通过分子标志物检测脑胶质瘤分级或免疫浸润程度的试剂盒的制作方法

1.本公开涉及生物医药技术领域，具体地，涉及检测分子标志物表达量的试剂在制备脑胶质瘤分级或免疫浸润程度的试剂中的应用、用于检测脑胶质瘤分级及免疫浸润程度的试剂盒。


背景技术：

2.脑胶质瘤是临床上最常见的颅内恶性肿瘤，由于各种理化、遗传等因素的影响，胶质瘤的发病率常居于颅内肿瘤首位，占颅脑肿瘤的50％左右，胶质瘤因具有发病隐匿，生长速度快，易侵袭与转移，病死率高，平均生存期短等特点，已经成为了对人生命健康造成极大危害的疾病类型。
3.因此，亟需发现新的能够检测胶质瘤免疫浸润程度及对脑胶质瘤分级的分子标志物，能够用于预测脑胶质瘤患者的预后，并有助于为个体化治疗提供参考。


技术实现要素：

4.本公开提供了检测分子标志物的试剂在制备脑胶质瘤分级试剂中的应用，该试剂通过检测分子标志物的表达量，评估脑胶质瘤分级及免疫浸润程度。为了实现上述目的，一方面，本公开提供了检测分子标志物表达量的试剂在制备脑胶质瘤分级试剂中的应用，其中，所述分子标志物为card9。
5.另一方面，本公开提供了检测分子标志物表达量的试剂在制备脑胶质瘤免疫浸润程度评估试剂中的应用，其中，所述分子标志物为card9。
6.根据本公开，所述检测分子标志物表达量的试剂为pcr试剂、western 印迹、north-western印迹、免疫吸附测定法、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射免疫测定法、免疫放射测定法、免疫酶测定法的检测试剂。
7.根据本公开，所述检测分子标志物表达量的过程通过如下步骤进行：
8.1)获得脑胶质瘤组织样品；以及
9.2)确定样品中分子标志物的表达量。
10.根据本公开，其中，所述步骤2)的方法选自pcr方法、western印迹、 north-western印迹、免疫吸附测定法、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射免疫测定法、免疫放射测定法和免疫酶测定法。
11.另一方面，本公开还提供了一种用于检测脑胶质瘤分级或免疫浸润程度的试剂盒，其中，所述试剂盒包括定量检测分子标志物表达量的试剂，所述分子标志物为card9。
12.根据本公开，其中，所述试剂包括pcr试剂、western印迹、north-western 印迹、免疫吸附测定法、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射免疫测定法、免疫放射测定法、免疫酶测定法的检测试剂。
13.通过上述技术方案，本公开提供的通过检测脑胶质瘤中card9的表达量，基于card9的表达水平，能够评估患者脑胶质瘤的免疫微环境并对患者的临床预后进行预测，从
而针对患者进行个体化治疗。
14.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
15.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
16.图1是免疫组织化学染色检测不同级别和不同idh突变状态的脑胶质瘤中card9的表达水平。
17.图2是免疫组织化学染色显示card9信号分布在血管结构周围。
18.图3是通过转录组测序结果比较肿瘤组织切片不同结构区域的card9 mrna的表达水平。
19.图4展示的是通过全转录组数据利用microenvironment cell populations-counter算法计算出的不同类型细胞在card9表达高和表达低胶质瘤样本中的分布情况。
20.图5是单细胞转录组测序数据展示card9在不同细胞中的表达情况。
21.图6是card9表达水平与免疫检查点表达水平的相关性。
22.图7是card9在全级别胶质瘤中的预后价值。
23.图8是card9在较低级别胶质瘤中的预后价值。
24.图9是card9在高级别胶质瘤中的预后价值。
具体实施方式
25.以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
26.一方面，本公开提供一种检测分子标志物表达量的试剂在制备脑胶质瘤分级试剂中的应用，其中，所述分子标志物为card9。
27.另一方面，本公开提供一种检测分子标志物表达量的试剂在制备脑胶质瘤免疫浸润程度评估试剂中的应用，其中，所述分子标志物为card9。
28.其中，card9的全称为“caspase recruitment domain family member 9”， ncbi数据库中的gene id为64170。
29.根据本公开，其中，所述检测分子标志物表达量的试剂为pcr试剂、 western印迹、north-western印迹、免疫吸附测定法、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射免疫测定法、免疫放射测定法、免疫酶测定法的检测试剂。
30.例如，所述检测试剂可以为atlas antibodies公司货号为hpa059502 的抗体。
31.根据本公开，其中，所述检测分子标志物表达量的过程通过如下步骤进行：
32.1)获得脑胶质瘤组织样品；以及
33.2)确定样品中分子标志物的表达量。
34.根据本公开，其中，所述步骤2)的方法选自pcr方法、western印迹、 north-western印迹、免疫吸附测定法、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射免疫测定法、免疫放射测定法和免疫酶测定法。
35.另一方面，本公开提供了一种用于检测脑胶质瘤分级或免疫浸润程度的试剂盒，
其中，所述试剂盒包括定量检测分子标志物表达量的试剂，所述分子标志物为card9。
36.根据本公开，其中，所述试剂包括pcr试剂、western印迹、north-western 印迹、免疫吸附测定法、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射免疫测定法、免疫放射测定法、免疫酶测定法的检测试剂。
37.下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
38.实施例1
39.本实施例用于说明card9可以作为脑胶质瘤免疫浸润程度检测的新靶点。
40.分子标志物为card9，ncbi gene id:64170、优选使用的抗体为atlasantibodies公司货号为hpa059502的抗体。
41.(1)利用免疫组化检测card9蛋白，并观察其在不同级别胶质瘤的表达。
42.在43例胶质瘤样本中通过免疫组织化学染色观察card9的蛋白表达水平，具体结果见图1，图1表示免疫组织化学染色检测不同级别和不同idh 突变状态的脑胶质瘤中card9的表达水平，左侧是代表性染色图，右侧是免疫组化信号强度统计图。由图1可知，card9的蛋白表达水平随胶质瘤恶性程度升高而升高。
43.(2)通过全转录组数据分析、免疫荧光染色、单细胞转录组测序分析 card9与免疫浸润的关系。
44.在上述card9蛋白免疫组化测试图1中，观察card9在血管周围等其余位置的表达分布；并在evy公开的转录组测序数据中观察card9在胶质瘤组织切片不同组织结构位置的表达水平；在中国脑胶质瘤基因图谱计划中收录的325例胶质细胞瘤转录组测序数据中，通过card9 mrna表达水平将其分为card9表达高和card9表达低两组，通过microenvironmentcell populations-counter算法计算出的不同样本中不同类型细胞多少的评分，并比较其在card9表达高和card9表达低两组中的表达水平，具体结果见图2。
45.图2(左)是免疫组织化学染色显示card9信号分布在血管结构周围；图2(中)是通过转录组测序结果比较肿瘤组织切片不同结构区域的card9 mrna的表达水平；图2(右)是microenvironment cell populations-counter 算法计算出的不同类型细胞在card9表达高和表达低胶质瘤样本中的分布情况。由图2可以得出card9在胶质瘤样本血管结构周围显著高表达， card9表达高的胶质瘤中多个免疫相关细胞的浸润程度增加。
46.在325例胶质瘤样本中，通过cibersort算法计算出的不同免疫细胞在card9表达高和表达低胶质瘤样本中的分布情况；然后通过免疫荧光染色观察card9和巨噬细胞的标记物在胶质瘤样本中的分布情况；并通过公开的单细胞转录组数据(geo:ges131928)比较card9在不同细胞中的表达情况；最后在上述325例胶质瘤样本中，通过相关性分析展示了card9表达水平与常见的免疫检查点表达水平的相关性，具体结果见图3-4。图3是单细胞转录组测序数据展示card9在不同细胞中的表达情况；图4是 card9表达水平与免疫检查点表达水平的相关性结果。由图3-4可以得出 card9的表达高的胶质瘤中免疫抑制相关的m2型巨噬细胞和调节型t细胞(treg细胞)浸润显著升高，而card9在胶质瘤相关的巨噬细胞中表达也显著升高，此外card9的表达水平与多个免疫检查点的表达升高也显著正相关(如图6所示)。
47.(3)通过全转录组数据分析card9表达水平胶质瘤患者预后的关系。
48.分别观察在上述325例胶质瘤样本中card9在全级别胶质瘤、较低级别胶质瘤(2级
和3级)、和胶质母细胞瘤(4级)中的预后价值，具体结果见图5，card9的表达水平在全级别胶质瘤、较低级别胶质瘤和高级别胶质瘤中的预后价值；可以得出card9的表达水平在全级别胶质瘤(图7)、较低级别胶质瘤(图8)和高级别胶质瘤(图9)中均具有显著的预后价值， card9表达高的患者预后显著短于card9表达低的患者。
49.通过上述技术方案，card9能够作为检测脑胶质瘤分级及免疫浸润程度的分子标志物，本公开基于card9的表达水平，能够评估患者脑胶质瘤的免疫微环境并对患者的临床预后进行预测，从而针对患者进行个体化治疗。
50.以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
51.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
52.此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。