腹膜透析液用艾考糊精原料药单酶体系制备方法与流程

1.本发明属于药品制备技术领域，具体涉及一种腹膜透析液用艾考糊精原料药单酶体系制备方法。


背景技术：

2.腹膜透析(peritoneal dialysis,pd)是居家治疗的肾脏替代治疗方式，经济有效，对终末期肾病患者(esrd)可达到与血液透析相似的治疗效果。艾考糊精(icodextrin)是一种水溶性葡萄糖聚合物，代谢产物不易透过腹膜被人体吸收。艾考糊精是葡萄糖通过α-1,4和少于10％α-1,6糖苷键连接而成，重均分子量为13000da-19000da，数量平均分子量为5000da-6500da，相比于葡萄糖腹膜透析液可以减少血管内皮生长因子、晚期糖基化终末产物(ages)的产生。
3.目前，艾考糊精制备方式主要分为酸法制备和酶法制备两类。
4.中国专利cn 103467608 b公开了一种使用酸水解淀粉制备艾考糊精的方法，首先，在一定的温度下，将预配制好的淀粉浆溶液使用一定浓度的酸进行水解得到酸解液，随后使用不同孔径的超滤膜进行分子量的筛选，最后干燥得到艾考糊精成品。中国专利cn 105131135 b则调整了加料的顺序，先配制低浓度酸溶液，然后再加入玉米淀粉，从而使得制备的水解产物分子量更为集中；并且只需经过一次1000da超滤膜即可得到分子量分布合格的艾考糊精。中国专利cn 106755199 a主要对酸法制备艾考糊精时的脱色工艺进行了改进，通过添加活性炭和壳聚糖在ph值3-4时脱色一次或两次，提高了反应效率。
5.但是，酸法制备艾考糊精的主要问题在于，淀粉进行酸水解时条件剧烈，选择性差，且反应程度难以控制，导致分子量分布很宽，后续使用超滤工艺进行分子量筛选时损失很大，从而导致最终产率的下降。相比于酸法，酶解淀粉制备艾考糊精得到的产品分子量分布更为集中，并且水解产品与原研一致性更好。
6.中国专利cn 106397616 a公开了一种酶法制备艾考糊精原料的方法，此方法以淀粉为原料，先使用α-淀粉酶进行酶解，然后使用脱支酶进行脱支，最后经醇沉、超滤、色谱分离得到重均分子量、数均分子量和α-1,6糖苷键均符合要求的艾考糊精。中国专利cn 106755199 a则为了破碎细菌的细胞壁释放出肽聚糖使用了溶菌酶，从而使得活性炭吸附和超滤时更好的除去肽聚糖。而且，为了升温过程更加方便，先使用适宜温度(40-80℃)更低的脱支酶进行脱支，然后升温至α-淀粉酶适宜温度(80-100℃)加入α-淀粉酶进行酶解，最后依次经超滤、脱色、过滤、喷干得到艾考糊精。但是，上述两种酶法工艺使用了溶菌酶、α-淀粉酶以及脱支酶等多种酶进行反应，操作复杂，反应过程难以控制，并不适合工业化放大。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种腹膜透析液用艾考糊精原料药单酶体系制备方法，仅使用一种α-高温淀粉酶，然后结合超滤、喷干操作得到艾考糊精，工艺
简便，操作简单，制备效率高，适合工业化放大。
8.本发明采用凝胶排阻色谱-多角度激光散射法对得到的艾考糊精产品进行重均分子量和数均分子量的测定；利用h
1-nmr来测定产品的氢谱；发现此方法制备的艾考糊精产品重均分子量、数均分子量以及α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键的占比均符合要求。
9.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
10.本发明所述的腹膜透析液用艾考糊精原料药单酶体系制备方法，包括以下步骤：
11.(1)酶解：将淀粉加入到10-40℃的水中，配置成质量浓度为5-40％的淀粉浆溶液，加入相对于淀粉浆5-100ppm的氯化钙，加入碱的水溶液调节ph值至5.0-7.0，搅拌升温至80-100℃，在此温度区间内保温搅拌30-60min后，加入α-高温淀粉酶进行酶解，酶解时间为60-90min，随后使用酸调节ph值至2.0-4.0，高温保持20-30min对酶进行灭活，趁热将酶解液进行硅藻土过滤，得滤液a；
12.(2)超滤：将滤液a依次使用大孔径超滤膜和小孔径超滤膜对滤液的分子量进行筛选，得到重均分子量为13000da-19000da，数均分子量为5000da-6500da，淀粉中α-1,6糖苷键的摩尔比例低于10％的组分的料液b；
13.(3)喷干：将超滤得到的料液b进行喷干，即可得到腹膜透析液用艾考糊精。
14.其中：
15.优选地，步骤(1)中，所述的淀粉要求α-1,6糖苷键的占比不高于5％(h
1-nmr确定α-1,6糖苷键的占比)。
16.优选地，步骤(1)中，所述的淀粉选自玉米淀粉、糯玉米淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉或马铃薯淀粉中的一种。更优选地，所述的淀粉选自玉米淀粉。
17.优选地，步骤(1)中，所述的α-高温淀粉酶选自诺维信或杰能科的高温淀粉酶。
18.优选地，步骤(1)中，所述的淀粉浆质量浓度为5-15％。
19.优选地，步骤(1)中，所述无水氯化钙的量为10-100ppm/克淀粉浆，更优选为10-20ppm。
20.优选地，步骤(1)中，所述的碱选自氢氧化钠或氢氧化钾，浓度为0.1-1m。
21.优选地，步骤(1)中，所述的酸选自盐酸、硫酸或醋酸，浓度为0.1-1m。
22.优选地，步骤(2)中，所述的超滤压力为0.2-0.6mpa。
23.优选地，步骤(2)中，所述的大分子超滤膜孔径范围为50kd-60kd。
24.优选地，步骤(2)中，所述的小分子超滤膜孔径范围为1000da-2000da。
25.优选地，步骤(2)中重均分子量与数均分子量通过凝胶渗透色谱(gpc)-激光光散射(ls)-示差检测(ri)检测的方法来测定，α-1,6糖苷键的占比通过核磁氢谱来测定。
26.优选地，步骤(3)中，所述的喷干操作：进料温度为90-100℃，进风温度为180-220℃，出风温度为110-130℃。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
28.1、相比于酸法制备艾考糊精，本发明采用酶法制备，水解淀粉中的糖苷键时具有一定的选择性，且反应更加的温和，更易控制反应的水解程度，从而可以提高艾考糊精的制备效率。
29.2、相比于已报道的酶法制备艾考糊精，本发明通过淀粉的来源来控制α-1,6糖苷键的占比符合要求，仅使用α-高温淀粉酶来进行酶解切断淀粉的主链，结合对于温度、加酶
量、ph值以及淀粉浆浓度等参数的优化达到控制分子量分布。本发明使用α-高温淀粉酶单酶体系来制备艾考糊精，条件温和，工艺简单，制备效率高，更加适用于工业化放大。
附图说明
30.图1是实施例1和2中的玉米淀粉1的h
1-nmr图谱；
31.图2是实施例3中的玉米淀粉2的h
1-nmr图谱；
32.图3是实施例1中的艾考糊精c1的h
1-nmr图谱；
33.图4是实施例2中的艾考糊精c2的h
1-nmr图谱；
34.图5是实施例3中的艾考糊精c3的h
1-nmr图谱；
35.图6是实施例3中的艾考糊精c3的分子量分布图谱；
36.图7是实施例1中的艾考糊精c1的分子量分布图谱；
37.图8是实施例2中的艾考糊精c2的分子量分布图谱。
具体实施方式
38.为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地说明。本发明有许多成功的实施例，下面列举具体的实施例，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
39.采用凝胶渗透色谱(gpc)—激光光散射(ls)—示差检测(ri)检测的方法来测定产品中的艾考糊精分子量与分子量分布范围(如图3)。具体参数为：以tskguandcolumn-pwh为保护柱，凝胶渗透色谱柱tsk gel g2000pw和tsk gel 52000pw串联，超纯水为流动相，柱温为35℃，流速为0.6ml/min，检测器温度为35℃。
40.以氘代dmso为溶剂，测定温度为70℃，测定玉米淀粉原料的h
1-nmr，此时α-1,4糖苷键连接对应的1号位氢的化学位移为5.15ppm，α-1,6糖苷键连接对应的1号位氢的化学位移为4.80ppm(如图1)；
41.以氘代h2o为溶剂，测定温度为25℃，测定艾考糊精产品的h
1-nmr，此时α-1,4糖苷键连接对应的1号位氢的化学位移为5.41，α-1,6糖苷键连接对应的1号位氢的化学位移为4.98(如图2)。
42.实施例1
43.(1)25℃下，1l的三口瓶中依次加入600ml的纯化水和60g的玉米淀粉1(图1，α-1,6糖苷键占比为4.74％)，搅拌均匀，随后加入18.4mg的无水氯化钙，测ph值为5.460；滴加0.1m naoh溶液调ph值为5.802；然后，将三口瓶转移至90℃的油浴锅中缓慢升温，30分钟后，温度计显示内温为90℃，保持此温度继续糊化30分钟后，加入24.2mg的α-高温淀粉酶(诺维信，使用4ml的纯化水稀释加入)，反应70分钟后，使用1m的盐酸溶液调ph值为3.45，加热至沸腾搅拌20分钟对酶进行灭活，随后趁热进行硅藻土过滤得到580ml滤液a1；
44.(2)将步骤(1)得到的滤液a1先使用0.3mpa的超滤压力，50kd的膜孔进行大分子的去除，用500ml纯化水洗滤5次，合并透过液；随后将透过液在0.3mpa的压力和1500da的膜孔对小分子进行去除，待料液体积浓缩至200ml后继续加入200ml的纯化水洗滤2次，待再次浓缩至200ml时停止超滤，得到分子量分布(如表1)，α-1,6糖苷键占比为8.6％，α-1,4糖苷键占比为91.4％，符合质量要求的料液b1(图3、图7)；
45.(3)参数设置为：进料温度为95℃，进风温度为200℃，出风温度为120℃，对得到的料液b1进行喷干，即得成品艾考糊精c1 34.2g(收率为57.1％)。
46.表1.艾考糊精c1的分子量分布结果
47.保留时间(min)校准后的保留时间(min)数均分子量(mn)重均分子量(mw)32.80032.800583014368
48.实施例2
49.(1)10℃下，10l的反应桶中依次加入4l的纯化水和400g的玉米淀粉1(图1，α-1,6糖苷键占比为4.74％)，搅拌均匀，随后加入122.4mg的无水氯化钙，测ph值为5.530；滴加0.1m naoh溶液调ph值为5.605；然后，将淀粉浆转移至提前预热至95℃的反应釜中缓慢升温，转速调为200rpm，15分钟后，温度计显示内温为80℃，此时粘度增大，调整转速为400rpm，20分钟后温度计显示内温为95℃，保持此温度继续糊化40分钟后加入160.2mg的α-高温淀粉酶(诺维信，使用20ml的纯化水稀释加入)，反应65分钟后，使用1m的硫酸溶液调ph值为3.45，加热至沸腾搅拌30分钟对酶进行灭活，随后趁热进行硅藻土过滤得到3900ml滤液a2；
50.(2)将步骤(1)得到的滤液a2先使用0.2mpa的超滤压力，60kd的膜孔进行大分子的去除，用3500ml纯化水洗滤5次，合并透过液；随后将透过液在0.3mpa的压力和2000da的膜孔对小分子进行去除，待料液体积浓缩至400ml后加入400ml的纯化水洗滤2次，得到分子量分布(如表2)，α-1,6糖苷键占比为5.9％，α-1,4糖苷键占比为94.1％，符合质量要求的料液b2(图4、图8)；
51.(3)参数设置为：进料温度为90℃，进风温度为195℃，出风温度为115℃，对得到的料液b2进行喷干，即得成品艾考糊精c2 263.2g(收率为65.8％)。
52.表2.艾考糊精c2的分子量分布结果
53.保留时间(min)校准后的保留时间(min)数均分子量(mn)重均分子量(mw)33.50033.500543816350
54.实施例3
55.(1)27℃下，1l的三口瓶中依次加入600ml的纯化水和60g的玉米淀粉2(图2，α-1,6糖苷键占比为8.70％)，搅拌均匀，随后加入18.2mg的无水氯化钙，测ph值为5.458；滴加0.1m naoh溶液调ph值为5.798；然后，将三口瓶转移至91℃的油浴锅中缓慢升温，30分钟后，温度计显示内温为91℃，保持此温度继续糊化30分钟后，加入24.6mg的α-高温淀粉酶(诺维信，使用4ml的纯化水稀释加入)，反应70分钟后，使用1m的盐酸溶液调ph值为3.45，加热至沸腾搅拌20分钟对酶进行灭活，随后趁热进行硅藻土过滤得到580ml滤液a1；
56.(2)将步骤(1)得到的滤液a1先使用0.3mpa的超滤压力，50kd的膜孔进行大分子的去除，用500ml纯化水洗滤5次，合并透过液；随后将透过液在0.3mpa的压力和1500da的膜孔对小分子进行去除，待料液体积浓缩至200ml后继续加入200ml的纯化水洗滤2次，待再次浓缩至200ml时停止超滤，得到分子量分布(如表3)，α-1,6糖苷键占比为15.60％，α-1,4糖苷键占比为84.40％的料液b1(图5、图6)；
57.(3)参数设置为：进料温度为100℃，进风温度为205℃，出风温度为125℃，对得到的料液b1进行喷干，即得成品艾考糊精c1 31.8g(收率为53.0％)。
58.表3.艾考糊精c2的分子量分布结果
59.保留时间(min)校准后的保留时间(min)数均分子量(mn)重均分子量(mw)19.30019.300621319349