一种检测孕妇样品中胎儿游离DNA存在或比例的方法和试剂盒

一种检测孕妇样品中胎儿游离dna存在或比例的方法和试剂盒
技术领域
1.本技术涉及分子诊断领域。具体而言，本技术涉及一种检测母亲来源的样品与父亲来源的样品的snp位点的方法，进一步的，涉及一种检测孕妇样品中胎儿游离dna的存在或其比例的方法，以及试剂盒。


背景技术：

2.早在1997年，lo ymd等人(lancet.1997；350:485
–
487)利用pcr技术在妊娠12～40周孕男胎的孕妇血浆和血清中检测到睾丸决定基因(sry)的特异序列，确定了胎儿游离dna(cell free fetal dna,cffdna)的存在。胎儿游离dna的发现使得单基因遗传病的无创产前诊断以及染色体非整倍体的无创产前筛查成为可能。然而，在孕妇血浆中获得的游离dna主要来源于母亲，胎儿游离dna比例(fetal fraction,ff)则会受到孕周、孕妇的身体质量指数(bmi)、孕妇年龄等诸多因素的影响，其可能在小于3％至大于30％之间波动(prenat diagn.2013；33:667
–
74)。胎儿游离dna比例已成为影响无创产前诊断(nipt)或产前筛查(nips)准确性的重要因素，许多分子诊断方法在胎儿游离dna比例低于4％时，其检测的准确性将大大降低(ultrasound obstet gynecol.2013；41:26
–
32)。
3.鉴于胎儿游离dna比例对无创产筛中的重要性，目前已有多种方法可以对胎儿游离dna比例进行测定，主要包括：(1)基于y染色体估算法(bmj.2011；342:c7401)；(2)基于cff-dna片段数目和长度差异(pnas.2018；115(22):e5106-e5114)；(3)基于单核苷酸多态性(snp)的深度靶向或低深度测序法(bioinformatics 2012；28,2883
–
2890；发明专利cn 103215350 b)；(4)基于snp标记的数字pcr方法(clin chem.2018；64(2):336-345)；(5)基于甲基化标记的数字pcr方法(发明专利cn 111154841 a)。基于y染色体片段所占比例可简单准确的估算男胎的cffdna浓度和比例，不适用于女胎；现有nips检测平台估算cffdna浓度和比例的方法大多基于cffdna片段数目和长度差异，通过构建识别模型进行胎儿ff估算，其准确性还有待snp等方法的验证；而基于snp的二代测序等方法虽然可以准确估算cffdna浓度和比例，但因测序成本较高且不能整合到现有的nips检测流程中，目前不具备大规模临床应用的可行性；基于数字pcr的方法可准确定量cffdna比例，但同时进行多个snp和甲基化标记物的数字pcr成本太高，较难在临床普及。综上，目前临床上迫切需要一种更为简便、准确、快速、低成本的测定胎儿cfdna浓度和比例的方法，以提升nips的准确性，降低nips的假阳性和假阴性。


技术实现要素：

4.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
5.如本文中所使用的，术语“snp(单核苷酸多态性)”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。术语“snp位点”为基因组中具有单核苷酸多态性的
位点。在本文中，snp位点包括，具有单核苷酸多态性的单个位点以及具有1个或多个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，或更多个)核苷酸的插入或缺失的位点。在本文中，snp位点通过其参考号(例如rs id)命名。可以利用rs id在公共数据库中查询snp位点及其型别，例如，通过ncbi的dbsnp数据库，chinamap数据库，jsnp数据库等。
6.如本文中所使用的，当提及snp位点的“基因型别”时，其是指某一生物个体所有同源染色体(通常是两条同源染色体)中该snp位点上的基因组合的总称。在本文中，snp位点的“基因型别”指来自胎儿或母亲的一对同源染色体中该snp位点上的基因组合。例如，某个体rs5858210位点的基因型别为“ag/
‑”
表示，该个体的一对同源染色体在rs5858210位点上分别具有核苷酸序列“ag”和
“‑”
(
“‑”
表示缺失)。“某个体rs5858210位点的基因型别为ag/ag”表示，该个体的一对同源染色体在rs5858210位点上均具有核苷酸序列“ag”。相应地，单条染色体上含有该snp位点的一段基因(即，核苷酸区段)即被称为含有该snp位点的“等位基因”。如本文中所使用的，对于某个snp位点而言，除了该snp位点上的核苷酸差异之外，不同的等位基因通常具有完全相同的核苷酸序列。当某个体的一对同源染色体在某snp位点上具有相同的核苷酸序列(即，具有相同的等位基因)时，该个体在该snp位点上的基因型别是纯合的。当某个体的一对同源染色体在某snp位点上具有不同的核苷酸序列(即，具有不同的等位基因)时，该个体在该snp位点上的基因型别是杂合的。如本文中所使用的，术语“fst”是指群体固定系数，其能够反应群体等位基因杂合性水平，用于衡量种群分化程度。fst取值在0到1之间，当fst为1时，表明等位基因在各地方群体中固定，完全分化；当fst为0时，表明不同地方群体遗传结构完全一致，群体间没有分化。在本技术中，选取的snp位点优选在不同人种之间fst＜0.01。这些位点在不同人种之间分化程度很小，基因杂合性水平接近。
7.如本文中所使用的，术语“fst”是指群体固定系数，其能够反应群体等位基因杂合性水平，用于衡量种群分化程度。fst取值在0到1之间，当fst为1时，表明等位基因在各地方群体中固定，完全分化；当fst为0时，表明不同地方群体遗传结构完全一致，群体间没有分化。在本技术中，选取的snp位点优选在不同人种之间fst＜0.01。这些位点在不同人种之间分化程度很小，基因杂合性水平接近。
8.如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(waston-crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本技术中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，术语“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。
9.如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本技术中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补
或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。
10.如本文中所使用的，术语“pcr反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。如本文中所使用的，术语“多重扩增”是指，在同一个反应体系中对多个靶核酸进行扩增。如本文中所使用的，术语“不对称扩增”是指，对靶核酸进行扩增所获得的扩增产物中，两条互补的核酸链的量不相同，一条核酸链的量大于另一条核酸链。
11.如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。
12.如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如the journal of molecular diagnostics 2009,11(2):93-101)。在本技术中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。
13.在本技术的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(tm)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的tm就越高。因此，通过检测双链体的tm，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“t
m”具有相同的含义，并且可互换使用。
14.本技术的发明人通过深入的研究，利用多重不对称pcr扩增和多色探针熔解曲线分析，建立了一种检测母亲样品与父亲样品的snp位点的方法。在此基础上，结合数字pcr系统，本技术开发了一种检测孕妇样品中胎儿游离dna的存在和比例方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。
15.因此，在一个方面，本技术提供了一种检测母亲来源的样品与父亲来源的样品的snp位点的方法，其包括以下步骤:
16.(a)提供含有来源于所述母亲的一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述父亲的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种候选snp位点，并且，
17.提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种候选snp位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，
18.所述第一通用引物包含第一通用序列；
19.所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
20.所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选snp位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和
21.(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，通过pcr反应分别扩增第一样品和第二样品中的靶核酸，从而获得分别与第一样品和第二样品对应的扩增产物；
22.(c)对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；
23.(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，确定这样的snp位点：在该位点上第一样品和第二样品具有不同基因型别。
24.在本技术的方法中，正向引物和反向引物分别包含特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列和反向核苷酸序列，由此，在pcr反应过程中，靶特异性引物对(正向引物和反向引物)将退火至靶核酸，并启动pcr扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物和反向引物互补的两条核酸链(核酸链a和核酸链b)。进一步，由于正向引物和第一通用引物均包含第一通用序列，因此，与正向引物互补的核酸链a也能够与第一通用引物互补。类似地，与反向引物互补的核酸链b也能够与第二通用引物互补。
25.因此，随着pcr反应的进行，第一通用引物和第二通用引物将分别退火至初始扩增产物的核酸链a和核酸链b，并进一步启动pcr扩增。在该过程中，由于反向引物/第二通用引物包含第一通用序列，因此，第一通用引物不仅能够退火至核酸链a(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而且能够退火至核酸链b(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链。也即，第一通用引物可以同时扩增初始扩增产物的核酸链a和核酸链b。与此同时，第二通用引物在第一通用序列的3'端包含额外的核苷酸，因此，虽然第二通用引物也可能退火至核酸链a(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链，其具有与正向引物互补的序列)，但是其与核酸链a在3'端是不匹配的(即，在3'端不能完全互补)。由此，在扩增过程中，第二通用引物将优先退火至核酸链b(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而基本上不能延伸合成核酸链a(与第一正向引物/第一通用引
物互补的核酸链)的互补链。
26.因此，随着pcr扩增的进行，核酸链a的互补链(核酸链b)的合成效率将显著低于核酸链b的互补链(核酸链a)，导致核酸链b的互补链(核酸链a)被大量合成和扩增，而核酸链a的互补链(核酸链b)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量单链产物(核酸链a，其含有与正向引物/第一通用引物互补的序列以及反向引物/第二通用引物的序列)，实现了对含有一种或多种snp位点的靶核酸的不对称扩增。因此，在本技术方法的步骤(a)和(b)中，实现了不对称扩增样品中的一种或多种靶核酸。
27.另外，由于正向引物和反向引物均含有第一通用序列，因此，在pcr反应过程中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸在退火阶段容易自身退火，形成稳定的锅柄结构，阻止第一通用引物和第二通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。因此，在本发明的方法中，引物二聚体的非特异性扩增能够被有效抑制。
28.在某些实施方案中，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定第一样品和第二样品的各个候选snp位点的型别，并分别进行比较，从而鉴定这样的snp位点：在该位点上第一样品具有第一纯合基因型别，且第二样品具有第二纯合基因型别。
29.在某些实施方案中，第一样品选自来自母亲的皮肤，唾液，毛发，指甲，及其任何组合。
30.在某些实施方案中，第二样品选自来自父亲的皮肤，唾液，毛发，指甲，及其任何组合。
31.在某些实施方案中，所述候选snp位点具有选自以下的1个或多个特征：
32.(1)所述候选snp位点在不同人种之间的fst小于0.3(例如，小于0.2，小于0.1，小于0.05，小于0.01)；
33.(2)所述候选snp位点位于不同染色体；
34.(3)所述候选snp位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)。
35.在某些实施方案中，所述候选snp位点具有选自以下的1个或多个特征：
36.(1)所述候选snp位点在不同人种之间的fst小于0.01；
37.(2)所述候选snp位点位于不同染色体；
38.(3)所述候选snp位点的等位基因频率在0.3至0.7之间。
39.在某些实施方案中，所述候选snp位点为人基因组中的snp位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组snp位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，以及前述snp位点的任意组合(例如，前述snp位点中任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)。
40.在某些实施方案中，所述样品中的靶核酸包含下列人基因组snp位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，
rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776和rs7160304。
41.在某些实施方案中，在步骤(a)中，针对每一种snp位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述snp位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；
42.并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析。
43.在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行pcr反应，然后，在pcr反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行pcr反应，然后，在pcr反应结束后，进行熔解曲线分析。
44.在某些实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(pna)或锁核酸)，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。
45.在本技术的方法中，检测探针不受其长度的限制。在某些实施方案中，所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。
46.在某些实施方案中，所述检测探针具有3'-oh末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-oh上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-oh去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。
47.在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在某些实施方案中，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。
48.在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在此类实施方案中，当检测探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针不发出信
red 590,rox,cal fluor red 610,texas red,cal fluor red 635,quasar 670,cy3,cy5,cy5.5,quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如dabcyl、bhq(例如bhq-1或者bhq-2)、eclipse、和/或tamra)。
53.在某些实施方案中，所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-o-氨基丙基修饰，2'-o-烷基修饰，2'-o-烯丙基修饰，2'-o-丁基修饰，和1-(4'-硫代-pd-呋喃核糖基)修饰。
54.在某些实施方案中，所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构。
55.在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团。在某些实施方案中，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在。
56.在某些实施方案中，在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(2)的产物从45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)逐渐升温至75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。升温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，升温的速率可以为：每步骤升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。
57.然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线。
58.在某些实施方案中，根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定各个snp位点的型别。
59.在某些实施方案中，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)：seq id no:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66和69。
60.在某些实施方案中，在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个靶特异性引物对。
61.在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍。
62.在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物
的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物。
63.在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的。
64.在某些实施方案中，所述样品或靶核酸包含mrna，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应。
65.在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行pcr反应。在某些实施方案中，，所述核酸聚合酶为dna聚合酶，例如热稳定的dna聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的dna聚合酶获自，thermus aquaticus(taq),thermus thermophiles(tth),thermus filiformis,thermis flavus,thermococcus literalis,thermus antranildanii,thermus caldophllus,thermus chliarophilus,thermus flavus,thermus igniterrae,thermus lacteus,thermus oshimai,thermus ruber,thermus rubens,thermus scotoductus,thermus silvanus,thermus thermophllus,thermotoga maritima,thermotoga neapolitana,thermosipho africanus,thermococcus litoralis,thermococcus barossi,thermococcus gorgonarius,thermotoga maritima,thermotoga neapolitana,thermosiphoafricanus,pyrococcus woesei,pyrococcus horikoshii,pyrococcus abyssi,pyrodictium occultum,aquifexpyrophilus和aquifex aeolieus。在某些实施方案中，所述dna聚合酶为taq聚合酶。
66.在某些实施方案中，所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
67.在某些实施方案中，所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分。
68.在本技术的实施方案中，所述第一通用引物可以是任意的长度，只要其能够进行pcr反应即可。在某些实施方案中，所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。
69.在某些实施方案中，所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。
70.在某些实施方案中，所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
71.在某些实施方案中，所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分。
72.在某些实施方案中，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
73.在本技术的实施方案中，所述第二通用引物可以是任意的长度，只要其能够进行pcr反应即可。在某些实施方案中，所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。
74.在某些实施方案中，所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。
75.在某些实施方案中，在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
76.在某些实施方案中，所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
77.在某些实施方案中，所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成。
78.在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分。
79.在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。
80.在某些实施方案中，所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
81.在某些实施方案中，所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。
82.在某些实施方案中，在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
83.在某些实施方案中，所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
84.在某些实施方案中，所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成。
85.在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分。
86.在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。
87.在某些实施方案中，所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
88.在某些实施方案中，所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。
89.在某些实施方案中，所述第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第二通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补。
90.在某些实施方案中，所述第一通用引物的序列如seq id no:71所示。
91.在某些实施方案中，所述第二通用引物的序列如seq id no:70所示。
92.在某些实施方案中，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：seq id no:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68。
93.在某些实施方案中，所述方法的步骤(a)-(b)通过包含下述步骤(i)-(vi)的方案来进行：
94.(i)提供来源于所述母亲的一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述父亲的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种snp位点；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种snp位点，提供一个靶特异性引物对；以及任选地，针对每一种snp位点，提供一个检测探针；其中，所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对如上所定义；所述检测探针如上所定义；
95.(ii)将所述样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，核酸聚合酶，以及任选地，检测探针混合；
96.(iii)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；
97.(iv)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；
98.(v)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和
99.(vi)任选地，重复步骤(iii)-(v)一次或多次。
100.在某些实施方案中，在步骤(iii)中，在80-105℃的温度下温育步骤(ii)的产物，从而使核酸变性。
101.在某些实施方案中，在步骤(iii)中，温育步骤(ii)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。
102.在某些实施方案中，在步骤(iv)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(iii)的产物，从而允许核酸退火或杂交。
103.在某些实施方案中，在步骤(iv)中，温育步骤(iii)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。
104.在某些实施方案中，在步骤(v)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(4)的产物，从而允许核酸延伸。
105.在某些实施方案中，在步骤(v)中，温育步骤(iv)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。
106.在某些实施方案中，在相同或不同的温度下进行步骤(iv)和(v)。
107.在某些实施方案中，重复步骤(iii)-(v)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；在某些实施方案中，当重复步骤(iii)-(v)一次或多次时，每一个循环的步骤(iii)-(v)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。
108.在另一方面，本技术还提供了一种检测孕妇样品中胎儿游离dna的存在或其比例的方法，其中，所述方法包含以下步骤：
109.(1)提供待检测的孕妇样品；
110.(2)检测母亲来源的样品与父亲来源的样品的一个或多个snp位点的基因型，并鉴定目标snp位点；其中，在所述目标snp位点上，母亲具有包含第一等位基因的纯合基因型，且，父亲具有包含第二等位基因的纯合基因型，其中，第一等位基因不同于第二等位基因；
111.(3)对所述待检测的孕妇样品中各个目标snp位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；然后，根据第一等位基因和第二等位基因定量检测的结果，确定所述待检测的孕妇样品中胎儿的核酸的存在或其比例。
112.在某些实施方案中，在步骤(2)中，可通过选自下列的机制来检测某个snp位点的基因型，从而鉴定目标snp位点：探针杂交、引物延伸、杂交连接和特异酶切。
113.在某些实施方案中，在步骤(2)中，可通过选自下列的方法来鉴定目标snp位点：测序法(例如，一代测序法、焦磷酸测序法、二代测序法)、芯片法(例如，使用能够检测snp的固相芯片、液相芯片)、基于qpcr的检测法(例如，taqman探针法)、质谱法(如基于massarray的iplex
tm gold)、色谱法(如变性高效液相色谱法dhplc)、电泳法(如snpshot法)、基于熔解曲线分析的检测法。
114.在某些实施方案中，在步骤(2)中，通过基于多重pcr结合熔解曲线分析的检测法鉴定目标snp位点。
115.在某些实施方案中，通过如前所描述的方法鉴定所述目标snp位点。
116.在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过数字pcr对所述样品中各个snp位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测。
117.在某些实施方案中，通过下述方案进行步骤(3)：
118.(i)从步骤(2)中选取至少1个(例如，1个，2个，3个，或更多个)目标snp位点，并且，针对每一个选取的目标snp位点，提供一个扩增引物组和一个探针组，其中，
119.(i-1)所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述目标snp位点的核酸分子；
120.(i-2)所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，
121.(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且
122.(ii)第一探针能够与含有所述目标snp位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标snp位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因；
123.(ii)使用所述扩增引物组和探针组对所述待检测的孕妇样品进行数字pcr，对具有第一等位基因的核酸分子和具有第二等位基因的核酸分子进行定量检测；
124.(iii)根据步骤(ii)的定量检测结果，确定所述待检测的孕妇样品中胎儿游离dna的比例。
125.在某些实施方案中，所述孕妇样品为血液(例如，外周血)。
126.在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针特异于同一snp位点的不同的基因型别。
127.在某些实施方案中，所述目标snp位点各自独立地选自母亲基因型别为第一纯合，且父亲基因型别为第二纯合的snp位点。
128.在某些实施方案中，所述孕妇样品在步骤(1)之前经过预处理。
129.在某些实施方案中，所述预处理包括对样品进行核酸提取和/或对样品中的核酸进行富集。
130.在某些实施方案中，所述核酸富集通过核酸浓缩和/或核酸扩增的方法。
131.在某些实施方案中，通过所述扩增引物组进行所述核酸扩增。
132.在此类实施方案中，根据孟德尔遗传定律，在所述目标snp位点，胎儿基因型为杂合，且第一等位基因与母亲相同，第二等位基因与父亲相同。
133.在本技术的方法中，以所述探针组中的第一探针为例，其能够与具有第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)。因此，在进行数字pcr反应时，在退火或延伸过程中，所述第一探针将与所述核酸分子形成双链体，并在扩增期间被核酸聚合酶(例如dna聚合酶)所降解，释放报告基团(例如荧光基团)。由此，在数字pcr扩增反应结束后，通过微滴检测仪对各微滴的终点荧光进行检测，根据游离的第一报告基团(例如第一荧光基团)的信号(例如第一荧光信号)强度，即可确定阳性微滴和阴性微滴数，从而确定样品中具有第一等位基因的核酸分子的量。类似地，在数字pcr扩增反应结束后，通过微滴检测仪对各微
滴的终点荧光进行检测，根据游离的第二报告基团(例如第二荧光基团)的信号(例如第二荧光信号)强度，即可确定阳性微滴和阴性微滴数，即可确定样品中具有第二等位基因的核酸分子的量。由于孕妇/胎儿基因型别不同，对应于第一/第二等位基因含量即不同，因此，通过比较和分析含有第一/第二等位基因的核酸分子的量，即可计算孕妇样品中胎儿游离dna的比例。
134.在本技术的方法中，在某些实施方案中，所述第一探针在数字pcr反应过程中不与具有第二等位基因的核酸分子退火或杂交；和/或，所述第二探针在数字pcr反应过程中不与具有第一等位基因的核酸分子退火或杂交。易于理解，所述第一/第二探针的杂交特异性是特别有利的，其能够有助于准确测定第一等位基因/第二等位基因的含量，从而有助于计算孕妇样品中胎儿游离dna的比例。在某些实施方案中，可通过控制数字pcr反应的退火温度和/或延伸温度，从而获得所述第一/第二探针的杂交特异性。例如，可设置退火温度和/或延伸温度低于第一探针与具有第一等位基因的核酸分子形成的双链体的熔点，但高于第一探针与具有第二等位基因的核酸分子形成的双链体的熔点，从而使得第一探针在数字pcr反应过程中与具有第一等位基因的核酸分子杂交，但不与具有第二等位基因的核酸分子杂交。类似地，可设置退火温度和/或延伸温度低于第二探针与具有第二等位基因的核酸分子形成的双链体的熔点，但高于第二探针与具有第一等位基因的核酸分子形成的双链体的熔点，从而使得第二探针在数字pcr反应过程中与具有第二等位基因的核酸分子杂交，但不与具有第一等位基因的核酸分子杂交。
135.在某些实施方案中，通过以下的方法计算所述孕妇样品中胎儿游离dna的比例：当目标snp位点是母亲基因型为第一纯合(例如，aa)，父亲基因型为第二纯合(例如，bb)的snp位点时，所述孕妇样品中胎儿游离dna的比例为：2nb/(na nb)，其中，nb为等位基因b的拷贝数(其可通过数字pcr确定)，na为等位基因a的拷贝数(其可通过数字pcr确定)。
136.在本技术的方法中，等位基因的拷贝数量可根据泊松分布原理，由数字pcr平台检测并通过软件直接输出，其相关原理及计算方法可参见例如，milbury ca,zhong q,lin j,et al.determining lower limits of detection of digital pcr assays for cancer-related gene mutations.biomol detect quantif.2014；1(1):8-22.
137.在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(pna)或锁核酸)，或其任何组合组成。
138.在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。
139.在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地具有3'-oh末端；或者，所述探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在探针的最后一个核苷酸的3'-oh上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将探针的最后一个核苷酸的3'-oh去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。
140.在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在某些实施方案中，所述报
告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。
141.在某些实施方案中，所述探针中的报告基团为荧光基团(例如，alex-350,fam,vic,tet,cal fluor gold 540,joe,hex,cal fluor orange 560,tamra,cal fluor red 590,rox,cal fluor red 610,texas red,cal fluor red 635,quasar 670,cy3,cy5,cy5.5,quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如dabcyl、bhq(例如bhq-1或者bhq-2)、eclipse、和/或tamra)。
142.在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构。
143.在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针具有不同的报告基团。在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针是可被核酸聚合酶(例如dna聚合酶)降解的。
144.在某些实施方案中，所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：seq id no:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163。
145.在某些实施方案中，所述扩增引物组的引物各自独立地含有特异于含有snp位点的靶核酸的序列。
146.在某些实施方案中，所述扩增引物组的引物的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
147.在某些实施方案中，所述扩增引物组的引物或其任何组成成分各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。
148.在某些实施方案中，所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：seq id no:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161。
149.在另一方面，本技术还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括，能够不对称扩增含有候选snp位点的靶核酸的鉴定引物组。
150.在某些实施方案中，所述鉴定引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种候选snp位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，
151.所述第一通用引物包含第一通用序列；
152.所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
153.所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选snp位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与
所述正向引物的互补序列完全互补。
154.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种能够检测所述候选snp位点的检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述候选snp位点的区域退火或杂交，并且标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。
155.在某些实施方案中，所述候选snp位点具有选自以下的1个或多个特征：
156.(1)所述候选snp位点在不同人种之间的fst小于0.3(例如，小于0.2，小于0.1，小于0.05，小于0.01)；
157.(2)所述候选snp位点位于不同染色体；
158.(3)所述候选snp位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)。
159.在某些实施方案中，所述候选snp位点具有选自以下的1个或多个特征：
160.(1)所述候选snp位点在不同人种之间的fst小于0.01；
161.(2)所述候选snp位点位于不同染色体；
162.(3)所述候选snp位点的等位基因频率在0.3至0.7之间。
163.在某些实施方案中，所述候选snp位点为人基因组中的snp位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组snp位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，以及前述snp位点的任意组合(例如，前述snp位点中任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)。
164.在某些实施方案中，所述靶核酸包含下列人基因组snp位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776和rs7160304。
165.在某些实施方案中，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)：seq id no:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66和69。
166.在某些实施方案中，所述第一通用引物的序列如seq id no:71所示。
167.在某些实施方案中，所述第二通用引物的序列如seq id no:70所示。
168.在某些实施方案中，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：seq id no:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68。
169.易于理解，本技术试剂盒中的第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针用于实施如上所述的方法。因此，上文中对于第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也
适用于此处。
170.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：扩增引物组，探针组，用于进行数字pcr的试剂。
171.在某些实施方案中，所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述snp位点的核酸分子。
172.在某些实施方案中，所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，
173.(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且
174.(ii)第一探针能够与含有所述目标snp位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标snp位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因。
175.在某些实施方案中，所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：seq id no:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163；
176.在某些实施方案中，所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：seq id no:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161。
177.在某些实施方案中，所述进行数字pcr的试剂选自包括选自下列的一种或多种组分：用于制备微液滴样本的试剂，用于进行核酸扩增的试剂，核酸聚合酶，用于检测微液滴样本的试剂，或其任何组合。
178.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合。
179.易于理解，本技术试剂盒中的扩增引物组和探针组(第一探针和第二探针)用于实施如上所述的方法。因此，上文中对于扩增引物组和探针组(第一探针和第二探针)所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也适用于此处。
180.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：用于进行测序的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合。
181.在某些实施方案中，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如dna聚合酶，特别是热稳定的dna聚合酶。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶如上所定义。
182.在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dntps(标记或未标记的)、水、包含离子(例如mg
2
)的溶液、单链dna结合蛋白、或其任何组合。
183.在某些实施方案中，所述试剂盒用于判断孕妇样品中是否含有胎儿游离dna，或者，计算孕妇样品中胎儿游离dna的比例。
184.在某些实施方案中，所述数字pcr选自微滴式数字pcr和芯片式数字pcr。
185.在又一方面，本技术提供了如前所定义的鉴定引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增靶核酸分子，或用于检测母亲来源的样品与父亲来源的样品的snp位点。
186.在某些实施方案中，所述试剂盒还包含如前所定义的检测探针。
187.在某些实施方案中，所述试剂盒用于实施如前所描述的方法。
188.在又一方面，本技术提供了如前所定义的扩增引物组和探针组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测孕妇样品中胎儿游离dna的存在或其比例。
189.在某些实施方案中，所述试剂盒还包含用于确定孕妇或胎儿的基因组中一个或多个snp位点的基因型别的试剂。
190.在某些实施方案中，所述试剂盒还包含如前所定义的鉴定引物组和检测探针。
191.在某些实施方案中，所述试剂盒用于实施如前所描述的方法。
192.发明的有益效果
193.与现有技术相比，本技术的优势在于：(1)自动化检测，人工操作步骤少，且检测周期短。本技术独特的snp分型系统可同时实现对多个snp的分型，自动化程度高。整个流程从核酸提取到获得结果可以在1天内完成，能够及时完成孕妇样品中胎儿游离dna比例的测定，辅助无创产前筛查和诊断(例如，筛查染色体非整倍体异常和单基因遗传疾病)；(2)准确、灵敏度高。能准确的定量孕妇样品中胎儿游离dna的比例，甚至可检测出低至0.1％的胎儿游离dna。
194.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
195.图1示意性地描述了本发明方法通过snp分型检测孕妇样品中胎儿游离dna存在或比例的示例性实施方案，以阐释本发明方法的基本原理。
196.图1a示意性地描述了该实施方案中所涉及的引物组和自淬灭荧光检测探针，其中，引物组包括：第一通用引物和第二通用引物，以及，包含正向引物和反向引物的靶特异性引物对；其中，
197.第一通用引物包含第一通用序列(tag1)；
198.第二通用引物包含第二通用序列(tag2)，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸(例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸)；
199.正向引物包含第一通用序列和特异于含有snp位点的靶核酸的正向核苷酸序列，且正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；
200.反向引物包含第二通用序列和特异于含有snp位点的靶核酸的反向核苷酸序列，且反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，
201.正向引物和反向引物能够特异性扩增相应的含有snp位点的靶核酸；并且，
202.第二通用序列不能与正向引物的互补序列完全互补。
203.图1b示意性地描述了使用图1a的引物组进行扩增时，引物二聚体的非特异性扩增被抑制的原理，其中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸自身在退火阶段将形成锅柄结构，阻止第一通用引物和第二通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。
204.图1c示意性地描述了使用图1a的引物组和检测探针对含有snp位点的多个靶核酸同时检测的原理。在该实施方案中，针对每个含有snp位点的靶核酸分别设计一对正向引物和反向引物以及一条自淬灭荧光检测探针，具体检测流程如下：
205.首先，由浓度低的靶特异性引物对启动pcr扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物/第一通用引物和反向引物/第二通用引物互补的两条核酸链(核酸链a和核酸链b)；随后，由浓度高的第一通用引物和第二通用引物对所述初始扩增产物进行后续的pcr扩增。
206.由于反向引物/第二通用引物包含第一通用序列，因此，第一通用引物不仅能够退火至核酸链a(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而且能够退火至核酸链b(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链。也即，第一通用引物可以同时扩增核酸链a和核酸链b。
207.第二通用引物在第一通用序列的3'端包含额外的核苷酸，因此，其与核酸链a(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)在3'端是不匹配的(即，在3'端不能完全互补)。由此，在扩增过程中，第二通用引物将优先退火至核酸链b(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而基本上不能延伸合成核酸链a(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)的互补链。
208.因此，随着pcr扩增的进行，核酸链a的互补链(核酸链b)的合成效率将显著低于核酸链b的互补链(核酸链a)，导致核酸链b的互补链(核酸链a)被大量合成和扩增，而核酸链a的互补链(核酸链b)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量目标单链产物(核酸链a，其含有与正向引物/第一通用引物互补的序列以及反向引物/第二通用引物的序列)，实现不对称扩增。此外，为进一步增强扩增的不对称性，还可以调整第一通用引物和第二通用引物的比例，使得第一通用引物的浓度低于第二通用引物，以更好地富集目标单链产物。在同一反应体系内同时使用多对正向引物和反向引物对，就可以同时不对称扩增多个含有snp位点的靶核酸，产生大量的含有snp位点的靶核酸单链。
209.pcr扩增完之后，预先加入的多条自淬灭荧光检测探针与对应的含有snp位点的靶核酸单链分别结合，形成检测探针与靶核酸单链的双链杂交体，因所形成双链杂交体稳定性的不同，经熔解曲线分析后，即能获得不同的熔解峰，再根据熔点(tm)的高低及探针所标记的荧光基团类型即可判定各靶核酸单链中snp的基因型。
210.图2显示了本技术方法用于测定孕妇样品中胎儿游离dna比例的流程图。
211.图3显示了实施例2中使用本发明方法对nips-2001样本组和nips-2002样本组的snp分型结果。其中，黑色实线代表nips-2001样本组中母亲基因组dna的检测结果，黑色虚线代表nips-2001样本组中父亲基因组dna的检测结果；灰色实线代表nips-2002样本组中母亲基因组dna的检测结果；灰色虚线代表nips-2002样本组中父亲基因组dna的检测结果。
具体实施方式
212.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。应当理解的是，这些实施例只是用于说明本发明的原理和技术效果，而并不是表示本发明的所有可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数。本领域技术人员可以根据本发明的原理，利用其它类似的材料或反应条件来实施其他技术方案。此类技术方案没有脱离本发明描述的基本原理和概念，并且涵盖在本发明的范围内。
213.实施例1.候选snp位点的选取
214.本技术的snp位点从美国国立生物技术信息中心(ncbi)的单核苷酸多态性位点库(dbsnp)中选取，优选的候选snp位点具备以下条件：(1)不同人种之间fst(群体固定系数)＜0.01，即这些位点在不同人种的人群中分化程度很小，基因杂合性水平接近；(2)等位基因频率为0.3至0.7之间；(3)在亚洲人群中的分布遵循哈迪温伯格平衡；(4)每两个snp之间的距离都》1mb；(5)为了避免不同位点之间连锁，尽量选择位于不同染色体上的位点。本实施例按照以上优选的标准选用了23个候选snp位点，具体如表1所示，snp位点信息及序列从美国国家生物技术信息中心(ncbi)的dbsnp数据库查询和下载，等位基因频率参考千人基因组数据库来源的亚洲人群频率，这些位点均匀分布在基因组各条染色体上。
215.表1.实施例1选取的候选snp位点信息
216.snp名称等位基因类型等位基因频率所在染色体rs16363tgttt/-0.4740/0.526022rs1610937agga/-0.4300/0.57005rs5789826gtaa/-0.4440/0.556011rs1611048taag/-0.4300/0.57007rs2307533tgac/-0.5790/0.421014rs112552066agag/-0.4940/0.50601rs5858210ag/-0.4380/0.56204rs2307839ga/-0.4700/0.53006rs149809066ct/-0.4680/0.53202rs66960151tg/-0.4900/0.510012rs34765837acat/-0.4554/0.544610rs68076527tt/-0.5258/0.47427rs10779650g/a0.3353/0.66471rs4971514g/c0.6399/0.36012rs6424243g/a0.5873/0.41271rs12990278t/c0.7113/0.28872rs2122080a/c0.5009/0.49912rs98506667c/g0.6348/0.36523rs774763c/g0.5654/0.43463rs711725a/t0.3740/0.62603rs2053911g/a0.8392/0.160816rs9613776a/g0.5645/0.435522
rs7160304g/t0.5109/0.489114
217.实施例2.无创产前筛查样本中胎儿游离dna比例的检测
218.本实施例采集并检测了临床中4例无创产前筛查样本，考察本发明方法的检测能力，整体实验流程如图2所示。
219.3.1样本的收集和提取
220.收集4组无创产前筛查样本，每组样本均包括孕妇(孕8-14周)外周血样本以及胎儿对应双亲的唾液样本(以下分别称为“母亲样本”和“父亲样本”)。唾液样本按照唾液采集器(厦门致善生物科技股份有限公司，厦门)的说明书要求进行采集，室温保存。用edta抗凝管(浙江拱东医疗器械股份有限公司，台州)采集5-10ml孕妇外周血样本，收集后在2小时之内按标准分离流程(1600g，离心10min，16000g，离心10min)进行血浆分离，血浆样本置于-80℃冷冻保存。
221.采用lab-aid 824核酸提取仪以及配套的基因组dna提取试剂(致善生物，厦门)提取上述各样本的基因组dna，使用nanodrop-2000微量紫外可见分光光度计(赛默飞，美国)测定基因组dna的浓度和纯度。使用apostle minimax
tm
高效游离dna富集分离试剂盒提取游离dna(apostle,usa)，使用qubit 3.0fluorometer(thermo fisher scientific,usa)测定游离dna浓度。
222.3.2目标snp位点的检测
223.按实施例1中所选取的候选snp位点，设计相应的引物和探针，具体序列及使用浓度如表2所示。利用多重不对称pcr系统和多色探针熔解曲线分析技术(技术原理如图1所示)，在2个pcr反应体系中同时对23个snp进行分型。
224.snp分型体系具体配置如下：25μl的pcr反应体系含有：1
×
pcr buffer(takara,北京)，5.0mm mgcl2，0.2mm dntps，1u taq dna聚合酶(takara,北京)，引物和探针及用量如表2所示，5μl人类基因组dna或阴性对照(水)。pcr扩增程序为：95℃预变性5min；10个循环的95℃变性15s，65℃-56℃退火15s(每个循环下降1℃)，76℃延伸20s；95℃变性15s，55℃退火15s，76℃延伸20s，50个循环；随后进行熔解曲线分析，程序为：95℃变性1min，37℃维持3min；随后按0.04℃/s的升温速率从40℃递增至85℃进行熔解曲线分析，并采集fam、hex、rox、cy5、quasar705通道的荧光信号。本实验采用的仪器为slan 96实时荧光pcr仪(上海宏石医疗科技有限公司)。
225.表2.使用的引物、探针序列及使用浓度
226.227.[0228][0229]
3.3目标snp位点的选取
[0230]
对比母亲dna样本和父亲dna样本相应的snp位点的基因型，获取目标snp位点。当同一个snp位点中，母亲dna样本和父亲dna样本的基因型为不同的纯合型时(例如，母亲样品的基因型为纯合型aa，父亲样品的基因型为纯合型bb)，此位点为目标snp位点。在本实施例中，以nips-2001样本组和nips-2002样本组为例，母亲dna样本和父亲dna样本的各snp分型结果见表3和图3。如图3所示，黑色实线代表nips-2001样本组中母亲基因组dna的检测结果；黑色虚线代表nips-2001样本组中父亲基因组dna的检测结果；灰色实线代表nips-2002样本组中母亲基因组dna的检测结果；灰色虚线代表nips-2002样本组中父亲基因组dna的检测结果。其中，nips-2001样本组的目标snp位点为5个(即rs66960151、rs68076527、rs1610937、rs1611048、rs9613776)，选取其中2个(即rs66960151和rs1610937)采用数字pcr体系对胎儿cfdna的各等位基因进行定量分析；nips-2002样本组的目标snp位点为3个(即rs5858210、rs149809066、rs2307553)，选取其中2个(即rs5858210和rs2307553)采用数字pcr体系对胎儿dna的各等位基因进行定量分析。
[0231]
表3.snp分型结果
[0232]
[0233][0234]
3.4游离dna样本目标snp位点的等位基因的定量分析
[0235]
按实施例1所选取的snp位点分别建立数字pcr定量分析体系，每个体系均包含有一对引物和分别针对snp等位基因特异的两条探针，各snp位点定量体系所使用的引物和探针以及使用量如表4所示。对于选定的目标snp位点，采用数字pcr体系中对应的引物组和探针组进行目标snp位点各等位基因比例的测定。
[0236]
可选的对上述游离dna样本预富集后，采用数字pcr进行等位基因比例的测定。将游离dna样本或预富集后的游离dna样本加入至pcr预混液，使用drop marker样本制备仪(新羿生物，北京)制备成体积纳升级别的液滴(按照微液滴样本制备通用试剂盒(新羿生物，北京)的说明书进行操作)，pcr扩增程序为：95℃预变性10min；40个循环的94℃变性30s，58℃退火和延伸60s。在pcr反应结束后，按照微液滴样本检测通用试剂盒(新羿生物，北京)的说明书，使用chip reader生物芯片阅读仪对微液滴进行定量检测，阅读系统导出excel格式的样本检测数据，包括fam、hex荧光通道的阴阳性微滴数、拷贝数等。
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根据孟德尔规律可推导出胎儿比例定量分析模型。假定目标snp位点中母亲的snp基因型为第一纯合型(例如，aa)，父亲的snp基因型为第二纯合型(例如，bb)，通过数字pcr测定父源b等位基因的个数为nb，测定母源a等位基因的个数为比例为na，则胎儿游离dna占母亲(孕妇)总游离dna的比例为ff：
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若检测多个目标snp位点，先通过如上所述的方法计算各目标snp位点的ff，再计算多个ff的平均值作为分析报告中的ff。
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表4.数字pcr定量分析体系所使用的引物和探针
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3.5检测结果
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利用本发明方法对4例孕妇(在8-14孕周之间)血浆样本中胎儿比例进行测定，各样本具体结果如表6所示。nips-2001样本组选取的目标snp位点(rs66960151和rs1610937)和nips-2002样本组选取的目标snp位点(rs5858210和rs2307553)的数字pcr定量分析结果如表5所示。其中，n
父
代表父源snp等位基因的拷贝数，n
母
代表母源snp等位基因的拷贝数，ff代表胎儿游离dna在总游离dna中占的比例。
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表5.数字pcr的检测结果
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表6. 4例孕妇血浆样本的胎儿比例测定结果
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尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。