鼠李糖乳杆菌在黏附结肠细胞中的应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及鼠李糖乳杆菌在黏附结肠细胞中的应用。


背景技术：

2.根据世界卫生组织的定义，益生菌是“非致病性微生物，摄入足够量时会对宿主产生积极的健康益处”。鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus))，从属于乳杆菌属，是人体正常菌群之一，肠道黏着率高，定植能力强，并具有高效降胆固醇，促进细胞分裂，可起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿、提高机体免疫力及抗癌等重要的生理保健功能。益生菌最终发挥作用的地方在消化道的下端——大肠或小肠内，而益生菌能否抵制消化道的各种消化液到达目的地，则需要它们必须有一定的黏附力使之能附在肠壁上。细菌在定植后才可以在肠黏膜表面形成微生物膜，防止外籍菌入侵，保护肠黏膜的健康。乳酸菌黏附于宿主肠上皮细胞的能力越强，越有助于其在肠道定植并发挥抑制病原菌和保护肠道等益生功能。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了提供一种鼠李糖乳杆菌jl1在黏附结肠细胞中的应用，为了提高鼠李糖乳杆菌在结肠细胞的粘附性。
4.本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌jl1在黏附结肠细胞中的应用，将鼠李糖乳杆菌jl1与结肠细胞共培养。
5.进一步限定，所述共培养的方法的具体步骤为将109
‑
106cfu鼠李糖乳杆菌jl1接种到105
‑
107个结肠细胞中，在37℃，含5％co2的条件下中共培养2
‑
4h。
6.进一步限定，所述结肠细胞为caco
‑
2细胞。
7.进一步限定，所述培养caco
‑
2细胞的方法是在37℃，含5％co2的条件下培养12
‑
24小时，当细胞单层平铺细胞培养瓶达到80％时，按照细胞：细胞培养基＝1:3(体积比)的比例传代，传至2
‑
3代后获得的细胞。
8.进一步限定，所述细胞培养液的制备方法为在900ml dmem培养液中分别加入100ml胎牛血清、10ml青链霉素和10ml非必须氨基酸并充分混合，采用0.22μm滤膜进行过滤。
9.进一步限定，所述共培养利用的是细胞培养液。
10.进一步限定，所述细胞培养液的配方：在900ml dmem培养液中分别加入10ml青链霉素和10ml非必须氨基酸并充分混合，采用0.22μm滤膜进行过滤，置于4℃冰箱中保存。
11.进一步限定，所述培养鼠李糖乳杆菌jl1的mrs培养基的成分：蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰和tween
‑
80。
12.进一步限定，所述结肠所述物种为人或猪。
13.有益效果：本发明提供了鼠李糖乳杆菌jl1在黏附结肠细胞中的应用，一株具有高黏附能力的鼠李糖乳杆菌jl1，该菌株容易培养且体外黏附能力强，与鼠李糖乳杆菌gg相
比，具有更强的黏附能力。
附图说明
14.图1为caco
‑
2细胞的生长状态；
15.图2为鼠李糖乳杆菌jl1和gg对caco
‑
2细胞的黏附能力；横坐标是菌株名称，纵坐标是黏附率。
具体实施例
16.材料与方法：鼠李糖乳杆菌jl1记载在protective effects of a novel lactobacillus rhamnosus strain with probiotic characteristics against lipopolysaccharide
‑
induced intestinal inflammation in vitro and in vivo[j].food&function。
[0017]
鼠李糖乳杆菌gg是商业购买。
[0018]
人克隆结肠癌细胞caco
‑
2，购自中科院上海细胞库。
[0019]
mrs培养基用于培养鼠李糖乳杆菌，培养基的配方如下：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，tween
‑
80 1ml；mrs培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000ml蒸馏水中，混匀后，ph调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。
[0020]
细胞培养液：在900ml dmem培养液中分别加入100ml胎牛血清、10ml青链霉素和10ml非必须氨基酸并充分混合，采用0.22μm滤膜进行过滤，置于4℃冰箱中保存。
[0021]
实施例1.
[0022]
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0023]
1.培养鼠李糖乳杆菌：
[0024]
取鼠李糖乳杆菌jl1，以3％的接种量接种至mrs培养基，37℃培养18h后，三区划线于mrs固体培养基上，培养后挑取单菌落于mrs培养基中，传代培养两代后为工作液，工作液与80％无菌甘油以3:1比例保种，
‑
80℃保存备用。
[0025]
2、人结肠癌caco
‑
2细胞的培养：
[0026]
将caco
‑
2细胞从液氮中取出后立刻放于37℃水浴条件下解冻1min，然后迅速转移到配制好的细胞培养液中，离心去除上清液，将细胞转移至细胞培养瓶中，在37℃，含5％co2的培养箱中培养，隔天更换培养液。当细胞单层平铺细胞培养瓶达到80％左右时，按照1:3的比例传代，传至3代培养至单层铺满细胞培养瓶的细胞为极化状态的细胞，可用于黏附试验，细胞状态如图1所示，caco
‑
2细胞在细胞培养瓶中贴壁生长，培养5～6天后，细胞生长至铺满培养瓶底部，此时的caco
‑
2细胞呈现不规则圆形，细胞间连接紧密，呈镶嵌式排列。
[0027]
3、鼠李糖乳杆菌与细胞共培养
[0028]
将活化两代的鼠李糖乳杆菌jl1在10000
×
g条件下4℃离心5min，利用无菌pbs洗涤菌体3次后，分别重悬于不含双抗的细胞培养液中，调整菌液浓度为108cfu/ml备用，培养至极化状态的caco
‑
2细胞从细胞培养瓶中以106个/孔接种于六孔板中，加入1ml菌液到一
个孔中，加菌前24h将培养液更换为不含双抗的细胞培养液，培养至单层细胞铺满六孔板，倒掉六孔板中的培养液，并加入含菌的细胞培养液，在37℃，含5％co2的培养箱中共培养2h，每组设置三个平行。
[0029]
实施例2.
[0030]
1、培养鼠李糖乳杆菌：方法同实施例1的步骤1。
[0031]
2、人结肠癌caco
‑
2细胞的培养：方法同实施例1的步骤2。
[0032]
3、鼠李糖乳杆菌与细胞共培养
[0033]
将活化两代的鼠李糖乳杆菌jl1在10000
×
g条件下4℃离心5min，利用无菌pbs洗涤菌体3次后，分别重悬于不含双抗的细胞培养液中，调整菌液浓度为106cfu/ml备用，培养至极化状态的caco
‑
2细胞从细胞培养瓶中以105个/孔接种于六孔板中，加入1ml菌液到一个孔中，加菌前24h将培养液更换为不含双抗的细胞培养液，培养至单层细胞铺满六孔板，倒掉六孔板中的培养液，并加入含菌的细胞培养液，在37℃，含5％co2的培养箱中共培养2h，每组设置三个平行。
[0034]
实施例3.
[0035]
1、培养鼠李糖乳杆菌：方法同实施例1的步骤1。
[0036]
2、人结肠癌caco
‑
2细胞的培养：方法同实施例1的步骤2。
[0037]
3、鼠李糖乳杆菌与细胞共培养
[0038]
将活化两代的鼠李糖乳杆菌jl1在10000
×
g条件下4℃离心5min，利用无菌pbs洗涤菌体3次后，分别重悬于不含双抗的细胞培养液中，调整菌液浓度为109cfu/ml备用，培养至极化状态的caco
‑
2细胞从细胞培养瓶中以107个/孔接种于六孔板中，加入1ml菌液到一个孔中，加菌前24h将培养液更换为不含双抗的细胞培养液，培养至单层细胞铺满六孔板，倒掉六孔板中的培养液，并加入含菌的细胞培养液，在37℃，含5％co2的培养箱中共培养2h，每组设置三个平行。
[0039]
对比例1.
[0040]
1.培养鼠李糖乳杆菌：
[0041]
取鼠李糖乳杆菌gg，以3％的接种量接种至mrs培养基，37℃培养18h后，三区划线于mrs固体培养基上，培养后挑取单菌落于mrs培养基中，传代培养两代后为工作液，工作液与80％无菌甘油以3:1比例保种，
‑
80℃保存备用。
[0042]
2、人结肠癌caco
‑
2细胞的培养：
[0043]
将caco
‑
2细胞从液氮中取出后立刻放于37℃水浴条件下解冻1min，然后迅速转移到配制好的细胞培养液中，离心去除上清液，将细胞转移至细胞培养瓶中，在37℃，含5％co2的培养箱中培养，隔天更换培养液。当细胞单层平铺细胞培养瓶达到80％左右时，按照1:3的比例传代，传至3代左右培养至单层铺满细胞培养瓶的细胞为极化状态的细胞，可用于黏附试验，细胞状态如图1所示。
[0044]
3、鼠李糖乳杆菌与细胞共培养
[0045]
将活化两代的鼠李糖乳杆菌gg在10000
×
g条件下4℃离心5min，利用无菌pbs洗涤菌体3次后，分别重悬于不含双抗的细胞培养液中，调整菌液浓度为108cfu/ml备用，培养至极化状态的caco
‑
2细胞从细胞培养瓶中以106个/孔接种于六孔板中，加入1ml菌液到一个孔中，加菌前24h将培养液更换为不含双抗的细胞培养液，培养至单层细胞铺满六孔板，倒
掉六孔板中的培养液，并加入含菌的细胞培养液，在37℃，含5％co2的培养箱中共培养2h，每组设置三个平行。
[0046]
利用以下实验验证实验效果：
[0047]
1.黏附率计算：计算实施例1和对比例1的黏附率。
[0048]
刚开始共培养时，将含菌培养液进行稀释涂布，并在厌氧培养箱中培养48h后进行菌落计数，2h后，使用pbs缓冲液冲洗掉未黏附于细胞的菌体，随后用胰酶对贴壁细胞进行消化，制备成细胞悬浮液，梯度稀释涂布于mrs琼脂培养基，培养48h后进行菌落计数并计算黏附率。黏附率公式如下：
[0049][0050]
其中，nt为黏附后的活菌数，n0为加入的活菌数。
[0051]
结果如图2可以看出，鼠李糖乳杆菌gg的黏附率为86.66％，鼠李糖乳杆菌jl1对caco
‑
2细胞的黏附率为92.91％，极显著高于其他受试鼠李糖乳杆菌(p<0.001)。结果显示，鼠李糖乳杆菌jl1是一株具有较强黏附能力的乳酸菌。
[0052]
2.黏附能力的比较基因组分析
[0053]
将鼠李糖乳杆菌jl1和鼠李糖乳杆菌gg进行全基因组测序，采用pgap软件进行泛基因组计算，并绘制泛基因组与核心基因组曲线图。基于core
‑
pan分析鉴定出的单拷贝core基因，采用用最大似然法(maximum likelihood，ml)构建系统发育树。采用mummer软件确定目标基因组与参考基因组间的共线性关系，之后使用lastz软件对区域间进行比对，并从中查找易位和倒置的区域。
[0054]
鼠李糖乳杆菌jl1和参考菌株鼠李糖乳杆菌gg基因组中与黏附作用有关的蛋白见表1，由表可知，基因的个数代表拷贝数，鼠李糖乳杆菌jl1和鼠李糖乳杆菌gg基因组中与黏附素蛋白有关的编码基因拷贝数一致，而鼠李糖乳杆菌jl1细胞表面蛋白编码基因的拷贝数比后者多了4个，转肽酶编码基因的拷贝数比鼠李糖乳杆菌gg多一个，结果表明鼠李糖乳杆菌jl1的黏附性显著高于鼠李糖乳杆菌gg，据此可以推断鼠李糖乳杆菌jl1的黏附性可能与细胞表面蛋白和转肽酶有关，验证鼠李糖乳杆菌jl1因其黏附基因的存在而具有高粘附能力。
[0055]
表1 l.rhamnosus jl
‑
1和l.rhamnosus gg的黏附相关蛋白及编码基因位点
[0056]