玉米miRNA在改变植物粗缩病抗性中的应用

玉米mirna在改变植物粗缩病抗性中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及玉米mirna在改变植物粗缩病抗性中的应用。


背景技术：

2.玉米粗缩病作为一种世界性玉米病害，在各地多有发生。玉米粗缩病会导致玉米的品质和产量下降，对玉米的危害较大，且该病一旦爆发难以得到有效的控制。玉米粗缩病已报到的病原有4种，分别是水稻黑条矮缩病毒(riceblack-streaked dwarf virus,rbsdv)、南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarfvirus,srbsdv)、玉米粗缩病毒(maize roughdwarf virus,mrdv)和里奥夸尔托病毒(mal derio cuarto virus,mrcv)。
3.玉米粗缩病不能通过蚜虫、蓟马、种子、土壤及汁液摩擦传播，该病主要由灰飞虱传播，灰飞虱取食带有粗缩病毒的小麦或其他禾本科植物，灰飞虱获毒后可终身带毒并传毒，灰飞虱有趋绿特性，小麦收获后向玉米迁移，获毒的灰飞虱取食玉米，从而使玉米植株感染粗缩病毒。玉米整个生育期都可感染粗缩病，苗期特别是5叶期前为敏感期，2叶1心时最易感病，播种早的夏玉米敏感期因为与灰飞虱重发期正好吻合而更容易感染此病。灰飞虱若虫或成虫在地边杂草下和田内麦苗下等处越冬，为翌年初侵染源。春季带毒的灰飞虱将病毒传播到返青的小麦上，以后由小麦和地边杂草等处再传到玉米上。此病发生很大程度上取决于灰飞虱田间数量和带毒个体的多少，不同品种之间发病程度有一定差异。
4.mirna为广泛存在于真核生物中大约21-24nt的非编码rnas，植物mirnas大多为靶向转录因子等调控蛋白，从而处于植物基因表达调控的中心位置。植物mirnas是目前国际研究的热点，在植物生长发育调节和病害防御中具有重要作用。病毒在侵染寄主植物的过程中能够诱导大量mirna产生，这些mirna在病毒侵染时上调或下调表达，通过抑制防卫反应中的负调控因子和促进防卫反应中的正调控因子来行使功能。
5.玉米粗缩病的发生受品种抗病性、介体灰飞虱数量、田间杂草数量、耕作制度以及气候条件等诸多因素的影响，所以此病害防治难度较大。目前，生产上主要采取以农业措施，如调整播期、加强田间管理等为主，药剂防治为辅的综合防治措施。但是上述防治措施存在费工费时、易造成环境污染且防治效果差等不足，培育和种植抗病品种是防治玉米粗缩病的有效途径。
6.因此需要深入解析其抗病分子机制，进而为抗病品种的培育及遗传机理的解析奠定基础。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种mirna在调控玉米粗缩病抗性中的应用，以期解决现有技术中的玉米种质资源无法满足当前玉米生产需要的技术问题。
8.本发明对rbsdv侵染的玉米进行了mirna、降解组和转录组联合分析，发现一种玉
米mirna是参与玉米粗缩病调控的重要因子。该mirna与玉米抗粗缩病相关。
9.具体地，本发明的技术方案如下：
10.第一方面，本发明提供一种玉米mirna、或含有所述玉米mirna的前体序列的生物材料在改变植物粗缩病抗性中的应用，所述玉米mirna的前体序列如seq id no.1所示。
11.第二方面，本发明提供一种玉米mirna、或含有所述玉米mirna的前体序列的生物材料在选育抗粗缩病性能改变的转基因植物中的应用，所述玉米mirna的前体序列如seq id no.1所示。
12.第三方面，本发明提供一种玉米mirna、或含有所述玉米mirna的前体序列的生物材料在植物抗粗缩病种质资源改良中的应用，所述玉米mirna的前体序列如seq id no.1所示。
13.本发明中，所述玉米mirna的成熟序列具有如seq id no.2所示的序列。
14.所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
15.所述植物为玉米。
16.第四方面，本发明提供一种改变植物抗粗缩病性能的方法，其通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制植物对玉米mirna的表达，所述玉米mirna的成熟序列如seq id no.2所示。
17.所述控制植物对玉米mirna的表达指使所述玉米mirna在植物中过表达或抑制表达；所述植物优选为玉米。
18.所述转基因包括利用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述玉米mirna的前体序列的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系，所述玉米mirna的前体序列如seq id no.1所示。
19.所述转基因包括利用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含抑制所述玉米mirna表达的序列的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系，所述玉米mirna的成熟序列如seq id no.2所示，所述抑制所述玉米mirna表达的序列通过模拟靶标技术获得。
20.本发明的有益效果至少在于：
21.1.本发明首次研究发现了一种玉米mirna的表达水平与玉米对粗缩病的抗性呈现正相关，即该mirna表达量与发病程度呈负相关。
22.2.本发明为探索创制玉米抗粗缩病新材料提供了新的途径，为后续研究奠定了遗传材料基础，为抗玉米粗缩病基因资源储备提供了良好的信息平台。
23.3.本发明推动了玉米抗粗缩病遗传机理和抗病分子育种研究，为增强玉米的粗缩病抗性的分子生物学机制研究提供可靠的材料和数据支撑。
附图说明
24.图1是本发明实施例2提供的拟南芥组织特异性gus染色图，图中椭圆形标注区域显示的为染色部位。
25.图2是本发明实施例3提供的过表达载体pcub-oe的检测电泳结果，m为2000的maker，w为水，p为阳性对照，n为阴性对照，1-4为重组农杆菌阳性质粒。
26.图3是本发明实施例4提供的过表达转基因后代t2代植株检测结果图，m为2000的
maker，w为水，p为阳性对照，n为阴性对照，1-21为转基因阳性株系。
27.图4是本发明实施例5提供的抑制表达载体pcub-mim的检测电泳图，m为2000的maker，w为水，p为阳性对照，n为阴性对照，1-4为重组农杆菌阳性质粒。
28.图5是本发明实施例6提供的抑制表达t2代转基因株系的检测结果图，m为2000的maker，w为水，p为阳性对照，n为阴性对照，1-21为转基因阳性株系。
29.图6本发明实施例7提供的转基因阳性株系t2代人工接种鉴定图。
30.图7是本发明实施例7提供的转基因阳性株系t2代人工接种鉴定株高分析图。其中b104代表接种粗缩病的受体自交系。
31.图8是本发明实施例7提供的过表达mirna前体序列和抑制表达mirna后代株系接种处理下玉米粗缩病病毒在叶片中的表达量图。
32.图9是本发明实施例7提供的过表达mirna和抑制表达mirna后代株系接种处理下mirna在叶片中的表达量图。
具体实施方式
33.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
34.下述实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.实施例1本发明mirna侧翼序列分析
36.在ncbi网站检索本发明mirna上游序列，为保证包含完全的启动子区序列，选择其上游2000bp左右的序列(如seq id no.4所示)在plantcare网站进行启动子预测和分析，结果显示，mirna上游含有典型的真核生物启动子核心原件tata-box(238-241bp)和caat-box(510-513bp)等，顺式作用调控元件a-box(705-708bp)等。同时在启动子区域存在多个光反应元件atct-motif(1495-1504bp)、sp1(1820-1825bp)等。
37.实施例2重组质粒pcambia1301-pro转化
38.以ecorⅰ酶和ncoⅰ酶(neb)对pcambia1301载体进行切割，将mirna启动子(如seq id no.4所示)插入到pcambia1301载体(购自擎科生物有限公司)，目的基因启动子完全取代35s启动子。采用蘸花法将重组质粒pcambia1301-pro转入拟南芥中。收获的t0代拟南芥种子，点播种植于含有1％潮霉素浓度的ms固体培养基中进行筛选，转基因拟南芥具有潮霉素抗性，正常生长，未转化成功的拟南芥则枯黄萎蔫。将两周后仍正常生长的拟南芥幼苗通过gus染色液进行染色，显微镜观察染色部位，结果如(图1)所示，经过多次重复，发现gus蛋白均在拟南芥叶片中有表达。结果表明，本发明mirna驱动目标基因在植物叶片中表达。
39.实施例3过表达载体的构建及检测
40.以自交系b73总dna为模板，以ttctttctcttctt(seq id no.5)，ccgcttggccatgc(seq id no.6)为引物，扩增mirna的前体序列(如seq id no.1所示，其成熟序列如seq id no.2所示)，将mirna的前体序列连接到的pcub载体上(莫乔程，2012，玉米漆酶zmlac5基因拟南芥遗转转化，第2页第3段)，利用bamhi酶切位点，将mirna的前体序列插入到pcub载体
上的启动子和终止子之间。具体将pcub空载体用bamhi单酶切，胶回收pcub载体片段，进行同源重组把目的片段连接到载体上，进行转化，挑单斑，测序，采用热激法将过表达载体质粒pcub-oe转化农杆菌eha105感受态细胞，挑取重组农杆菌单菌落扩繁，提取质粒dna进行pcr鉴定。结果参见图2，其表明，重组农杆菌质粒中均能扩增出约250bp的目的片段，而阴性对照和水则无该特异条带，证明靶基因过表达载体质粒已成功转入农杆菌中，可以用于下步对玉米的遗传转化。
41.实施例4过表达转基因t2代株系检测
42.采用农杆菌侵染幼胚法转化玉米自交系b104，繁殖得到t2代株系。以ctab法提取上述获得的玉米转基因植株t2代两叶期叶片总dna。根据启动子加目的基因加终止子序列设计特异引物(gcgctatattttgtttt，seq id no.7；acatattcatagtt，seq id no.8)，以野生型玉米b104两叶期叶片dna为阴性对照，质粒dna为阳性对照，进行pcr检测。参见图3，阳性转基因植株和质粒均能够扩增出842bp的启动子加目的基因加终止子片段，阴性对照和水对照未见扩增条带。
43.实施例5抑制表达载体的构建及检测
44.采用模拟靶标技术，将靶基因上与mirna结合的区域通过设计特定引物进行重叠pcr扩增得到mim目的片段，将mim序列(如seq id no.3所示)连接到的pcub(莫乔程，2012，玉米漆酶zmlac5基因拟南芥遗转转化，第2页第3段)载体上，利用bamhi酶切位点，将mim序列插入到pcub载体上的启动子和终止子之间。具体将pcub空载体用bamhi单酶切，胶回收pcub载体片段，进行同源重组把目的片段连接到载体上，进行转化，挑单斑，测序，采用热激法将抑制表达载体质粒pcub-mim转化农杆菌eha105感受态细胞，挑取重组农杆菌单菌落扩繁，提取质粒dna进行pcr鉴定。结果如图4所示，其表明，重组农杆菌质粒中均能扩增出约700bp的目的片段，而阴性对照和水则无该特异条带，证明抑制表达载体质粒已成功转入农杆菌中，可以用于下一步对玉米的遗传转化。
45.实施例6抑制表达转基因t2代株系检测
46.采用农杆菌侵染幼胚法转化玉米自交系b104，繁殖得到t2代株系。以ctab法提取上述获得的玉米转基因植株t2代两叶期叶片总dna。根据启动子加目的基因加终止子序列设计特异引物(seq id no.7-8)，以野生型玉米b104两叶期叶片dna为阴性对照，质粒dna为阳性对照，进行pcr检测。结果见图5，阳性转基因植株和质粒均能够扩增出194bp的启动子加目的基因加终止子基因片段，阴性对照和水对照未见扩增条带。
47.实施例7转基因株系中mirna的时空表达模式分析
48.(1)转基因阳性株系人工接种鉴定
49.采用网箱接种的方法进行粗缩病人工接种。首先将玉米b104和转基因株系种子播种到育苗穴盘中，每个穴盘共有72个孔(12穴
×
6穴)，单粒播种，将其置于无灰飞虱的地方培养，生长至两叶一心期进行接种。接种时将穴盘裁剪后放置于集装箱中(70cm
×
50cm
×
50cm)，培土至穴盘之间无缝隙，每个集装箱加盖80目防虫网。根据人工培养灰飞虱的带毒率(本实施例中为30％)，按照每株1头带毒灰飞虱的比例，计算各接种箱中需要加入的带毒灰飞虱数量(灰飞虱数量＝幼苗数量
×
1/灰飞虱带毒率)，使用接种转移器将带毒灰飞虱按照计算的数量均匀的转移到玉米苗上，各组相应的对照组未接种。接种后封好接种箱口，置于室内。在室温条件下接种2d。接种期间，定期对接种箱内灰飞虱进行惊扰，促其迁飞，增加
接种效率。接种结束后，打开防虫网，拿出穴盘，喷洒杀虫剂终止灰飞虱传毒。将玉米幼苗置于无灰飞虱室外，炼苗2d后，移栽到大田生长。待至其生长60d后，对每一个单株进行抗病性鉴定，每份材料检测40株，结果表明过表达株系(过表达t2代)和抑制表达株系(抑制表达t2代)株高均低于未接种植株(ck)，过表达株系株高高于抑制表达株系，过表达株系病级指数为3级(株高约为健康植株1/2)，抑制株系病级指数为4级(株高约为健康植株1/3)，受体自交系b104病级指数为4级(株高约为健康植株1/3)，且抑制株系株高低于受体自交系b104，过表达株系株高高于受体自交系b104(参见图6、图7，图中横坐标第一个ck代表接种粗缩病的受体自交系b104的对照组，第二个ck代表接种粗缩病的过表达株系的对照组，第三个ck代表接种粗缩病的抑制表达株系的对照组)。
50.(2)过表达和抑制表达转基因阳性株系中病毒表达分析
51.从放入带毒灰飞虱开始起，在接种的第5d、14d、28d后，分别采集b104、过表达和抑制表达20株转基因株系叶片，根据rbsdv病毒序列设计引物(tgtgcgttgcgactcagaaa，seq id no.9；gctgtctcttgatgtcccagt，seq id no.10)，进行qrt-pcr检测病毒表达情况。结果参见图8，粗缩病接种后，病毒在受体自交系b104、过表达转基因株系和抑制表达转基因株系的表达均呈现出不断升高的趋势，峰值出现的时间点相同，均在接种后28天；接种后5、14、28天b104株系病毒表达量分别为20.256、45.456和59.552，接种后5、14、28天抑制表达转基因株系病毒表达量分别为31.595、71.156和79.497，接种后5、14、28天过表达转基因株系病毒表达量分别为7.034、25.057和33.395。过表达转基因株系病毒表达量低于抑制表达转基因株系和受体自交系b104，抑制表达转基因株系病毒表达量高于受体自交系b104。
52.(3)过表达和抑制表达转基因阳性株系中mirna表达分析
53.从放入带毒灰飞虱开始起，在接种的第5d、14d、28d后，分别采集b104、过表达和抑制表达20株转基因株系叶片，设计特异性引物(cagcgtgtctttctcttctttc，seq id no.11；agcagggtccgaggtattc，seq id no.12)，进行qrt-pcr检测mirna表达情况。结果参见图9，b104植株株系中mirna在取样后5、14、28天表达量分别为1.356、1.468、1.298；过表达株系中过表达-1分别为2.055、2.560、1.630；过表达-2分别为2.560、2.894、2.14；过表达-3分别为1.982、2.354、1.489；抑制表达株系中抑制表达-1中mirna在取样后5、14、28天表达量分别为0.801、1.094、0.550；抑制表达-2分别为0.562、0.896、0.354；抑制表达-3分别为0.789、0.912、0.364。各株系中均出现先上升后下降的趋势，峰值出现在处理后14d；过表达转基因株系在3个时间点表达量均显著高于受体自交系b104和抑制表达转基因株系(p＜0.05)。
54.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。