一种洛克米兰醇羟基衍生物、其制备方法和应用

1.本发明属于药物技术领域，具体地说涉及洛克米兰醇羟基衍生物，同时还 涉及该洛克米兰醇羟基衍生物的制备方法，以及该洛克米兰醇羟基衍生物在制 备抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.癌症或肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，目前死亡率据世界卫 生组织统计已经上升到第一位。癌症或肿瘤的治疗方法主要有手术、放射和化 学药物治疗三种方法。但是目前临床上很大程度上仍以化学药物治疗为主。现 有化疗药物是非手术治疗癌症或肿瘤的常用方法之一，存在有效剂量和中毒剂 量非常接近、毒副作用等问题，其中以消化功能受损和骨髓造血功能受抑制等 反应最为明显，往往使癌症或肿瘤患者因反应严重而难以接受化疗或不能坚持 完成整个疗程。另外，放疗和化疗没有选择性，对正常组织有严重的副作用， 并能诱导癌症细胞产生耐药性。高效低毒的抗癌药物研究是目前国内外研究的 热点和重点。
3.wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，其功能最常见于胚胎发育和 癌症，但也参与成年动物的正常生理过程。在多种恶性肿瘤中，wnt信号通路 往往处于高度激活状态，在结直肠癌、乳腺癌和肝癌中尤为突出。最新研究表 明，经典的wnt/β-catenin信号通路对于调节肿瘤细胞的自我更新能力、维持肿 瘤细胞的干性有着至关重要的作用。发现靶向wnt信号通路抗结直肠癌药物的 药物已经成为一个研究热点。
4.中国发明专利公开号cn113149942a于2021年7月23日公开了一种洛克米兰 醇酚羟基衍生物、其制备方法其结构为洛克米兰醇酚羟基衍生物，主要作用机 制途径为mapk信号通路抑制剂。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种具有纳摩尔级的抗结直肠癌、 抗白血病和乳腺癌的活性的洛克米兰醇羟基衍生物。
6.本发明的另一目的在于提供该洛克米兰醇羟基衍生物的制备方法。
7.本发明的再一目的在于提供该洛克米兰醇羟基衍生物在制备抗结直肠癌、 抗白血病、mapk信号通路及wnt信号通路抑制剂药物中的应用。
8.本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：
9.本发明的一种洛克米兰醇羟基衍生物，具有下述结构式(ⅰ)：
[0010][0011]
其中：r为甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，5-溴戊基，烯丙基， 异戊烯基，炔丙基，2-丁炔基，乙酰基，丙酰基，戊酰基，苯甲酰基，对硝基 苯甲酰基，乙基磺酰基，丙基磺酰基或苯基磺酰基。
[0012]
本发明的一种洛克米兰醇羟基衍生物的制备方法，包括下述步骤：
[0013]
(1)化合物3的合成
[0014]
称取20g芹菜素(化合物1，0.0740mol)放入500ml的圆底烧瓶中，向烧 瓶中加51g无水碳酸钾(5.0eq)和250ml丙酮做溶剂，搅拌下缓慢加入24.5 ml硫酸二甲酯(3.5eq)，将体系放入油浴锅70℃下加热回流72h。tlc跟踪 反应，反应结束后，冷却至室温，用氨水调节ph＝11。过滤除去沉淀，滤液用 饱和食盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥后，旋干部分溶剂，加入硅胶拌样， 使用快速硅胶柱纯化(氯仿:丙酮＝8:2)得到淡黄色固体化合物；
[0015]
称取700mg的化合物2，加入80ml二氯甲烷和60ml丙酮混合溶剂，缓 慢加入140ml浓度为11.6g/ml的一硫酸氢钾复合盐水溶液，得到化合物3，反 应路线如下：
[0016][0017]
(2)化合物4与5混合物的合成
[0018]
称取800mg的化合物3(2.44mmol)，加入40ml乙腈和30ml甲醇和12.6 当量的反式肉桂酸甲酯5.0g，用氙气灯进行强光照射，反应17h后，得到产 物化合物4与5的混合物，反应路线如下：
[0019][0020]
(3)化合物6的合成
[0021]
称取1g的化合物4与5的混合物，加入30ml的甲醇和10ml浓度为0.5 m的甲醇钠的
甲醇溶液，于70℃条件回流4h，得到化合物6，反应路线如下：
[0022][0023]
(4)化合物7的合成
[0024]
称取2g化合物6，加入100ml的dmso和氯化锂170mg，于100℃的搅拌8h，得到化合物7，反应路线如下：
[0025][0026]
(5)化合物8的合成
[0027]
称取3.27g的三乙酰氧基硼氢化钠加入200ml乙腈和1.2ml冰乙酸，然后缓慢加入700mg的化合物7，于40℃搅拌8h，得到化合物8，反应路线如下：
[0028][0029]
(6)化合物9的合成
[0030]
称取30mg化合物8(0.069mmol)置于25ml的圆底烧瓶中，加入2mldcm作为溶剂，加入28.7μlet3n(0.207mmol)，11μl氯乙酰氯(0.138mmol)和催化量dmap，室温搅拌10h，得到化合物9，反应式如下：
[0031]
[0032]
(7)化合物10a到10w合成
[0033]
称取30mg的1-氯乙酰基-4'-脱甲氧基洛克米兰醇(9,0.059mmol)，加入 5ml的dmf溶液，16.3mg的碳酸钾(0.118mmol)，1.5当量的酸(0.085mmol)， 于70℃的恒温油浴锅中，加热12h，得到系列衍生物10a到10w，反应路线如 下：
[0034][0035]
本发明的洛克米兰醇羟基衍生物在制备抗结直肠癌，抗白血病和抗乳腺癌 药物中的应用。
[0036]
本发明的洛克米兰醇羟基衍生物在制备mapk信号通路及wnt信号通路 抑制剂药物中的应用。
[0037]
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本 发明以芹菜素为原料，在硫酸二甲酯作用下生成化合物2，其在过一硫酸氢钾 复合盐的作用下被氧化为化合物3，化合物3与肉桂酸甲酯在氙灯光照下发生 光催化[3 2]反应得到互变化合物4/5，化合物4/5在甲醇的甲醇钠溶液中发生类 似频哪醇重排得到化合物6，化合物7在氯化锂作用下脱去甲氧基得到化合物 7，其经过三乙酰氧基硼氢化钠还原得到化合物8，化合物8在氯乙酰氯作用下 得到活性先导物1-氯乙酰基洛克米兰醇(化合物9)，1-氯乙酰基洛克米兰醇 (化合物9)在不同酸或者胺作用下，得到不同结构的1-酸基或者胺基取代的 洛
克米兰醇衍生物。本发明化合物具有纳摩尔级的抗结直肠癌、抗白血病及抗 乳腺癌的活性，通过抑制mapk及wnt信号通路进而诱导结直肠细胞调亡与 细胞周期阻滞。用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
附图说明
[0038]
图1为化合物10r对hct116肿瘤细胞处理48小时的周期影响图；
[0039]
图2为化合物10r对hct116肿瘤细胞的周期不同阶段的百分比图；
[0040]
图3为化合物10r诱导hct116肿瘤细胞凋亡图；
[0041]
图4为化合物10r诱导肿瘤细胞凋亡的柱状统计图；
[0042]
图5化合物10r对hct116克隆球形成的影响
[0043]
图6化合物10r对hct116克隆球形成数目统计图
[0044]
图7为化合物10r对相关凋亡蛋白的影响图；
[0045]
图8为化合物10r对相关周期蛋白的影响图；
[0046]
图9为化合物10r对mapk信号通路相关蛋白的影响图；
[0047]
图10为化合物10r对wnt信号通路相关蛋白的影响图；
具体实施方式：
[0048]
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来 限定本发明。
[0049]
实施例1：目标化合物10a的制备方法，包括以下步骤：
[0050]
(1)化合物3合成
[0051][0052]
称取20g芹菜素(化合物1，0.0740mol)放入500ml的圆底烧瓶中，向烧 瓶中加51g无水碳酸钾(5.0eq)和250ml丙酮做溶剂，搅拌下缓慢加入24.5 ml硫酸二甲酯(3.5eq)，将体系放入油浴锅70℃下加热回流72h。tlc跟踪 反应，反应结束后，冷却至室温，用氨水调节ph＝11。过滤除去沉淀，滤液用 饱和食盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥后，旋干部分溶剂，加入硅胶拌样， 使用快速硅胶柱纯化(氯仿:丙酮＝8:2)得到淡黄色固体化合物2(12g)， 产率52.3％。
[0053]
称取700mg的化合物2(2.24mmol)，加入1000ml的圆底烧瓶中，然 后分别加入80ml二氯甲烷和60ml丙酮，置于常温搅拌器上进行搅拌溶解， 然后配置缓冲液200ml(16g碳酸钠、7.6g碳酸氢钠、200ml水)，在圆底 烧瓶中加入配置好的缓冲液，进行搅拌30分钟。称取过一硫酸氢钾复合盐12 g，加入140ml水进行超声溶解。在圆底烧瓶上放置滴液漏斗，加入140ml的 盐溶液，进行缓慢滴加，约5-7秒每滴。待盐溶液滴加完之后，用ph试纸对反 应液进行检测，使反应体系ph＝9。进行搅拌过夜，薄层硅胶色谱进行监测。 继续配置140ml的过一硫酸氢钾复合盐溶液，重复进行滴加，待盐溶液滴加 完之后，用ph试纸对反应液进行检
测，用饱和碳酸钠水溶液调至ph＝9。再 次进行搅拌过夜，薄层硅胶色谱监测。继续重复前面实验步骤。之后关掉常温 搅拌器，静置大约30min。分离得到二氯甲烷层，浓缩有机层，得到少部分的 浓缩液，加入一水合对甲苯磺酸调ph＝3，室温下搅拌2h。薄层硅胶色谱监测， 然后进行拌样。用氯仿：甲醇＝50：1，进行快速正相硅胶柱纯化，得到黄色 固体化合物3(350mg)，产率为50％。
[0054]
(2)化合物4与5混合物的合成
[0055][0056]
化合物4与5混合物的合成：称取800mg的化合物3(2.44mmol)于250 ml的圆底烧瓶中，加入40ml乙腈和30ml甲醇进行搅拌溶解。再加入反式肉 桂酸甲酯5.0g，室温下进行搅拌溶解。使用隔膜泵对其进行氩气(ar)脱气保 护，进行多次换气，确保圆底烧瓶内全部充满氩气。将圆底烧瓶置于0℃的低 温恒温搅拌器中进行搅拌。之后用氙气灯进行强光照射反应。在0℃条件下搅 拌17-20h后，薄层硅胶色谱检测反应，待原料点反应完之后。使用旋蒸蒸发 仪在水泵减压作用下浓缩溶剂至干得到化合物4与5的混合物，直接下一步备 用。
[0057]
(3)化合物6的合成
[0058][0059]
称取上一步反应过后的化合物4与5的混合物1g，加入30ml的甲醇溶解， 在室温条件下搅拌，缓慢加入10ml浓度为0.5m甲醇钠的甲醇溶液，然后将 体系置于70℃条件下，油浴回流4h。薄层硅胶色谱监测反应，待反应完全后， 冷却体系至室温，加入20ml的饱和氯化铵溶液淬灭反应，再加入100ml的 水。用乙酸乙酯萃取3次，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。之后进行快速柱层析纯化。用氯仿：丙酮9:1的混合溶剂洗脱，得到棕色油状物化合物6，重量920mg，产率76.9％。
[0060]
(4)化合物7的合成
[0061][0062]
称取2g的化合物6(0.0035mol)于250ml的圆底烧瓶中，加入100ml的dmso溶解。然后加入170mg的氯化锂(1.1当量)，再加入2ml的水在室温条件下搅拌30min，之后将圆底烧瓶置于100℃的恒温油浴锅中加热过夜。薄层硅胶色谱进行反应监测，待反应完成。将反应体系冷却至室温，加入100ml的水，用乙酸乙酯进行萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得到有机层。用石油醚：乙酸乙酯＝7：3的混合溶剂进行快速正相柱层析得到黄色固体化合物7(820mg)，产率46.1％。
[0063]
(5)化合物8的合成
[0064][0065]
称取3.27g的三乙酰氧基硼氢化钠(9.0当量)于250ml的圆底烧瓶中，加入200ml乙腈和1.2ml冰乙酸，室温下搅拌20min。用90ml乙腈将700mg的化合物7(1.38mmol)进行溶解，然后缓慢滴加至反应体系，搅拌30min后，将圆底烧瓶置于40℃的恒温油浴锅中加热。薄层硅胶色谱监测，待反应完成。在反应体系中加入30ml的饱和氯化铵溶液淬灭反应，再加入100ml的水，用乙酸乙酯进行萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得到反应物。用石油醚：乙酸乙酯＝1：0.5的混合溶剂进行正相柱层析，得到白色固体化合物8(420mg)，产率69.2％。
[0066]
洛克米兰醇(8).白色固体；熔点136-137℃1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.13
–
7.07(5h,m),6.99(2h,d,j＝7.1hz),6.69
–
6.66(2h,m),6.29(1h,d,j＝1.9hz),6.14(1h,d,j＝1.9hz),4.81(1h,d,j＝6.3hz),4.00(1h,dd,j＝14.1,6.5hz),3.90(3h,s),3.84(3h,s),3.71(3h,s),3.30(1h,s),2.74(1h,td,j＝14.0,6.5hz),2.20(1h,dd,j＝14.0,6.9hz),1.72(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:163.9,161.0,158.6,157.0,138.7,128.9,128.9,128.1,128.1,127.6,127.6,126.8,126.2,112.7,107.7,103.5,94.8,92.4,89.4,79.0,55.8,55.6,55.0,53.2,36.4,30.9；esimsm/z457.0[m na]

；hresimsm/z457.1613[m na]

(calcd.forc
26h26
o6na,457.1622).
[0067]
(6)化合物9的合成
[0068][0069]
化合物9的合成：称取30mg化合物8(0.065mmol)置于25ml的圆底烧瓶中，加入2mldcm作为溶剂，室温搅拌使样品溶解。加入28.7μlet3n(0.207mmol)，11μl氯乙酰氯(0.138mmol)和催化量dmap，室温搅拌10h，tlc点板跟踪反应，直至原料点消失后。然后加入5ml水淬灭反应，分出dcm层，水层继续用5mldcm萃取两次，合并dcm层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，使用快速硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝6:4)得到白色固体化合物9(23.5mg)，产率69.5％。
[0070]
1-氯乙酰基-洛克米兰醇(9).白色固体；熔点173-174℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.15
–
7.12(2h,m),7.10
–
7.08(5h,m),6.64(2h,d,j＝8.9hz),6.23(1h,d,j＝1.9hz),6.05(1h,d,j＝1.9hz),5.94(1h,dd,j＝5.5,1.5hz),4.06(1h,dd,j＝13.7,6.2hz),3.89(1h,d,j＝15.1hz),3.84(3h,s),3.78(3h,s),3.74(1h,d,j＝15.1hz),3.68(3h,s),2.88(1h,td,j＝13.8,5.4hz),2.33(1h,ddd,j＝13.8,6.2,1.6hz),2.15(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.0,163.8,160.9,158.6,157.9,138.2,128.7,128.7,128.0,128.0,127.9,127.9,126.9,126.4,112.7,106.4,103.0,93.3,91.8,88.4,80.9,55.6,55.4,55.0,53.7,40.9,35.3,30.9；esimsm/z533.0[m na]

；hresimsm/z533.1330[m na]

(calcd.forc
28h27
o7clna,533.1338).
[0071]
(7)化合物10a的合成
[0072][0073]
称取30mg化合物9(0.0557mmol)置于25ml的圆底烧瓶中，加入2ml(n,n-二甲基甲酰胺)dmf作为溶剂，然后加入苯甲酸10.18mg(1.5eq),nahco37mg(1.5eq)，适量csf，然后将体系放入75℃油浴搅拌反应2小时，tlc点板检测反应，直至原料点消失后停止反应。然后加入5ml水淬灭反应，分出dcm层，水层继续用5ml乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，使用快速硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝6:4)得到白色固体19.3mg，为目标化合物10a，产率48.7％。
[0074]
1-(苯甲酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10a)白色固体；熔点137-138℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.99(2h,dd,j＝8.6,1.1hz),7.58(1h,t,j＝7.4hz),7.44(2h,t,j＝7.8hz),7.15-7.06(7h,m),6.64(2h,d,j＝9.0hz),6.14(1h,d,j＝1.9hz),6.05(1h,d,j＝1.9hz),5.95(1h,dd,j＝5.3,1.2hz),4.70(1h,d,j＝16.0hz),4.61(1h,d,j＝16.0hz),4.02(1h,dd,j＝13.8,6.1hz),3.82(3h,s),3.79(3h,s),3.68(3h,s),2.88(1h,td,j＝13.8,5.3hz),2.36(1h,ddd,j＝13.8,6.2,1.4hz),2.12(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.6,165.7,163.7,160.7,158.6,157.9,138.3,133.3,129.9,129.1,128.7,128.7,128.4,128.4,128.0,128.0,127.8,127.8,127.0,126.3,112.7,106.5,102.9,93.3,91.8,88.3,80.1,60.9,55.5,55.5,55.5,55.0,53.8,35.5,35.5；esimsm/z619.2[m na]

；hresimsm/z631.1740[m cl]-(calcd.forc
35h32
o9cl,631.1729).
[0075]
实施例2：目标化合物10b的制备
[0076]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成对氟苯甲酸，制备得目标化合物10b，产率58.9％。
[0077]
1-(对氟苯甲酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10b).白色固体；熔点159-160℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.03
–
7.96(2h,m),7.16
–
7.05(9h,m),6.64(2h,d,j＝9.0hz),6.13(1h,d,j＝1.9hz),6.04(1h,d,j＝1.9hz),5.94(1h,d,j＝4.0hz),4.69(1h,d,j＝16.0hz),4.60(1h,d,j＝16.0hz),4.00(1h,dd,j＝13.9,6.1hz),3.82(3h,s),3.81(3h,s),3.68(3h,s),2.88(1h,td,j＝13.9,5.3hz),2.35(1h,ddd,j＝13.8,6.1,1.3hz),2.10(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.5,164.7,163.7,160.7,158.6,157.9,138.2,132.5,132.4,128.7,128.7,128.0,128.0,127.8,127.8,127.0,126.3,125.4,115.6,115.5,112.7,106.5,103.0,93.2,91.9,88.2,80.2,60.9,55.5,55.5,55.4,55.0,53.7,35.5,35.5；esimsm/z637.3[m na]

；hresimsm/z649.1646[m cl]-(calcd.forc
35h31
o9clf,649.1635).
[0078]
实施例3：目标化合物10c的制备
[0079]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成对甲氧基苯甲酸，制备得目标化合物10c，产率55.9％。
[0080]
1-(对甲氧基苯甲酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10c).白色固体；熔点71-72℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.94(2h,d,j＝8.6hz),7.14
–
7.06(7h,m),6.90(2h,d,j＝8.6hz),6.64(2h,d,j＝8.6hz),6.15(1h,d,j＝1.9hz),6.05(1h,d,j＝1.9hz),5.94(1h,dd,j＝5.1,1.4hz),4.67(1h,d,j＝16.0hz),4.57(1h,d,j＝16.0hz),4.01(1h,dd,j＝13.7,6.1hz),3.87(3h,s),3.82(3h,s),3.80(3h,s),3.68(3h,s),2.87(1h,td,j＝13.5,5.3hz),2.36(1h,ddd,13.8,6.4,1.7hz),2.12(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.8,165.4,163.7,163.6,160.7,158.6,157.9,138.3,131.9,128.7,128.7,128.0,128.0,127.8,127.8,127.0,127.0,126.3,121.5,113.6,112.7,106.6,103.0,93.2,91.8,88.3,80.1,60.7,55.5,55.5,55.5,55.4,55.0,53.7,35.5,35.5；esimsm/z649.3[m na]

；hresimsm/z661.1845[m cl]-(calcd.forc
36h34o10
cl,661.1835).
[0081]
实施例4：目标化合物10d的制备
[0082]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成对溴苯甲酸，制备得目标化合物10d，产率58.5％。
[0083]
1-(对溴苯甲酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10d)，白色固体；熔点134-135℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.82(2h,d,j＝8.2hz),7.52(2h,d,j＝8.2hz),7.15(2h,t,j
＝7.4hz),7.10-7.05(5h,m),6.65(2h,d,j＝8.7hz),6.11(1h,d,j＝1.9hz),6.02(1h,d,j＝1.9hz),5.93(1h,dd,j＝5.1,1.2hz),4.69(1h,d,j＝16.0hz),4.60(1h,d,j＝16.0hz),3.98(1h,dd,j＝13.9,6.1hz),3.81(3h,s),3.79(3h,s),3.68(3h,s),2.88(1h,td,j＝13.7,5.3hz),2.35(1h,ddd,j＝13.6,6.2,1.7hz),2.11(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.3,164.9,163.7,160.7,158.6,157.9,138.2,131.7,131.3,128.7,128.7,128.5,128.5,128.0,128.0,128.0,128.0,127.9,127.9,127.0,127.0,126.4,112.7,106.5,102.9,93.2,91.9,88.1,80.2,61.0,55.5,55.5,55.4,55.0,53.7,35.5；esimsm/z697.2[m na]

；hresimsm/z697.1050[m na]

(calcd.forc
35h31
o9brna,697.1044).
[0084]
实施例5：目标化合物10e的制备
[0085]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成4,5-二甲氧基-2-硝基-苯甲酸，制备得目标化合物10e，产率58.8％。
[0086]
1-(4,5-二甲氧基-2-硝基-苯甲酸-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10e).白色固体；熔点145-146℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.45(1h,s),7.15
–
7.07(8h,m),6.64(2h,d,j＝8.8hz),6.16(1h,d,j＝1.9hz),6.01(1h,d,j＝1.9hz),5.96(1h,d,j＝4.0hz),4.66(1h,d,j＝16.0hz),4.58(1h,d,j＝16.0hz),4.04(1h,dd,j＝13.6,6.2hz),3.98(3h,s),3.97(3h,s),3.80(3h,s),3.78(3h,s),3.68(3h,s),2.89(1h,td,j＝13.4,5.8hz),2.37(1h,ddd,j＝14.1,6.1,1.7hz),2.13(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.1,164.7,163.7,160.6,158.5,157.9,152.4,150.6,141.0,138.1,128.7,128.7,127.9,127.9,127.8,127.8,126.9,126.3,120.5,112.7,111.0,106.9,106.4,102.9,93.2,91.6,88.3,80.3,61.6,56.6,56.5,56.5,55.5,55.4,55.0,53.7,35.4；esimsm/z724.2[m na]

；hresimsm/z724.2010[m na]

(calcd.forc
37h35o13
nna,724.2000).
[0087]
实施例6：目标化合物10f的制备
[0088]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成对硝基肉桂酸，制备得目标化合物10f，产率54.8％。
[0089]
1-(对硝基肉桂酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10f).白色固体；熔点110-111℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.26(2h,d,j＝8.8hz),7.73
–
7.65(3h,m),7.15
–
7.06(7h,m),6.65(2h,t,j＝6.0hz),6.53(1h,d,j＝16.1hz),6.17(1h,d,j＝1.9hz),6.08(1h,d,j＝1.9hz),5.93(1h,d,j＝4.0hz),4.60(1h,d,j＝16.0hz),4.42(1h,d,j＝16.0hz),4.03(1h,dd,j＝13.9,6.1hz),3.83(3h,s),3.77(3h,s),3.68(3h,s),2.89(1h,td,j＝14.0,5.3hz),2.37(1h,ddd,j＝14.1,6.1,1.7hz),2.11(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.3,165.0,163.7,160.8,158.6,158.0,148.6,142.9,140.2,138.2,128.8,128.8,128.7,128.7,127.9,127.9,127.9,126.9,126.4,124.1,121.0,112.7,106.6,103.0,93.2,91.8,88.2,77.2,77.0,76.7,60.8,55.5,55.4,55.0,55.0,53.7,35.5；esimsm/z690.2[m na]

；hresimsm/z690.1954[m na]

(calcd.forc
37h33o11
nna,690.1946)。
[0090]
实施例7：目标化合物10g的制备
[0091]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成对2-呋喃甲酸，制备得目标化合物10g，产率45.7％。
[0092]
1-(2-呋喃甲酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10g).白色固体；熔点157-158℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.60(1h,d,j＝0.8hz),7.20(1h,dd,j＝3.6,0.8hz),7.15
–
7.05(7h,m),6.64(2h,d,j＝9.0hz),6.52(1h,dd,j＝3.5,1.7hz),6.17(1h,d,j＝1.9hz),6.07(1h,d,j＝1.9hz),5.93(1h,dd,j＝5.3,1.hz),4.64(1h,d,j＝16.0hz),4.55(1h,d,j＝16.0hz),4.03(1h,dd,j＝13.8,6.1hz),3.83(3h,s),3.82(3h,s),3.68(3h,s),2.88(1h,td,j＝13.9,8.6hz),2.36(1h,ddd,j＝13.8,6.2,1.4hz),2.12(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.2,163.8,160.7,158.6,157.9,157.5,146.9,143.6,138.3,128.7,128.0,128.0,127.8,127.0,127.0,126.3,126.3,119.0,112.7,111.9,106.5,103.0,93.2,91.8,88.2,80.2,60.5,55.5,55.5,55.0,53.7,35.5,30.9；esimsm/z609.2[m na]

；hresimsm/z587.1883[m h]

(calcd.forc
33h31o10
,587.1912).
[0093]
实施例8：目标化合物10h的制备
[0094]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成对2-吡啶甲酸，制备得目标化合物10h，产率59.8％。
[0095]
1-(2-吡啶甲酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10h).白色固体；熔点79-80℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.76(1h,dd,j＝4.7,0.7hz),8.09(1h,d,j＝7.8hz),7.85(1h,t,j＝6.92hz),7.50(1h,ddd,j＝8.16,4.87,1.36hz),7.14
–
7.07(7h,m),6.64(2h,d,j＝6.1hz),6.14(1h,d,j＝1.9hz),6.05(1h,d,j＝1.9hz),5.94(1h,d,j＝4.0hz),4.71(1h,d,j＝15.9hz),4.66(1h,d,j＝15.9hz),4.05(1h,dd,j＝13.9,6.1hz),3.83(3h,s),3.80(3h,s),3.67(3h,s),2.92(1h,td,j＝14.3,5.3),2.38(1h,ddd,j＝14.1,6.1,1.7hz),2.12(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.1,164.1,163.7,160.7,158.5,157.9,149.9,147.0,138.2,136.9,128.7,127.9,127.9,127.8,127.8,127.2,127.0,126.3,125.5,112.7,106.4,102.9,93.2,91.7,88.2,80.2,61.4,55.5,55.4,55.00,55.0,53.7,35.5；esimsm/z620.2[m na]

；hresimsm/z620.1901[m na]

(calcd.forc
34h31
o9nna,620.1891).
[0096]
实施例9：目标化合物10i的制备
[0097]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成6-氯烟酸，制备得目标化合物10i，产率50.6％。
[0098]
1-(6-氯烟酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10i).白色固体；熔点79-80℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.89(1h,dd,j＝2.4,0.6hz),8.15(1h,dd,j＝8.3,2.4hz),7.41(1h,dd,j＝8.3,0.5hz),7.17
–
7.05(7h,m),6.63(2h,d,j＝9.0hz),6.10(1h,d,j＝1.9hz),6.00(1h,d,j＝1.9hz),5.91(1h,d,j＝4.2hz),4.72(1h,d,j＝16.0hz),4.63(1h,d,j＝16.0hz),3.98(1h,dd,j＝14.0,6.1hz),3.80(3h,s),3.79(3h,s),3.67(3h,s),2.89(1h,td,j＝14.0,5.2hz),2.37(1h,dd,j＝14.0,6.1,1.2hz),2.08(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:165.9,163.7,163.5,160.7,158.6,157.8,156.0,151.2,139.6,138.1,128.6,128.6,127.9,127.9,127.8,126.8,126.8,126.3,124.1,124.0,112.7,106.3,102.9,93.2,91.9,88.0,80.3,61.1,55.5,55.5,55.4,55.0,53.7,35.5；esimsm/z654.2[m na]

；hresimsm/z654.1510[m na]

(calcd.forc
34h30
o9nclna,654.1501).
[0099]
实施例10：目标化合物10j的制备
[0100]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成丁酸，制备得目标化合物10j，产率52.3％。
[0101]
1-(丁酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10j).白色固体；熔点114-115℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.15
–
7.08(7h,m),6.64(2h,d,j＝8.9hz),6.23(1h,d,j＝1.9hz),6.07(1h,d,j＝1.9hz),5.91(1h,dd,j＝5.2,1.3hz),4.45(1h,d,j＝16.0hz),4.35(1h,d,j＝
16.0hz),4.02(1h,dd,j＝13.7,6.2hz),3.84(3h,s),3.79(3h,s),3.68(3h,s),2.86(1h,td,j＝14.7,5.4hz),2.33(1h,ddd,j＝13.7,7.7,1.3hz),2.29(2h,td,j＝7.5,3.0hz),2.12(1h,s),1.64(2h,dd,j＝14.8,7.4hz),0.96(3h,t,j＝7.4hz)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:172.7,166.7,163.8,160.8,158.6,158.0,138.3,128.7,128.7,128.0,128.0,127.8,127.8,127.0,127.0,126.3,112.7,106.6,103.0,93.2,91.8,88.2,80.1,60.2,55.6,55.4,55.0,53.7,35.5,35.5,18.2,13.6；esimsm/z585.3[m na]

；hresimsm/z585.2104[m na]

(calcd.forc
32h34
o9na,585.2095).
[0102]
实施例11：目标化合物10k的制备
[0103]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成葵酸，制备得目标化合物10k，产率55.1％。
[0104]
1-(葵酰基-2-羟基乙酰基)-洛克米兰醇(10k).白色固体；熔点74-75℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.14
–
7.07(7h,m),6.65-6.63(2h,m),6.22(1h,d,j＝1.9hz),6.07(1h,d,j＝1.9hz),5.91(1h,dd,j＝5.2,1.4hz),4.44(1h,d,j＝16.0hz),4.35(1h,d,j＝16.0hz),4.02(1h,dd,j＝13.6,6.3hz),3.84(3h,s),3.79(3h,s),3.68(3h,s),2.86(1h,td,j＝13.7,5.4hz),2.34
–
2.28(3h,m),2.11(1h,s),1.66
–
1.62(4h,m),1.28(10h,d,j＝14.4hz),0.88(3h,t,j＝7.0hz)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:172.8,166.7,163.7,160.7,158.6,158.0,138.2,128.7,128.0,128.0,127.85,127.85,127.02,126.33,112.73,106.61,103.00,93.24,91.84,88.25,80.07,60.2,55.5,55.4,55.0,53.7,35.4,33.7,33.7,31.8,30.9,30.9,29.3,29.2,29.06,24.7,22.6,14.1；esimsm/z669.3[m na]

；hresimsm/z647.3184[m h]

(calcd.forc
38
.h
47
.o9,647.3215).
[0105]
实施例12：目标化合物10l的制备
[0106]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成二甲胺，制备得目标化合物10l，产率59.4％。
[0107]
1-(2-甲胺基乙酰基)-洛克米兰醇(10l).白色固体；熔点149-150℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.13-7.06(7h,m),6.63(2h,d,j＝8.9hz),6.23(1h,d,j＝1.9hz),6.03(1h,d,j＝1.9hz),5.86(1h,d,j＝3.7hz),4.10(1h,dd,j＝13.8,6.1hz),3.84(3h,s),3.76(3h,s),3.67(3h,s),3.00(1h,d,j＝16.9hz),2.86(1h,td,j＝13.9,4.9hz),2.82(1h,d,j＝16.9hz),2.33(1h,dd,j＝13.7,6.3hz),2.25(6h,s),1.77(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ169.3,163.7,161.0,158.5,157.9,138.5,128.7,128.7,128.0,128.0,127.8,127.8,127.2,127.2,126.2,112.6,106.6,103.0,93.3,91.7,88.2,79.1,59.8,55.6,55.4,55.0,53.8,44.9,44.9,35.7；esimsm/z542.2[m na]

；hresimsm/z520.2338[m h]

(calcd.forc
30h34
o7n,520.2329).
[0108]
实施例13：目标化合物10m的制备
[0109]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成二乙胺，制备得目标化合物10m，产率56.6％。
[0110]
1-(2二乙胺基乙酰基)-洛克米兰醇(10m).白色固体；熔点50-51℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.10(7h,m),6.63(2h,d,j＝9.0hz),6.23(1h,d,j＝1.9hz),6.03(1h,d,j＝1.9hz),5.82(1h,d,j＝3.6hz),4.14(1h,dd,j＝14.0,6.2hz),3.83(3h,s),3.76(3h,s),3.67(3h,s),3.15(1h,d,j＝17.1hz),3.03(1h,d,j＝17.1hz),2.88(1h,td,j＝13.9,4.9hz),2.54
–
2.48(4h,m),2.37(1h,ddd,j＝13.4,6.1,1.5hz),1.25(1h,s),0.96(6h,t,j＝7.2hz)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:170.2,163.7,161.1,158.5,158.0,138.6,128.6,128.6,128.0,128.0,127.8,127.8,127.3,127.3,126.2,126.2,112.6,103.1,
93.3,91.7,88.2,79.0,55.6,55.4,55.0,53.8,53.8,53.6,47.4,35.8,12.4,12.4；esimsm/z548.3[m h]

；hresimsm/z548.2650[m h]

(calcd.forc
32h38
o7n,548.2643).
[0111]
实施例14：目标化合物10n的制备
[0112]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成二丁胺，制备得目标化合物10n，产率48.2％。
[0113]
1-(2-二丁胺基乙酰基)-洛克米兰醇(10n).白色固体；熔点39-40℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.15-7.13(3h,m),7.10-7.07(4h,m),6.64(2h,dd,j＝6.8,2.18hz),6.22(1h,dd,j＝6.7,2.0hz),6.05(1h,dd,j＝17.7,1.9hz),5.97(1h,dd,j＝5.1,1.6hz),4.45(1h,d,j＝16.2hz),4.35(1h,d,j＝16.2hz),4.09(1h,dd,j＝13.8,6.1hz),3.84(3h,s),3.78(3h,s),3.68(3h,s),3.14(1h,d,j＝16.8hz),2.91-2.82(1h,m),2.42(1h,td,j＝4.5,2.3hz),2.37-2.33(1h,m),2.17(1h,s),1.53
–
1.46(2h,m),1.35
–
1.21(7h,m),0.96
–
0.85(7h,m)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:167.6,163.7,163.7,161.1,160.7,158.6,158.5,158.0,128.7,128.6,128.0,127.8,127.8,126.2,126.2,112.7,103.1,103.0,91.7,88.3,88.1,79.8,61.1,55.5,55.5,55.4,55.3,55.0,55.0,53.8,53.8,53.7,29.9,20.4,14.0,13.8；esimsm/z604.2[m h]

；hresimsm/z604.3273[m h]

(calcd.forc
36h46
o7n,604.3269).
[0114]
实施例15：目标化合物10o的制备
[0115]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成二辛胺，制备得目标化合物10o，产率46.3％。
[0116]
1-(2-二辛胺基乙酰基)-洛克米兰醇(10o).白色固体；熔点41-42℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.14
–
7.11(4h,m),7.08
–
7.05(3h,m),6.62(1h,d,j＝8.9hz),6.22(1h,dd,j＝6.1,1.9hz),6.02(1h,d,j＝8.9hz),5.82(1h,d,j＝3.8hz),4.13(1h,dd,j＝14.0,6.1hz),3.83(3h,s),3.75(3h,s),3.67(3h,s),3.14(1h,d,j＝17.0hz),3.04(1h,d,j＝17.0hz),2.87(1h,td,j＝13.1,6.5h,),2.40(4h,dd,j＝8.1,5.4hz),2.35(1h,ddd,j＝13.5,6.1,1.0hz),1.32(5h,dd,j＝14.5,7.4hz),1.28
–
1.22(18h,m),0.87(7h,t,j＝7.1hz)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:170.4,163.7,161.1,158.5,158.0,138.6,128.7,128.0,128.0,127.8,127.3,126.2,112.7,106.6,103.1,93.4,91.8,88.2,78.9,55.5,55.4,55.0,54.7,54.1,53.8,35.8,35.8,35.8,31.8,31.8,30.9,30.9,29.5,29.5,29.3,29.3,27.8,27.8,27.3,27.3,22.6,22.6,14.1,14.1；esimsm/z738.5[m na]

；hresimsm/z716.4535[m h]

(calcd.forc
44h62
o7n,716.4521).
[0117]
实施例16：目标化合物10p的制备
[0118]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成苯甲胺，制备得目标化合物10p，产率55.6％。
[0119]
1-(2-苯甲胺基乙酰基)-洛克米兰醇(10p).白色固体；熔点59-60℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.31-7.27(4h,m),7.26(1h,s),7.15
–
7.06(8h,m),6.67
–
6.62(2h,m),6.21(1h,d,j＝1.9hz),5.99(1h,d,j＝1.9hz),5.88(1h,d,j＝3.6hz),4.08(1h,dd,j＝13.7,6.2hz),3.80(3h,s),3.70(2h,s),3.69(3h,s),3.68(3h,s),3.27(1h,d,j＝17.5hz),3.12(1h,d,j＝17.5hz),2.88(1h,td,j＝13.8,5.2hz),2.37
–
2.30(1h,m)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:170.9,163.7,160.9,158.5,157.9,138.4,128.7,128.4,128.3,128.0,128.0,127.8,127.8,127.2,127.1,126.3,112.7,106.5,103.0,93.3,91.8,88.3,79.6,55.5,55.3,55.3,55.0,53.8,53.1,49.8,49.8,35.5,35.5,29.3,29.3；esimsm/z604.2[m na]

；hresimsm/z582.2484[m h]

(calcd.forc
35h36
o7n,582.2486).
[0120]
实施例17：目标化合物10q的制备
[0121]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成3,4-二甲氧基苯乙胺，制备得目标化合物10q，产率58.4％。
[0122]
1-(2-(3,4-二甲氧基苯乙胺)-乙酰基)-洛克米兰醇(10q).白色固体；熔点54-55℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.16-7.15(7h,m),6.77(1h,d,j＝8.2hz),6.73
–
6.71(2h,m),6.65
–
6.62(2h,m),6.22(1h,d,j＝1.9hz),6.00(1h,d,j＝1.9hz),5.85(1h,dd,j＝4.9,1.4hz),4.08(1h,dd,j＝13.7,6.2hz),3.86(3h,s),3.83(3h,s),3.82(3h,s),3.70(3h,s),3.68(3h,s),3.25(1h,d,j＝17.6hz),3.09(1h,d,j＝17.6hz),2.86(1h,td,j＝13.8,5.1hz),2.80
–
2.71(2h,m),2.73-2.66(2h,m),2.33(1h,ddd,j＝13.6,6.2,1.5hz)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:171.1,163.7,160.9,158.6,157.9,148.9,147.4,138.4,132.2,128.7,128.7,128.0,128.0,127.8,127.8,127.1,126.3,120.4,112.7,111.9,111.3,106.6,103.0,93.3,91.8,88.2,79.5,55.9,55.8,55.6,55.4,55.4,55.0,53.8,50.8,50.8,36.0,35.6；esimsm/z678.3[m na]

；hresimsm/z656.2857[m h]

(calcd.forc
38h42
o9n,656.2854).
[0123]
实施例18：目标化合物10r的制备
[0124]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成四氢吡咯，制备得目标化合物10r，产率57.2％。
[0125]
1-(2-(1-四氢吡咯基)-乙酰基)-洛克米兰醇(10r).黄色固体；熔点121-122℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.16
–
7.05(7h,m),6.63(2h,d,j＝8.9hz),6.23(1h,d,j＝1.9hz),6.03(1h,d,j＝1.9hz),5.86(1h,d,j＝3.7hz),4.12
–
4.05(1h,m),3.83(3h,s),3.76(3h,s),3.67(3h,s),3.19(1h,d,j＝17.0hz),2.99(1h,d,j＝17.0hz),2.86(1h,td,j＝13.8,5.1hz),2.59
–
2.47(4h,m),2.33(1h,ddd,j＝13.7,6.2,1.4hz),1.80-1.75(3h,m)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:169.5,163.6,160.9,158.5,157.9,138.5,128.7,128.7,128.0,128.0,127.8,127.8,127.2,126.2,112.6,106.7,103.0,93.2,91.7,88.1,79.2,56.2,56.2,55.5,55.5,55.4,55.4,54.9,53.7,53.6,35.6,35.6,23.7,23.7；esimsm/z546.3[m h]

；hresimsm/z546.2485[m h]

(calcd.forc
32h36
o7n,546.2486).
[0126]
实施例19：目标化合物10s的制备
[0127]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成咪唑，制备得目标化合物10s，产率49.3％。
[0128]
1-(2-(1-咪唑基)-乙酰基)-洛克米兰醇(10s).白色固体；熔点100-101℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.63(1h,s),7.14
–
7.01(8h,m),6.78(1h,s),6.62(2h,d,j＝8.9hz),6.27(1h,d,j＝1.8hz),6.08(1h,d,j＝1.8hz),5.89(1h,d,j＝3.8hz),4.50(1h,d,j＝17.6hz),4.28(1h,d,j＝17.6hz),4.13-4.06(1h,m),3.87(3h,s),3.71(3h,s),3.67(3h,s),2.90(1h,td,j＝13.6,4.5hz),2.37(1h,dd,j＝13.7,6.0hz),2.04(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:164.0,161.2,158.6,157.9,138.0,133.3,128.6,128.6,127.9,127.9,127.9,126.8,126.3,112.7,105.9,102.9,93.3,91.8,88.6,80.8,80.0,65.1,55.8,55.6,55.3,55.0,53.7,53.4,52.0,48.2,45.6；esimsm/z533.2[m h]

；hresimsm/z543.2124[m h]

(calcd.forc
31h31
o7n2,543.2125).
[0129]
实施例20：目标化合物10t的制备
[0130]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成吡唑，制备得目标化合物10t，产率58.7％。
[0131]
1-(2-(1-吡唑基)乙酰基)-洛克米兰醇(10t).白色固体；熔点95-96℃；1hnmr
(400mhz,cdcl3)δ:7.48(1h,d,j＝1.6hz),7.25(1h,d,j＝2.2hz),7.17
–
7.06(7h,m),6.63(2h,d,j＝8.9hz),6.26(1h,t,j＝2.1hz),6.24(1h,d,j＝1.9hz),6.08(1h,d,j＝1.8hz),5.90(1h,d,j＝3.6hz),4.71(1h,d,j＝17.5hz),4.60(1h,d,j＝17.5hz),4.01(1h,dd,j＝13.7,6.1hz),3.86(3h,s),3.79(3h,s),3.68(3h,s),2.86(1h,td,j＝13.8,5.1hz),2.35(1h,ddd,j＝13.7,6.2,1.5hz),2.14(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:166.5,163.9,161.0,158.6,158.0,139.9,138.3,130.4,128.9,128.7,128.1,128.0,127.8,127.0,126.3,112.7,106.5,106.4,103.0,94.8,93.3,91.9,88.4,80.3,55.6,55.6,55.0,55.0,53.7,52.9,35.4；esimsm/z565.2[m na]

；hresimsm/z565.1953[m na]

(calcd.forc
31h30
o7n2na,565.1945).
[0132]
实施例21：目标化合物10u的制备
[0133]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成吗啉，制备得目标化合物10u，产率59.2％。
[0134]
1-(2-(1-吗啉基)乙酰基)-洛克米兰醇(10u).白色固体；熔点97-98℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.16
–
7.05(7h,m),6.64(2h,t,j＝6.0hz),6.24(1h,d,j＝1.9hz),6.03(1h,d,j＝1.9hz),5.85(1h,d,j＝3.7hz),4.11(1h,dd,j＝13.9,6.1hz),3.84(3h,s),3.76(3h,s),3.67(3h,s),3.66(4h,m),3.05(1h,d,j＝16.8hz),2.93(1h,d,j＝16.8hz),2.89
–
2.85(1h,m),2.50
–
2.31(5h,m),2.20(1h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:168.8,163.7,161.0,158.5,157.9,138.4,128.6,128.0,128.0,127.8,127.8,127.1,127.1,126.2,126.2,112.6,106.5,103.0,93.2,91.7,88.1,79.3,66.7,59.3,55.5,55.4,54.9,53.7,52.9,52.9,35.6,35.6；esimsm/z562.2[m h]

；hresimsm/z562.2424[m h]

(calcd.forc
32h36
o8n,562.2435).
[0135]
实施例22：目标化合物10v的制备
[0136]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成哌啶，制备得目标化合物10v，产率54.6％。
[0137]
1-(2-(1-哌啶基)二辛胺基乙酰基)-洛克米兰醇(10v).白色固体；熔点85-86℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.14
–
7.06(7h,m),6.64(2h,m),6.23(1h,d,j＝1.9hz),6.03(1h,d,j＝1.9hz),5.84(1h,dd,j＝4.8,1.3hz),4.11(1h,dd,j＝13.8,6.1hz),3.84(3h,s),3.75(3h,s),3.67(3h,s),3.03(1h,dd,j＝16.7hz),2.88(1h,dd,j＝16.7hz),2.84(1h,td,j＝14.0,5.2hz),2.43-2.29(5h,m),1.72
–
1.40(6h,m)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:169.4,163.6,161.0,158.5,158.0,138.5,128.7,128.7,128.0,128.0,127.8,127.8,127.2,127.2,126.2,112.6,106.7,103.0,93.3,91.7,88.2,79.1,59.8,55.5,55.5,55.4,55.0,53.8,53.7,35.7,25.8,25.8,23.8；esimsm/z560.2[m h]

；hresimsm/z560.2650[m h]

(calcd.forc
33h38
o7n,560.2643).
[0138]
实施例23：目标化合物10w的制备
[0139]
步骤同实施例1，将苯甲酸换成n-甲基哌嗪，制备得目标化合物10w，产率55.2％。
[0140]
1-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰基)-洛克米兰醇(10w).白色固体；熔点88-89℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.15
–
7.04(7h,m),6.63(2h,d,j＝8.9hz),6.22(1h,d,j＝1.9hz),6.02(1h,d,j＝1.9hz),5.84(1h,d,j＝3.8hz),4.11
–
4.04(1h,m),3.83(3h,s),3.75(3h,s),3.67(3h,s),3.03(1h,d,j＝16.8hz),2.85(1h,d,j＝16.8hz),2.84(1h,td,j＝3.8hz),2.43-2.41(8h,m),2.30(1h,ddd,j＝13.1,6.5,1.2hz),2.29(3h,s)；
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ:168.9,163.7,160.9,158.5,158.0,138.4,128.7,128.7,128.0,128.0,
127.8,127.8,127.2,126.2,112.6,112.6, 106.7,103.0,93.2,91.7,88.2,79.3,59.0,55.5,55.4,55.4,55.0,54.7,53.7,53.4,52.7, 45.9,35.6；esims m/z 574.2[m h]

；hresims m/z 575.2751[m h]

(calcd. for c
33h39
o7n2,575.2752).
[0141]
试验例1：体外抗肿瘤活性筛选
[0142]
细胞株：人红白细胞白血病细胞株(hel)、乳腺癌细胞(mda-mb
‑ꢀ
231)、人结肠癌细胞(hct116)。
[0143]
实验原理：采用mtt比色法进行检测。mtt全称3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中 琥珀酸脱氢酶能够还原mtt，并且在细胞色素c的作用下，可以生成蓝色(或 蓝紫色)不溶于水的甲臜(formazan)，用酶标仪在490nm处进行测定甲臜的 含量。在一般情况下，甲臜的生成量与活细胞数成正相关，所以活细胞的数量 可根据光密度od值推测出。
[0144]
实验方法：将对数生长期细胞以6
×
103/孔的细胞接种于96孔板，置于37 ℃，5％co2细胞培养箱培养16h，观察细胞状态良好达到对数生长期时，加 入不同浓度梯度的化合物继续培养，以阿霉素作为阳性对照。37℃，5％co2培养72h后，加入20μl/孔mtt(5mg/ml)，继续培养4h，将96孔板2500 r/min离心15min，弃去上清，加入160μl/孔dmso，置于37℃摇床避光低速 摇15min，使沉淀充分溶解。
[0145]
比色：使用多功能酶标仪测定od值。将吸收波长调至490nm，对96孔 板板的每个孔的光吸收值进行测定和记录。然后进行各个孔的抑制率计算，再 进行ic
50
值的测定。
[0146]
实验结果：合成的20个化合物对hel、mda-mb-231和hct116三个细 胞系进行体外抗肿瘤活性筛选评估，以阿霉素作为阳性对照组，结果以ic
50
值 进行表示(见表1)。在hct116肿瘤细胞筛选中，结果显示13个化合物(化合 物10g，10h，10j，10k，10l，10m，10p，10q，10r，10t，10u，10u和10w)活 性比阳性对照阿霉素具有更好的抗肿瘤活性。
[0147]
表1 24个衍生物活性筛选数据
[0148][0149]
[0150]
[0151][0152]
试验例2：高活性代表性化合物10r抗肿瘤作用机制研究
[0153]
1.化合物10r对细胞周期的作用研究
[0154]
不同浓度的化合物10r(0.05,0.1及0.2μm)，按照下述实验步骤处理 hct116肿瘤细胞，结果显示此化合物可以剂量依赖性的阻滞hct116肿瘤细 胞于g1期。
[0155]
化合物10r对hct116肿瘤细胞的周期影响的具体实验步骤如下：
[0156]
(1)处理样本和收集细胞：取对数生长期的细胞，以3.5
×
104/ml的浓度 接种于接种60mm培养皿中，每个培养皿3ml，放置于37℃，5％co2细胞孵 育箱中24h后，将细胞分为不同时间组，每个时间组分为对照组和不同浓度样 品干预组，对照组为0.1％dmso。将各组细胞放置于37℃，5％co2细胞孵 育箱中48h后收集细胞；
[0157]
(2)固定：收集细胞培养基，用预冷后的pbs洗细胞，加入1.5ml不含 edta的胰酶，进行消化大约3min，观察细胞开始松动，用微量移液枪轻吹细 胞，收集细胞悬液，再用1.5ml pbs洗培养皿并收集。用离心机进行1000 r/min离心3min，弃去上清液，再用pbs洗细胞，继续1000r/min，离心3 min，弃去上清液，加入500μl预冷的75％乙醇，-20℃过夜固定；
[0158]
(3)染色：在进行染色之前，首先用pbs洗2次，弃去上清液，然后加 入500μml用pbs
配的染色液(0.05％triton、0.5％rnaase和5％pi)，进行避光37℃孵育30min；
[0159]
(4)上机：用离心机将染色的细胞进行1000r/min，离心3min，弃去上清液，然后用300μlpbs重悬，过滤后上机。
[0160]
实验结果如图1、图2：图1为化合物10r对hct116肿瘤细胞处理48小时的周期影响图；10r阻止hct116细胞周期，细胞用不同浓度的化合物(0.05μm,0.1μm和0.2μm)处理48小时。图2为化合物10r对hct116肿瘤细胞的不同阶段的百分比图；每次实验至少重复三次，*p《0.05,**p《0.01，结果显示此化合物可以剂量依赖性的阻滞hct116肿瘤细胞于g1期。
[0161]
2.化合物10r对细胞凋亡的作用研究
[0162]
不同浓度的化合物10r(0.05μm,0.1μm和0.2μm)，按照下述实验步骤处理hct116肿瘤细胞，结果显示此化合物可以剂量依赖性的诱导hct116肿瘤细胞调亡。
[0163]
化合物诱导细胞的调亡作用
[0164]
(1)处理样本和收集细胞：取对数生长期的细胞，以3.0
×
105/ml的浓度接种于60mm培养皿中，每皿3ml，放置于37℃，5％co2细胞孵育箱中24h后将细胞分为对照组和10r样品组，对照组为0.1％dmso组，样品组分别为0.05μm、0.1μm及0.2μm三组，将各组细胞置于细胞培养箱中孵育48h后收集各组细胞；
[0165]
(2)收集细胞培养基，用pbs洗细胞，加入1.5ml不含edta的胰酶，消化3min，观察细胞开始松动，轻轻吹细胞，收集细胞悬液，再用1.5mlpbs洗培养皿并收集。1000r/min离心3min，弃上清，用pbs洗细胞，重复两次；
[0166]
(3)染色：加入50μlbindingbuffer重悬细胞，移到流式管中，加药组每管加入碘化丙啶(propidiumiodide，pi)2.5μl/管、磷脂结合蛋白v(annexinv-fitc)2.5μl/管，轻轻混匀细胞，室温下避光孵育20min；
[0167]
(4)上机：将染色细胞1000r/min离心3min，弃上清，每管加入50μl1
×
bindingbuffer，尽快进行流式细胞术分析；
[0168]
实验结果如图3、图4：图3为化合物10r诱导hct116肿瘤细胞凋亡图；流式细胞仪分析不同浓度化合物10r(0.05μm,0.1μm和0.2m)；图4为化合物10r诱导肿瘤细胞凋亡的柱状统计图；每次实验至少重复三次，*p《0.05,**p《0.01与对照组比较。结果显示此化合物可以剂量依赖性的诱导hct116肿瘤细胞调亡。
[0169]
3、化合物10r对hct116克隆球形成的影响研究
[0170]
对数生长期hct116细胞，以500/孔接种于6孔板中，放置于37℃，5％co2细胞孵育箱过夜，更换新鲜培养基，设对照组和不同浓度10r(0.00625,0.0125，0.025,0.05及0.1μm)干预组，对照组为0.1％dmso组。将细胞置于37℃，5％co2条件培养，三天更换一次培养基，连续培养15天。用pbs洗三次后加入500μl甲醇固定30min，pbs洗两次后结晶紫染色20min，pbs清洗三次，晾干后拍照。
[0171]
实验结果如图5、图6：图5为化合物10r对hct116克隆球形成的影响图；图6为hct116用化合物10r(0.05μm,0.1μm和0.2μm)处理15天后形成克隆球数的柱状统计图；每次实验至少重复三次，*p《0.05,**p《0.01与对照组比较。结果显示此化合物可以剂量依赖性的抑制hct116克隆球的形成。
[0172]
前期实验表明，10r具有抑制hct116细胞增殖的作用，并以剂量依赖方式诱导细胞凋亡，且将细胞阻滞在g1期。为了进一步确证10r对细胞增殖的抑制作用，以hct116为研
究对象，探讨10r对克隆球形成的影响。结果如5和 6所示，10r显著抑制hct116克隆球形成，且呈剂量依赖性。与对照组相比， 10r(0.025μm)诱导的克隆能力几乎完全被抑制。
[0173]
4.化合物10r对相关细胞凋亡蛋白、周期蛋白、mapk信号通路和wnt 信号通路关键蛋白表达的影响研究
[0174]
hct116细胞以1
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106/皿接种于100mm培养皿中，培养过夜。不同浓度 10r(0.05,0.1及0.2μm)作用细胞，对照组加入0.1％dmso。收集细胞并裂解。 得到总蛋白经bca进行蛋白定量，蛋白被10％sds-page分离并转至pvdf 膜。5％脱脂牛奶进行封闭，4℃一抗(c-myc、g1/s-特异性周期蛋白-e、g1/s
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特异性周期蛋白-d、细胞周期依赖性激酶4、细胞周期依赖性激酶6、全长
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parp1、裂解-parp1、半胱天冬酶原-3、裂解半胱天冬酶原
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3、半胱天冬酶原
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9、裂解半胱天冬酶原-9、bcl-2、p-erk、erk、p-jnk、jnk、p
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p38、p38、β-catenin、axin-2、gsk-3β、tcf-4、β-actin和磷酸甘油醛脱 氢酶)孵育过夜，二抗室温下孵育2h后。使用odyssey platform进行检测。
[0175]
实验结果如图7、图8：图7为化合物10r对相关凋亡蛋白表达的影响图； 。图8为化合物10r对相关周期蛋白表达的影响图；。
[0176]
基于前期实验结果，采用western bolt分析10r对细胞凋亡和细胞周期相关 蛋白的影响，进一步探讨10r诱导hct116细胞凋亡和细胞周期阻滞的分子机 制。如图7所示，10r诱导hct116中凋亡蛋白parp、半胱天冬酶原-3和半胱 天冬酶原-9发生特异性裂解，且呈剂量依赖性。此外，随着10r浓度升高，抑 凋亡蛋白bcl-2表达下调，表明10r可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。10r诱 导hct116阻滞于细胞周期g1期，分析10r对g1期周期蛋白及相关蛋白激酶 表达的影响。如图8所示，10r(0.1μm)显著降低c-myc、g1/s-特异性周期蛋 白-d、g1/s-特异性周期蛋白-e、细胞周期依赖性激酶4和细胞周期依赖性激酶 6的表达，由此可推测，10r可能是通过降解c-myc、g1/s-特异性周期蛋白
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d、g1/s-特异性周期蛋白-e、细胞周期依赖性激酶4和细胞周期依赖性激酶 6，从而cyclin-cdk复合物无法正常形成，导致hct116阻滞于g1。
[0177]
实验结果如图9、图10：图9为化合物10r对丝裂原活化蛋白激酶 (mapk)信号通路相关蛋白表达影响图；。图10为化合物10r对wnt信号通 路关键蛋白表达的影响图。
[0178]
丝裂原活化蛋白激酶(mapk)和wnt家族作为调节细胞增殖、稳态和发育 的关键信号分子，参与细胞的生长、分化、凋亡等一系列细胞生理活动。采用western bolt检测10r对mapk和wnt信号通路的影响。如图9所示，10r显著 上调p-p38和p-jnk的表达水平，下调p-erk的表达水平，且均呈剂量依赖性。 如图10所示，10r处理后，以剂量依赖的方式显著降低β-catenin、axin
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2、gsk-3β、tcf-4的表达。
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以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的 限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例 所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。