一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用与流程

一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用
1.本技术为申请号201910169525.0、申请日2019年03月06日、发明名称“一种中脑多巴胺能神经前体细胞及其制备方法和应用”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用。


背景技术：

3.帕金森病是最为普遍的神经退行性疾病之一，主要影响中老年人。其症状表现为静止时手、头或嘴非自主地震颤，肌肉僵直、运动缓慢以及姿势平衡障碍等。帕金森病的病因目前仍不明确，但它最主要的病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元发生大量选择性丢失，引起多巴胺合成和分泌不足。脑内需要多巴胺来指挥肌肉的运动，缺乏足够的多巴胺就会影响动作技能、语言能力以及其他功能。帕金森病目前的治疗主要靠左旋多巴制剂，但这无法治愈或逆转病情发展，并且患者需长期用药，以延缓病情进程，控制疾病。
4.细胞移植治疗帕金森病是通过选择适当的细胞群，移植于宿主脑组织内，替代受损的神经元以重建或恢复神经功能。帕金森患者由于中脑黑质多巴胺能神经元选择性丢失，使它更适合于细胞移植治疗。相比于esc，ipsc可由人体皮肤、血液等体细胞在体外重编程而来，可成功地绕开了免疫排斥和伦理性两个最关键的问题，为临床上获得体外来源的中脑多巴胺能神经前体细胞进行临床移植提供了可能性。
5.目前已有多篇研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法。较早诱导多巴胺能神经前体细胞的方法需经过神经上皮干细胞(neuroepithelial stem cells,nes)的过程(pax6 )，该分化过程耗时较长，且获得的细胞纯度不高(koch et al.,2009；falk et al.,2012)。friling等报道在使用bfgf等细胞因子的作用下，使用拟胚体分化的方法可以先将人多能干细胞神经化，产生菊形团细胞(rosettes)中间体结构，再通过音猥因子(sonic hedgehog,shh)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,fgf8)的刺激获得多巴胺能神经前体细胞，该分化方法操作较为复杂，且分化过程长。虽然早期的分化方法可以诱导成功多巴胺能神经前体细胞，但是仍使用一些成分不确定或含异源成分的细胞基质或试剂，例如matrigel和血清替代物(knockout serum replacement,ksr)，这些成分不仅会改变细胞的一些特征，并且不同批次的matrigel和ksr之间会有差异性，因此很难推广于临床应用。


技术实现要素：

6.本发明涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用，该中脑多巴胺能神经前体细胞稳定性强且可以大量扩增至4-5代，公开的制备方法能够快速高效的从人多能干细胞分化获得中脑多巴胺细胞，解决了现有的分化方法时间较长、效果不稳定、效率低及利用了含血清的培养体系或滋养层细胞不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。
7.本发明的具体技术方案如下：
8.本发明一方面公开了一种中脑多巴胺能神经前体细胞，其表达lmx1a 、foxa2 、en1 和otx2 ，其中所述中脑多巴胺能神经前体细胞不表达nkx2.1、dbx1和gbx2中的一种或多种。
9.优选的，所述细胞为人细胞。
10.优选的，所述细胞为非贴壁细胞培养。
11.本发明第二个方面公开了一种制备上述的中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包括以下步骤：
12.s1：将人多能干细胞接种于人多能干细胞维持培养基中形成拟胚体；
13.s2：将s1得到的拟胚体在第一分化培养基中进行分化培养得到中脑底板细胞；
14.s3：将s2得到的中脑底板细胞在第二分化培养基中进行分化培养得到中脑多巴胺能神经前体细胞。
15.应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤s1之前、步骤s1和s2之间、步骤s2和s3之间、步骤s3之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
16.优选的，所述第一分化培养基和所述第二分化培养基均包括神经诱导分化培养基。
17.上述神经诱导分化培养基的成分包括：dmem/f12、neurobasal、glutamax、transferrin、insulin、progesterone、putrescine和selenite。其中，dmem/f12可作为开发无血清配方的基础，该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养；neurobasal是神经细胞维持生长和成熟的基础培养基；此培养基配方中，dmem/f12和neurobasal以1:1混合配制。glutamax是指谷氨酰胺，它是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必须氨基酸，本发明中作为细胞培养的必需添加物。nicotinamide是指烟酰胺，为维生素b3，可促进神经发育，本发明中作为促进神经细胞生长的添加物。transferrin(转铁蛋白)、insulin(胰岛素)、progesterone(孕酮)、putrescine(腐胺)和selenite(亚硒酸盐)在此培养基中作为补充剂，是维持神经细胞生长的添加剂。
18.优选的，所述s1包括：
19.s11：将人多能干细胞接种于人多能干细胞维持培养基中得到细胞悬液，所述人多能干细胞维持培养基中添加有rock抑制剂；
20.s12：将细胞悬液悬浮培养得到拟胚体。
21.更优选的，将细胞悬液置于摇床上进行培养得到拟胚体。
22.其中，rock抑制剂即抑制rho激酶(rock)功能的物质。例如包括y-27632、ha100、ha1152和blebbistatin。blebbistatin是一种细胞通透性的非肌肉肌球蛋白ii型atp酶抑制剂。
23.在本发明的一优选实施例中rock抑制剂为y-27632。培养基中y-27632的浓度只要是抑制rho激酶的浓度即可为，例如浓度为1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、30μm、50μm，但不限于此。y-27632的优选浓度为10μm
24.更优选的，在s1之前还包括步骤s0，即培养人多能干细胞，在人多能干细胞的汇合
度为70-90％时消化收集进行拟胚体形成实验。
25.更优选的，摇床的转速为10-100rpm，培养时间为8-32个小时，培养结束时，获得大小和形态较为均一的拟胚体。
26.优选的，所述s2包括：
27.s21：收集s1得到的拟胚体，去除其上清液；
28.s22：将拟胚体重悬于第一分化培养基中进行培养得到中脑底板细胞。
29.优选的，所述第一分化培养基包括bmp4抑制剂、tgf-β抑制剂、shh激动剂和gsk3β抑制剂。
30.bmp(骨形态发生蛋白)抑制剂即bmp信号通路抑制剂。可选择chordin、noggin和follistatin等蛋白质，及dorsomorphin和ldn193189等小分子化合物。本发明的一优选实施例中中使用的bmp4抑制剂为noggin。其中培养基中noggin的浓度只要是阻碍bmp的浓度即可，例如为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、20ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、300ng/ml，但不限于此。优选的浓度为100ng/ml。
31.tgfβ抑制剂是阻碍从tgfβ与受体的结合至继续向smad传递信号的物质，可选择阻碍与作为受体的alk家族结合的物质或阻碍有alk家族导致的smad的磷酸化的物质，例如lefty-1、sb431542、sb202190、sb505124、npc30345、sd093、sd908、sd208、ly2109761、ly364947、lt580276、a83-01，以及它们的衍生物。本发明的一优选实施例中使用的tgfβ抑制剂为a83-01。其中培养基中a83-01的浓度只要是阻碍alk5的浓度即可，例如浓度为0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm，但不限于此。优选浓度为0.5μm。
32.shh信号激动剂：引起shh结合于作为受体的patched(ptch1)而导致的smoothenod(smo)的脱抑制和进一步引起gli2的活化的物质，可选择shh、shh c25ii、purmorphamine，sag，sag 21k、hh-ag1.5、20a-羟基胆固醇、嘌吗啡胺和它们的衍生物等。本发明一优选实施例中使用的shh信号激动剂为purmorphamine。
33.培养基中purmorphamine的浓度只要是使gli2活化的浓度即可，例如浓度可以为0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm，但不限于此。优选浓度为2μm。
34.gsk3β抑制剂即为阻碍gsk3β蛋白质的激酶活性的物质，例如gsk3β抑制剂ix(6-溴靛玉红3
’‑
肟)、sb216763、gsk3β抑制剂vii(4-二溴苯乙酮)、l803-mts、6-bromo-indirubin-3
’‑
oxime(bio)、tws119、azd2858、ar-a014418、tdzd-8、ly2090314、2-d08、im-12、1-azakenpaullone、indirubin以及具有高选择性的chir99021。
35.本发明的一个具体实施例中，所述gsk3β抑制剂为chir99021。培养基中chir99021的浓度只要是阻碍gsk3β蛋白质的激酶活性的浓度即可，例如浓度为0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、20μm，但不限于此。在本发明的一优选实施例中chir99021的浓度范围为0.5～3μm。
36.优选的，在s3中，所述第二分化培养基包括bmp4抑制剂、shh激动剂、gsk3β抑制剂和fgf8b。
37.优选的，在步骤s3之后还包括步骤s4，在s4中，所述第三分化培养基包括bmp4抑制
剂、gsk3β抑制剂和fgf8b。
38.s41：收集s3得到的中脑多巴胺能神经前体细胞，去除其上清；
39.s42：将中脑多巴胺能神经前体细胞消化成单细胞，在第三分化培养基中进行扩增培养。
40.在本发明一具体实施例中，将s3得到的中脑多巴胺能神经前体细胞消化成单个细胞后，用2d的方法接种于神经诱导分化培养基中，并向所述神经诱导分化培养基中加入rock抑制剂、bmp4抑制剂、shh激动剂、gsk3β抑制剂和fgf8b。
41.本发明第三个方面公开了一种细胞群，所述细胞群富集有上述的中脑多巴胺能神经前体细胞。
42.本发明第四个方面公开了一种治疗帕金森病的药物，所述药物包含上述的中脑多巴胺能神经前体细胞。
43.本发明第五个方面公开了上述的中脑多巴胺能神经前体细胞在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
44.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
45.本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
46.(1)本方法获得的多巴胺能神经前体细胞在实验动物体内具有功能性，并且在体外具有向成熟多巴胺能神经元的分化能力，具有极大的临床及科研应用潜力；
47.(2)通过使用小分子化合物对分化过程进行精细调控，实现了稳定、高效的分化，最终培养体系中lmx1a /foxa2 /en1 前体细胞的比例可达到90％以上；
48.(3)整个分化过程均使用无血清培养基且不使用滋养层细胞，适于后续临床级细胞制剂的生产；
49.(4)本方法在诱导分化期间采用拟胚体悬浮摇动培养的方法，并且可大量扩增4-5代，适于规模化细胞制剂的生产。
附图说明
50.图1显示了本发明一个实施例的流程图。
51.图2显示了本发明一个实施例中从人多能干细胞形成拟胚体(第1天)。
52.图3显示了本发明一个实施例中拟胚体体积逐渐变大，向中脑多巴胺能神经前体细胞分化的过程(左图和右图分别为第9天和第11天)。
53.图4采用rt-qpcr对多巴胺能神经前体细胞的标志物lmx1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-进行检测(相比于人多能干细胞)。
54.图5采用流式细胞仪检测多巴胺能神经前体细胞的lmx1a /foxa2 /en1 表型所占的比例。
55.图6采用细胞免疫荧光验证多巴胺能神经前体细胞的lmx1a /foxa2 /en1 表型。
56.图7显示了chir99021处理可显著提高了eb中lmx1a /foxa2 /en1 细胞的比例。
57.图8显示了fgf8b的浓度影响中脑多巴胺能神经前体细胞分化的效率。
58.图9显示了中脑多巴胺能神经前体细胞扩增至第4代时，中脑lmx1a /foxa2 /en1 指标的表达情况(相比于人多能干细胞)。
59.图10显示了lmx1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-前体细胞移植到帕金森模型小鼠脑内的行为学特征。
60.图11显示了lmx1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-前体细胞分化为中脑多巴胺能神经元的能力(成熟多巴胺能神经元表达th和nurr1)。
61.图12显示了lmx1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-前体细胞分化为中脑多巴胺能神经元的能力(成熟多巴胺能神经元可以分泌多巴胺)。
具体实施方式
62.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
63.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
64.实施例1
65.本实施例公开了一种制备中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，如图1所示，具体步骤如下：
66.d-1-d0：拟胚体(eb)的形成
67.首先培养人多能干细胞，将状态良好未分化的、培养至汇合度为70-90％的人多能干细胞消化为单细胞悬液，以一定密度重悬于人多能干细胞维持培养基中，置于37℃培养箱内的摇床上摇动培养过夜，形成大小和形态较为均一的eb。
68.其中，上述人多能干细胞通过专利cn 108085299a公开的方法进行制备，应当理解，上述人多能干细胞不受来源的限制，可包括任何途径获得的人多能干细胞。
69.d-1-d0实验操作细节及优化如下：
70.1)人多能干细胞的培养
71.实验中所用的人多能干细胞经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。人多能干细胞在人多能干细胞维持培养基中正常培养，所用的培养基为e8或tesr或其它类似培养基。
72.2)eb的形成
73.按上述方法培养人多能干细胞至70-90％汇合度时进行拟胚体形成实验。具体操作为：使用tryple或accutase将人多能干细胞消化为完全的单细胞悬液，重悬于ipsc维持培养基中，并向培养基中加入rock抑制剂。将此细胞悬液置于37℃培养箱内的3d摇床上摇动培养，摇床的转速为10-100rpm；此步骤摇动培养的时间为8-32小时；培养结束时，获得大小和形态较为均一的eb。例如使用t25培养瓶时，rock抑制剂可以是y-27632，浓度可以为10um；细胞密度可以为0.1
×
10
6-5
×
106/ml；摇床的转速可以为10-20rpm；培养的时间可以为8-32小时。
74.d0-d9：eb向中脑底板分化
75.将上述d0的eb重悬于加入第一分化培养基，该第一分化培养基配制：在神经特异性分化培养基中添加小分子bmp4抑制剂、tgf-β抑制剂、shh激动剂和gsk3β抑制剂。继续于37℃培养箱内的摇床上摇动培养9天，eb体积继续增大，获得较为均一的中脑底板细胞。其中，神经特异性分化培养基的成分如下表1所示。
76.表1神经特异性分化培养基成分
[0077][0078][0079]
d0-d9实验操作细节及优化
[0080]
从培养箱内取出装有d0 eb的培养瓶，倾斜培养瓶使eb沉于底部，去除上清液，加入第一分化培养基，该第一分化培养基配制：在神经特异性分化培养基中添加小分子bmp4抑制剂、tgf-β抑制剂、shh激动剂和gsk3β抑制剂。bmp4抑制剂可以是dorsomorphin、noggin、ldn-193189、follistatin、chordin和gremlin等；tgf-β抑制剂可以是a-83-01、gw6604、ly2157299、ly550410、l y5 73636、ly580276、npc-30345、sb-431542和sb-505124等；shh激动剂可以是shh重组蛋白、purmorphamine和sag等；gsk3β抑制剂可以是np031112、tws119、sb216763、chir-98014、azd2858、azd1080、sb415286、ly2090314和chir99021等。例如当使用t25培养瓶进行培养时，其中bmp4抑制剂可以是noggin；tgf-β抑制剂可以是a83-01，shh激动剂可以是purmorphamine；gsk3β抑制剂可以是chir99021。
[0081]
整个诱导分化过程中采用3d培养方法，即诱导初期18～36小时内，将ipsc形成较小体积的eb，然后换成新鲜的特殊神经分化培养基。在培养过程中，eb的体积逐渐增大。在第11天时，获得的中脑多巴胺能神经前体细胞的比例(lmx1a /foxa2 /en1 )高达90％以上，高于已有文献报道中用2d分化方法得到的阳性细胞比例(约50～80％)。
[0082]
d9-d11：中脑底板细胞特异性向多巴胺能神经前体细胞分化
[0083]
将上述d9的eb重悬于第二分化培养基中，第二分化培养基配制：在神经特异性分化培养基中加入细胞因子noggin、优化浓度的小分子chir99021和优化浓度的细胞因子fgf8b，继续于37℃培养箱内的摇床上摇动培养2天，诱导中脑底板细胞特异性向多巴胺能神经前体细胞分化过程的发生，获得多巴胺能神经前体细胞。
[0084]
d9-d11实验操作细节及优化
[0085]
从培养箱内取出装有d9 eb的培养瓶，倾斜培养瓶使eb沉于底部，去除上清液，加入重悬于第二分化培养基中，第二分化培养基配制：在神经特异性分化培养基中加入细胞因子noggin、优化浓度的小分子chir99021和优化浓度的细胞因子fgf8b。
[0086]
分化培养的第1天、第9天、第11天，拟胚体的直径分别为90-120μm、380-430μm、400-450μm，具体细胞形态分别见图2和图3左图和图3右图所示。
[0087]
p1-p4：多巴胺能神经前体细胞扩增实验
[0088]
将上述d11的eb用tryple或accutase消化成单细胞，并重新用2d的方法接种于神经特异性分化培养基中，并向培养基中加入rock抑制剂(如y-27632)，gsk3β抑制剂(如chir99021)，优化浓度的fgf8b，继续于37℃培养箱内培养2-5天，扩增多巴胺能神经前体细胞。
[0089]
实验结果如表1所示，将分化得到的多巴胺能神经前体细胞进行传代扩增，从表2可以看出传至第四代以后细胞的扩增倍数显著下降，第5代之后细胞的活性显著降低。
[0090]
表2多巴胺能神经前体细胞不同代数的扩增倍数和细胞活力值
[0091][0092][0093]
p1-p4实验操作细节及优化
[0094]
在分化方法中，除了使用3d可提高分化效率，小分子的联合使用也进一步大大增加了多巴胺能神经前体细胞的比例。从培养箱内取出培养板，去除上清液，然后加入新鲜的神经特异性分化培养基，并添加y-27632、chir99021和fgf8b。y-27632的浓度为10μm；chir99021的浓度为0.5～3μm。fgf8b的浓度为100ng/ml。
[0095]
实施例2
[0096]
本实施例对实施例1得到的多巴胺能神经前体细胞进行鉴定，鉴定方法分别如下：
[0097]
方法一：使用rt-qpcr(实时荧光定量pcr)检测前脑、间脑、中脑及后脑的指标以确定分化细胞的类型，rt-qpcr的具体操作步骤采用常规技术方法，具体实验数据如附图4所示，其中，图4中纵坐标指的是相对于hpsc的表达量，以hpsc的目的基因表达量为“1”，从图中可以得出实验鉴定所得多巴胺能神经前体细胞的表型为：lmx1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-。
[0098]
其中，nkx2.1为前脑和间脑的指标；dbx1为前端中脑的指标；lmx1a、foxa2、en1和otx2为中脑的指标；gbx2为后脑的指标。抽提rna所用的试剂盒是rnaprep pure cell/
bacteria kit，厂家为tiangen，货号是dp430；逆转录＝所用试剂盒是reverse transcriptase，厂家为vazyme，货号是r223-01；rt-qpcr所用试剂盒是transstart top green qpcr supermix，厂家为transgen，货号是aq131。
[0099]
方法二：使用流式细胞仪检测细胞表型，流式细胞仪检测的具体操作步骤采用常规技术方法，证明所得多巴胺能神经前体细胞的表型为：lmx1a /foxa2 /en1 ；分化效率达到90％左右，其中(lmx1a /foxa2 ＞90％，en1 /foxa2 ＞90％)。说明实施例1分化所得的细胞群是多巴胺能神经前体细胞，且多巴胺能神经前体细胞的纯度很高，实验结果如图5所示。
[0100]
其中，流式的抗体信息如下：lmx1a，millipore，#mab10533；pe mouse anti-human foxa2，bd，#561589；en1，abcam，#ab108598；goat anti-rabbit igg h&l(apc)，abcam，#ab130805。
[0101]
方法三：使用细胞免疫荧光检测细胞表型，证明所得细胞表型为：lmx1a /foxa2 /en1 ；三种标志物的重合度达90％左右，进一步说明分化所得的细胞群是多巴胺能神经前体细胞且细胞纯度很高。图像结果见附图6。图6为分化至第11天的多巴胺能神经前体细胞荧光染色图片。lmx1a、foxa2和en1皆为中脑多巴胺能神经前体细胞的特异性指标。上图为lmx1a和foxa2的双标，意为证明二者共定位，进一步说明其为中脑多巴胺能神经前体细胞；下图为en1和foxa2的双标，意为证明二者共定位，也是进一步说明其为中脑多巴胺能神经前体细胞。该荧光结果与流式结果相对应。
[0102]
其中，免疫荧光的抗体信息如下：lmx1a，millipore，#mab10533；foxa2，abcam，#ab60721；en1，abcam，#ab70993；alexa fluor 488donkey anti-chiken igg(h l)antibody，thermofisher，#a11039；alexa fluor 594donkey anti-goat igg(h l)antibody，thermofisher，#a11058。
[0103]
实施例3对chir99021浓度的优化
[0104]
本实施例目的在于优化chir99021的浓度，实验发现chir99021处理可显著提高了第11天eb中lmx1a /foxa2 /en1 细胞的比例，几乎不表达其他脑区的杂细胞。具体操作如下：
[0105]
当使用t25培养瓶进行eb分化时，其它条件方法如实施例1所述，对chir99021的浓度进行梯度优化，即在d9-d11分别使用0μm，0.5μm，0.8μm，1μm，1.5μm或3μm的chir99021处理细胞，并在d11使用rt-qpcr测定各脑区特异性指标，结果见附图7。图7中，纵坐标为各组相对于chir＝1μm目的基因表达量的相对值(chir＝1μm目的基因表达量的值为“1”)。
[0106]
可见，优化的chir99021的加入会提高分化的效率；不同chir99021浓度会使得ipsc向不同脑区分化：在较低浓度时，向前脑及间脑的细胞分化，在较高浓度时，向后脑细胞分化；优化chir99021浓度可提高中脑多巴胺能神经前体细胞的纯度，即提高了lmx1a /foxa2 /en1 细胞的比例；chir99021较优浓度应为0.5～3μm。
[0107]
实施例4fgf8b的浓度影响中脑多巴胺能神经前体细胞分化的效率
[0108]
当使用t25培养瓶进行eb分化时，其它条件方法如实施例1所述，对fgf8b的浓度进行梯度优化，即在d9-d11分别使用0ng/ml、50ng/ml或100ng/ml的fgf8b处理细胞，并在d11使用rt-qpcr测定各脑区指标的表达，结果见附图8。
[0109]
可见，fgf8b浓度会影响分化效率。fgf8b浓度为0时，中脑特异性指标en1表达很
低，且有间脑指标表达，说明分化效率低；当fgf8b浓度为50ng/ml，100ng/ml及200ng/ml时，中脑特异性指标皆表达较高，但较优浓度为100ng/ml。
[0110]
实施例5中脑多巴胺能神经前体细胞可以扩增至第4代，并且仍表达中脑各项指标
[0111]
当使用2d方法对多巴胺能神经前体细胞进行扩增时，前体细胞可以至少扩增4-5代，细胞活力也保持在较高水平；在细胞数目增加的同时，仍表达中脑关键性指标lmx1a /foxa2 /en1 ，且en1的表达持续增高。实验数据见附图9。图9纵坐标指的是相对于hpsc的表达量，以hpsc的目的基因表达量为“1”[0112]
实施例6
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本实施例发现将实施例1得到的1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-前体细胞移植到帕金森模型小鼠脑内具有功能性。
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具体的，将中脑多巴胺能神经前体细胞移植到单侧损伤帕金森模型小鼠脑内，其行为学有了明显的改善：减少了向一侧旋转的圈数，一共三只小鼠，实验数据分为曲线a、b和c，见附图10。
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实验鼠:c57bl/6品系，8-10月龄，雌性，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司；
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具体实验条件和步骤：
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1)以6-ohda注射单侧纹状体部位，造成单侧中脑多巴胺系统损伤，模拟帕金森氏症(单侧受损的鼠在注射一定剂量的多巴胺受体激活剂阿扑吗啡之后，会向受损侧的对侧旋转，受损程度与单侧旋转的程度成正相关)；
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2)细胞移植前，给6-ohda造模成功的实验小鼠腹腔注射阿扑吗啡，并记录其单侧旋转数；
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3)利用脑立体定位仪技术给实验小鼠损伤侧纹状体部位注射15-30万个多巴胺能神经前体细胞(在移植前两天开始小鼠皮下注射免疫抑制药物，之后每天注射)；
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4)细胞移植后每月对实验小鼠腹腔注射阿扑吗啡，并记录其单侧旋转数。从图10可知，lmx1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-前体细胞移植到帕金森模型小鼠脑内可以改善其行为学运动，说明分化的多巴胺能神经前体细胞在体内具有功能性。
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实施例7
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实施例1得到的lmx1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-前体细胞具有分化为中脑多巴胺能神经元的能力。
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成熟多巴胺能神经元表达th和nurr1，且可以分泌多巴胺。用免疫荧光的方法对成熟神经元进行染色可见th和nurr1的表达(如图11所示)；用放射性免疫法对成熟神经元进行检测，可以检测到多巴胺的释放，实验结果见附图12。对照组为人多能干细胞，即为尚未分化的细胞；分化组为已分化成熟的中脑多巴胺能神经元。
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与对照组相比，分化组血浆内的多巴胺浓度约为对照组的27倍，具有显著差异。
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可见，lmx1a /foxa2 /en1 /otx2 /nkx2.1-/dbx1-/gbx2-前体细胞可高效分化为成熟中脑多巴胺能神经元。显示了分化方法的高效性和完整性。
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在本发明的一优选实施例中，在d-1-d0步骤中：分化第0天，我们使用accutase将人人多能干细胞消化成单细胞，初始细胞密度应控制在0.1～5百万个细胞/t25，细胞在人多能干细胞维持培养基中培养8～32小时。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。