一种深绿木霉及其在防治三七病害发生中的应用

1.本发明涉及一种菌株，具体涉及一种深绿木霉及其在同时防治三七根腐病和黑斑病主要病原菌中的应用。


背景技术：

2.三七是云南文山地区主要的经济作物，性喜温暖阴湿，其独特的生长环境容易诱发多种土传病害。由于三七神奇的药用功效，全球对三七及其相关产品的需求日益增加，而可供种植三七的区域并不多，因此大多数地区采取三七连作的种植方式。随着三七种植年限的增加，土传病害的种类、发病面积及严重程度逐年增加，严重损害三七的产量和质量，其中最主要的病害为根腐病。
3.根腐病是由于土壤中微生物失调，大量病原性和真菌侵染三七植株根部导致的，土壤中微生物失调是导致三七连作障碍的一个重要因素，目前常用的治理方法主要是施用杀菌剂，但是效果越来越不理想，而采用高效熏蒸剂进行土壤灭生处理，然后再补充益生菌剂调整微生物区系使土壤活化和健化的方法则成本较高，效果也不理想。
4.三七黑斑病是三七种植过程中的另一种常见病害，病原为人参链格孢(学名：altemaria panax whetzel)，属半知菌亚门、丝孢目、链格孢属真菌。三七黑斑病可导致三七的茎、叶、叶柄、花轴、果实、果柄、根、根茎及芽等部位受害，但以地上部幼嫩组织或组织结构较松散的幼茎、茎顶、叶柄和花轴等部位为主，占所有发病植株的60％以上。最初呈椭圆形褐色病斑，然后病斑向纵向和横向扩展，往往造成发病部位缢缩，最终病部折断致茎枯或花苔下垂枯萎死亡，到后期在病斑上可以看到明显黑色霉层。三七黑斑病侵染和发病的温度为18-22℃，空气相对湿度80％以上，并随着空气相对湿度的增加而发生严重。3-10月间的日平均气温18-25℃，为三七黑斑病发生的适宜温度范围，因而降雨情况和空气相对湿度是决定该病发生的主要因子。该病在中国云南的文山地区有三个高峰期，分别在5月、7-8月、9月。高峰期雨量集中、空气相对湿度大，如防治不及时会导致该病的暴发与流行。三七黑斑病也可能导致三七根腐病的发生。目前三七黑斑病的主要防治方法仍采用化学制剂世高、代森锰锌以及多抗霉素，尚无有效的生物防治手段的相关报道。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种深绿木霉及其在防治三七根腐病主要病原菌中的应用方法。
6.本发明的第一个方面，提供一种深绿木霉(trichoderma atroviride)t21-2菌株，保藏编号为cgmcc no.22462；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2021年6月22日。
7.本发明所提供的深绿木霉(trichoderma atroviride)t21-2菌株为从健康三七根际土壤中分离得到。
8.本发明的第二个方面，提供一种包含深绿木霉t21-2菌株、分生孢子和/或菌培养物的挥发物的制剂。
9.在一种实施方式中，所述制剂为悬浮液。
10.本发明的第三个方面，提供一种将深绿木霉t21-2菌株、分生孢子和/或菌培养物的挥发物的制剂在用于三七病害生物防治中的应用。
11.在一种实施方式中，其中，三七病害是指黑斑病。
12.在另一种实施方式中，其中，三七病害是指根腐病。
13.本发明的第四个方面，提供一种将深绿木霉t21-2菌株、分生孢子和/或菌培养物的挥发物的制剂在用于促进三七生长中的应用。
14.本发明的第五个方面，提供一种将深绿木霉t21-2菌株、分生孢子和/或菌培养物的挥发物在用于制备生物防治药剂中的应用。优选的，该生物防治药剂的使用对象为三七。
15.本发明的第六个方面，提供一种将深绿木霉t21-2菌株、分生孢子和/或菌培养物的挥发物在用于制备植物促生中的应用。优选的，该生物防治药剂的使用对象为三七。
16.本发明相对于现有技术获得了如下有益的技术效果：
17.本发明提供的深绿木霉(trichoderma atroviride)t21-2菌株在抗菌实验中能有效地抑制三七根腐病主要病菌锈腐病原菌ilyonectria destructans的生长，在pda培养基上深绿木霉t21-2菌株对供试4个锈腐病菌的抑制率均在60％以上；通过使用深绿木霉t21-2菌株分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理24后，叶部接种三七黑斑病源菌alternaria panax，发现病斑面积显著降低，说明该菌株可有效用于同时防治三七根腐病和黑斑病的发生。并且，通过使用深绿木霉t21-2菌株分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理，证明该菌株可显著促进三七出苗以及提高单株鲜重。
附图说明
18.图1为深绿木霉t21-2菌株在pda培养基上的形态学特征，其中a为菌落形态，b为分生孢子梗形态，c为分生孢子形态。
19.图2为深绿木霉t21-2菌株在粗皂苷培养基上生长。
20.图3为深绿木霉t21-2菌株对三七根腐病原菌ilyonectria destructans的拮抗能力测定。
21.图4为深绿木霉t21-2菌株分生孢子悬浮液对黑斑病的抑制作用。
22.图5深绿木霉t21-2对三七种子出苗以及鲜重的影响.
具体实施方式
23.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
24.实施例1深绿木霉t21-2菌株的分离及鉴定
25.(1)菌株的分离与纯化
26.称取三七根际土10g加入装有90ml无菌水的三角瓶中，25℃摇床振荡培养30min，然后进行10倍梯度稀释至10-1
、10-2
。吸取稀释液0.1ml放入添加有硫酸链霉素(100ppm)的pda平板上均匀涂布，所述pda平板组成为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l。在28℃
恒温培养箱中倒置培养，定期观察；待培养皿中长出疑似菌落后，立即进行挑取并转移到新鲜的pda平板上进行编号保存；采用菌丝末端法进行纯化，得到如图1所示的纯培养物，该培养物在pda上培养4d时已长满直径为9cm的培养皿，菌丝发达，气生菌丝蓬松茂密，白色，分生孢子为绿色。
27.(2)菌株的鉴定
28.提取步骤(1)中分离纯化后菌株的基因组dna，采用以下引物进行pcr扩增：
29.上游引物its1：5
’‑
tccgtaggtgaacctg cgg-3’，
30.下游引物its4：5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’.
31.将上述扩增序列在ncbi数据库中进行比对，用blast比对后与深绿木霉trichoderma atroviride相似度最高，结合形态学鉴定，确定分类命名为深绿木霉(trichoderma atroviride)，菌株命名为t21-2，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为cgmcc no.22462；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2021年6月22日。如图2所示，该深绿木霉t21-2菌株可在以粗皂苷为碳源的培养基上生长；所述粗皂苷培养基组成为：3g nano3，1g kh2po4，0.5g kcl，0.5g mgso4·
7h2o，0.01gfeso4·
7h2o，10g粗皂苷，17g琼脂，1000ml蒸馏水，溶解，混匀，用1mol/l naoh溶液调ph至7.0。
32.实施例2深绿木霉t21-2菌株在三七根腐病防控中的应用
33.(1)所述深绿木霉t21-2菌株挥发物对锈腐病原菌ilyonectria destructans生长的影响
34.采用对扣培养的方法。将深绿木霉t21-2菌株与锈腐病原菌分别进行活化，待生长3天后，用5mm打孔器分别在深绿木霉t21-2菌株与锈腐病原菌的菌落边缘打取新鲜菌丝块；将深绿木霉t21-2菌株菌丝块放置在含20mlpda的9cm培养皿中央，锈腐病原菌菌丝块放置在另一个新鲜的含20mlpda的9cm培养皿中央；将两个皿底相互对扣，用封口膜进行4层包裹处理，每个处理3次重复；含锈腐病原菌菌丝块的一面在上，含深绿木霉t21-2菌株菌丝块的一面在下，以两面都接锈腐病原菌的处理作为空白对照，28℃恒温培养箱中进行培养7d后量取病原菌直径，计算抑制率，公式如下：抑制率(％)＝100*(ck-处理)/ck。结果如表1所示：
35.表1.深绿木霉t21-2菌株挥发物对锈腐病原菌ilyonectria destructans生长的影响
[0036][0037][0038]
由表1可见，深绿木霉t21-2菌株挥发物能显著抑制锈腐病原菌ilyonectria destructans的生长，其对4个锈腐病原菌的抑制率范围为2-20％，与空白对照组相比，4个锈腐病原菌的生长被显著抑制。
[0039]
(2)对峙培养
[0040]
采用平板对峙培养法测定深绿木霉t21-2对供试锈腐病菌菌丝生长的抑制活性。在超净工作台上将在pda培养基上长好的供试锈腐病菌或深绿木霉t21-2用直径为5mm的打孔器制成菌饼，然后将锈腐病菌饼转至pda培养基平板上，再在距病原菌2.5cm处接种深绿木霉t21-2菌饼，设置10次重复，以只放病原菌菌饼的平板为对照，26℃恒温培养3天后测量菌落直径，并按照以下供试计算抑菌率。抑菌率(％)＝[(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径]
×
100％。
[0041]
结果如图3所示，在pda培养基上深绿木霉t21-2菌株对供试4个锈腐病菌的抑制率均在60％以上。
[0042]
实施例3深绿木霉t21-2菌株在诱导植株抗性防控三七黑斑病中的应用
[0043]
制备深绿木霉t21-2菌株分生孢子悬浮液：
[0044]
1)将深绿木霉t21-2菌株接种于pda培养基上培养，得到深绿木霉t21-2菌株菌落；
[0045]
2)在步骤1)的培养皿中加入20ml无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到深绿木霉t21-2分生孢子悬浮液。
[0046]
通过使用50ml浓度为1
×
106/ml的深绿木霉t21-2菌株分生孢子悬浮液对每盆三七盆栽进行灌根处理24h后，叶部接种三七黑斑病源菌alternaria panax，结果发现的病斑面积显著降低(图4)。
[0047]
实施例4深绿木霉t21-2菌株在促进三七生长中的应用
[0048]
制备深绿木霉t21-2菌株分生孢子悬浮液：
[0049]
1)将深绿木霉t21-2菌株接种于pda培养基上培养，得到深绿木霉t21-2菌株菌落；
[0050]
2)在步骤1)的培养皿中加入20ml无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，即得到深绿木霉t21-2分生孢子悬浮液。
[0051]
3)在装有灭菌土的花盆中种入三七种子，每盆12棵，然后将深绿木霉t21-2分生孢子悬浮液稀释至106/ml接种花盆中，每盆50ml，以加入相同体积的灭菌水作为对照，每个处理5盆自然条件下培养3个月后，测量记录植株的出苗率以及单株鲜重(图5)。
[0052]
通过使用深绿木霉t21-2菌株分生孢子悬浮液对三七进行灌根处理，显著促进三七出苗以及单株鲜重。
[0053]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。