lncrna、circrna、mrna、trna等)、蛋白、胆固醇等物质能被外泌体双层膜有效包裹，因此可抵抗各种因素的降解，使外泌体在体液中稳定存在，随着近年来对外泌体研究的深入，临床上在发现在癌症发病的早期阶段肿瘤病人体液中的外泌体与正常人外泌体所携带的生物物质就存在明显差异，因此对体液中外泌体提取有望成为癌症早期诊断技术，由于人体结构的特殊性，人尿液中的外泌体可作为肾脏疾病、前列腺疾病、膀胱疾病的临床检测的新型生物标记物。
4.现阶段对尿液外泌体的提取主要有超高速离心法，磁珠抗体捕获法，色相柱尺寸排阻法，peg沉淀过柱法，正电荷捕获法。超高速离心法：超速离心法是目前最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将大小相同的囊泡从样本中沉淀并纯化出来。需在离心机中以100,000-200,000xg离心沉淀(含有外泌体)120分钟。磁珠抗体捕获法：外泌体膜上磷酯酰丝氨酸(ps)特异性的结合tim4锚定的磁珠，再经过含有edta的洗脱缓冲液进行分离。色相柱尺寸排阻法：根据外泌体的粒径大小将外泌体和和其他粒径大小的蛋白质分离。peg沉淀过柱法：通过peg沉淀外泌体，再通过过离子柱将peg去除，最后用高盐溶液洗脱外泌体。正电荷捕获法：在固相载体上覆盖带正电荷的涂层，再通过正负电荷吸引捕获带负电荷的外泌体。
5.现有的外泌体技术均耗时(40min-10小时不等)，存在不同程度的提取试剂的污染(如peg沉淀法中沉淀试剂残留，如用过柱法中高盐试剂的残留，如磁珠吸附法中磁珠锚链抗体的污染，洗脱液edta的污染)，正电荷捕获虽然不造成提取试剂的污染，但对粒径为大于200nm的微囊泡和粒径在50-200nm的外泌体无法区分，色相柱尺寸排阻法对尿液外泌体提取效率低，大量的尿液中含有的大分子物质容易堵塞色相柱，且容易被粒径大约为100nm左右的脂蛋白污染。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种尿液外泌体提取试剂管，本发明的另一目的是提供一种制作上述尿液外泌体提取试剂管制作方法。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
8.本发明一种尿液外泌体提取试剂管，包括盖帽、外管和内管，所述外管的顶端表面螺纹套接有盖帽，所述外管的内部套接有内管，所述内管的内壁设置有纳米纤维膜。
9.作为本发明的一种优选技术方案，所述外管和内管的外壁均设置有容量刻度线，且外管和内管均为聚碳酸酯材料制成。
10.本发明提供的制作上述尿液外泌体提取试剂管制作方法，制作步骤如下：
11.a：将分子量9万的plla溶解后和壳聚糖按5:1的比例溶解于三氟乙醇溶液制备得到浓度为8wt％的混合溶液，并在25-30℃的室温下充分溶解plla和壳聚糖混合液；
12.b：用27g针头在8-10kv的高电压下,以0.5
–
1.0ml/h的速度推进注射器,用静置平面接收纳米纤维膜；
13.c：将纳米纤维膜放入乙醇和间甲苯酚的混合溶剂中，在25-30℃的室温溶脱60min后干燥；
14.d：将膜放入1.5mol/l氢氧化钠甲醇水溶液浸泡30min，获得多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜；
15.e：将50mg阳离子聚丙烯酰胺添加至100ml去离子水中，加热至50℃下搅拌，用naoh调节出ph＝7.0的溶液，将多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜浸入溶液中，在25-30℃的室温搅拌24小时后，干燥；
16.f：用紫外灯照射3小时，对阳离子聚丙烯酰胺与壳聚糖进行交联反应，则得到带正电荷多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜；
17.g：将正电荷多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜粘附在内管的内壁，将内管3与外管组合后拧上盖帽即可。
18.以上制作方法中，步骤c中乙醇和间甲苯酚的比例为1:1。
19.以上制作方法中，步骤d当中氢氧化钠甲醇水溶液的甲醇与水比例为1∶1。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
21.本发明可在短时间能完成整个反应，无需长时间等待；利用正负电荷吸引原理，不但无分离试剂的污染，还可以除掉尿液中粒径大小为50-200nm不带电荷的脂蛋白；正电荷多孔纳米纤维膜上的孔径大小为50-200nm左右，可得到高纯度的粒径大小为50-200nm的外泌体，防止其他粒径微囊泡的污染；正电荷多孔纳米纤维膜上多孔的结构大大提高了膜与样品的接触面积，增大尿液外泌体提取效率。
附图说明
22.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
23.图1是本发明的整体结构示意图；
24.图2是图1结构截面图；
25.图3是本发明的正电荷多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜制作流程图；
26.图4是本发明的尿液外泌体提取的流程图；
27.图中：1、盖帽；2、外管；3、内管；4、纳米纤维膜。
具体实施方式
28.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
29.实施例1
30.如图1-4所示，本发明提供一种尿液外泌体提取试剂管，包括盖帽1、外管2和内管3，外管2的顶端表面螺纹套接有盖帽1，外管2的内部套接有内管3，内管3的内壁设置有纳米纤维膜4。
31.外管2和内管3的外壁均设置有容量刻度线，且外管2和内管3均为聚碳酸酯材料制成。
32.尿液外泌体提取试剂管制作方法，制作步骤如下：
33.a：将分子量9万的plla溶解后和壳聚糖按5:1的比例溶解于三氟乙醇溶液制备得到浓度为8wt％的混合溶液，并在25-30℃的室温下充分溶解plla和壳聚糖混合液；
34.b：用27g针头在8-10kv的高电压下,以0.5
–
1.0ml/h的速度推进注射器,用静置平面接收纳米纤维膜；
35.c：将纳米纤维膜放入乙醇和间甲苯酚的混合溶剂中，在25-30℃的室温溶脱60min后干燥；
36.d：将膜放入1.5mol/l氢氧化钠甲醇水溶液浸泡30min，获得多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜；
37.e：将50mg阳离子聚丙烯酰胺添加至100ml去离子水中，加热至50℃下搅拌，用naoh调节出ph＝7.0的溶液，将多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜浸入溶液中，在25-30℃的室温搅拌24小时后，干燥；
38.f：用紫外灯照射3小时，对阳离子聚丙烯酰胺与壳聚糖进行交联反应，则得到带正电荷多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜；
39.g：将正电荷多孔plla/壳聚糖纳米纤维膜粘附在内管3的内壁，将内管3与外管2组合后拧上盖帽1即可。
40.进一步的，步骤c中乙醇和间甲苯酚的比例为1:1。
41.步骤d当中氢氧化钠甲醇水溶液的甲醇与水比例为1∶1。
42.具体的，内管3内壁的纳米纤维膜4为正电荷多孔纳米纤维膜，使用时首先用5ml磷酸盐缓冲液洗涤纳米纤维膜4一次后，将10ml尿液喷洒在纳米纤维膜4上将盖帽1盖合，以1000rpm的转速，进行离心1min去废液，再加入500ul磷酸盐缓冲液轻轻洗膜一次，吸去并丢掉洗涤液，以清除黏附在膜上大于200nm的微囊泡成分，最后加入500ul磷酸盐缓冲液反复冲洗纳米纤维膜4五次，以1000rpm的转速，进行离心1min，收集洗膜液(50-200nm直径外泌体)。
43.本发明可在短时间能完成整个反应，无需长时间等待；利用正负电荷吸引原理，不但无分离试剂的污染，还可以除掉尿液中粒径大小为50-200nm不带电荷的脂蛋白；正电荷多孔纳米纤维膜上的孔径大小为50-200nm左右，可得到高纯度的粒径大小为50-200nm的外
泌体，防止其他粒径微囊泡的污染；正电荷多孔纳米纤维膜上多孔的结构大大提高了膜与样品的接触面积，增大尿液外泌体提取效率。
44.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。