一株短小芽孢杆菌t5-1及其应用
技术领域：
：1.本技术属于马铃薯土传病害防控
技术领域：
：。技术背景2.马铃薯土传病害是指病原体生活在土壤中，条件适宜时从马铃薯根部或者茎部侵害马铃薯而引起的病害，由于其存在的条件限制，一般较难防控，常见的马铃薯土传病害有：疮痂病、枯萎病、黑痣病、青枯病等，对于马铃薯土传病害，重茬连作、施肥不当都是其主要的发病原因，近年来，随着我国马铃薯生产的快速发展，土传病害呈高发态势。3.对于马铃薯土传病害的防治，一般采用(1)土壤处理：麦草秸秆合尿素覆盖，封闭大棚，该方法一般用于温室大棚，(2)选用抗病品种：选用抗病或者耐病的品种，可大大地减轻土传病害的危害程度，(3)轮作：这是防治土传病害较为有效的措施，(4)改善栽培措施：通常选择小水勤浇，避免大水漫灌，合理密植，清洁田园等措施，(5)施肥管理：避免偏施氮肥，适当增施磷、钾肥，最好增施有机肥，提高作物抗病性。(6)药剂防治：该方法应用较多，但对土壤生态危害较大。4.本发明生产一株具有拮抗马铃薯疮痂病等病原菌的短小芽孢杆菌，能够有效抑制马铃薯疮痂病、黑痣病、枯萎病、早疫病等病原菌，促进植物生长，改善土壤生态环境。技术实现要素：5.本发明的第一目的是提供一株短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1，其保藏编号为cgmccno.23942。6.本发明所提供的短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmccno.23942，保藏日期为：2021年11月19日，保藏单位简称为cgmcc，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。7.本发明的第二目的是提供短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1在防治马铃薯土传病害防治菌剂中的应用。8.本发明提供的短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1，培养简单、周期短、无生态毒性、可利用的碳源种类丰富，能够有效促进植物生长，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病、黑痣病等病原菌的生长。附图说明：9.图1是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1菌落形态图。10.图2是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1抑菌结果图。11.图3是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1马铃薯疮痂病防治效果盆栽结果图。具体实施方式：12.如无特殊说明，下列实施例中待测菌株均指短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1。13.如无特殊说明，下列实施例中的活化均指短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1在马铃薯固体培养基上扩大培养三次。14.实施例115.菌种的分离与鉴定16.1.培养基：17.马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar，pda)培养基(1l)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph自然。18.2.菌株来源：19.短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1由发明人于2020年12月分离自广西南宁市武鸣区甘蔗地。20.取1g土样放入50ml离心管中，加入10ml无菌水震荡均匀，于37℃、200rpm的摇床上振荡30min，静置至澄清得土壤悬浮液。21.在超净工作台中将制备好的土壤悬浮液进行梯度稀释，分别取1100μl10-3、10-4、10-5倍稀释液在lb固体培养基上进行涂布，重复3次，37℃培养24h。24h后在超净工作台中挑取形态不同的菌落分别划线纯化，37℃培养24h，重复纯化3次。将得到的纯的单菌落转移到试管斜面培养基中，放入4℃冰箱保存备用。22.3.筛选结果：23.分离得到菌株如图1所示，命名为菌株t5-1，革兰氏阳性，该菌株为杆状，以二分裂方式增殖。菌落为黄白色，圆形，边缘整齐，扁平，光滑，有光泽，黏稠。产芽孢。分解葡萄糖、麦芽糖和其他糖类。24.4.细菌菌株鉴定方法：25.采用tiangen细菌基因组dna提取试剂盒提取基因组dna。以待测菌株基因组dna为模板，利用细菌16srrna基因通用引物27f/1492r扩增目的片段，pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将pcr原液送博迈德生物工程股份有限公司测序。16srrna基因序列分析，经过序列对比鉴定，菌株t5-1以mk757660.1(ncbi)为标准鉴定t5-1菌株为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)，测序序列如序列表中seqidno.1所述的序列。26.实施例227.菌株生理生化分析28.采用梅里埃api20ne非发酵g-杆菌鉴定试剂盒试验菌株t5-1生理生化指标。短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能利用丙酮酸盐，能利用葡萄糖、麦芽糖、kohn明胶、蜜糖、阿拉伯糖等。29.详细结果如下表：30.表1生理生化性质分析31.tablelanalysisofphysiologicalandbiochemicalproperties[0032][0033][0034]实施例3[0035]菌株对马铃薯黑痣病病原菌抑制效果[0036]马铃薯黑痣病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号：3.2888)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天；取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备菌悬液。[0037]将马铃薯黑痣病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块，对角线接种与马铃薯琼脂培养基上，将t5-1菌悬液吸取6μl两次，分别滴于空白对角线处。得到如图2a结果所示：短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯黑痣病病原菌生长。抑菌圈直径达15mm。[0038]菌株对马铃薯早疫病病原菌抑制效果[0039]马铃薯早疫病病原菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心(accc)编号：38869)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天；取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备菌悬液。[0040]将马铃薯早疫病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块，对角线接种与马铃薯琼脂培养基上，将t5-1菌悬液吸取6μl两次，分别滴于空白对角线处。得到如图2b结果所示：短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯早疫病病原菌生长，抑菌圈直径达10mm。[0041]菌株对疮痂链霉菌抑制效果[0042]马铃薯疮痂病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号：4.1765)在马铃薯培养基上28℃培养3天；用0.2ml无菌水刮取孢子和菌丝体，制成一定浓度的病原体悬液，要求100ul体积涂布平板时菌丝生长后可以铺满平板表面。[0043]取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备细胞悬液。[0044]将试验马铃薯疮痂病病原菌4.1765涂布于不同平板上(pda)，在平板上局部点接6ul菌株t5-1，28℃培养，5天以后观察。得到如图2c所示的实验结果：短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制马铃薯疮痂病病原菌4.1765生长。抑菌圈直径达10mm。[0045]菌株对马铃薯枯萎病病原菌抑制效果[0046]马铃薯枯萎病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号：3.18025)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天；取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备菌悬液。[0047]将马铃薯枯萎病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块，对角线接种与马铃薯琼脂培养基上，将t5-1菌悬液吸取6μl两次，分别滴于空白对角线处。得到如图2d结果所示：短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯枯萎病病原菌生长。抑菌圈直径达20mm。[0048]实施例4[0049]菌株耐盐测试试验[0050]基础培养基为lb液体培养基，向lb固体培养基中加入nacl调节盐质量浓度为1％、3％、5％、9％、11％，调节ph为7.0，121℃高压灭菌20min。[0051]将活化后的待测菌株t5-1分别接种于五种不同盐浓度的lb液体培养基上，以不接种菌的培养基为空白对照，放入37℃的恒温培养箱中培养24h观察菌株t5-1的生长情况。测定od值。[0052]结果如下，随着nacl质量浓度的升高，菌株t5-1的浓度逐渐降低，但是当nacl质量浓度达到11％时，还能生长，但生长明显收到抑制。证明该菌株可以在盐碱地改良中应用，具有耐盐性，适合作为微生物盐碱地改良剂。[0053]表2不同盐浓度下t5-1生长情况[0054][0055]实施例5[0056]菌株对不同ph敏感性测定[0057]基础培养基lb液体培养基，分别调节ph值为3、5、6、7、8、9、11。将活化后的待测菌株t5-1接种于六种ph值的敏感性测定培养基上，放入37℃的恒温培养箱中培养24h，观察待测菌株t5-1的生长情况。若菌株t5-1能够正常生长，说明该菌株t5-1能够耐受该ph；反之，则说明该菌株t5-1不能耐受该ph。测定其浓度od值，[0058]结果如下，当ph小于5以及大于9，菌株t5-1生长明显受到抑制，ph为9还能继续生长，但生长收到一定程度的抑制。证明该菌株能在ph为1-11的环境中存活及繁殖，即可以在盐碱地改良中应用，具有耐碱性，适合作为微生物盐碱地改良菌剂。[0059]表3不同ph下t5-1生长情况[0060][0061]实施例6[0062]菌株对马铃薯疮痂病防治盆栽试验[0063]将马铃薯品种夏波蒂组培苗移栽至蛭石的花盆(直径17cm)中，生长10d后选取长势一致的幼苗，采用灌根法接种100ml疮痂链霉菌(4.1765)(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号：4.1765)孢子悬液(1×106cfu/ml)于花盆中；再生长10d后接入100ml短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)菌株t5-1的发酵液(1×106cfu/ml)，对照组不加生防菌，并以未接种任何菌剂的处理为空白对照，每个处理重复3次。待马铃薯收获后，依据疮痂病病害分级标准，分别统计发病率、病情指数和防治效果。统计结果显示，只有病原菌处理的马铃薯发病率达到92.4％，病情指数达到57.7％而t5-1处理之后的马铃薯发病率为46.2％，病情指数为11.5％，菌株t5-1对马铃薯疮痂病的防效达到80.1％。[0064]马铃薯疮痂病发病统计：[0065]0级：薯皮健康，无病斑[0066]1级：1-2个零星病斑，或发病病斑面积为0-1/8(0-12.5％)[0067]2级：3-5个零星病斑，或发病病斑面积为1/8-1/4(12.5-25％)[0068]3级：6-10个零星病斑，或发病病斑面积为1/4-1/2(25-50％)[0069]4级：11-15个零星病斑，或发病病斑面积为1/2-3/4(50-75％)[0070]统计表[0071][0072][0073]发病率(％)＝发病块茎数/调查总块茎数×100[0074]病情指数(％)＝∑(各病级块茎数×该病级数代表值)/(调查个体总和×最高病级数)×100[0075]防效(％)＝(对照病指-处理病指)/对照病指×100。当前第1页12当前第1页12
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：1.本技术属于马铃薯土传病害防控
技术领域：
：。技术背景2.马铃薯土传病害是指病原体生活在土壤中，条件适宜时从马铃薯根部或者茎部侵害马铃薯而引起的病害，由于其存在的条件限制，一般较难防控，常见的马铃薯土传病害有：疮痂病、枯萎病、黑痣病、青枯病等，对于马铃薯土传病害，重茬连作、施肥不当都是其主要的发病原因，近年来，随着我国马铃薯生产的快速发展，土传病害呈高发态势。3.对于马铃薯土传病害的防治，一般采用(1)土壤处理：麦草秸秆合尿素覆盖，封闭大棚，该方法一般用于温室大棚，(2)选用抗病品种：选用抗病或者耐病的品种，可大大地减轻土传病害的危害程度，(3)轮作：这是防治土传病害较为有效的措施，(4)改善栽培措施：通常选择小水勤浇，避免大水漫灌，合理密植，清洁田园等措施，(5)施肥管理：避免偏施氮肥，适当增施磷、钾肥，最好增施有机肥，提高作物抗病性。(6)药剂防治：该方法应用较多，但对土壤生态危害较大。4.本发明生产一株具有拮抗马铃薯疮痂病等病原菌的短小芽孢杆菌，能够有效抑制马铃薯疮痂病、黑痣病、枯萎病、早疫病等病原菌，促进植物生长，改善土壤生态环境。技术实现要素：5.本发明的第一目的是提供一株短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1，其保藏编号为cgmccno.23942。6.本发明所提供的短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmccno.23942，保藏日期为：2021年11月19日，保藏单位简称为cgmcc，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。7.本发明的第二目的是提供短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1在防治马铃薯土传病害防治菌剂中的应用。8.本发明提供的短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1，培养简单、周期短、无生态毒性、可利用的碳源种类丰富，能够有效促进植物生长，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病、黑痣病等病原菌的生长。附图说明：9.图1是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1菌落形态图。10.图2是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1抑菌结果图。11.图3是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1马铃薯疮痂病防治效果盆栽结果图。具体实施方式：12.如无特殊说明，下列实施例中待测菌株均指短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1。13.如无特殊说明，下列实施例中的活化均指短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1在马铃薯固体培养基上扩大培养三次。14.实施例115.菌种的分离与鉴定16.1.培养基：17.马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar，pda)培养基(1l)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph自然。18.2.菌株来源：19.短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1由发明人于2020年12月分离自广西南宁市武鸣区甘蔗地。20.取1g土样放入50ml离心管中，加入10ml无菌水震荡均匀，于37℃、200rpm的摇床上振荡30min，静置至澄清得土壤悬浮液。21.在超净工作台中将制备好的土壤悬浮液进行梯度稀释，分别取1100μl10-3、10-4、10-5倍稀释液在lb固体培养基上进行涂布，重复3次，37℃培养24h。24h后在超净工作台中挑取形态不同的菌落分别划线纯化，37℃培养24h，重复纯化3次。将得到的纯的单菌落转移到试管斜面培养基中，放入4℃冰箱保存备用。22.3.筛选结果：23.分离得到菌株如图1所示，命名为菌株t5-1，革兰氏阳性，该菌株为杆状，以二分裂方式增殖。菌落为黄白色，圆形，边缘整齐，扁平，光滑，有光泽，黏稠。产芽孢。分解葡萄糖、麦芽糖和其他糖类。24.4.细菌菌株鉴定方法：25.采用tiangen细菌基因组dna提取试剂盒提取基因组dna。以待测菌株基因组dna为模板，利用细菌16srrna基因通用引物27f/1492r扩增目的片段，pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将pcr原液送博迈德生物工程股份有限公司测序。16srrna基因序列分析，经过序列对比鉴定，菌株t5-1以mk757660.1(ncbi)为标准鉴定t5-1菌株为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)，测序序列如序列表中seqidno.1所述的序列。26.实施例227.菌株生理生化分析28.采用梅里埃api20ne非发酵g-杆菌鉴定试剂盒试验菌株t5-1生理生化指标。短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能利用丙酮酸盐，能利用葡萄糖、麦芽糖、kohn明胶、蜜糖、阿拉伯糖等。29.详细结果如下表：30.表1生理生化性质分析31.tablelanalysisofphysiologicalandbiochemicalproperties[0032][0033][0034]实施例3[0035]菌株对马铃薯黑痣病病原菌抑制效果[0036]马铃薯黑痣病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号：3.2888)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天；取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备菌悬液。[0037]将马铃薯黑痣病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块，对角线接种与马铃薯琼脂培养基上，将t5-1菌悬液吸取6μl两次，分别滴于空白对角线处。得到如图2a结果所示：短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯黑痣病病原菌生长。抑菌圈直径达15mm。[0038]菌株对马铃薯早疫病病原菌抑制效果[0039]马铃薯早疫病病原菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心(accc)编号：38869)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天；取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备菌悬液。[0040]将马铃薯早疫病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块，对角线接种与马铃薯琼脂培养基上，将t5-1菌悬液吸取6μl两次，分别滴于空白对角线处。得到如图2b结果所示：短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯早疫病病原菌生长，抑菌圈直径达10mm。[0041]菌株对疮痂链霉菌抑制效果[0042]马铃薯疮痂病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号：4.1765)在马铃薯培养基上28℃培养3天；用0.2ml无菌水刮取孢子和菌丝体，制成一定浓度的病原体悬液，要求100ul体积涂布平板时菌丝生长后可以铺满平板表面。[0043]取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备细胞悬液。[0044]将试验马铃薯疮痂病病原菌4.1765涂布于不同平板上(pda)，在平板上局部点接6ul菌株t5-1，28℃培养，5天以后观察。得到如图2c所示的实验结果：短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制马铃薯疮痂病病原菌4.1765生长。抑菌圈直径达10mm。[0045]菌株对马铃薯枯萎病病原菌抑制效果[0046]马铃薯枯萎病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号：3.18025)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天；取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备菌悬液。[0047]将马铃薯枯萎病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块，对角线接种与马铃薯琼脂培养基上，将t5-1菌悬液吸取6μl两次，分别滴于空白对角线处。得到如图2d结果所示：短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯枯萎病病原菌生长。抑菌圈直径达20mm。[0048]实施例4[0049]菌株耐盐测试试验[0050]基础培养基为lb液体培养基，向lb固体培养基中加入nacl调节盐质量浓度为1％、3％、5％、9％、11％，调节ph为7.0，121℃高压灭菌20min。[0051]将活化后的待测菌株t5-1分别接种于五种不同盐浓度的lb液体培养基上，以不接种菌的培养基为空白对照，放入37℃的恒温培养箱中培养24h观察菌株t5-1的生长情况。测定od值。[0052]结果如下，随着nacl质量浓度的升高，菌株t5-1的浓度逐渐降低，但是当nacl质量浓度达到11％时，还能生长，但生长明显收到抑制。证明该菌株可以在盐碱地改良中应用，具有耐盐性，适合作为微生物盐碱地改良剂。[0053]表2不同盐浓度下t5-1生长情况[0054][0055]实施例5[0056]菌株对不同ph敏感性测定[0057]基础培养基lb液体培养基，分别调节ph值为3、5、6、7、8、9、11。将活化后的待测菌株t5-1接种于六种ph值的敏感性测定培养基上，放入37℃的恒温培养箱中培养24h，观察待测菌株t5-1的生长情况。若菌株t5-1能够正常生长，说明该菌株t5-1能够耐受该ph；反之，则说明该菌株t5-1不能耐受该ph。测定其浓度od值，[0058]结果如下，当ph小于5以及大于9，菌株t5-1生长明显受到抑制，ph为9还能继续生长，但生长收到一定程度的抑制。证明该菌株能在ph为1-11的环境中存活及繁殖，即可以在盐碱地改良中应用，具有耐碱性，适合作为微生物盐碱地改良菌剂。[0059]表3不同ph下t5-1生长情况[0060][0061]实施例6[0062]菌株对马铃薯疮痂病防治盆栽试验[0063]将马铃薯品种夏波蒂组培苗移栽至蛭石的花盆(直径17cm)中，生长10d后选取长势一致的幼苗，采用灌根法接种100ml疮痂链霉菌(4.1765)(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号：4.1765)孢子悬液(1×106cfu/ml)于花盆中；再生长10d后接入100ml短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)菌株t5-1的发酵液(1×106cfu/ml)，对照组不加生防菌，并以未接种任何菌剂的处理为空白对照，每个处理重复3次。待马铃薯收获后，依据疮痂病病害分级标准，分别统计发病率、病情指数和防治效果。统计结果显示，只有病原菌处理的马铃薯发病率达到92.4％，病情指数达到57.7％而t5-1处理之后的马铃薯发病率为46.2％，病情指数为11.5％，菌株t5-1对马铃薯疮痂病的防效达到80.1％。[0064]马铃薯疮痂病发病统计：[0065]0级：薯皮健康，无病斑[0066]1级：1-2个零星病斑，或发病病斑面积为0-1/8(0-12.5％)[0067]2级：3-5个零星病斑，或发病病斑面积为1/8-1/4(12.5-25％)[0068]3级：6-10个零星病斑，或发病病斑面积为1/4-1/2(25-50％)[0069]4级：11-15个零星病斑，或发病病斑面积为1/2-3/4(50-75％)[0070]统计表[0071][0072][0073]发病率(％)＝发病块茎数/调查总块茎数×100[0074]病情指数(％)＝∑(各病级块茎数×该病级数代表值)/(调查个体总和×最高病级数)×100[0075]防效(％)＝(对照病指-处理病指)/对照病指×100。当前第1页12当前第1页12
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