一种CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法与流程

一种cd163基因猪源化小鼠模型的构建方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种cd163基因猪源化小鼠模型的构建方法。


背景技术：

2.近年来蔓延的非洲猪瘟疫情给我国生猪产业带来了严重的打击，是目前我国养猪业的“头号杀手”。非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)引起的一种猪烈性传染病，该病对全球养猪业带来了极大的困难和挑战。强毒株引发的超急性和急性感染致死率几乎高达100％。2018年8月，asf传入中国，目前在国内32个省份均有疫情爆发。
3.非洲猪瘟病毒(asfv)是一种独特的双链dna病毒，主要通过从口鼻黏膜进入扁桃体，以受体介导的“细胞内吞”方式进入细胞，复制后通过淋巴液、血液快速扩散至全身。免疫是猪抵抗asfv的第一道屏障。单核细胞和巨噬细胞是asfv最主要的感染细胞，并且高度成熟的、细胞表达高水平的特定标记的巨噬细胞最容易感asfv。
4.cd163清道夫受体是猪巨噬细胞和单核细胞表面的一种受体，有研究提示表达了受体cd163、表面抗原4e9(猪cd107a或溶酶体相关的膜蛋白i)的巨噬细胞易受asfv感染。也有研究表明cd163受体是必要但不充分的asfv(例如高致病georgia 2007/1strain)感染条件，说明asfv的感染还需要其他的受体协助。此外，国内外已有多例针对cd163基因构建的基因敲除猪的报道，证明了该基因缺失的猪可以抵抗高致病的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染(pathogenic-porcine reproductive and respiratory syndrome virus，prrsv)，是介导prrsv感染最重要的受体。cd163基因修饰在体外和体内均能显著抑制prrsv复制，这些发现表明修饰cd163可能为抗prrsv治疗提供潜在的策略。
5.阻止流行性传染病扩散的最佳途径之一是接种有效疫苗，但是迄今全球还没有能对付它的有效疫苗。疫苗研发进展缓慢，是因为非洲猪瘟病毒本身结构复杂，具有多种免疫逃逸机制，且不会诱发产生中和抗体，科学家对用非洲猪瘟毒株激发保护性免疫反应的具体机制，尚不了解。疫苗是防控非洲猪瘟所不可或缺的，使用活病毒制造减毒疫苗，存在着微生物可能在整个猪群中持续存在，并导致不可接受的不良反应的风险。
6.疫苗药物研发和筛选实验需要在动物模型上进行评价，啮齿类动物作为应用最广泛的实验动物模型，因为体型小，生长繁育周期短，易操作，是最佳的实验动物模型之一，截止目前，尚无针对猪源cd163基因制备的小鼠模型。
7.crispr/cas9系统的基因编辑功能主要应用于多个物种的基因组打靶，将等位基因进行修饰(例如敲除、突变、敲入)操作，可快速高效的建立各种修饰模型，来研究基因功能或建立疾病模型，与传统的基于胚胎干细胞打靶技术制作的基因编辑小鼠模型相比，设计简单，操作方便，省去了复杂的打靶载体体外拼接的过程，以及胚胎干细胞的筛选与培养等工作，无论是模型的制作成本还是周期，都展现了极大的应用前景。虽然crispr/cas9基因编辑系统有很高的切割效率，已经普遍应用于基因敲除模型的建立，但是面临更为复杂
的基因修饰需求，例如较长片段的基因打靶时，随着敲入片段长度的增加，打靶的效率会明显降低。另外，含有donor重组片段的crispr/cas9体系直接在受精卵上进行显微操作时，donor片段除了会在靶位点进行重组，也有很大概率会随机整合到小鼠的基因组中，整合的位点随机，而且可能会出现高拷贝的敲入，受整合位点和拷贝数的影响，发生随机整合的小鼠可能会出现外源基因异位表达、非靶位点内源基因沉默或激活等非预期的表型，从而干扰实验的结果。因此，crispr/cas9体系的重组效率还有待进一步的摸索和优化，同时，如何在打靶时降低或避免donor的随机整合概率，以及提高随机整合的检出率，无疑给基因编辑工作者带来了系列的挑战。


技术实现要素：

8.发明目的：本发明通过crisrp/cas9基因修饰的方法，将猪的cd163基因替换了小鼠的cd163基因，制备了cd163猪源化小鼠模型，具有猪的功能性基因，对于猪源相关病毒的感染、入侵以及免疫等研究有十分重要的意义，将可能成为筛选评价非洲猪瘟、蓝耳病等相关的药物及诊断产品的理想动物模型，为控制疫情的发展带来新的思路和策略。
9.本发明所要解决的技术问题是提供了一种sgrna。
10.本发明还要解决的技术问题是提供了含有所述sgrna的表达盒、重组载体或细胞。
11.本发明还要解决的技术问题是提供了扩增或鉴定所述的sgrna、所述的表达盒、重组载体或细胞的引物对。
12.本发明还要解决的技术问题是提供了所述的sgrna、所述的表达盒、重组载体或细胞、所述的引物对在cd163基因编辑中的应用。
13.本发明还要解决的技术问题是提供了一种cd163基因猪源化小鼠模型的构建方法。
14.本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定cd163基因猪源化小鼠的方法。
15.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明提供了sgrna，其具有：
16.(i)、如seq id no：1和/或seq id no：2所示的核苷酸序列；或
17.(ii)、如seq id no：1和/或seq id no：2所示的核苷酸序列的互补序列；或
18.(iii)、与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的序列；或
19.(iv)、与(i)或(ii)或(iii)所述序列至少有70％同源性的序列。
20.本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的sgrna。
21.其中，所述重组载体为puc57kan-t7-delg-sgrna。
22.本发明内容还包括扩增或鉴定所述的sgrna、所述的表达盒、重组载体或细胞的引物对。
23.其中，所述所述引物对序列如seq id no：3和seq id no：4所示；或/和seq id no：5和seq id no：6所示。
24.本发明内容还包括所述的sgrna、所述的表达盒、重组载体或细胞、所述的引物对在cd163基因编辑中的应用。
25.本发明内容还包括一种打靶载体，所述打靶载体包括如下元件：上游同源臂、猪源cd163基因、stop元件和下游同源臂，所述上游同源臂序列如seq id no：34所示，所述猪源
id no：32和seq id no：33所示。
44.本发明内容还包括所述的方法构建的模型小鼠在筛选或制备猪瘟或蓝耳病的药物及诊断产品中的应用。
45.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
46.1、本发明构建的cd163基因猪源化小鼠具有了猪的功能性基因，敲入的基因来自猪源cd163基因，敲入至小鼠的cd163基因位点，由于保留了小鼠自身的调控元件，因此利用小鼠自身的调控机制控制猪源cd163的表达，同时沉默了小鼠cd163基因，可以避免因物种氨基酸同源性关系带来的药物交叉反应。该模型具有猪的功能性基因，对于猪源相关病毒的感染、入侵、免疫及药物开发等研究有重要的指导意义。
47.2、本发明敲入的猪源基因序列长度为3330bp(seq id no:35)，为了调控猪源基因的转录，同时在猪源基因cds后敲入了长度为830bp的转录本终止元件“stop”(seq id no:37)，该元件含有3个拷贝的polya结构，以增强基因的转录调控功能，模型插入元件长度达4160bp。显微注射和移植后获得的小鼠后代，我们通过pcr和测序的检测手段，从119只f0代小鼠中成功筛选获得了2只阳性鼠。
48.3、本发明在通过pcr和测序的方法验证靶位点基因的正确整合的同时，也对中靶阳性的小鼠进行了qpcr检测，检测了小鼠基因组中存在其他位点整合的可能性，进一步验证了阳性小鼠为正确中靶，阳性小鼠其他非靶位点无随机插入。
附图说明
49.图1、pcd163猪源化小鼠模型策略图；
50.图2、1～44#f0代小鼠初筛鉴定pcr结果；代表positive control，pcr体系加入该项目打靶前的donor质粒作为positive control模板对照；wt：wt为c57bl/6j野生型，为阴性对照；n：n为negative空白对照；/：该泳道无样品；1～44：1～44#f0代小鼠；m：8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
51.图3、45～119#f0代小鼠初筛鉴定pcr结果；代表positive control，pcr体系加入该项目打靶前的donor质粒作为positive control模板对照；wt：wt为c57bl/6j野生型，为阴性对照；n：n为negative空白对照；/：该泳道无样品；45～119：45～119#f0代小鼠；m：8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
52.图4、f0代小鼠5’端pcr鉴定电泳图；p：代表positive control，pcr体系加入该项目打靶前的donor质粒作为positive control模板对照；wt：wt为c57bl/6j野生型，为阴性对照；n：n为negative空白对照；5’端和3’端pcr结果：14#，23#，26#，31#，40#中靶，发生重组。
53.图5、f0代小鼠3’端pcr鉴定电泳图；p：代表positive control，pcr体系加入该项目打靶前的donor质粒作为positive control模板对照；wt：wt为c57bl/6j野生型，为阴性对照；n：n为negative空白对照；
54.图6、f1代小鼠5’端pcr鉴定电泳图；
55.图7、f1代小鼠3’端pcr鉴定电泳图；
56.图8、f1代小鼠58#，59#内部pcr电泳图；m：8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
具体实施方式
57.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
58.实施例1 pcd163猪源化小鼠模型建立
59.我们使用同源重组与crispr/cas9技术在b6背景小鼠的受精卵上将猪的cd163基因替换为鼠的cd163基因，从而构建可以表达猪源cd163的小鼠模型，打靶策略见图1。
60.1、确定猪源片段替换区域及插入的猪源序列
61.根据猪源cd163的结构及功能，我们选取猪源cd163的cds和转录本终止元件polya插入至小鼠cd163的翻译起始密码子位点，插入的同时终止了小鼠cd163基因的转录和翻译。选取的猪源cd163基因氨基酸序列如seq id no:37所示，策略图见图1所示。
62.2、载体注射移植获得阳性鼠
63.1)选择小鼠cd163基因翻译起始密码子两侧作为打靶位点，设计包含猪源cd163基因的同源dna供体和鉴定方案；
64.2)基于crispr/cas9技术，制备cas9或其表达载体；在猪源化序列插入区域设计针对鼠源序列的sgrna。设计合成识别靶位点，并构建sgrna表达载体。sgrna识别位点位于小鼠cd163基因翻译起始密码子所在的exon上，sgrna在cd163上的靶位点序列见表1。将sgrna的dna序列克隆至puc57kan-t7-delg载体(将puc57的抗性由amp 改造为kana ，载体命名为puc57kan-t7-delg，其中，puc57来自genscript，货号sd1176)中，构建puc57-sgrna质粒。
65.表1 sgrna的dna序列
[0066][0067]
sgrna转录制备方法：以primerstar或primerstar max体系，sgrna-f、sgrna-r为引物，测序正确的puc57-sgrna质粒为模板进行pcr，pcr产物进行纯化，制备sgrna转录模板。使用t7-shortscript体外转录试剂盒(am1354)进行转录得到sgrna。
[0068]
表2 sgrna引物序列
[0069]
[0070]
sgrna筛选：分别将sgrna与cas9蛋白进行孵育后，将混合液注射至0.5天的受精卵中，培养至囊胚阶段后，进行小鼠cd163基因的ko阳性率的鉴定，以此筛选切割活性高的sgrna。
[0071]
sgrna切割鉴定方法：对收集的囊胚进行pcr扩增(pcr方案如下表3)，将扩增条带进行二代测序(测序引物：cd163-intf1)，与野生型(wt)条带比对，统计发生突变的概率(鉴定结果见下表3)。
[0072]
表3 sgrna切割pcr鉴定方案
[0073][0074]
表4 sgrna切割活性
[0075]
sgrna名称切割效率sgrna1(cd163-s1)87.0％sgrna2(cd163-s2)66.7％
[0076]
3)将cas9/sgrna系统(s1和s2分别打靶)及打靶载体注射至0.5天的小鼠受精卵中，移植至假孕雌鼠体内，等小鼠出生后，基因鉴定筛选出的中靶小鼠即阳性f0代小鼠。
[0077]
其中，打靶载体的构建方法如下：将上游同源臂(seq id no:34)、下游同源臂(seq id no:38)、合成的pcd163基因片段采用融合pcr的方式进行融合，融合后的产物与stop元件，pmd18t载体进行slic连接。体外连接并转化至大肠杆菌dh5α后，挑取单克隆进行pcr和酶切鉴定，连接成功的载体命名为dsdna-cd163-s1/s2；bstz171酶切dsdna-cd163-s1/s2，将产生两个条带分别为7098bp，3702bp，回收7092bp片段即为打靶载体。
[0078]
具体的，阳性f0代小鼠的筛选步骤为：
[0079]
a、将出生的f0代小鼠，提取尾巴dna，首先进行pcr初筛鉴定，pcr引物见表5，引物pcd163-ki-tf1/pcd163-ki-5tr1分别位于上游同源臂和猪源cd163 cds上，引物3stop-ki-3tf1/pcd163-ki-tr2分别位于外源stop元件和下游同源臂。若pcr产生预期大小的条带，则表明小鼠基因组有目标片段插入。pcr初筛鉴定结果见图2和图3。
[0080]
表5 f0代小鼠初筛鉴定pcr方案
[0081][0082]
备注：ki为中靶基因型；wt为野生型。
[0083]
从图2和图3中可以看出，初筛pcr结果：14#，23#，26#，31#，40#初筛为阳性。
[0084]
b、针对初筛阳性的小鼠，进一步鉴定5’端和3’端的重组，测序确认是否中靶。用5’端和3’端pcr引物进行中靶后的pcr鉴定(见表6)，引物pcd163-ki-5tf2/pcd163-ki-5tr2分别位于上游同源臂外及打靶载体的猪源片段内，3stop-ki-3tf1/pcd163-ki-3tr1分别位于
外源stop元件及下游同源臂外，如5’端和3’端pcr扩增产生与预期大小的pcr产物，且测序与理论序列一致，则表明目标片段在靶位点发生了重组。
[0085]
表6 cd163猪源化小鼠5端和3端基因型鉴定引物
[0086][0087]
备注：ki为中靶基因型；wt为野生型。
[0088]5’
端和3’端pcr鉴定结果见图4和图5，5’端和3’端pcr结果：14#，23#，26#，31#，40#中靶，发生重组。
[0089]
c、测序方案：测序方法采用回收5端和3端pcr产物，根据表7的测序方案对回收的pcr产物进行测序，测序正确的小鼠为阳性鼠。
[0090]
测序引物：pcd163-ki-5tf1，检测5端同源臂与基因组接头，测序引物：pcd163-ki-5tr1，检测猪源cds与同源臂接头，测序引物：pcd163-ki-3seqf1，检测3端同源臂与基因组接头；测序引物：pcd163-ki-3seqr1，检测stop与3端同源臂接头；
[0091]
表7 cd163猪源化小鼠5端和3端基因型测序方案
[0092][0093]
该测序结果为：23#，31#：5’端和3’端测序正确，即23#，31#为阳性f0代小鼠。
[0094]
4)选择得到的31#阳性f0代小鼠与野生型c57bl/6j小鼠配繁后出生的一窝小鼠
‑‑
f1代小鼠，一共有4只，编号为57～60#，出生的小鼠经过基因型鉴定，鉴定得到2只阳性小鼠，阳性小鼠编号是58#，59#，该阳性小鼠为可以稳定遗传的cd163猪源化小鼠动物模型。
[0095]
实施例2 f1代小鼠的基因型鉴定
[0096]
cd163猪源化小鼠5’端和3’端基因型鉴定，对实施例1步骤4)获得的f1代小鼠的鼠尾基因组dna分别使用两对引物进行中靶后的两端pcr鉴定(表6)，鉴定方案及鉴定引物和实施例1相同，引物pcd163-ki-5tf2/pcd163-ki-5tr2分别位于5’端同源臂外及打靶载体的猪源片段内，如该对引物扩增产生pcr产物，说明目标载体在小鼠基因组5’端进行了有效重组；3stop-ki-3tf1/pcd163-ki-3tr1分别位于打靶载体的外源片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生pcr产物，说明目标载体在小鼠基因组3’端进行了有效重组。图6和图7可以看出，pcd163鼠尾dna鉴定电泳图，电泳条带中第58号和第59号小鼠5’及3’鉴定有目的条带的均为阳性，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠，回收第58号和第59号小鼠的5’端和3’端的pcr产物，进一步测序确认(测序引物见表11)，测序正确的小鼠为初筛阳性鼠。
[0097]
实施例3 f1代小鼠内部序列鉴定
[0098]
对实施例2两端pcr初筛鉴定的第58号和第59号阳性小鼠，进一步进行内部序列的pcr扩增(图8和表10)及测序验证(表11)，pcr引物针对插入的外源序列设计，确定靶位点同源臂与基因组接头及敲入的外源基因序列全部正确，测序正确的小鼠经鉴定为阳性中靶小鼠。pcr反应条件和体系参考表8和表9。测序结果表明：第58号小鼠(58#)和第59号小鼠(59#)插入的cd163及stop元件正确，插入位点与同源臂的接头序列均正确，为阳性小鼠。
[0099]
表8 pcr反应体系
[0100]
试剂(vazyme p112-03)体积(μl)规格2
×
taq master mix，dye plus12.5\ddh2o9.5\primer a(10pmol/μl)110pmol/μlprimer b(10pmol/μl)110pmol/μltemplate(≈100ng/μl)1≈100ng/μl
[0101]
表9 pcr反应条件
[0102][0103]
表10 cd163猪源化小鼠内部鉴定引物
[0104][0105]
注：ki为中靶基因型；wt为野生型。
[0106]
表11 cd163猪源化小鼠内部测序方案
[0107][0108]
实施例4 qpcr检测鉴定
[0109]
qpcr检测：对于筛选到的58#和59#阳性中靶小鼠，提取小鼠尾巴dna，进一步使用表12的引物分别进行qpcr检测(表13和表14位反应体系和反应程序)，pcd163-5q-tf1/pcd163-5q-tr1设计在5’端同源臂，使用野生型小鼠作为对照，用于检测插入的外源打靶片段在基因组中的拷贝数，其中oimr3580和oimr1544引物产物作为内参，对qpcr数据进行校正，若小鼠拷贝数位于0.75～1.25之间，则说明无随机插入。
[0110]
表12 cd163猪源化小鼠qpcr方案
[0111][0112]
表13 qpcr反应体系表14qpcr反应程序
[0113][0114]
qpcr检测结果如表15和表16，b6-1和b6-2为两只c57bl/6j野生型对照。qpcr结果：58#和59#拷贝数与野生型一致，未检测到随机插入。
[0115]
表15
[0116]
校准数据样品号随机插入拷贝数0.8158#与野生型一致0.8759# 1.00b6-1野生型0.98b6-2野生型。