一株玫烟色棒束孢及其在防治柑橘木虱中的应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株玫烟色棒束孢及其在防治柑橘木虱中的应用。


背景技术：

2.柑橘黄龙病是由韧皮部杆菌属类细菌引起的一种毁灭性柑橘病害，由于其危害严重和致死率高被称为柑橘的“癌症”。柑橘木虱是柑橘黄龙病在田间重要的传播媒介，主要通过刺吸柑橘韧皮部汁液获取和传播柑橘黄龙病菌。由于柑橘黄龙病菌尚未能进行人工培养，很难从黄龙病菌本身提出防治黄龙病的有效策略，控制柑橘木虱仍是全世界目前杜绝黄龙病蔓延最有效的手段。目前防治柑橘木虱主要以化学防治为主，长期大量化学杀虫剂的使用，导致柑橘木虱抗药性增加、农药残留、环境污染、生物多样性被破坏等一系列问题。
3.昆虫病原真菌能够在昆虫寄主体内寄生至昆虫发病死亡，具有良好的病害流行潜力及生产便利性，利用昆虫病原真菌防治柑橘木虱具有良好的发展前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株对柑橘木虱具有高致病力的玫烟色棒束孢，并利用其防治柑橘木虱虫害及由柑橘木虱引起的病害——柑橘黄龙病。
5.本发明从柑橘木虱体内分离得到一株对柑橘木虱具有高致病力的菌株scau-cfdc01。
6.scau-cfdc01菌株的形态特征如下：
7.scau-cfdc01菌株在sday培养基上早期呈乳白色，不透明，菌落光滑，圆形，边缘完整；10天后可以看到明显的淡紫色的孢子，15天后整个平板呈淡紫色，每个平板的产孢量约为5.8
×
108分生孢子/ml；成熟的分生孢子为棒状。
8.scau-cfdc01菌株的分子鉴定：
9.通过扩增scau-cfdc01菌株基因组dna的16s rdna序列ts1/ts5(核苷酸序列如seq id no.1所示)，然后将该序列在ncbi基因库进行同源性比对分析，发现scau-cfdc01菌株属于cordyceps属。基于系统发育分析，发现scau-cfdc01菌株属于玫烟色棒束孢。与cordyceps fumosorosea ifts02(kx057373.1)，cordyceps fumosorosea arsef:3302(hm209050.1)和cordyceps fumosorosea cnrcb1(hm209049.1)三个菌株具有较近的亲缘性关系。结合菌株的形态特征及及16s rdna，确定scau-cfdc01菌株属于虫草菌(cordyceps)属，命名为玫烟色棒束孢(cordyceps fumosorosea)scau-cfdc01。
10.因此，本发明的第一个目的是提供一株玫烟色棒束孢scau-cfdc01，其保藏编号为gdmcc no.62330。
11.本发明还提供玫烟色棒束孢scau-cfdc01在防治柑橘木虱及由柑橘木虱引起的病害中的应用。
12.优选，所述的由柑橘木虱引起的病害为柑橘黄龙病。
13.优选，所述的应用，包括将玫烟色棒束孢scau-cfdc01的活菌体或包含玫烟色棒束孢scau-cfdc01活菌体的培养物接触柑橘木虱虫体的步骤。
14.优选，所述的包含玫烟色棒束孢scau-cfdc01活菌体的培养物为玫烟色棒束孢scau-cfdc01的菌悬液，浓度为1
×
10
3-1
×
108个孢子/ml。
15.优选，所述的柑橘木虱为柑橘木虱若虫。
16.优选，所述的柑橘木虱若虫为三龄至五龄若虫。
17.本发明还提供一种防治柑橘木虱及由柑橘木虱引起的病害的生防制剂，其含有玫烟色棒束孢scau-cfdc01和/或玫烟色棒束孢scau-cfdc01的培养物作为有效成分。
18.优选，所述的生防制剂为玫烟色棒束孢scau-cfdc01的菌悬液，浓度为1
×
10
3-1
×
108个孢子/ml。
19.本发明的cordyceps fumosorosea scau-cfdc01(玫烟色棒束孢scau-cfdc01)具有高效防治柑橘木虱虫害发生的特性，尤其对柑橘木虱若虫防治效果显著；且在应用过程中，无污染、无残留、生物环保，是一株在虫生真菌领域应用前景良好的菌株。
20.保藏说明：
21.本发明的cordyceps fumosorosea scau-cfdc01(玫烟色棒束孢scau-cfdc01)于2022年03月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmcc no.62330，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
附图说明
22.图1是菌株scau-cfdc01在sday培养基上的菌落形态及分生孢子形态图；其中图a为菌株scau-cfdc01在sday培养基上生长5天的菌落形态，图b为为菌株scau-cfdc01在sday培养基上生长15天的菌落形态，图c为菌株scau-cfdc01分生孢子在光学显微镜下的形态。
23.图2是菌株scau-cfdc01侵染木虱的形态图；其中图a为菌株scau-cfdc01侵染柑橘木虱3天的形态图，图b为为菌株scau-cfdc01侵染柑橘木虱5天的形态图，图c为菌株scau-cfdc01侵染柑橘木虱9天的形态图。
24.图3是菌株scau-cfdc01基于16s rdna序列ts1/ts5的系统发育树；图中括号内为相应菌株在genbank数据库中的编号。
25.图4是不同浓度scau-cfdc01菌处理下柑橘木虱若虫和成虫累计死亡率随时间变化的趋势；图a为孢子悬浮液处理下三龄若虫的累计死亡率；图b为孢子悬浮液处理下五龄若虫的累计死亡率；图c为孢子悬浮液处理下成虫的累计死亡率。
26.图5是scau-cfdc01菌株对三龄若虫生长发育的影响；图a：scau-cfdc01菌株对三龄若虫逐日存活率的影响；图b：scau-cfdc01菌株对三龄若虫羽化率的影响；图c：scau-cfdc01菌株对三龄若虫羽化的成虫性比的影响；图d：scau-cfdc01菌株对三龄若虫羽化的成虫寿命的影响。
27.图6是scau-cfdc01菌株对五龄若虫生长发育的影响；图a：scau-cfdc01菌株对五龄若虫逐日存活率的影响；图b：scau-cfdc01菌株对五龄若虫羽化率的影响；图c：scau-cfdc01菌株对五龄若虫羽化的成虫性比的影响；图d：scau-cfdc01菌株对五龄若虫羽化的成虫寿命的影响。
具体实施方式
28.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
29.实施例1
30.发明人从柑橘木虱体内分离得到一株对柑橘木虱具有高致病力的菌株(图2)，编号为scau-cfdc01。
31.1.菌株scau-cfdc01特性测定采用的培养基制备方法如下：
32.萨式(sday)平板培养基：40g葡萄糖，10g蛋白胨，2g酵母膏，1.5g琼脂加入到无菌水中调节总体积为1000ml，ph 7.0-7.2。灭菌后冷却倒平板待用。
33.2.菌株scau-cfdc01的鉴定
34.依据魏景超编著的《真菌鉴定手册》，明确scau-cfdc01菌株形态特征。参照周德庆等人编著的《微生物学实验手册》(上海:科学技术出版社)中介绍的方法以及16s rdna对scau-cfdc01菌株进行鉴定。
35.3.scau-cfdc01菌株的形态特征如下：
36.scau-cfdc01菌株在sday培养基上早期呈乳白色，不透明，菌落光滑，圆形，边缘完整(图1a)；10天后可以看到明显的淡紫色的孢子，15天后整个平板呈淡紫色(图1b)，每个平板的产孢量约为5.8
×
108分生孢子/ml；成熟的分生孢子为棒状(图1c)。菌体在pda培养基平板上早期呈白色，11-12天后变为玫烟色，不透明，菌落光滑，圆形。
37.scau-cfdc01菌株的培养特性为：生长温度范围为4℃～32℃，最适生长温度为25℃-27℃；生长ph范围为5.0～8.0，在偏酸的条件下生长良好，最适生长ph范围为6.0～7.0；在sday培养基上培养10天的产孢量是5
×
108分生孢子/ml。
38.4.scau-cfdc01菌株的16s rdna序列ts1/ts5
39.挑取少量单菌落，利用真菌试剂盒提取菌株scau-cfdc01的基因组dna。以菌株scau-cfdc01的基因组dna为模板，采用如下引物：its1：5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’，its5：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’，进行pcr扩增，扩增体系为50μl，含有2
×
pri-113max dna 25μl、正反向引物各2μl、ddh2o 19μl、dna模板2μl，最后用去离子灭菌超纯水调整反应总体积为50μl。扩增条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min。pcr扩增出约500bp大小的片段，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果表明序列含有564个碱基，其核苷酸序列如seq id no.1所示。将该序列经chromas序列拼接软件校正，在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对，采用mega7.0软件用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，进行系统发育分析，各支上的数字是1000次bootstrap重抽样分析的支持百分比。
40.通过在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，发现scau-cfdc01菌株属于cordyceps属。基于系统发育分析(图3，表1)，发现scau-cfdc01菌株属于玫烟色棒束孢。与cordyceps fumosorosea ifts02(kx057373.1)，cordyceps fumo sorosea arsef:3302(hm209050.1)和cordyceps fumosorosea cnrcb1(hm209049.1)三 个菌株具有较近的亲缘性关系。结合菌株的形态特征及及16s rdna，确定scau-cfdc01菌株属于虫草菌(cordyceps)属，命名为玫烟色棒束孢(cordyceps fumosorosea)scau-cfdc01；并将该菌于2022年03月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmcc no.62330。
41.表1为构建系统发育树的所用的菌株的信息，包括菌株名字，在genbank数据库的编号，采集地，16s rdna序列ts1/ts5序列大小及与scau-cfdc01菌株的相似性分析。
42.表1构建系统发育树的所用的菌株的信息
[0043][0044][0045]
5.scau-cfdc01菌株对柑橘木虱室内致病力测定
[0046]
取scau-cfdc01菌株干孢粉于0.05％吐温-80溶液中，磁力搅拌器搅拌充分混匀，用血球计数板确定其孢子浓度，稀释成1
×
108、1
×
107、1
×
106、1
×
105、1
×
104、1
×
103个孢子/ml 6个浓度用来检测scau-cfdc01菌株对柑橘木虱三龄和五龄若虫的致病力；每个生物测定设空白对照，空白对照为0.05％吐温-80，选取个体大小，活力一致的三龄若虫/五龄若虫，用软毛笔将供试若虫挑入上述不同处理的孢子悬浮液中，浸渍20s后挑出，将若虫置于干净的滤纸上吸取多余水分后，转移至柑橘叶片上，放入底部垫有湿润滤纸的培养皿中(直径为9cm)，培养皿用保鲜膜封口并扎孔通气，若虫接菌后置于人工气候箱中(25
±
1℃，相对湿度(rh)60％-70％),光周期14l：10d)，24h后开始观察和记录死亡虫数，连续观察七天，并将死虫挑入培养皿底放有湿润滤纸的培养皿内。每个处理30头若虫，实验重复三次。
[0047]
将干孢粉于0.05％吐温-80溶液中，稀释成稀释成1
×
108、5
×
107、1
×
107、5
×
106、1
×
106个孢子/ml 5个浓度用来检测scau-cfdc01菌株对柑橘木虱成虫的致病力，方法与处理若虫类似。
[0048]
测定结果表明：scau-cfdc01菌株对柑橘木虱若虫和成虫的都有较强的致病力(图4)，在不同浓度(1
×
10
3-1
×
108孢子/ml)的孢子悬浮液处理后7天，三龄若虫的死亡率为53.19％-100％，五龄若虫的死亡率为41.82％-100％；在不同浓度(1
×
10
6-1
×
108孢子/ml)的孢子悬浮液处理后，成虫死亡率为30％-62.5％。其中，用1
×
108个孢子/ml孢子悬浮液处理后两天，三龄若虫的死亡率高达96.2％，五龄若虫的死亡率为86.2％；用1
×
107个孢子/ml孢子悬浮液处理后两天，三龄若虫的死亡率高达88.89％，五龄若虫的死亡率为70.13％；用1
×
106个孢子/ml孢子悬浮液处理后两天，三龄若虫的死亡率高达59.32％，五龄若虫的
死亡率为35.48％；用1
×
105个孢子/ml孢子悬浮液处理后两天，三龄若虫的死亡率高达59.26％，五龄若虫的死亡率为26.69％。用1
×
108个孢子/ml和1
×
107个孢子/ml孢子悬浮液处理后3天，三龄和五龄若虫的死亡率均高达100％。用1
×
106个孢子/ml孢子悬浮液处理后三天，三龄若虫的死亡率高达88.89％，五龄若虫的死亡率为72.58％；用1
×
105个孢子/ml孢子悬浮液处理后三天，三龄若虫的死亡率高达81.48％，五龄若虫的死亡率为69.23％。用1
×
105个孢子/ml孢子悬浮液处理后6天，三龄若虫的死亡率高达100％，五龄若虫的死亡率为80.77％(表2)。
[0049]
表2不同处理天数、不同处理浓度下柑橘木虱若虫的累计死亡率
[0050]
[0051][0052]
lc50s(表3)和lt50s(表4)均表明scau-cfdc01菌株对柑橘木虱若虫有很强的的致病力，致死速度快，其中对三龄若虫的致病力最强，其次是柑橘木虱五龄若虫，再次是柑橘木虱成虫。
[0053]
表3是scau-cfdc01菌株处理不同天数后柑橘木虱三龄、五龄和成虫的致死中浓度，随着处理天数的增加，lc
50
值越小。
[0054]
表3scau-cfdc01菌株处理不同天数后柑橘木虱三龄、五龄和成虫的致死中浓度
[0055][0056]
表4是在不同浓度scau-cfdc01菌处理后柑橘木虱三龄、五龄和成虫的致死中时，随着处理浓度的增加，lt
50
值越小。
[0057]
表4scau-cfdc01菌株不同浓度处理下柑橘木虱三龄、五龄和成虫的致死中时
[0058]
[0059][0060]
6.scau-cfdc01菌株对柑橘木虱三龄和五龄若虫温室致病力测定
[0061]
在室内毒力测定的基础上，评价scau-cfdc01菌株对柑橘木虱三龄若虫/五龄若虫的田间效果。
[0062]
实验在温室的养虫笼内(120cm
×
120cm
×
120cm)进行，实验条件为广州六月-九月，取长势一致，嫩梢一致的九里香苗放入养虫笼内，每笼放九盆，将约300只处于交配盛期的柑橘木虱接入养虫笼内自由交配12h，然后将所有的成虫全部移出，待卵长到三龄若虫/五龄若虫用于实验。实验处理组为1
×
105个孢子/ml scau-cfdc01菌孢子悬浮液，对照组为0.05％的吐温-80。处理前记录柑橘木虱三龄和五龄若虫虫口基数，用手动喷雾器喷施于九里香苗的正反面，每株喷药20ml。每天观察和记录各处理上的幼虫数量、死亡数和死亡原因，直至全部羽化，计算若虫每天的存活率和成虫羽化率及雌雄性比，并统计羽化的成虫的寿命。
[0063]
结果表明，scau-cfdc01菌株在温室内对柑橘木虱三龄若虫有很好的控制作用(图5)，处理后第5天，三龄若虫的存活率仅有9.20％、成虫羽化率仅有7.17％、雌虫的寿命16.45天，均显著低于对照(p《0.001)，然而对五龄若虫处理后羽化的成虫的性比和雄虫的寿命并无显著的影响(p》0.05)。
[0064]
scau-cfdc01菌株在温室内对柑橘木虱五龄若虫也有很好的控制作用(图6)，处理后第5天，五龄若虫的存活率仅有33.53％、成虫羽化率仅有26.32％、雌虫的寿命16.47天，均显著低于对照(p《0.001)，然而对五龄若虫处理后羽化的成虫的性比和雄虫的寿命并无
显著的影响(p》0.05)。