一种毛竹叶片形状调控基因PheLBD29及其应用

一种毛竹叶片形状调控基因phelbd29及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种毛竹叶片形状调控基因 phelbd29及其应用。


背景技术：

2.毛竹(phyllostachys edulis)是禾本科刚竹属多年生常绿植物，为全国最主要竹种，中国被称为毛竹的“故乡”。毛竹是我国栽植面积最大、分布范围最广、生长最快、应用最广泛的经济竹种。毛竹在保持水土、维护环境等方面作用明显，作为木材有非常广泛的应用价值，另外竹笋、竹叶都给人们带来重要的经济效益，在竹产业生产中占有十分重要的地位。
3.lbd(lateral organ boundaries domain)基因家族是植物特有的一个基因家族，最早在拟南芥中发现，其氨基酸序列的n端含有lteral organboundaries domain。根据功能域不同，lbd转录因子被分为2大类型，即classi 和classii。classi类lbd基因包含一个完全保守的基因cx2cx6cx3c锌指状结构域和c端一个lx6lx3lx6l亮氨酸拉链状卷曲基序，而classii类lbd基因仅有一个保守的锌指状结构域。lbd转录因子家族在植物的生长发育过程中起着关键性的作用，它们参与根的形成，胚、叶片和花序的发育等。例如，拟南芥中的atlbd16,atlbd18和atlbd29，三个生长素诱导蛋白，在拟南芥的侧根的发育过程中起着重要作用。同时atlbd16、atlbd17、atlbd18和 atlbd29也是愈伤组织诱导过程中的关键调控因子。在拟南芥双突变体lbd10 和lbd27中，所有花粉均败育，表明atlbd10和atlbd27可能在花粉发育中起关键作用水稻里的lbd基因，oas2，参与芽分化和叶片的发育。
4.目前已公布的调节植物生长发育的基因多为拟南芥、水稻等模式植物中的 lbd基因，而毛竹中lbd基因的功能尚未报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种可以改变拟南芥叶片形状的毛竹叶片形状调控基因phelbd29及其应用。
6.为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种毛竹叶片形状调控基因phelbd29，所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
7.本发明所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29编码的蛋白质，为如下(1) 或(2)所述的蛋白质：
8.(1)由序列表中的seqi d no.2氨基酸序列组成的蛋白质；
9.(2)将序列表中的seqi d no.2氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或添加且具有毛竹叶片形状调控基因phelbd29功能由(1)衍生的蛋白质。
10.本发明所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29在调节拟南芥叶片形状中的应用。
11.本发明的一种植物过量表达载体，所述植物过量表达载体为多克隆位点区域依次
连接有35s启动子、如权利要求1所述的phelbd29基因和终止子的 pcambia1301a-phelbd29植物表达载体。
12.本发明含有所述的植物过量表达载体的宿主菌。
13.本发明用于克隆所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29的引物对，所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
14.本发明一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的植物过量表达载体，或其基因组中整合有外源的如权利要求1所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29序列。
15.有益效果：本发明首次提供了调控叶片形状相关的毛竹phelbd29基因及其编码蛋白与应用。通过农杆菌介导的花序浸染法将phelbd29基因过表达载体转入野生型拟南芥中，结果显示过表达株系与野生型株系相比,其叶片形状发生了明显的改变。该结果为研究毛竹叶片发育提供理论基础。
附图说明
16.图1为本发明的phelbd29基因所编码的蛋白的氨基酸序列和结构域划分图。
17.图2为本发明的phelbd29基因不同组织表达模式分析结果柱状图。
18.图3为本发明的载体示意图。
19.图4为本发明的phelbd29基因过表达植株和野生型植株表型图。
20.图5为本发明的phelbd29基因过表达植株和野生型植株的叶片表型分析图。a为过表达植株和野生型植株的叶片表型图；b为过表达植株和野生型植株的叶柄统计图；c-e分别为过表达植株和野生型植株的叶长、叶宽和叶面积统计图。
具体实施方式
21.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
22.实施例1
23.本发明的一种毛竹叶片形状调控基因phelbd29，所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
24.本发明所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29编码的蛋白质，为如下(1) 或(2)所述的蛋白质：
25.(1)由序列表中的seqi d no.2氨基酸序列组成的蛋白质；
26.(2)将序列表中的seqi d no.2氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或添加且具有毛竹叶片形状调控基因phelbd29功能由(1)衍生的蛋白质。
27.本发明所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29在调节拟南芥叶片形状中的应用。
28.本发明的一种植物过量表达载体，所述植物过量表达载体为多克隆位点区域依次连接有35s启动子、所述的phelbd29基因和终止子的pcambia1301a
‑ꢀ
phelbd29植物表达载体。
29.本发明含有所述的植物过量表达载体的宿主菌。
30.本发明用于克隆所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29的引物对，所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
31.本发明一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的植物过量表达载体，或其基因组中整合有外源的所述的毛竹叶片形状调控基因phelbd29 序列。
32.1、材料
33.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
34.2、方法
35.2.1毛竹phelbd29基因编码的蛋白序列分析
36.利用毛竹数据库查找phelbd29基因，并且找到对应的蛋白序列(seq idno.2)，并根据lbd基因特点，对phelbd29蛋白序列结构域进行分析，标注 phelbd29蛋白序列中的cx2cx6cx3c锌指状结构域和c端一个lx6lx3lx6l (图1)结构域。
37.2.2phelbd29基因不同组织表达模式分析
38.取毛竹不同组织根(r)、茎(s)、老叶(ml)、幼叶(yl)、竹鞭(r)和笋(sh)，每个样取完后，迅速放入液氮速冻，然后冻存于-70℃冰箱，用于后期rna时提取使用。
39.rna的提取步骤参考e.z.n.a.tm magsi植物rna提取试剂盒和使用核酸自动提取仪。荧光定量pcr引物以tip41(f:
40.aaaatcattgtaggccattgtcg；r:actaaattaagccagcgggagtg
41.)作为内参基因，定量反应使用的是roche定量试剂盒，反应体系为25μl，各组分为染料混合液9.5μl，cdna模板为2μl，上下游引物各(10μmol/l)各 0.5μl，最后补去离子水至25μl。pcr反应参数如下：95℃，10min；95℃， 15s；60℃，1min，共40个循环。反应结束后，对产物进行加热，获得产物的溶解曲线。采用2
–
δδct
[δct＝ct
目标基因
–
ct
内参基因
.δδct＝δct
处理后
–
δct
对照
]法进行数据处理。
[0042]
每次实验测定三次生物学重复，至少三次实验操作重复，测定结果见图2 所示，图中可以看出，phelbd29基因各个组织中均有表达，且在叶中表达量最高。
[0043]
2.3毛竹phelbd29蛋白编码序列的克隆
[0044]
选取正常生长的毛竹叶片，提取毛竹叶片rna并反转录成cdna，以毛竹叶片cdna为模板，根据毛竹基因组数据库公布的基因序列，结合克隆载体的多克隆位点设计引物，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物。
[0045]
引物序列为：
[0046]
phelbd29-f-1：5
′‑
gg ggtacc atggcatcttcgtcgagca-3
′
[0047]
phelbd29-r-1：5
′‑
cgggatcc tcacatgctgctgtctcctc-3
′
[0048]
pcr反应程序为：98℃，预变性10min；98℃，变性20s；58℃，退火20s； 72℃，延伸2min，30个循环；72℃，复性10min；10℃保存。
[0049]
将pcr扩增产物用质量比为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，将与目的基因长度一致的电泳条带进行切胶回收，回收片段连接至peasy-t1载体(购于全式金生物技术有限公司)，获得连接产物。将连接产物转化到大肠杆菌感受态trans5α细胞中，并提取质粒，以提取的
质粒做模板，以phelbd29-f-1、phelbd29-r-1 为引物进行pcr扩增验证，同时用kpni和bamhi双酶切质粒进行检测，筛选阳性克隆子，将阳性克隆子送去华大生物公司进行测序，测序结果使用mega5.0 软件比对，结果与预测一致。获得的重组质粒命名为t-phelbd29。
[0050]
2.4毛竹phelbd29基因过表达载体pcambi1301a-phelbd29构建
[0051]
以pcambia1301(购于上海捷兰生物技术有限公司，载体图谱如图3所示) 为原始载体，在其多克隆位点的ecori和saci酶切位点之间连接一个35s启动子，并在sphi和hindiii酶切位点之间加上一段nos终止子，获得改造的载体pcambi1301a。用kpn i和bamhi双酶切t-end1a得到小的目的片段，同时用kpn i和bamhi双酶切pcambi1301a得到大的目的片段，将上述两片段使用t4连接酶连接，构建获得载体pcambi1301a-phelbd29。
[0052]
2.5过表达phelbd29转基因拟南芥的获得及鉴定
[0053]
2.5.1过表达phelbd29转基因拟南芥的获得：
[0054]
待野生型拟南芥生长至初花期时，用1ml胶头滴管吸取配制好的侵染缓冲液滴蘸花蕾，避光黑暗培养三天左右。待侵染后的拟南芥生长势恢复后用样的方法进行第二次侵染。经过两次侵染后收获种子为t0代。
[0055]
2.5.2过表达phelbd29转基因拟南芥的鉴定：
[0056]
1.gus基因的组织化学染色
[0057]
分别取不同株系的phelbd29转基因拟南芥及野生型对照植株的叶片进行 gus组织化学染色。具体操作步骤如下：分别取不同株系的phelbd29转基因拟南芥及野生型对照植株的叶片，将叶片移入试管中，加入适量的gus缓冲液浸没叶片，再加入gus染色液，混匀后37℃下保存4-12h，结束后，将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再用50％和20％乙醇各侵泡20min以上，直到叶片呈白色；肉眼或显微镜下观察，叶片上有蓝色小点即为gus表达。染色结果如图3所示，oe-2、oe-5和oe-6株系的叶片呈现蓝色，而野生型植株的叶片未观察到蓝色。
[0058]
2.pcr分子验证
[0059]
提取oe-2、oe-5、oe-6和野生型拟南芥叶片的dna。
[0060]
取生长状况良好的拟南芥叶片0.1g于2ml灭菌后的离心管中；
[0061]
放入钢珠，35hz研磨35s；
[0062]
加入400μl dna extraction buffer，最高速离心15min；
[0063]
离心后小心吸取300μl上清液于新的1.5ml灭菌的离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，室温静置2min；
[0064]
再以最高转速离心5min以沉淀dna；
[0065]
弃去(5)中的上清液，加入1ml 75％的酒精，7500rpm离心5min；重复一次，弃去上清，使沉淀的dna尽量干燥后加入100μl双蒸水，轻轻震荡使dna沉淀溶解；
[0066]
同时以相同的方法提取野生型拟南芥的基因组dna为对照组。
[0067]
以上述提取的基因组dna为模板，使用引物petcp10-f和petcp10-r进行pcr分子检测。扩增程序：98℃10min；变性：98℃10s；退火：62℃5s；延伸：72℃30s，28个循环；总延伸：72℃10min。反应结束后，取pcr产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中观察。
[0068]
2.6毛竹phelbd29基因的转基因拟南芥的叶片表型分析
[0069]
同时将野生型和转基因拟南芥种植于温室中，四周后，拍照观察表型差异。结果如
图4所示，图中可以看出，过表达株系与野生型株系相比，叶片形状发生了明显的改变。与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的叶片也发生了明显的向外卷曲现象(图5)。
[0070]
同时对野生型和转基因拟南芥的叶片长、宽及叶面积大小进行扫面测量。结果发现，转基因拟南芥的叶片长和宽都明显小于野生型拟南芥的，导致转基因拟南芥的叶面积明显小于野生型拟南芥的。
[0071]
此外，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的叶柄明显短于野生型株系的(如 5)。
[0072]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。