一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法、重组微生物及其应用

1.本发明涉及生物化工技术领域，具体地说，涉及一种全细胞催化生产1,6-己二醇的方法、重组微生物及其应用。


背景技术：

2.1,6-己二醇是一种重要的化学品,可以作为原料合成一系列具有重要应用的高附加值产品，例如具有特殊性能的高档聚氨酯胶黏剂、聚氨酯弹性体，其应用覆盖聚氨酯、聚酯、涂料、染料、医药等多个领域，具有广阔的市场前景。目前1,6-己二醇高价格限制了其产能和应用，但全球市场对该产品的需求正在以5％～8％的年增长率增长。
3.工业上主要是通过1,6-己二酸酯化加氢生产1,6-己二醇，其生产装置属高压甲级防爆装置，通常面临设备装置要求高、设备腐蚀问题严重、催化剂稳定性差等问题。例如公开号cn113683483a的中国专利，提供了将己二酸和c6混合醇混合进行酯化反应再加氢还原的方式生产1,6-己二醇，也需要高温高压进行加氢反应。
4.目前，生物基合成1,6-己二醇的研究主要集中在使用纤维素、糠醛等生物质经过酸催化转化，例如公开号为cn113024350a的中国专利通过生物基呋喃类化合物制备1,6-己二醇。
5.通过生物催化的方法生产1,6-己二醇，不仅反应温和，而且具备较好的反应选择性，可以减少金属催化剂和化石能源的消耗，提高循环经济水平，实现低碳生产。因此，开发基于1,6-己二酸为底物生物生产1,6-己二醇的生物制造工业对于环境保护及提高循环经济水平都具有重大意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是提供一种高效、高产，可利用利用己二酸在温和条件下转化生产1,6-己二醇的新方法。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种重组微生物，其与出发菌株相比，过表达醛还原酶yahk，以及表达羧酸还原酶mpcar和4
′‑
磷酸泛酰氨基转移酶sfp，所述出发菌株为大肠杆菌。
9.本发明通过在大肠杆菌中引入来自mycolicibacterium paratuberculosis的羧酸还原酶mpcar和来自bacillus subtilis的4
′‑
磷酸泛酰氨基转移酶sfp，并过表达大肠杆菌中原有的醛还原酶yahk获得了一种新的重组大肠杆菌，其可高效生物转化己二酸生产1,6-己二醇。
10.本发明中，所述羧酸还原酶mpcar的氨基酸序列如seq id no.1所示。所述4
′‑
磷酸泛酰氨基转移酶sfp的氨基酸序列如seq id no.2所示。所述羧酸还原酶mpcar的核苷酸序列如seq id no.3所示。所述4
′‑
磷酸泛酰氨基转移酶sfp的核苷酸序列如seq id no.4所示。
no.5)和vector-r(agtagcagtactcatgtatatctccttcttccatggtctgtttcc，seq id no.6)为引物，以质粒pcdfduet(购自addgene)为模板扩增获得3.9kb的pcr片段。以mpcar-f(aagaaggagatatacatgagtactgctactcacgatgaacg，seq id no.7)和mpcar-r(gtatatctccttcttttacaataagcctaacaactgaaggtcagtg，seq id no.8)为引物，以人工合成密码子优化后的mpcar基因(核酸序列如seq id no.3所示)为模板扩增获得3.5kb的pcr片段。以sfp-f(ttaggcttattgtaaaagaaggagatatacatgaaaatttacggcat，seq id no.9)和sfp-r(agctttgatcttcatgtatatctccttcttaaagtttcaaagtaactcctcg，seq id no.10)为引物，以人工合成密码子优化后的sfp基因(核酸序列如seq id no.4所示)为模板扩增得到0.8kb的pcr片段。以yahk-f(aagaaggagatatacatgaagatcaaagctgttggtgca，seq id no.11)yahk-r(ttgctcagcggtggctcagtctgttagtgtgcgattatcgataaca，seq id no.12)为引物，以w03菌株为模板扩增获得1.1kb的pcr片段。利用gibson组装的方法将四个片段组装，获得质粒pcdfduet-mpcar-sfp-yahk。
31.将重组大肠杆菌w03/mpcar-sfp-yahk在500ml的摇瓶中进行培养，培养基为包含2g/l己二酸的mr培养基(己二酸二钠2g/l，葡萄糖20g/l，mgso4·
7h2o 0.8g/l，(nh4)2hpo
4 4g/l，kh2po
4 6.67g/l，柠檬酸钾0.8g/l，酵母粉2.5g/l，feso4·
7h2o 10g/l,cacl2·
2h2o 2g/l,znso4·
7h2o 2.2g/l，mnso4·
4h2o 0.5g/l,cuso4·
5h2o 1.0g/l，(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 0.1g/l,na2b4o7·
10h2o 0.02g/l，壮观霉素100mg/l)，培养温度为37度，转速200rpm，发酵周期为48h，发酵结束利用高效液相色谱检测己二酸转化情况，检测条件：aminex hpx-87h柱子，流动相为5mm硫酸，流速0.6ml/min，柱温35℃，进样量20μl，根据标准曲线计算即得各组分实际浓度。结果发现w03/mpcar-sfp-yahk菌株48h可以积累1.25g/l 1,6-己二醇。
32.实施例2全细胞催化合成1，6-己二醇的方法
33.为了提升1,6-己二醇的产量，本发明开发了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体步骤如下：
34.(1)将大肠杆菌菌株w03/mpcar-sfp-yahk在含有100mg/l壮观霉素的lb平板上37℃过夜培养。然后接种至30ml含有100mg/l壮观霉素的lb培养基中，37℃培养12h，获得种子液；将种子液按1％体积接种量接入200ml含有100mg/l壮观霉素的lb培养基中，37℃发酵培养12h，4000rpm离心，收集菌体，用pbs缓冲液(10mm,ph值为7.2)洗涤细胞，再离心后用无菌水重悬细胞，得到重组大肠杆菌细胞悬液。
35.(2)在250ml带挡板的摇瓶中加入10ml的催化体系，其中包含：pbs缓冲液(0.01m，ph值为7.2)、葡萄糖(40g/l)、己二酸二钠(20g/l)、重组大肠杆菌细胞悬液(初始od
600
为30)。以上催化体系，在30℃，200rpm中催化反应，反应时间为24h后终止反应，得到反应液。采用高效液相色谱分析本实验得到的1,6-己二醇的浓度。通过上述体系最终1,6-己二醇浓度达到6.97g/l。
36.实施例3
37.本实施例提供了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2的步骤(2)中己二酸二钠的添加量，使催化体系中的己二酸浓度分别为40g/l、10g/l、60g/l，其他反应条件不变，24h后反应液中1,6-己二醇的浓度分别为5.37g/l、6.18g/l、3.54g/l。
38.对比例1
39.本对比例提供了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2的步骤(2)中己二酸二钠的添加量，使催化体系中的己二酸浓度为80g/l，其他反应条件不变，24h后反应液中1,6-己二醇的浓度分别为1.36g/l。
40.实施例4
41.本实施例提供了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2的步骤(2)中重组大肠杆菌在催化体系中的初始od值，使其初始od
600
分别为20、40、60，其他反应条件不变，24h后反应液中1,6-己二醇的浓度分别为4.73g/l、6.48g/l、5.26g/l。
42.对比例2
43.本对比例提供了一种全细胞催化合成1,6-己二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2的步骤(2)中重组大肠杆菌在催化体系中的初始od值，使其初始od
600
分别为10、80、100，其他反应条件不变，24h后反应液中1,6-己二醇的浓度分别为1.35g/l、4.45g/l、3.74g/l。
44.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。