玉米抗盐碱蛋白质及其编码基因与应用

1.本发明涉及玉米抗盐碱蛋白质及其编码基因与应用。


背景技术：

2.土壤盐渍化(soil salinization)是指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到地表，水分蒸发后，使盐分积累在表层土壤中的过程。是指易溶性盐分在土壤表层积累的现象或过程，也称盐碱化。中国盐渍土或称盐碱土主要发生在干旱、半干旱和半湿润地区。盐碱土的可溶性盐主要包括钠、钾、钙、镁等的硫酸盐、氯化物、碳酸盐和重碳酸盐。硫酸盐和氯化物一般为中性盐，碳酸盐和重碳酸盐为碱性盐。许多新的基因或蛋白参与调控盐碱胁迫响应过程中，探索新的抵抗盐碱胁迫的基因，在提高作物抵抗盐碱胁迫中具有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何提高玉米的抗盐碱性。
4.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种培育抗盐碱植物的方法，所述方法包括提高受体植物中所述抗盐碱蛋白质的含量，得到与所述受体植物相比盐碱抗性提高的目的植物；
5.所述抗盐碱蛋白质为如下a1)、a2)或a3)：
6.a1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
7.a2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
8.a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。
9.上述a2)中的蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
10.上述a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
11.上述a2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5
′
端和/或3
′
端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1所示的dna分子编码序列2所示的蛋白质。
12.本发明还提供了一种提高植物盐碱抗性的方法，所述方法包括提高受体植物中所述抗盐碱蛋白质的含量，得到与所述受体植物相比盐碱抗性提高的目的植物，实现植物盐碱抗性的提高。
13.上文中，提高受体植物中抗盐碱蛋白质的含量可通过向所述受体植物中导入所述抗盐碱蛋白质的编码基因并使所述编码基因表达实现。
14.所述编码基因可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：
15.b11)编码序列是序列表中序列1的cdna分子或dna分子；
16.b12)序列表中序列1所示的cdna分子或dna分子；
17.b13)序列表中序列3所示的dna分子；
18.b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述抗盐碱蛋白质的cdna分子或dna分子；
19.b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗盐碱蛋白质的cdna分子或dna分子。
20.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
21.上文中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％sds中漂洗。
22.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
23.上文中，所述受体植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为玉米。
24.本发明还提供了一种提高植物抗盐碱性的产品，所述产品含有所述抗盐碱蛋白质。
25.本发明还提供了一种提高植物抗盐碱性的产品，所述产品含有所述抗盐碱蛋白质，或所述抗盐碱蛋白质的编码基因，或所述抗盐碱蛋白质的编码基因的表达盒。
26.所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为玉米。
27.本发明的实验证明，eld1过表达株系与野生型b73-329相比较，过表达株系表现出显著的盐碱胁迫耐受性。从而证明，eld1蛋白的功能为提高植物对高盐碱的耐逆性。
附图说明
28.图1为100mm nahco3处理后的植株的表型。
具体实施方式
29.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
30.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
31.下述实施例中的玉米(zea mays l.)b73-329记载于“王芳,崔鹏娟,黄芸,王志文,
王海峰,陈益芳.玉米磷吸收和再分配的分子机制,2018全国植物生物学大会论文集,2018年”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
32.实施例1、
33.本实施例发现一个来源于玉米的蛋白质可以提高玉米的抗盐碱性，将该蛋白质记为抗盐碱蛋白质eld1，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，在玉米中，eld1的基因组序列为序列表中序列3，其cds序列为序列表中序列1。
34.1、重组载体的构建
35.将序列表的序列2所示的eld1编码基因插入pbcxun载体中，得到重组载体pbcxun-eld1，经测序验证所得重组载体序列的正确性。重组载体pbcxun-eld1中，由ubi启动子驱动外源dna分子表达以得到eld1蛋白。
36.其中，pbcxun载体是将pcxun载体(genbank:fj905215.1，06-jul-2009)的hyg基因(hptii，潮霉素抗性基因)替换为bar基因(编码膦丝菌素乙酰转移酶)(其序列为序列表中序列4)，保持pcxun的其它核苷酸不变得到的表达载体。
37.2、转基因玉米的构建
38.将步骤1得到的pbcxun-eld1导入农杆菌eha105菌株中，得到重组菌eha105/pbcxun-eld1。将重组菌eha105/pbcxun-eld1接种于含有100μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有100μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至od
600
在0.8-1.0之间，得到重组农杆菌悬浮液。采用获得的重组农杆菌菌悬液侵染无菌条件下扒出的玉米b73-329幼胚后，经诱导愈伤、除草剂草丁膦筛选得到幼苗，移入温室后在苗期进行标记基因bar鉴定来选择转基因植株移入大田。t1代田间种植中会通过喷洒农药草丁膦来选择留下转基因植株，另外t1代后期设计eld1基因的特异引物进行表达量和拷贝数检测，进而获得可以稳定遗传的过表达转基因材料。过表达转基因植株经自交繁种后获得t3代进行后续实验。
39.标记基因bar鉴定：在bar基因的5’和3’端分别设计特异引物，合成该引物对，对植株的基因组dna进行pcr扩增，能得到特异性扩增产物的植株为转基因植株，不能得到特异性扩增产物的植株为非转基因植株。
40.其中，三个转基因株系分别为ox-1、ox-2、ox-13。
41.3、转基因玉米的表型鉴定
42.待测玉米：ox-1、ox-2、ox-13、玉米b73-329。
43.将待测玉米的种子种植于不含营养土的纯蛭石中，用1/2hoagland’s营养液浇灌。玉米生长约7-10天后(三叶期)浇灌含100mm nahco3的1/2hoagland’s营养液，每7-10天浇灌一次，继续培养28天观察玉米长势以及叶片黄化程度，并测量株高。每种玉米设置5个重复。
44.结果如图1所示，在100mm nahco3处理的条件下，eld1过表达株系ox-1、ox-2、ox-13表现出比野生型b73-329更强的耐盐碱性，叶片较绿，株高更高。与野生型b73-329相比，ox-1、ox-2、ox-13的株高分别提高了17％、18％和18％。
45.上述结果表明，eld1可以正调控玉米的抗盐碱性。
46.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和
范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。