一株栅藻及其产品和应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株栅藻及其产品和应用。


背景技术：

2.在水产养殖中，很多的水产品的疾病是由弧菌属细菌引起的，常见的致病菌如副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)等。目前在水产养殖中，对副溶血弧菌或溶藻弧菌导致的弧菌病主要以预防为主，并且其治疗也主要依靠抗生素。
3.长期使用抗生素可诱导耐药菌的出现，尤其在动物中长期使用低于治疗剂量的抗生素(如预防剂量)可加速耐药细菌的出现。耐药菌一旦在养殖动物中出现并在动物间传播，将使大规模养殖动物成为庞大的耐药基因储藏库。研究表明，食品中的耐药菌可以通过直接或间接方式传递给食用动物的最终消费者——人类，对人类临床感染的治疗产生严重威胁。
4.因此亟需开发一种适于治疗水产品弧菌病的微生态产品。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株栅藻及其产品和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的栅藻能够有效抑制副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)的生长。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一株栅藻(scenedesmus sp.)zjzy091，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2022183，保藏日期为2022年3月2日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
8.本发明还提供上述栅藻在制备预防或治疗弧菌病的产品中的应用。
9.进一步地，所述弧菌病的致病菌为副溶血弧菌或溶藻弧菌。
10.本发明还提供一种预防或治疗弧菌病的产品，所述产品中包含上述的栅藻。
11.进一步地，所述弧菌病的致病菌为副溶血弧菌或溶藻弧菌。
12.本发明还提供上述栅藻在水产养殖中的应用。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.本发明从小龙虾养殖水体中分离出一株栅藻，该栅藻能够有效抑制有害菌副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)的生长，本发明为治疗水产品的弧菌病提供了一种新思路。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施
例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为基于18s rrna部分序列(左)及ssu rrna部分序列(右)构建的系统发育树；
17.图2为栅藻与两种有害菌的共培养比生长率，其中a为副溶血弧菌和栅藻共培养实验，b为溶藻弧菌和栅藻共培养实验；a中实验组为副溶血弧菌与栅藻泥地共培养，对照组为副溶血弧菌单独培养；b中实验组为溶藻弧菌与栅藻泥地共培养，对照组为溶藻弧菌单独培养；
18.图3为栅藻抑制两种有害菌纸片扩散结果，其中a为副溶血弧菌；b为溶藻弧菌；每个平板的左三个滤纸片上是栅藻上清液，右三个滤纸片上是栅藻液，下方三个滤纸片上是栅藻泥，中间是bg11对照。
具体实施方式
19.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
20.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
21.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
22.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
23.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
24.以下实施例中所用副溶血弧菌和溶藻弧菌，购买于atcc菌种库。
25.实施例1藻株的分离鉴定
26.从湖北省潜江市的小龙虾养殖水体中利用96孔板梯度稀释法分离出一株微藻zjzy091，将其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2022183，保藏日期为2022年3月2日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
27.(1)形态学鉴定方法
28.将上述分离出的藻种接种于15mlbg-11液体培养基，4000lx光强zrg-250b-l3型光照培养箱环境复苏培养，光暗周期为12h，25
±
1℃。培养7d，梯度稀释后涂布，选择长势优良的单藻落连续划线分离，将单克隆藻株进行扩大培养。
29.采用光学显微镜与电子显微镜相结合的方法，观察栅藻形态结构与周期性形态变
化。取10μl藻液于血球计数板上，使用光学显微镜进行观察，记录单生藻细胞及聚集藻细胞形态。取离心后的藻泥加入25％戊二醛固定液，放入4℃冰箱固定后送至杭州科学指南针公司，拍摄微藻的透射电镜(tem)及扫描电镜(sem)。
30.栅藻在光学显微镜下呈绿色，细胞形状呈卵形，常聚集成群，个别细胞单生。电子显微镜下观察，单个细胞呈椭圆形，细胞表面平滑，细胞表面含有多个周生。
31.(2)分子生物学鉴定方法
32.微藻18s rrna和its序列的扩增
33.将纯化的藻种用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒提取该藻dna，所用18s rrna基因通用引物为ns1(seq id no：1):5
’‑
gtagtcatatgcttgtctc-3’)和ns6(seq id no：2):(5
’‑
gcatcacagacctgttattgcctc-3’)(上海生工生物工程股份有限公司)，pcr反应条件：94℃4min，94℃45s，55℃45s，72℃1min，72℃10min。扩增结果用1％琼脂糖电泳，150v、100ma 20min电泳观察。
34.序列的比对和进化树的构建
35.序列的测定及系统发育树的构建：pcr扩增产物由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将获得的序列提交至美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information)genebank数据库，编号分别为：sub10575772(18s rrna)、sub10574373(its)。
36.18s rrna(seq id no：3)
37.caaataaggccatgcatgtctagtataactgcttatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatagtttatttggtggtaccttactattcggataaccgtagtaattctagagctaatacgtgcgtaaatcccgactcctggaagggacgtatatattagataaaaggccgaccggactttgtccgacccgcggtgaatcatgatatcttcacgaagcgcatggccttgcgccggcgctgttccattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagaggcctaccatggtggtaacgggtgacggaggattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctgatacggggaggtagtgacaataaataacaatatcgggcatttaatgtctggtaattggaatgagtacaatctaaatcccttaacgaggatccattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatatttaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttggatttcgggtgggttctagcggtccgcctatggtgagtactgctatggccttcctttctgtcggggacgggcttctgggcttcactgtccgggactcggagtcgacgtggttactttgagtaaattagagtgttcaaagcaggcttacgccagaatactttagcatggaataacacgataggactctggcctatcttgttggtctgtaggaccggagtaatgattaagagggacagtcgggggcattcgtatttcattgtcagaggtgaaattcttggatttatgaaagacgaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaagaacgaaagttgggggctcgaagacgattagataccgtcgtagtctcaaccataaacgatgccgactagggattggcgaatgtttttttaatgacttcgccagcaccttatgagaaatcaaagtttttgggttccggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaacttaccaggtccagacatagtgaggattgacagattgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtgggttgccttgtcaggttgattccggtaacgaacgagacctcagcctgctaaatagtctcagttgctttttgcagctggctgacttcttagagggactattggcgtttagtcaatggaagtatgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgatgcattcaacaagcctatccttgaccgaaaggtccgggtaatctttgaaactgcatcgtgatggggatagattattgcaattattagtcttcaacgaggaatgcctagtaggcgcaagtcatcagcttgcgtcgattacgtccctgccctttgtac
acaccgcccgtcgctcctaccgattgggtgtgctggtgaagtgttcggattggcagcttagggtggcaacacctcaggtctgccgagaagttcataaaccctcccacctagagacgagagtagacc.
38.its(seq id no：4)
39.cctgcggaaggatcattgaattattaaaaccacaacgtgaactctgttgtaccgtgcctttgctgccagcagggcgatcgggcttatctcggttgcagcctgcagctggtgtgagcattgctgcccgcatcagtggcgctctggcatgcctatacaccagtgctaaccactgtcgaaaccaaactctgaagtttagattgctattaactggcaatcctaaccaaagacaactctcaacaacggatatcttggctctcgcaacgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtagtgtgaattgcagaattccgtgaaccatcgaatctttgaacgcatattgcgctcgagccctcgggcaagagcatgtctgcctcagcgtcggtttacaccctcacccctctttccttttggatcgcaggttagcttcacagctggccctaggggtggatctggctttcccaatcctttctgggttgggttggctgaagtgaagaggcttaatcaaggacccgatatgggcttcaactggataggtagcaacggcttctgccgactacacgaagttgtagcttgtggactttgataggagccaagcaggaaacgtgcttgcacgttctaaactttcgacctgagctcaggcaaggctacccgctgaacttaagcatatcaata.
40.并将序列通过ncbi的blast进行比对后，利用软件mega-x对测序结果和genbank中所下载的序列进行对位排列，采用邻接法(neighbor-joining method，nj)构建系统发育树，见图1。
41.通过上述形态学和分子生物学鉴定，鉴定该微藻属于栅藻属(scenedesmusmeyen)。
42.实施例2抑菌实验
43.96孔板共培养法
44.经lb培养基预先活化的副溶血弧菌和溶藻弧菌，分别加至已培养到对数时期的栅藻中，每种菌做3个平行组。按等体积(菌：栅藻＝1:1)接入96孔板中，每孔的总体积为0.2ml，每隔5min、10min、20min用酶标仪测取od
600
值，并计算菌的生长比率。同时设置空白对照，用bg11培养基培养菌作阳性对照。用以排除bg11培养基对菌的影响。
45.每24小时通过评估光密度跟踪栅藻(680nm)、菌细胞(副溶血弧菌和溶藻弧菌，600nm)的生长。此后，光密度用于计算生物量积累。根据下面的公式在不同组合下确定细菌比生长率
[0046][0047]
式中：μ表示比生长率，n和n0分别描绘了时间t和t0处的菌细胞密度。栅藻与两种有害菌分别共培养后测定有害菌的比生长率，结果见图2。从图2可以看出，两种有害菌的生长均受到显著抑制。
[0048]
纸片扩散法
[0049]
分别吸取0.25ml活化好的副溶血弧菌和溶藻弧菌涂布在lb固体培养基平板上，等菌液干透后，放入无菌滤纸圆片。随后，在每个滤纸片上分别滴入50μl栅藻液(正常培养至对数生长期的藻液)、栅藻泥(正常培养至对数生长期的藻液经4000rpm离心后收集的藻细胞)、栅藻上清液(正常培养至对数生长期的藻液经4000rpm离心后收集的上清液)，每种组分进行三种重复。bg11培养液作为阳性对照。将培养皿封口，培养在24℃静置培养箱中，培养7d。结果见图3。
[0050]
利用栅藻不同组分(栅藻上清液、栅藻液、栅藻泥、bg11培养液)进行抑菌活性的分
析，采用纸片扩散法测定，栅藻泥对革兰氏阴性菌弧菌(副溶血弧菌、溶藻弧菌)具有较为明显的抑菌圈(图3)。
[0051]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。