一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用与流程

技术特征：
1.一种采用无血清方法制备中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，由以下步骤组成：s1：在d-1-d0，将人诱导多能干细胞消化为单细胞悬液，重悬于人诱导多能干细胞维持培养基中得到细胞悬液，将细胞悬液3d培养形成拟胚体，所述人诱导多能干细胞维持培养基中添加有rock抑制剂y-27632；s2：在d0-d9，将s1得到的拟胚体在第一分化培养基中进行悬浮培养得到中脑底板细胞；所述第一分化培养基为神经特异性分化培养基，并添加有bmp4抑制剂、tgf-β抑制剂、shh激动剂和gsk3β抑制剂chir99021；s3：在d9-d11，将s2得到的中脑底板细胞用3d的方法接种在第二分化培养基中进行分化培养得到中脑多巴胺能神经前体细胞；所述第二分化培养基为神经特异性分化培养基，并添加有bmp4抑制剂noggin、gsk3β抑制剂chir99021和fgf8b；所述chir99021的浓度范围为0.5～3μm，所述fgf8b浓度为50ng/ml或100ng/ml或200ng/ml；s4.将d11得到的中脑多巴胺能神经前体细胞消化成单细胞，并用2d的方法接种于神经特异性分化培养基中，并向培养基中加入rock抑制剂、gsk3β抑制剂、fgf8b，继续扩增多巴胺能神经前体细胞，扩增至4-5代。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s2包括：s21：收集s1得到的拟胚体，去除其上清液；s22：将拟胚体重悬于第一分化培养基中进行培养得到中脑底板细胞。3.一种中脑多巴胺能神经前体细胞，其由权利要求1-2中任意一项所述的方法制备而得。4.一种治疗帕金森病的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的中脑多巴胺能神经前体细胞。5.根据权利要求4所述的中脑多巴胺能神经前体细胞在制备治疗帕金森病的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用。本发明公开了一种中脑多巴胺能神经前体细胞，其表达Lmx1a 、Foxa2 、En1 和Otx2 ，其中所述中脑多巴胺能神经前体细胞不表达Nkx2.1、DBX1和GBX2中的一种或者多种。制备该中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包括以下步骤：形成拟胚体、得到中脑底板细胞和得到中脑多巴胺能神经前体细胞。该制备方法能够快速高效的从人多能干细胞分化获得中脑多巴胺能神经细胞，解决了现有的分化方法时间较长、效果不稳定、效率低及利用了含血清的培养体系或滋养层细胞不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。


技术研发人员：ꢀ(74)专利代理机构
受保护的技术使用者：安徽中盛溯源生物科技有限公司
技术研发日：2019.03.06
技术公布日：2022/6/10