一种载酶微球及Pickering乳液酶法制备生物柴油的方法

一种载酶微球及pickering乳液酶法制备生物柴油的方法
技术领域
1.本发明涉及基于固定化酶的生物多相催化技术领域，具体涉及一种载酶微球制备方法以及通过载酶微球稳定pickering乳液酶法制备生物柴油的方法。


背景技术：

2.不可再生化石能源的过度消耗所导致的环境污染和能源危机已经成为全球生物生存所共同面临的主要威胁。在我国“双碳”规划的指导下，对于不可再生化石能源替代品的开发成为了实现我国绿色、低碳、可持续发展的重要任务。
3.生物柴油被定义为源自可再生脂质来源(例如植物油、动物脂肪或废弃油脂)的长链脂肪酸单烷基酯混合物，可直接用于压燃式发动机，是对于化石能源的优良替代。现阶段化的酯化/酯交换反应制备，具有可再生、清洁燃烧、可生物降解、无毒等特点，生物柴油的使用能够有效减少温室气体的排放及环境污染。公开号为cn101397504b(申请号为cn200810218887.6)的中国专利采用均相碱(naoh/koh)作为催化剂通过催化废动植物油脂与甲醇的转脂化反应制备生物柴油。然而，现阶段广泛使用的化学催化方法(均相酸、碱催化)存在催化剂去除困难，副反应多，产品品质低，对设备要求高，能耗高，环境污染等问题。相比之下，利用脂肪酶催化的酯化/酯交换反应制备生物柴油是更加绿色、可持续的方法，因为脂肪酶能在温和的条件下，以高催化效率和高选择性催化生产高质量的生物柴油，不仅能够有效减少化学催化方法生产生物柴油过程中所带来的环境污染和能源消耗，还能够大幅缩减产品的分离纯化步骤，降低生产成本。
4.然而，以下2个因素严重阻碍了酶法在生物柴油的实际生产过程中的应用：(1)酶与反应底物的不混溶性导致双相体系极为有限的反应接触面积与极低的反应速率；(2)酶稳定性差，短链醇(甲醇/乙醇)作为底物会对脂肪酶的活性造成大幅损伤。
5.为了解决生物柴油生产中两相不互溶的问题，传统加入大量可同时溶解两相底物的有机试剂并在反应过程中进行不间断的剧烈搅拌的方法存在能源消耗高、环境污染、产物分离纯化复杂等问题，并且有机溶剂与剧烈搅拌均对酶的活性有损伤；基于固定化酶的pickering乳液界面生物催化体系为解决酶法生物柴油生物中两相不互溶的问题提出了可行的方案。pickering乳液是一种由固体粒子稳定的乳液体系，其中的一相以微米级的液滴形式分散于不混溶的另一相中，固体粒子通过在两相的界面处的不可逆地吸附来稳定pickering乳液，大大增加了不混溶两相间接触的反应面积，从而提高了反应效率(marc pera-titus,et al.angewandtechemie-international edition,2015,54(7):2006-2021.)。进一步的，通过固定化酶技术将酶固定在不溶性的固体载体上，固定化酶可同时作为稳定pickering乳液的乳化剂与在界面处催化反应的催化剂，实现在pickering乳液两相界面上高效的酶促催化反应。yanjun jiang等(yanjun jiang,et al.bioresource technology,2014,153,278-83.)利用吸附脂肪酶的介孔二氧化硅稳定的pickering乳液制备生物柴油，但物理吸附的方法在生产过程中易发生酶的泄露导致固定化酶失活；xiaobo liu等(xiaobo liu，et al.green chemistry,2021,23(2),966-972.)通过共价交联的方法
将脂肪酶固定在磁性载体上，稳定了大豆油与甲醇的pickering乳液进行酶法生物柴油的生产，但共价交联的方法会导致酶活性的降低及催化特性的改变；xiao he等(xiao he,et al.langmuir,2021,37,2,810
–
819.)通过物理截留的方式固定化脂肪酶有效避免了pickering乳液酶法生产生物柴油过程中酶的泄漏以及固定化操作所带来的酶活性损失。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种载酶微球的制备方法。
7.本发明的目的是这样实现的：一种载酶微球的制备方法，载酶微球由不同质量比的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子与脂肪酶通过乳液模板辅助的界面自组装的方法制备，载酶微球的表面润湿性通过改变自组装过程中亲水/疏水二氧化硅纳米粒子的质量比调节；
8.包括以下步骤：
9.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中以99:1或9:1的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比加入疏水二氧化硅纳米粒子，将分散液均匀混合；
10.步骤2：向步骤1所得混合液中加入0.2～1.8ml的脂肪酶液与0.2～1.8ml磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)，将所得3ml混合液进行充分混合；
11.步骤3：向步骤2所得混合液中加入30～50ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机转速为12000转每分钟的条件下乳化均质13min；
12.步骤4：将步骤3所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃下以6000rpm的转速离心5min，沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为载酶微球。
13.所述载酶微球通过离心或过滤等方式分离后能再次循环使用，循环10次后，载酶微球的乳化性能稳定，并且催化活性保持在94％以上。
14.本发明的又一目的是提供上述载酶微球在pickering乳液在酶法制备生物柴油中的应用。
15.本发明的再一目的是提供一种通过pickering乳液酶法制备生物柴油的方法。
16.本发明的再一目的是这样实现的：
17.步骤1：将月桂酸溶于正辛烷中，配制成15～55wt.％的月桂酸-正辛烷溶液作为油相；甲醇分散于磷酸盐缓冲液(ph＝7.5)中，配制成15～50wt.％的甲醇水溶液作为水相；
18.步骤2：在油-水两相比例为1:1～7:1，月桂酸与甲醇摩尔比为1:1～1:8，载酶微球添加量为1～2wt.％(占油水两相质量比)的条件下，通过手摇(100次每分钟)或均质机8000～20000转每分钟、2～8min形成w/o或o/w类型的pickering乳液，乳液液滴直径为150～650μm，并至少在12h内的催化反应过程中保持稳定；
19.步骤3：将由载酶微球稳定的pickering乳液置于旋转培养器或摇床上，保持温度15～25℃下，以20～150rpm的转速条件反应0～12h，即可生成月桂酸甲酯(生物柴油的一种)。
20.载酶微球同时作为乳化剂和生物界面催化剂在pickering乳液中油-水两相界面处催化反应高效制备生物柴油，酶的催化活性提高至7.52～8.18倍，其转化率达到75～84％。
21.与现有技术相比，本发明具有以下特点和优点：
22.本发明与现有技术相比，具有如下优点：
23.(1)本发明通过载酶微球稳定的pickering乳液通过酶法生产生物柴油，与传统化学法相比，催化条件温和，催化过程高效、绿色、可持续，所得产品质量高，能够有效降低产品的分离纯化成本；
24.(2)本发明利用载酶微球稳定的pickering乳液突破了现阶段酶法生产生物柴油中双相体系催化效率低下的问题，可显著提高酶法生产生物柴油的效率；
25.(3)本发明中载酶微球的制备、改性方法灵活、简单、生物相容性好、酶活保留率高，易于工业化生产。
26.(4)通过调整载酶微球自组装过程中亲水/疏水二氧化硅纳米粒子的质量比可改变在载酶微球在两相界面处的吸附状态，使负载的酶远离短链醇所在的水相，从而在涉及高浓度短链醇的生物柴油酶法生产过程中有效保护酶的催化活性；
27.(5)本发明中载酶微球具有良好的重复使用性，10次循环使用后乳化性能良好，催化活性保持在94％以上，能够有效降低酶法生产生物柴油的生产成本。
28.本发明通过对于固定化酶表面润湿性的调控改变其在pickering乳液油-水两相界面处的吸附状态，使其更加偏向于油相，远离短链醇所处的水相，可保护酶远离短链醇的灭活作用，从而在生物柴油酶法生产中实现长时间的高效酶催化。
29.本发明能够显著提升酶法生产生物柴油的效率并在催化过程中保护酶远离甲醇的灭活作用。载酶微球通过基于亲水/疏水纳米粒子与脂肪酶共组装过程将脂肪酶通过物理截留方式固定；其润湿性可通过改变共组装过程中亲水/疏水纳米粒子的质量比调节，这种非化学改性方法更加生物相容，能够避免化学改性时造成的酶活性损失。进一步的，通过此方法控制载酶微球在pickering乳液油-水两相界面处的吸附状态，使其更加偏向于油相，远离短链醇所处的水相，保护酶远离短链醇的灭活作用，有效的提高了酶的催化效率与重复使用性。综上所述，本发明提出的基于载酶微球的pickering乳液制备生物柴油的应用技术有望解决现阶段酶法生物柴油生产过程中的实际问题，从而实现绿色、高效、可持续的生物柴油的酶法生产。
附图说明
30.图1为本发明中载酶微球稳定的pickering乳液催化生产生物柴油的原理示意图。
31.图2为亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1、9:1制备的载酶微球在两相界面处的吸附状态对比示意图。
32.图3为实施例1中由亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1制备的载酶微球稳定的pickering乳液的微观形貌光学显微镜图。
33.图4为实施例2中由亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1制备的载酶微球稳定的pickering乳液的微观形貌光学显微镜图。
34.图5为实施例3中双相体系中游离酶的酶活性与pickering乳液体系中不同亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比制备的载酶微球酶活性对比图。
35.图6为实施例4中双相体系与亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1的载酶微球稳定的pickering乳液体系催化生产生物柴油的产率与反应时间的关系图。
36.图7为实施例5中双相体系与亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1的载酶微球稳定的pickering乳液体系催化生产生物柴油的产率与反应时间的关系图。
37.图8为实施例6中不同亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比制备的载酶微球稳定pickering乳液在10次循环反应中生物柴油的产率的对比图。
具体实施方式
38.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
39.一种利用pickering乳液制备生物柴油的方法，包括以下步骤：
40.步骤1：将月桂酸溶于正辛烷中，配制成15～55wt.％的月桂酸-正辛烷溶液作为油相；甲醇分散于磷酸盐缓冲液(ph＝7.5)中，配制成15～50wt.％的甲醇水溶液作为水相。
41.步骤2：在油-水两相比例为1:1～7:1，月桂酸与甲醇摩尔比为1:1～1:8，载酶微球添加量为1～2wt.％(占油水两相质量比)的条件下，通过手摇(100次每分钟)或其他乳化方式(均质机8000～20000转每分钟)2～8min形成w/o或o/w类型的pickering乳液，乳液液滴直径为150～650μm，并至少在12h内的催化反应过程中保持稳定。
42.步骤3：将由载酶微球稳定的pickering乳液置于旋转培养器或摇床上，保持温度15～25℃下，以20～150rpm的转速条件反应0～12h，即可生成月桂酸甲酯(生物柴油的一种)。
43.载酶微球由不同质量比的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子与脂肪酶通过乳液模板辅助的界面自组装的方法制备，载酶微球的表面润湿性可通过改变自组装过程中亲水/疏水二氧化硅纳米粒子的质量比调节。包括以下步骤：
44.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中以99:1和9:1的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比加入疏水二氧化硅纳米粒子，将分散液均匀混合。
45.步骤2：向步骤1所得混合液中加入0.2～1.8ml的脂肪酶液与0.2～1.8ml磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)，将所得3ml混合液进行充分混合。
46.步骤3：向步骤2所得混合液中加入30～50ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机转速为12000转每分钟的条件下乳化均质1～3min。
47.步骤4：将步骤3所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃下以6000rpm的转速离心5min。沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为载酶微球。
48.脂肪酶的活性定义为：在室温下，每分钟催化月桂酸产生1μmol月桂酸甲酯所需要的酶量，即为1个酶活单位，用u(u
·
ml-1
)表示，计算公式如下，其中m(g)为十二酸的质量，m(g
·
mol-1
)为十二酸的摩尔质量，y(％)为一定时间是十二酸甲酯的产率，ve(ml)为添加的酶量，t(min)是反应时间。酶活性：u＝(m/m)
×
106×
(y/100)/(ve×
t)
49.实施例1
50.一种由亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1制备的载酶微球稳定pickering乳液的方法，包括以下步骤：
51.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中加入6mg疏水二氧化硅纳米粒子(亲水/疏水二氧化硅纳米粒子的质量比为99:1)，将分散液均匀混合；
52.步骤2：向步骤1所得混合液中加入1.4ml脂肪酶液与0.6ml磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)，均匀混合；
53.步骤3：向步骤2所得混合液中快速加入30ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机
转速为12000rpm的条件下乳化均质1min；
54.步骤4：将步骤3所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃下以6000rpm的转速离心5min。沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1载酶微球；
55.步骤5：将2g的月桂酸溶于8ml的正辛烷中作为油相，1.614ml甲醇分散至2ml的磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)中作为水相；
56.步骤6：将步骤4制备的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1载酶微球以2wt.％(占油水两相质量比)的添加量加入到步骤5所述的双相反应体系中，手摇(100次每分钟)2min使其分离的两相体系形成pickering乳液体系；
57.如图3所示，在优化的油水比条件下，亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1的载酶微球展现出良好的乳化性能，所形成的乳液类型为o/w型。
58.如图3所示，亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1的载酶微球所形成的pickering乳液的平均直径为477μm。
59.实施例2
60.一种由亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1制备的载酶微球稳定pickering乳液的方法，包括以下步骤：
61.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中加入58mg疏水二氧化硅纳米粒子(亲水/疏水二氧化硅纳米粒子的质量比为99:1)，将分散液均匀混合；
62.步骤2：向步骤1所得混合液中加入1.4ml脂肪酶液与0.6ml磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)，均匀混合；
63.步骤3：向步骤2所得混合液中快速加入30ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机转速为12000rpm的条件下乳化均质1min；
64.步骤4：将步骤2所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃下以6000rpm的转速离心5min。沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1的载酶微球；
65.步骤5：将2g的月桂酸溶于8ml的正辛烷中作为油相，1.614ml甲醇分散至2ml的磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)中作为水相；
66.步骤6：将步骤4制备的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1载酶微球以2wt.％(占油水两相质量比)的添加量加入到步骤5所述的双相反应体系中，手摇(100次每分钟)2min使其分离的两相体系形成pickering乳液体系；
67.如图4所示，在优化的油水比条件下，亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1的载酶微球展现出良好的乳化性能，所形成的乳液类型为w/o型。
68.如图4所示，亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1的载酶微球所形成的pickering乳液的平均直径为182μm。
69.亲水/疏水二氧化硅纳米质量比为9:1时，所制备载酶微球稳定的pickering乳液催化体系催化活性比双相体系高8.18倍；反应12h后，生物柴油得率可达84％；并且在10次循环使用过程后保持了94％以上的初始催化活性。
70.实施例3
71.一种载酶微球稳定pickering乳液制备生物柴油的方法，包括以下步骤：
72.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中以99:1、9:1的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比加入疏水二氧化硅纳米粒子，将分散液均匀混合；
73.步骤2：向步骤1所得混合液中加入1.4ml脂肪酶液与0.6ml磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)，将所得混合液进行充分混合；
74.步骤3：向步骤2所得混合液中快速加入30ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机转速为12000rpm的条件下乳化均质1min；
75.步骤4：将步骤3所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃下以6000rpm的转速离心5min。沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1、9:1的载酶微球。
76.步骤5：将2g的月桂酸溶于8ml的正辛烷中作为油相，1.614ml甲醇分散至2ml的磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)中作为水相；
77.步骤6：将步骤4制备的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1、9:1的载酶微球以2wt.％(占油水两相质量比)的添加量加入到步骤5所述的双相反应体系中，手摇(100次每分钟)2min使其分离的两相体系形成pickering乳液体系；
78.步骤7：将步骤5中的pickering乳液反应体系置于旋转培养器上，在40rpm转速下进行反应；
79.步骤8：反应8h后，提取100μl油相样品，在5000rpm下离心1min破乳后，利用气相色谱对月桂酸甲酯的含量进行定量分析，计算不同体系下的酶活力。
80.如图5所示，两相游离酶体系的酶活力为：1.46u
·
ml-1
，亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1的载酶微球稳定的pickering乳液体系的酶活力为：10.98u
·
ml-1
，是双向体系的7.52倍，亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1的载酶微球稳定的pickering乳液体系的酶活力为：11.94u
·
ml-1
，是双相体系的8.18倍。
81.实施例4
82.一种由亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1制备的载酶微球稳定pickering乳液体系制备生物柴油的方法，包括以下步骤：
83.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中加入6mg疏水二氧化硅纳米粒子(亲水/疏水二氧化硅纳米粒子的质量比为99:1)，将分散液均匀混合；
84.步骤2：向步骤1所得混合液中加入1.4ml脂肪酶液与0.6ml磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)，均匀混合；
85.步骤3：向步骤2所得混合液中快速加入30ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机转速为12000rpm的条件下乳化均质1min；
86.步骤4：将步骤3所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃下以6000rpm的转速离心5min。沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1的载酶微球；
87.步骤5：将2g的月桂酸溶于8ml的正辛烷中作为油相，1.614ml甲醇分散至2ml的磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)中作为水相；
88.步骤6：将步骤4制备的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1载酶微球以2wt.％(占油水两相质量比)的添加量加入到步骤5所述的双相反应体系中，手摇(100次每分钟)2min使其分离的两相体系形成pickering乳液体系；
89.步骤7：将步骤6中的pickering乳液反应体系置于旋转培养器上，在40rpm转速下进行反应；
90.步骤8：每隔1h提取100μl油相样品，在5000rpm下离心1min破乳后，利用气相色谱对月桂酸甲酯的含量进行定量分析。
91.如图6所示，亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1制备载酶微球稳定的pickering乳液催化体系显示出比双相游离酶体系更高的催化效率；反应12h后，生物柴油得率为79.75％。
92.实施例5
93.一种由亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1制备的载酶微球稳定pickering乳液制备生物柴油的方法，包括以下步骤：
94.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中加入58mg疏水二氧化硅纳米粒子(亲水/疏水二氧化硅纳米粒子的质量比为9:1)，将分散液均匀混合；
95.步骤2：向步骤1所得混合液中加入1.4ml脂肪酶液与0.6ml磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)，均匀混合；
96.步骤3：向步骤2所得混合液中快速加入30ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机转速为12000rpm的条件下乳化均质1min；
97.步骤4：将步骤3所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃下以6000rpm的转速离心5min。沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1载酶微球；
98.步骤5：将2g的月桂酸溶于8ml的正辛烷中作为油相，1.614ml甲醇分散至2ml的磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)中作为水相；
99.步骤6：将步骤4制备的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1载酶微球以2wt.％(占油水两相质量比)的添加量加入到步骤5所述的双相反应体系中，手摇(100次每分钟)2min使其分离的两相体系形成pickering乳液体系；
100.步骤7：将步骤6中的pickering乳液反应体系置于旋转培养器上，在40rpm转速下进行反应；
101.步骤8：每隔1h提取100μl油相样品，在5000rpm下离心1min破乳后，利用气相色谱对月桂酸甲酯的含量进行定量分析。
102.如图7所示，由亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为9:1制备的载酶微球稳定的pickering乳液催化体系显示出最高的催化效率；反应12h后，生物柴油得率为84.27％。
103.实施例6
104.载酶微球的重复使用性能，包括以下步骤：
105.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中以99:1、9:1的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比加入疏水二氧化硅纳米粒子，将分散液均匀混合；
106.步骤2：向步骤1所得混合液中加入1.4ml脂肪酶液与0.6ml磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)，将所得混合液进行充分混合；
107.步骤3：向步骤2所得混合液中快速加入30ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机转速为12000rpm的条件下乳化均质1min；
108.步骤4：将步骤3所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃
下以6000rpm的转速离心5min。沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1、9:1的载酶微球。
109.步骤5：将2g的月桂酸溶于8ml的正辛烷中作为油相，1.614ml甲醇分散至2ml的磷酸盐缓冲液(0.05m，ph＝7.5)中作为水相；
110.步骤6：将步骤4制备的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比为99:1、9:1的载酶微球以2wt.％(占油水两相质量比)的添加量加入到步骤5所述的双相反应体系中，手摇(100次每分钟)2min使其分离的两相体系形成pickering乳液体系；
111.步骤7：将步骤5中的pickering乳液反应体系置于旋转培养器上，在40rpm转速下进行反应；
112.步骤8：反应8h后，在5000rpm下离心5min破乳，提取油相利用气相色谱对月桂酸甲酯的含量进行定量分析。
113.步骤9：回收水相和载酶微球，补充消耗的甲醇，向其中添加步骤5所述油相，重复步骤7和步骤8的操作10次。
114.如图8所示，10次循环使用过程中，两种载酶微球的催化活性均未出现明显降低，保持了对应初始酶活性的94％以上；10次循环后，生物柴油的得率均在80％以上。
115.实施例7
116.载酶微球的制备方法如下：
117.步骤1：向1ml的亲水二氧化硅纳米粒子分散液(40wt％)中以99:1，9:1的亲水/疏水二氧化硅纳米粒子质量比加入疏水二氧化硅纳米粒子，将分散液均匀混合；疏水二氧化硅纳米粒子粒径为12nm，由八甲基环四硅氧烷改性。亲水二氧化硅纳米颗粒粒径为22nm，无改性。
118.步骤2：向上述亲水/疏水二氧化硅纳米粒子分散液中加入0.2～1.8ml脂肪酶液与0.2～1.8ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.5)，将所得3ml混合液进行充分混合；
119.步骤3：所得混合液中快速加入0～50ml的正丁醇/三丁酸甘油酯，并在均质机转速为12000r/min的条件下乳化均质1～3min；
120.步骤4：所得乳化液置于4℃冰箱中静置自组装12h，通过冷冻离心机在4℃下以6000rpm的转速离心5min。沉淀经洗涤，冷冻干燥后即为载酶微球。
121.如图2所示，亲水/疏水性二氧化硅纳米粒子质量比为99:1、9:1的载酶微囊在乳液界面处由于不同的润湿性(三相接触角分别为91
°
、121
°
)具有不同的吸附状态，质量比为9:1时载酶微球更加偏向于油相，远离甲醇所在的水相，可有效的保护酶远离甲醇的灭活作用。
122.当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。