一种高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法

1.本发明涉及生物工程与生物技术领域，尤其涉及一种高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法。


背景技术：

2.传统化石能源的开发与利用为现代社会和工业的快速发展提供了可能。然而，在社会的快速发展下，由化石能源所带来的资源短缺与环境污染问题日益严重。因此，为解决环境污染和资源短缺的问题，人类必须开发新的可持续能源。生物能源是被认为可以替代化石能源的新型能源。生物能源可再生且对环境友好，同时在生物能源生产过程中也可以实现碳中和的宏大目标。因此以玉米秸秆等木质纤维素类等可再生原料生产生物能源具有巨大潜力。玉米秸秆价格便宜且产量巨大，如果可以开发出利用玉米秸秆作为原料生产以生物乙醇等的能源类物质，将能在很大程度上缓解甚至解决由化石资源所带来的几大问题。
3.然而非常遗憾的是，目前为止，利用木质纤维素等作为原料生产生物能源或者其他生物基品的技术还远没有被工业化，其中的主要原因是由木质纤维素类原料变成可发酵性糖要经过许多步骤。首先，结构致密的木质纤维素类原料首先需要通过预处理使其结构松散，然后预处理后的物料要通过纤维素酶将其酶解成可发酵性糖，最后再用可发酵性糖生产生物燃料或者其他生物基品。众多步骤导致了木质纤维素乙醇的生产成本难以到达工业化要求。在总成本中，酶水解步骤约占30％，因此酶水解过程的高成本一直是木质纤维素的工业化利用的瓶颈。因此只有开发高效的纤维素酶制剂才能降低酶解过程的成本，从而使得纤维素乙醇的生产成为可能。
4.目前，利用微生物发酵的方法生产纤维素酶已经有很长的历史，其中里氏木霉(trichoderma reesei)，草酸青霉(penicillium oxalicum)粗糙脉孢菌(neurospora crassa)等是目前为止已被证明可以生产纤维素酶的微生物，其中里氏木霉生产纤维素酶的产量高、酶系全，因此被研究的最为广泛。但遗憾的是，目前里氏木霉的产酶效率还不足以降低酶水解步骤的成本，因此还需要提高里氏木霉生产纤维素酶效率。在提高里氏木霉生产纤维素酶的效率过程中遇到了许多瓶颈，其中最为重要的问题是里氏木霉生产纤维素酶需要诱导物，里氏木霉只有在诱导物的诱导作用下才能分泌纤维素酶。诱导效果低且昂贵的诱导物的额外添加是纤维素酶生产成本高的最重要原因。因此为解决上述问题，本文的研究核心是开发出价格低廉且高效的纤维素酶诱导物，降低纤维素酶生产成本，从而进一步降低木质纤维素利用成本，为木质纤维素工业化利用提供了可能。
5.目前工业上主要采用乳清作为里氏木霉的产纤维素酶的诱导物，但乳糖价格昂贵且对里氏木霉诱导效果不佳，其他研究中的诱导物研究主要集中在微晶纤维素，处理后的木质纤维素原料等，但微晶纤维素价格更为昂贵，而木质纤维素物料诱导效果极差，因此这些原料都不能满足工业上的要求。近年来，大量的工作表明由β-糖苷键连接而成的寡糖类物质如(纤维二糖、龙胆二糖、槐糖等)可以高效诱导里氏木霉生产纤维素酶。但是由于分离
纯化等因素成本高，使其价格十分昂贵。因此，如果可以实现上述寡糖类物质的低成本的高效生产，就可以实现纤维素酶的高效生产。从而降低纤维素酶生产成本并进一步降低木质纤维素利用成本。
6.因此，本领域的技术人员致力于开发一种低成本的高效生产的高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法。


技术实现要素：

7.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种低成本高效生产高效的纤维素酶诱导物以及其制备方法和应用方法。
8.为实现上述目的，本发明提供了一种高效纤维素酶诱导物，该诱导物为二糖和多聚寡糖的混合物acm(acid-catalyzed mixture)，其中二糖包括槐糖、和\或龙胆二糖、和\或纤维二糖。
9.本发明还提供了一种高效纤维素酶诱导物的制备方法，以葡萄糖或含有葡萄糖的糖浆为底物，通过酸催化葡萄糖的化学反应，制备高效纤维素酶诱导物；过程中通过acm流加补料策略，控制发酵反应中还原糖的浓度在1g/l以下。
10.进一步地，上述酸包括能够提供h 进行催化的化学试剂。
11.进一步地，能够提供h 进行催化的化学试剂包括液体酸或固体酸，液体酸包含硫酸、磷酸或盐酸等，固体酸包括amberlyst15或amberlyst35等。
12.进一步地，所采用的酸为硫酸，且酸的浓度不低于40mm。
13.进一步地，底物中葡萄糖的浓度大于或者等于300g/l。
14.进一步地，底物中葡萄糖浓度不低于700g/l。
15.进一步地，液体酸的浓度大于1mm，固体酸的浓度大于0.01％(重量/重量)。
16.进一步地，催化的方法为将酸加入底物中，然后孵育，孵育的温度为50-250℃，孵育的时间为1min
–
100h，其中加入的酸的浓度越高，孵育的温度越低，孵育的时间越短。
17.进一步地，所采用的温度不低于120℃，加热时间不低于1h。
18.进一步地，配制好700g/l的葡萄糖溶液后，加20ml葡萄糖溶液到50ml的防爆瓶中，加浓硫酸127.6μl使得硫酸浓度为120mm，并于140℃油浴锅中加热1h。
19.本发明还提供一种高效纤维素酶诱导物在高效生产纤维素酶的应用。
20.进一步地，应用方法包括以下步骤：以acm为碳源和诱导物，培养可以生产纤维素酶及其组分的微生物高效生产纤维素酶，微生物包括自然界或通过人工诱变和基因改造的。
21.进一步地，可以生产纤维素酶及其组分的微生物包括里氏木霉(trichoderma reesei)或草酸青霉(penicillium oxalicum)，将里氏木霉(trichoderma reesei)或草酸青霉(penicillium oxalicum)的孢子接种于固体培养基(pda)中，温度为28℃条件下培养7天，用无菌水洗，得到孢子液体；将孢子液体接种于液体培养基中，在温度为28℃，转速为150rpm条件下摇床培养24h，即得到菌丝液体；用acm作为产酶培养基的唯一碳源，诱导菌丝液体生产纤维素酶。
22.进一步地，以acm作为碳源和诱导物培养t.reesei时，发酵罐内的葡萄糖浓度小于1g/l。
23.进一步地，纤维素酶生产菌株来自t.reesei，美国典型培养物保藏中心编号为atcc56765及中国工业微生物保藏中心编号为cicc13052的t.reesei rut c30。
24.本发明，技术人员可以根据t.reesei培养的常识，对发酵培养基的组成进行调整。
25.在本发明的较佳实施方式1中，详细说明使用硫酸催化葡萄糖反应制备acm；
26.在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明使用固体酸amberlyst15催化葡萄糖反应制备acm；
27.在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明以硫酸作为催化剂制备出的acm作为碳源和诱导物在摇瓶中培养t.reesei rut c30高效生产纤维素酶；
28.在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明以acm作为碳源和诱导物在发酵罐中诱导t.reesei rut c30产纤维素酶。
29.与现有技术相比,本发明具有如下突出优势：
30.本发明中的acm是含有葡萄糖和槐糖，龙胆二糖，纤维二糖及其他多聚寡糖的混合物，通过控制葡萄糖浓度在1g/l以下，有利于菌丝生长而不抑制纤维素酶的生产，以槐糖为主的β-二糖可以高效诱导合成纤维素酶，缩短发酵时间，节省过程能耗，从而降低纤维素酶的成本。
31.本发明中acm的制备仅需要硫酸作为催化剂，制备时间短，制备过程简单，大大降低了生产设备投资，降低了纤维素酶的成本。
32.本发明中acm其反应后ph接近2，不仅易于储存，且添加至发酵产酶培养基中不会对发酵体系的ph发生变化。
33.本发明中的高酶活的纤维素酶可以直接用于木质纤维素类生物质炼制过程中纤维素组分的水解。
34.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
35.图1是本发明的一个较佳实施例1的硫酸催化葡萄糖反应制备acm的流程示意图；
36.图2是本发明的一个较佳实施例1的硫酸催化葡萄糖反应制备acm的成分测定色谱图；
37.图3是本发明的一个较佳实施例3的以硫酸作为催化剂制备出的acm作为碳源和诱导物在摇瓶中培养t.reesei rut c30高效生产纤维素酶与其他常用诱导物诱效果柱状图；
38.图4是本发明的一个较佳实施例4的以acm作为碳源和诱导物在发酵罐中诱导t.reesei rut c30产酶的工艺流程图；
39.其中，1-调节阀，2-增湿器中增湿，3-发酵罐，4-溶氧(do)检测系统，5-检测系统，6-水循环系统，7-ph系统，8-氨水储藏罐，9-第一蠕动泵，10-acm储槽，11-第二蠕动泵，12-消泡剂储槽，13-第三蠕动泵；
40.图5是本发明的一个较佳实施例4的以acm作为碳源和诱导物在发酵罐中随发酵时间诱导t.reesei rut c30产酶的结果变化图。
具体实施方式
41.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
42.在附图中，结构相同的部件以相同数字标号表示，各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。
43.实施例1、硫酸催化葡萄糖反应制备acm
44.硫酸催化葡萄糖反应制备acm的流程如图1所示，配制700g/l葡萄糖溶液，向1l的葡萄糖溶液中添加6.39ml的浓硫酸使其最终浓度为120mm，在140℃条件下加热1h，即可制备可溶性诱导物acm；硫酸催化葡萄糖反应制备的acm的成分测定如图2所示，经过测定acm中含葡萄糖390g/l及槐糖4.6g/l，龙胆二糖46g/l，纤维二糖4g/l。
45.实施例2、固体酸amberlyst15催化葡萄糖反应制备acm
46.配置700g/l葡萄糖溶液，添加固体酸的浓度是葡萄糖浓度的3％(质量分数)，在140℃条件下加热3h，即可制备可溶性诱导物acm，经过测定acm中含葡萄糖390g/l及槐糖12.3g/l，龙胆二糖30g/l，纤维二糖12g/l。
47.实施例3、以硫酸作为催化剂制备出的acm作为碳源和诱导物在摇瓶中培养t.reesei rut c30高效生产纤维素酶。
48.测定acm中还原糖的浓度，待t.reesei rut c30培养基灭完菌后，再向其中添加1％还原糖(质量分数)的acm作为碳源和诱导物，诱导t.reesei rut c30生产纤维素酶，以硫酸作为催化剂制备出的acm作为碳源和诱导物在摇瓶中培养t.reesei rut c30高效生产纤维素酶与其他常用碳源的诱导效果对比如图3所示，acm的诱导能力与微晶纤维素相比差异不大，但是诱导效果远远大于乳糖，是乳糖诱导效果的1.5倍。
49.实施例4、以acm作为碳源和诱导物在发酵罐中诱导t.reesei rut c30产酶
50.批式补料流加培养t.reesei rut-c30生产纤维素酶工艺流程如图4所示，空压机的空气通过调节阀1进入气体增湿器2中增湿，然后进入发酵罐3，并与溶氧(do)检测系统4联动控制发酵液中do不低于20％，以满足菌丝生长和纤维素酶生物合成的需求。温度检测系统5与水循环系统6调节系统温度，ph系统7和氨水储藏罐8以及第一蠕动泵9联动，控制发酵过程中ph不低于4.2。acm储槽10和第二蠕动泵11联动，检测发酵液中葡萄糖浓度，控制acm的流加，消泡剂储槽12和第三蠕动泵13联动，及时消除培养过程中产生的泡沫。
51.具体包括如下步骤：
52.1.斜面培养：从-80℃冰箱取少量t.reesei rut c30孢子接种于pda培养基中，在28℃条件下培养7天，用无菌水洗下孢子。
53.2.种子培养：将步骤1中洗下的孢子，接种于含4g/l葡萄糖和10g/l的玉米浆培养基中，于28℃和150rpm条件下培养24h制备菌丝液体，作为种子液。
54.3.发酵培养：按10％接种量接种至3l发酵培养基的发酵罐中，在发酵的前12h-36h为菌体生长的主要阶段，控制发酵温度为28℃，流加氨水使得ph不低于4.2，同时补充氮源。检测发酵液中葡萄糖的浓度，待发酵液中葡萄糖耗尽时将温度降低到25℃，并开始流加acm，每4h检测一次发酵罐中的葡萄糖浓度，保证管内葡萄糖浓度小于1g/l。滤纸酶活采用
国际理论纯粹化学会iupac颁发的标准方法，发酵结果如图5所示，培养96h发酵液中纤维素酶活单位达到20fpu/ml
55.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。