与植物光合功能相关的基因SCD1及其编码蛋白的应用以及相关生物材料

与植物光合功能相关的基因scd1及其编码蛋白的应用以及相关生物材料
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及与植物光合功能相关的基因scd1及其编码蛋白的应用以及相关生物材料。


背景技术：

2.植物的叶绿体被认为是十亿年前蓝藻被真核生物吞噬后经内共生演化而来。在内共生演化过程中，蓝藻自身携带的基因组绝大部分丢失或者转移并整合到宿主细胞核基因组中，叶绿体基因组仅保留了很少量的基因。叶绿体基因组与原核生物的基因组类似，为双链闭合环状dna分子，高等植物的叶绿体基因组仅含有约120个基因，包括全部的rrna和trna基因、启动基因表达所需的蛋白基因、光系统蛋白基因和少量代谢相关的蛋白基因。叶绿体基因的表达与调控对叶绿体发育、叶绿体中的能量转化和物质代谢至关重要。
3.最早认为叶绿体基因的表达与原核生物相似，是在转录起始水平上的调控。但是随着基因组测序工作的进行及对叶绿体基因表达调控研究的深入，发现叶绿体基因表达调控比预想的要复杂得多，涉及转录、转录后加工、翻译、翻译后加工等多个步骤和环节，而且叶绿体基因表达调控需要细胞核基因组和叶绿体基因组协同调控。大量细胞核基因编码的叶绿体蛋白聚集在叶绿体类核区，参与叶绿体的基因表达调控。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的生物量和/或如何调控植物的光合功能。该调控光合功能可为调控叶绿素含量、调控光系统活性和/或调控光合蛋白含量。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种应用，其中，所述应用为如下a1)-a4)中的至少一种：
6.a1)scd1蛋白在调控植物生物量中的应用；
7.a2)scd1蛋白在调控植物叶绿素含量中的应用；
8.a3)scd1蛋白在调控植物光系统活性中的应用；
9.a4)scd1蛋白在调控植物光合蛋白含量中的应用。
10.所述scd1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
11.a1)氨基酸序列是序列表中seq id no.3所示的蛋白质；
12.a2)在序列表中seq id no.3所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
13.a3)将序列表中seq id no.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；
14.a4)与序列表中seq id no.3限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于拟南芥且具有相同生物学功能的蛋白质。
15.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
16.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
17.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
18.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
19.本发明还提供了另一种应用，其中，所述应用为如下b1)-b4)中的至少一种：
20.b1)与scd1蛋白相关的生物材料在调控植物生物量中的应用；
21.b2)与scd1蛋白相关的生物材料在调控植物叶绿素含量中的应用；
22.b3)与scd1蛋白相关的生物材料在调控植物光系统活性中的应用；
23.b4)与scd1蛋白相关的生物材料在调控植物光合蛋白含量中的应用。
24.所述生物材料为下述c1)至c7)和d1)至d7)中的任意一种：
25.c1)编码所述scd1蛋白的核酸分子；
26.c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
27.c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
28.c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
29.c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
30.c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
31.c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
32.d1)抑制或降低所述scd1蛋白编码基因表达的核酸分子；
33.d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；
34.d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；
35.d4)含有d1)所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物；
36.d5)含有d1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有d2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
37.d6)含有d1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有d2)所述表达盒的转基因植物组织；
38.d7)含有d1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有d2)所述表达盒的转基因植物器官。
39.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
40.c1所述核酸分子具体可为如下c1)或c2)或c3)所示的dna分子：
41.c1)核苷酸序列是序列表中seq id no.1或seq id no.2所示的dna分子；
42.c2)与c1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于拟南芥且编码所述scd1蛋白的dna分子；
43.c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述scd1蛋白的dna分子；
44.d1所述核酸分子具体可为表达靶向上述c1所述核酸分子的grna的dna分子。该grna可为靶向scd1基因(seq id no.2)，则编码grna的序列为gcgaaagctagaaagtgaac(seq id no.4)，和/或agtgacatgaacatgattgc(seq id no.5)。
45.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码scd1蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的scd1蛋白的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码scd1蛋白且来源于拟南芥，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码scd1蛋白的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。
46.所述编码所述scd1蛋白的核酸分子既可为scd1基因的cdna序列，也可为scd1基因的基因组dna序列；与scd1基因具有90％以上同一性且编码scd1蛋白的dna序列，是将scd1基因的cdna用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效的发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变异的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
47.上文中，所述调控植物的生物量可为降低生物量，例如使植株变小。所述调控植物叶绿素含量可为降低植物叶绿素含量，例如使植物叶片迟绿。所述调控植物光系统活性可为降低植物光系统活性。所述调控植物光合蛋白含量可为降低植物光合蛋白含量-。
48.本发明还提供了培育转基因植物的方法一或培育转基因植物的方法二。
49.所述培育转基因植物的方法一包括向出发植物甲中导入提高所述scd1蛋白的含量和/或活性的物质，得到转基因植物甲的步骤；所述出发植物甲为含有或不含有所述scd1蛋白的编码基因的植物；
50.所述转基因植物甲与所述出发植物甲相比，所述转基因植物甲至少具有如下一种特性：
51.1)植物的生物量提高；
52.2)植物的叶绿素含量提高；
53.3)植物的光系统活性提高；
54.4)植物的光合蛋白含量提高。
55.上述方法一中，所述“提高所述scd1蛋白的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到表达或过量表达所述蛋白质、或提高所
述蛋白质的活性的效果。
56.上述方法一中，所述“提高所述scd1蛋白的含量和/或活性的物质”具体可为上文记载的所述scd1蛋白相关的生物材料。例如，向出发植物中导入编码所述scd1蛋白的核酸分子。可选地，提高scd1蛋白的含量和/或活性的物质为c1)至c7)中任一种生物材料。
57.上述方法一中，所述“向出发植物中导入编码所述scd1蛋白的核酸分子”为通过重组表达载体导入所述出发植物；所述重组表达载体具体可为实施例提及的scd1基因表达载体。
58.所述培育转基因植物的方法二包括向出发植物乙中导入抑制所述scd1蛋白的含量和/或活性的物质，得到转基因植物乙的步骤；所述出发植物乙为含有所述scd1蛋白的编码基因的植物；
59.所述转基因植物乙与所述出发植物乙相比，所述转基因植物以至少具有如下一种特征：
60.1)植物的生物量降低；
61.2)植物的叶绿素含量降低；
62.3)植物的光系统活性降低；
63.4)植物的光合蛋白含量降低。
64.上述方法二中，所述“抑制所述scd1蛋白的含量和/或活性”可通过rna干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制所述蛋白质的表达量和/或活性的目的。
65.上述方法二中，所述“抑制所述scd1蛋白的含量和/或活性的物质”可为特异rna分子；所述特异rna分子如式(i)所示：a
反向-y-a
正向
(i)；所述a
正向
的序列为编码所述scd1蛋白的基因中的200-500bp dna片段转录得到的单链rna分子；所述a
反向
的序列与所述a
正向
的序列反向互补；所述y是所述a
正向
与所述a
反同
之间的间隔序列，在序列上，所述y与所述a
正向
及所述a
反向
均不互补。
66.上述方法二中，所述“在出发植物乙中导入特异rna分子”的实现方法可如下：将特异dna分子甲导入出发植物乙；所述特异dna分子甲如式(ii)所示：seq
反向-x-seq
正向
(ii)；所述seq
正向
的序列为编码所述scd1蛋白的基因中的200-500bp dna片段；所述seq
反向
的序列与所述seq
正向
的序列反向互补；所述x是所述seq
正向
与所述seq
反向
之间的间隔序列，在序列上，所述x与所述seq
正向
及所述seq
反向
均不互补。
67.上述方法二中，所述“抑制所述scd1蛋白的含量和/或活性的物质”可为植物基因组编辑的载体；所述植物基因组编辑的载体含有grna编码基因；所述grna在植物中识别的靶标dna为编码scd1蛋白的dna片段。例如，该植物基因组编辑的载体为实施例所述的crispr/cas9重组表达载体。
68.可选地，抑制scd1蛋白的含量和/或活性的物质为d1)至d7)中任一种生物材料。
69.本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括将通过上述方法获得的转基因植物与待改良植物杂交，得到后代转基因植物的步骤。所述后代转基因植物与所述转基因植物(即作为亲本的转基因植物)表型基本一致。
70.本发明所述载体可通过使用原生质体-化学介导法(ca
2
、peg)、ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、花粉管、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中
的任一一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。
71.本发明还提供了植物育种方法一或植物育种方法二。
72.所述植物育种方法一包括如下步骤：增加植物中所述scd1蛋白的含量和/或活性，从而植物具有下述至少一种特性：
73.1)植物的生物量提高；
74.2)植物的叶绿素含量提高；
75.3)植物的光系统活性提高；
76.4)植物的光合蛋白含量提高。
77.所述植物育种方法二包括如下步骤：降低植物中所述scd1蛋白的含量和/或活性，从而植物具有下述至少一种特征：
78.1)植物的生物量降低；
79.2)植物的叶绿素含量降低；
80.3)植物的光系统活性降低；
81.4)植物的光合蛋白含量降低。
82.上述c1)至c7)和d1)至d7)中的任一种生物材料也在本发明的保护范围之内。
83.本发明还提供了包含上述的生物材料的下述任一种产品：
84.1)提高植物的生物量的产品；
85.2)提高植物的叶绿素含量的产品；
86.3)提高植物的光系统活性的产品；
87.4)提高植物的光合蛋白含量的产品；
88.5)降低植物的生物量的产品；
89.6)降低植物的叶绿素含量的产品；
90.7)降低植物的光系统活性的产品；
91.8)降低植物的光合蛋白含量的产品。
92.上文中，所述植物可为如下e1)至e4)中的任意一种：e1)双子叶植物；e2)单子叶植物；e3)十字花科植物；e4)拟南芥。
93.上文中，所述植物量可为植物地上部分的鲜重；所述叶绿素可为叶绿素a和/或叶绿素b；所述光系统可为光系统i和/或光系统ii；所述光合蛋白可选自psaa、d1、cp47和cytf中的一种或多种。
94.通过对拟南芥突变体scd1的研究，发现了一个与植物光合功能相关的新基因scd1，该基因可能参与了叶绿体翻译的调节，进而影响了叶绿体的发育和光合功能。该基因突变导致植株叶片迟绿，植株变小，这一表型特点在观赏植物培育方面，例如培养植株矮小的观赏植物或者叶片色彩多样的观赏植物具有潜在的应用价值。
附图说明
95.图1为实施例1的植株生长表型、实施例2的叶绿素含量测定以及实施例1的scd1蛋白含量测定，wt、scd1-1、scd1-2、scd1-1com分别表示wt、scd1-1、scd1-2、scd1-1com进行sds-page的蛋白质总质量相同，1/4wt表示进行sds-page的蛋白质总质量是wt的1/4，1/2wt
表示进行sds-page的蛋白质总质量是wt的1/2。
96.图2为实施例2的光合功能分析。
97.图3为实施例3的scd1蛋白定位于叶绿体类核区。
98.图4为实施例4的叶绿体mrna的积累和叶绿体编码光合蛋白的含量变化。
具体实施方式
99.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
100.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
101.下述实施例涉及到的菌株主要包括：载体构建过程需要大肠杆菌(escherichia coli)trans-1、bl21；农杆菌gv3101。其中，trans-1和bl21购买自全式金公司；gv3101购买自庄盟生物公司。
102.下述实施例涉及到的质粒主要包括：表达载体pet28a( )；双元载体pcambia1301，pbi221-gfp。pet28a( )和pcambia1301质粒均购买自全式金公司，pbi221-gfp购自北京华越洋生物。
103.下述实施例涉及到的抗体主要包括兔源多克隆抗体anti-d1、anti-psaa、anti-cytf、anti-cp47、anti-scd1；鼠源单克隆抗体anti-β-actin。其中anti-d1、anti-cytf、anti-cp47由实验室制备并保存，制备方法见实施例5，anti-psaa购买自瑞典agrisera公司，anti-scd1制备方法见实施例5。
104.实施例1 scd1突变体的获得和分子鉴定
105.1.scd1突变体的获得
106.植物材料包括野生型(wt)、功能未知基因scd1基因的突变体。这两类材料遗传背景均为拟南芥哥伦比亚生态型(arabidopsis thaliana columbia-0)。其中，wt购自拟南芥生物资源中心arabidopsis biological resource center(abrc)(http：//abrc.osu.edu/)。突变体委托杭州百格生物技术公司利用crispr/cas9方法获得。野生型(wt)为拟南芥哥伦比亚生态型(arabidopsis thaliana columbia-0)，含有scd1基因，scd1基因的核苷酸序列是序列表中seq id no.2所示，编码序列是序列表中seq id no.1所示，编码氨基酸序列是序列表中seq id no.3所示的蛋白质
107.通过crispr/cas9方法敲除拟南芥的scd1基因(seq id no.2)，具体方法包括：利用在线crispr设计工具(http：//tools.genome-engineering.org)设计scd1基因的基因组上(seq id no.2)的两个引导序列(guide sequences)，分别是gcgaaagctagaaagtgaac(grna1的编码dna)，靶向于scd1基因(seq id no.2)第137位-157位(靶位点序列)和agtgacatgaacatgattgc(grna2的编码dna)，靶向于scd1基因(seq id no.2)第203位-223位(靶位点序列)，利用百格crispr/cas载体构建试剂盒(cat#bgk03)按照其说明书利用crispr/cas载体bgk03分别构建grna1的crispr/cas重组表达载体和grna2的crispr/cas重组表达载体，其名称分别为pcrispr/cas9-grna1(表达grna1)和pcrispr/cas9-grna2(表达
grna2)，然后将pcrispr/cas9-grna1和pcrispr/cas9-grna1分别单独转化至wt获得突变体scd1(suppressor of chloroplast development1)，一共获得不携带转基因克隆载体的纯合突变体株系5个。这5个株系的生长表型一致，均表现出新叶黄化，随着新叶的长大，黄化表型逐渐恢复，整个植株的生长受到抑制。该5个纯合突变体株系对应的scd1基因的靶标序列处分别有碱基插入或缺失造成移码突变，其中，scd1-1，scd1-2在scd1基因的编码序列的第38位上分别增添了一个碱基a或碱基g，从而导致发生移码突变。
108.2.scd1-1突变体的互补株系获得
109.将编码scd1基因的编码序列(seq id no.1)构建到经ncoi和psteii双酶切的双元转化载体pcambia1301载体上，将构建好的载体转化农杆菌gv3101菌株，随后通过花浸染(clough and bent 1998)的方式转化突变体scd1-1获得转化种子。将转化种子使用10％(v/v)次氯酸钠表面消毒10min后用灭菌水冲洗5次，然后直接点播在含2％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)琼脂和50mg l-1
潮霉素的ms(murashige and skoog)固体培养基上，于4℃黑暗条件下放置2天后置于温度23℃、湿度50％、光强100μmol m-2
s-1
、光照周期14h/10h(白天/黑夜)的条件下生长2周，筛选到的阳性苗即为scd1-1突变体的互补株系，命名为scd1-1com。然后将阳性苗移栽到培养土中进行培养。
110.将wt、scd1-1、scd1-2的种子使用10％(v/v)次氯酸钠表面消毒10min后用灭菌水冲洗5次，然后直接点播在含2％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)琼脂的ms(murashige and skoog)固体培养基上，于4℃黑暗条件下放置2天后置于温度23℃、湿度50％、光强100μmol m-2
s-1
、光照周期14h/10h(白天/黑夜)的条件下生长2周，然后将小苗移栽到培养土中进行培养。
111.植株鲜重的测定方法：分别取5株在培养土中生长3周的wt、scd1-1、scd1-2和scd1-1com小苗的地上部分，用天平称量鲜重，然后计算每株植株的鲜重。数据处理取平均值
±
标准差。
112.小苗形态如图1中a，b所示，scd1突变体(scd1-1，scd1-2)均表现出新叶黄化，随着新叶的长大，黄化表型逐渐恢复，且整个植株的生长受到抑制，其鲜重明显降低。在scd1-1突变体中表达scd1基因(scd1-1突变体的互补株系，scd1-1com)后，能恢复突变体的表型。图1中b下方条状图为wt、scd1-1、scd1-2和scd1-1com小苗的地上部分鲜重统计，wt地上部分鲜重为0.101
±
0.005g/每株，scd1-1地上部分鲜重为0.059
±
0.002g/每株，scd1-2地上部分鲜重为0.051
±
0.003g/每株，scd1-1com地上部分鲜重为0.109
±
0.006g/每株。
113.3.scd1蛋白水平鉴定
114.通过western blot对wt、scd1-1，scd1-2以及scd1-1com进行蛋白水平鉴定，具体方法如下：
115.1)总蛋白提取：参照mart
í
nez-garc
í
a et al.(1999)的方法，取0.1g在培养土中生长3周的上述wt、scd1-7、scd1-2和scd1-1com小苗的叶片在液氮中进行研磨，磨碎后加入总蛋白提取液(125mmtris-hcl，ph8.8，1％[w/v]sds，10％[v/v]glycerol，50mm na2s2o5)，在室温下放置10min后于室温13000g离心10min，上清即为拟南芥全蛋白。使用dc蛋白分析试剂盒(美国bio-rad公司)的标准方法进行蛋白浓度测定。
[0116]
2)sds-page电泳和蛋白免疫印迹分析：
[0117]
a将蛋白样品加入上样缓冲液(50mm tris-hcl，ph6.8，8murea，5％[w/v]sds，20％[v/v]glycerol，5％[v/v]β-me，0.02％[w/v]bromophenol blue)，变性后上样于sds-page
胶。将胶块置于电泳缓冲液(50mmtris，0.384mm glycine，ph8.3，0.1％[w/v]sds)中进行电泳。电泳条件为室温下10ma每块胶(恒流)，时间为3h左右。当溴酚蓝前沿接近胶块底部时结束电泳。
[0118]
b凝胶染色：采用考马斯亮蓝染色法衡量蛋白上样量。将凝胶在蛋白快速染色剂(购买自中科瑞泰)中染色10min以上。
[0119]
c.转膜：电泳结束后，将胶块放入转膜液(25mmtris，0.192mm glycine，ph8.3，10％[v/v]methanol)中平衡。在转膜夹中依次放入一块吸水海绵、三张滤纸、胶块、pvdf膜(用前用甲醇活化)、三张滤纸和吸水海绵。转膜条件为室温下180ma每块胶(恒流)，时间为1.5h左右。
[0120]
d.封闭：转膜完成后，将pvdf膜浸泡于甲醇中约10s，晾干后置于封闭液(50mmtris-hcl，ph 7.4，150mmnacl，0.05％[v/v]tween-20，5％[w/v]skim milk)中封闭2h。
[0121]
e.抗体孵育：根据抗体效价将抗体以不同稀释倍数稀释于缓冲液(50mmtris-hcl，ph 7.4，150mmnacl，0.05％[v/v]tween-20，1％[w/v]skim milk)中。待封闭后将膜置于抗体稀释液中，于室温孵育4h后，转移到二抗稀释液(50mmtris-hcl，ph 7.4，150mmnacl，0.05％[v/v]tween-20，1％[w/v]skim milk，1/10000山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗)中，于室温孵育2h后，用洗膜液(50mmtris-hcl，ph 7.4，150mmnacl，0.05％[v/v]tween-20)洗涤三次，每次5min。
[0122]
f.化学发光：将化学发光液(购买自天根公司)均匀涂在膜上，盖上保鲜膜后于暗室用x胶片曝光，然后将x胶片在显影液中显影，之后置于定影液中定影。
[0123]
结果如图1中c所示，结果表明scd1-1，scd1-2突变体中scd1蛋白缺失，scd1-1突变体的互补株系(scd1-1com)中可以检测到scd1蛋白，且scd1-1com表型与野生型无明显差异。
[0124]
以上这些结果表明scd1的突变体表型是由scd1单个基因突变引起的
[0125]
实施例2 scd1突变体的光合功能显著降低
[0126]
1.叶绿素含量测定
[0127]
1)取100mg上述wt、scd1-1、scd1-2和scd1-1com生长3周的小苗的幼嫩叶片，加入1ml 80％(v/v)丙酮，于室温黑暗条件下放置12h萃取叶绿素。
[0128]
2)在室温黑暗条件下8000g离心10min后取上清，用分光光度计分别测定其在645nm和663nm处的吸光值。
[0129]
3)根据下面公式计算叶片叶绿素含量：
[0130]
chlorophyll a(mg g-1
fw)＝(12.7
×
a663-2.69
×
a645)/鲜重
[0131]
chlorophyll b(mg g-1
fw)＝(22.9
×
a645-4.64
×
a663)/鲜重
[0132]
chlorophyll a b(mg g-1
fw)＝(20.2
×
a645 8.02
×
a663)/鲜重
[0133]
其中，公式中的鲜重为100mg。
[0134]
实验重复三次，数据取其平均值
±
标准差。
[0135]
结果如图1中b的上图所示，其中，wt叶绿素含量为1.10
±
0.16mg g-1
fw，scd1-1叶绿素含量为0.74
±
0.14mg g-1
fw，scd1-2叶绿素含量为0.76
±
0.11mg g-1
fw，scd1-1com叶绿素含量为1.13
±
0.17mg g-1
fw，scd1突变体叶片的叶绿素含量明显低于wt。
[0136]
2.叶绿素荧光测定
[0137]
上述wt、scd1-1、scd1-2和scd1-1com小苗叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线使用调制荧光仪pam-2100(德国heinz walz公司)测定，步骤如下：
[0138]
1)培养土中生长3周的植物置于黑暗条件下暗适应30min。
[0139]
2)打开测量光(波长650nm，光强0.1μmol m-2
s-1
)，得到初始荧光值fo。
[0140]
3)开启饱和脉冲光(光强3000μmol m-2
s-1
，持续时间0.8s)，得到最大荧光值fm。最大光化学效率fv/fm根据公式计算所得，公式为fv/fm＝(fm-fo)/fm。
[0141]
4)1.5min后开启活化光(波长650nm，光强100μmol m-2
s-1
)。大约7min后荧光值趋于稳定，得到稳态荧光fs。开启饱和脉冲光，得到光适应条件下的最大荧光值fm
′
。
[0142]
5)大约5min后荧光值趋于稳定，开启远红光(波长730nm，持续时间3s)，得到光适应条件下的最小荧光值fo
′
。
[0143]
叶绿素a荧光慢诱导曲线显示光系统ii(psii)的光合功能。结果如图2中a所示，scd1突变体(scd1-1和scd1-2)中的f0的值明显高于wt，从而导致fv/fm的值明显低于wt。fv/fm是检测psii反应中心活性的重要指标，当植物psii受损时，fv/fm显著下降(krause&weis 1991)。因此该数据显示scd1突变体的psii的活性降低。
[0144]
3.p700氧化还原动力学测定
[0145]
使用pam-101荧光仪及其附件ed-800t(德国heinz walz公司)测定上述wt、scd1-1、scd1-2和scd1-1com小苗的光系统i(psi)反应中心色素p700的氧化还原动力学曲线，步骤如下：
[0146]
1)培养土中生长3周的植物置于黑暗条件下暗适应30min。
[0147]
2)开启活化光(波长625nm，光强100μmol m-2
s-1
)照射30s。
[0148]
3)p700信号平稳后关闭活化光，打开远红光(波长720nm，光强24μmol m-2
s-1
)照射45s。
[0149]
4)关闭远红光。通过远红光下p700吸收值的变化估算psi的活性。
[0150]
p700氧化还原动力学曲线显示光系统i(psi)的光合功能，结果如图2中b所示，scd1突变体(scd1-1和scd1-2)中的p700的氧化还原信号明显低于wt。p700是psi反应中心色素，是psi的原初电子供体，p700的氧化还原信号为870nm和810nm的差示吸收值(aa
810
)，当psi的功能受损，p700的氧化还原信号降低。因此，该实验结果表明scd1突变体的psi活性降低。
[0151]
上述结果表明，突变体的叶绿素含量、psi和psii活性均明显低于野生型。
[0152]
实施例3 scd1蛋白定位于叶绿体类核区
[0153]
gfp融合蛋白表达用来验证scd1蛋白的亚细胞定位。将scd1的编码序列(seq id no.1)融合到pbi221-gfp载体中gfp的n末端，得到融合表达载体pbi221-scd1-gfp载体。通过peg介导的方法转化拟南芥原生质体，主要参照yoo et al.(2007)的方法，步骤如下：
[0154]
1)配制原生质体提取液：先配制酶液(20mm mes，ph5.7，1.5％[w/v]纤维素酶r10，0.4％[w/v]离析酶，0.4m mannitol，20mmkcl)，于55℃加热该酶液10min，室温冷却后加入cacl2和bsa，其终浓度为10mm cacl2、0.1％(w/v)bsa。然后用0.45μm滤膜过滤后所得溶液即为原生质体提取液。
[0155]
2)将生长状态良好的野生型拟南芥真叶的叶片切成长条细丝，置于原生质体提取
液中，抽真空后于室温黑暗条件下消化3h。
[0156]
3)加入10ml预冷的w5缓冲液(2mm mes，ph 5.7，154mmnacl，125mm cacl2，5mmkcl)终止消化反应。用细胞筛过滤消化产物，将过滤后溶液于4℃200g离心2min后去除上清。沉淀用10ml预冷的w5缓冲液轻轻悬浮后冰浴30min，于4℃200g离心2min后去除上清，用2ml mmg溶液(4mm mes，ph 5.7，0.4m mannitol，15mm mgcl2)重悬沉淀后得到悬浮状态的原生质体。吸取少量原生质体，通过光学显微镜观察原生质体是否完整。
[0157]
4)原生质体转化：将200μl原生质体与10μg pbi221-scd1-gfp载体混匀，加入220μl peg溶液(40％[w/v]peg4000，0.2m mannitol，100mm cacl2)，轻弹混匀后于23℃放置10min。加入880μl的w5溶液轻弹混匀，于室温200g离心2min后去除上清，加入1ml的w5溶液轻轻重悬沉淀，于室温下光照培养12h。
[0158]
5)将悬浮状态的原生质体滴于载玻片，使用激光共聚焦荧光显微镜(德国leica公司)观察荧光信号。
[0159]
将scd1的编码序列插入pbi221-gfp载体，读码框与载体上的gfp蛋白相融合。将构建的pbi221-scd1-gfp载体转化拟南芥原生质体进行瞬时表达分析。对照蛋白ptac5是叶绿体类核区蛋白，在叶绿体中呈点状分布(图3，上)，scd1蛋白在叶绿体中的分布与ptac5的分布特征是一致的(图3)。这一结果，结合前人的叶绿体类核区蛋白质组的研究结果，表明scd1蛋白定位于叶绿体类核区。
[0160]
实施例4检测叶绿体mrna积累以及叶绿体编码的光合蛋白含量
[0161]
采用q-pcr实验检测wt、scd1突变体的叶绿体mrna积累水平。具体方法如下。
[0162]
1)总rna提取：总rna提取的方法参照trizol试剂盒的标准方法。分别取0.1gms培养基上生长2周的上述wt、scd1-1小苗在液氮下进行研磨，磨碎后加入1ml trizol，于室温下放置5min充分变性。加入200μl氯仿抽提，于4℃，12,000g离心15min后小心吸取上层水相后加入等体积异丙醇于室温下沉淀10min。沉淀后于4℃12,000g离心10min，去除上清后，用70％(v/v)乙醇重悬洗涤沉淀后于4℃，7,500g离心5min，所得沉淀即为拟南芥总rna。
[0163]
2)反转录：cdna的获得参照日本takara公司反转录试剂盒的方法。取1μg总rna使用随机引物反转录，生成cdnas。
[0164]
3)定量pcr：定量pcr参照日本takara公司荧光定量pcr试剂盒的标准方法进行。使用荧光定量pcr仪(瑞士roche公司)进行定量pcr反应。使用actin2或18srrna作为内参基因。
[0165]
实验重复三次，数据取其平均值
±
标准差。
[0166]
由于叶绿体类核区蛋白主要参与叶绿体的基因表达，利用q-pcr对叶绿体编码的绝大多数基因的rna积累水平进行分析，结果如图4中a所示，表明，与wt相比，scd1-1突变体中rna的积累水平稍有升高或变化不大，表明scd1基因敲除不影响叶绿体基因的转录。
[0167]
采用western blot检测wt、scd1-1，scd1-2以及scd1-1com小苗中光合蛋白水平，具体方法如下：
[0168]
1)总蛋白提取：参照mart
í
nez-garc
í
a et al.(1999)的方法，取0.1g培养土中生长3周的上述wt、scd1-7、scd1-2和scd1-1com小苗的叶片在液氮中进行研磨，磨碎后加入总蛋白提取液(125mmtris-hcl，ph8.8，1％[w/v]sds，10％[v/v]glycerol，50mm na2s2o5)，在室温下放置10min后于室温13000g离心10min，上清即为拟南芥全蛋白。使用dc蛋白分析试
剂盒(美国bio-rad公司)的标准方法进行蛋白浓度测定。
[0169]
2)sds-page电泳和蛋白免疫印迹分析：
[0170]
a将蛋白样品加入上样缓冲液(50mm tris-hcl，ph6.8，8murea，5％[w/v]sds，20％[v/v]glycerol，5％[v/v]β-me，0.02％[w/v]bromophenol blue)，变性后上样于sds-page胶。将胶块置于电泳缓冲液(50mmtris，0.384mm glycine，ph8.3，0.1％[w/v]sds)中进行电泳。电泳条件为室温下10ma每块胶(恒流)，时间为3h左右。当溴酚蓝前沿接近胶块底部时结束电泳。
[0171]
b凝胶染色：采用考马斯亮蓝染色法衡量蛋白上样量。将凝胶在蛋白快速染色剂(购买自中科瑞泰)中染色10min以上。
[0172]
c.转膜：电泳结束后，将胶块放入转膜液(25mmtris，0.192mm glycine，ph8.3，10％[v/v]methanol)中平衡。在转膜夹中依次放入一块吸水海绵、三张滤纸、胶块、pvdf膜(用前用甲醇活化)、三张滤纸和吸水海绵。转膜条件为室温下180ma每块胶(恒流)，时间为1.5h左右。
[0173]
d.封闭：转膜完成后，将pvdf膜浸泡于甲醇中约10s，晾干后置于封闭液(50mmtris-hcl，ph 7.4，150mmnacl，0.05％[v/v]tween-20，5％[w/v]skim milk)中封闭2h。
[0174]
e.抗体孵育：根据抗体效价将抗体以不同稀释倍数稀释于缓冲液(50mmtris-hcl，ph 7.4，150mmnacl，0.05％[v/v]tween-20，1％[w/v]skim milk)中。待封闭后将膜置于抗体稀释液中，于室温孵育4h后，转移到二抗稀释液(50mmtris-hcl，ph 7.4，150mmnacl，0.05％[v/v]tween-20，1％[w/v]skim milk，1/10000山羊抗兔或山羊抗鼠二抗)中，于室温孵育2h后，用洗膜液(50mmtris-hcl，ph 7.4，150mmnacl，0.05％[v/v]tween-20)洗涤三次，每次5min。
[0175]
f.化学发光：将化学发光液(购买自天根公司)均匀涂在膜上，盖上保鲜膜后于暗室用x胶片曝光，然后将x胶片在显影液中显影，之后置于定影液中定影。
[0176]
结果如图4中b所示，其中wt、scd1-1、scd1-2、scd1-1com分别表示wt、scd1-1、scd1-2、scd1-1com进行sds-page的蛋白质总质量相同，1/4wt表示进行sds-page的蛋白质总质量是wt的1/4，1/2wt表示进行sds-page的蛋白质总质量是wt的1/2。结果表明scd1-1，scd1-2突变体中叶绿体基因编码的光合蛋白含量(psaa、d1、cp47、cytf)含量显著降低，scd1-1突变体的互补株系(scd1-1com)中叶绿体基因编码的光合蛋白含量恢复wt水平。
[0177]
以上这些结果表明scd1基因敲除可能影响了叶绿体基因的翻译过程。
[0178]
实施例5抗体制备
[0179]
使用原核蛋白表达系统表达重组蛋白。方法如下：
[0180]
1)重组表达载体构建：将编码scd1的编码序列的181bp-1245bp片段(seq id no.1)融合到pet28a( )载体上，得到重组载体。将重组载体转入大肠杆菌bl21菌株。
[0181]
2)诱导蛋白表达：将含有重组载体的菌株于37℃摇菌培养，待菌液od(a550)值达到0.4左右，加入200μgl-1脱水四环素，于37℃诱导蛋白表达4h左右。
[0182]
3)纯化蛋白：通过镍柱(德国qiagen公司)进行亲和层析纯化重组蛋白。具体步骤如下：
[0183]
a收集菌体后重悬于缓冲液(50mm phosphate buffer，ph 7.5，400mmnacl，
100mmkcl，)中。
[0184]
b超声破碎菌体，4℃，13,000g离心20min。收集上清和沉淀，sds电泳检测，确定scd1的融合表达蛋白在沉淀中。
[0185]
c沉淀溶于binding缓冲液中(50mm phosphate buffer，ph 7.5，400mmnacl，6m urea)；离心，取上清，0.45um滤器过滤蛋白样品。
[0186]
d把柱子填料50％的ni-resin混匀，取2ml，均匀加入到柱子中，柱子填料自然沉降后得到v＝1ml的柱子，3v无菌水冲洗，3v binding缓冲液平衡。
[0187]
e依次取下述样品or溶液过柱，并依次收集各部分样品：
[0188]
取约10-15mg的蛋白样品过柱，速度为10v/hour；
[0189]
6v binding缓冲液洗柱；
[0190]
4v washing缓冲液(20mm phosphate buffer，ph ph6.0；400mmnacl；4m urea)洗柱；
[0191]
6v 10mm咪唑washing缓冲液洗柱；
[0192]
6v 50mm咪唑washing缓冲液洗柱；
[0193]
6v 100mm咪唑washing缓冲液洗柱；
[0194]
6v 150mm咪唑washing缓冲液洗柱；
[0195]
6v 200mm咪唑washing缓冲液洗柱；
[0196]
f取不同咪唑washing缓冲液洗脱后的收集物跑sds胶检测。结果发现洗脱产物主要集中在含100mm咪唑washing缓冲液的洗脱后的收集物中。
[0197]
4)透析
[0198]
剪下10cm长的膜，在蒸馏水中浸泡15min；移入500ml的处理液中，加热至80℃以上，约30min；用80℃以上温度的水洗30min；换至20％的酒精中，4℃冰箱保存；处理好的透析袋用干净绳子把一头绑紧，无菌水漂洗干净，内装约10ml(10-15mg)纯化的蛋白液，把另外一头绑紧；置于500ml含4m urea pbs(ph 7.2)中，在磁力搅拌机上，4℃透3h；换至500ml含2m urea pbs(ph 7.2)中，在磁力搅拌机上，4℃透3h；换新的500ml含2m urea pbs(ph 7.2)中，在磁力搅拌机上，4℃透3h。
[0199]
5)免疫兔子
[0200]
透析后的蛋白质浓缩，并测定蛋白质浓度在0.5mg/ml以上时，送启维益成免疫兔子，制备抗体，用于实施例1的蛋白免疫印迹实验。
[0201]
anti-d1、anti-cytf、anti-cp47的制备方法如下。
[0202]
d1，cytf，cp47蛋白的抗体是通过氨基酸序列合成的方法制备的。设计并选取d1，cytf，cp47蛋白特定的序列，分别是：d1的235-246位上的蛋白序列egyrfgqeeety；cp47的497-508位上的蛋白序列klgdpttkrqav；cytf的168-179位上的蛋白序列pdpatnkdvhfl，选取的多肽在启维益成生物公司进行合成，合成后的多肽免疫兔子，制备抗体。
[0203]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，
可以进行一些基本特征的应用。