一种基于CRISPR-Cas13d敲低动物mRNA的方法及其应用与流程

一种基于crispr-cas13d敲低动物mrna的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于crispr-cas13d敲低动物mrna的方法及其应用。


背景技术：

2.crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是细菌和古细菌在自身长期的进化演变过程中形成的一种对外界遗传物质免疫的防御机制，其主要通过使用crispr rnas(crrna)引导核酸酶来抵抗外界核酸的入侵。crispr系统通过将入侵的噬菌体和质粒dna的片段整合到自身的crispr中，并利用相应的crispr rnas(crrna)来指导同源序列的断裂与降解，从而提供免疫防御。
3.cas13家族包括4种亚型(a-d)，它们的蛋白主要包括2种不同酶活性的核糖核酸酶：一种核糖核酸酶可以加工pre-crrna形成成熟的crrna，而另一种核糖核酸酶可以通过2个hepn(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding domain)结构域降解target-rna。其中，cas13d是最小的class 2 crispr cas13效应器，其源于动物消化道的革兰氏阳性微生物(瘤胃球菌属)，大小只有930个氨基酸(其它的cas13主要为1120-1250aa)。
4.近几年随着基因编辑技术的快速发展，crispr-cas9(type
ꢀⅱ
)和crispr-cas12a/cpf
ꢀⅰ
(type
ⅴ
)等dna编辑技术已经不仅停留在细菌和细胞层面，早已成为生物基因编辑的实用工具，包括成功应用于斑马鱼和小鼠以及各类动植物的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点敲除、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。
5.然而，随着cas13d各项特征和重要功能的发现，其优势也愈发突显，但也存在一些局限性，主要包括以下几种情况：首先，在功能上没有pfs(the protospacer flanking sequence)区，会选择性的打靶目的mrna的各个区域，无法随机选择mrna打靶位点；其次，其在对mrna剪切编辑的过程中没有反式切割效应对mrna打靶具有较高的特异性；最后，其仅有930aa的大小，远远小于其他cas13家族(1120-1250aa)的大小，摆脱了病毒载体包装运送大小的限制。这些使crispr-cas13d可以作为一种重要的mrna编辑工具，并可开发为生物mrna编辑的实用工具。
6.因此，目前亟待克服现有技术中的困难，实现mrna编辑技术在动物体内的突破，目的将crispr-cas13d体系转化为一种在动物体内发挥效用的实用性工具。这将极大的加快生物编辑技术在生物工程、生物治疗和现代医学的发展。


技术实现要素：

7.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于crispr-cas13d敲低动物mrna的方法及其应用，用于解决现有技术中crispr-cas13d编辑技术未能在动物体内实现对目的mrna编辑的问题。
8.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于crispr-cas13d编辑系统敲低动物mrna的方法，包括如下步骤：
9.a、通过动物密码子偏好性优化编码cas13d(crispr vi-d型)的目的基因序列并合成cas13d的目的质粒，将获得的cas13d质粒转录成mrna；
10.b、根据crrna的设计原则，选择动物的内源性基因，确定所述内源性基因转录后的mrna的打靶位点以及打靶序列，设计并合成内源性基因mrna的crrna序列；
11.c、将步骤a获得的cas13d mrna和步骤b获得的crrna显微共注射到所述动物的受精卵中，并进行培育，使crispr-cas13d编辑系统在动物体内通过crrna介导定向剪切目的靶mrna并进行敲低。
12.进一步，所述动物包括但不局限于鱼、鼠、兔、牛、羊；优选地，所述动物为斑马鱼，但不仅限于斑马鱼物种，也可以选择其他物种进行优化。
13.进一步，所述步骤a中，所述cas13d(crispr vi-d型)的目的基因序列从ncbi官网查找获得。
14.进一步，所述步骤a中，cas13d斑马鱼密码子优化后序列如seq id no.1所示。
15.进一步，所述步骤a中，将所述基因序列克隆到质粒载体上获得cas13d质粒，质粒载体外源性插入为cas13d基因序列。
16.进一步，所述步骤a中，所述质粒载体上还包括t7启动子、ori复制子和抗氨苄基因序列。
17.进一步，所述步骤a中，所述cas13d质粒的合成和转录方法包括如下步骤：
18.a1、利用限制性内切酶(xba
ꢀⅰ
)消化获得线性化cas13d质粒；
19.a2、利用t7 rna转录试剂盒对a1获得的线性化cas13d质粒进行体外转录，转录完成后，对获得的mrna进行纯化。
20.进一步，所述步骤a1中，利用限制性内切酶(xba
ꢀⅰ
)消化获得线性化cas13d质粒过程包括如下步骤：配制质粒酶切体系，所述质粒酶切体系包括限制性内切酶、cas13d质粒、限制性内切酶缓冲液；将质粒酶切体系混匀后瞬时离心，于37℃酶切3h，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化较亮的目的条带。
21.进一步，所述步骤a1中，所述质粒酶切体系包括：5μl限制性内切酶，10μl 0.5μg/μl cas13d质粒，5μl限制性内切酶缓冲液，30μl ddh2o，共50μl。
22.进一步，所述步骤a2包括如下步骤：配制转录反应体系，所述转录反应体系包括线性化cas13d质粒、t7 rna polymerase-plus酶混合物、转录缓冲液、ntp混合物；将转录反应体系混匀后置于pcr仪中37℃孵育3h，孵育完成后取样观察是否有rna条带；验证正确后向体系中加入dna酶，继续孵育15min；转录完成后，使用天根rna纯化试剂盒对获得的mrna进行纯化。
23.进一步，所述步骤a2中，所述转录反应体系包括：4μl 125ng/μl线性化cas13d质粒、2μl t7 rna polymerase-plus酶混合物，2μl转录缓冲液，10μl ntp混合物，2μl ddh2o，共20μl。
24.进一步，所述步骤b中，斑马鱼的内源性基因为ntl基因，打靶位点在ntl基因的第一个外显子前段，所述序列如seq id no.2所示。但根据需要，也可以选择其他目的基因的mrna序列作为打靶序列。
25.进一步，所述步骤b中，斑马鱼的打靶序列spacer为seq id no.3。但根据需要，也可以选择其他目的基因的spacer序列作为打靶序列。
26.进一步，所述步骤b中，crrna的合成过程中，将带有t7启动子的前引物和带打靶位点的后引物进行pcr结合扩增得到crrna前体dna，再对其转录得到目的crrna，所述crrna的序列如seq id no.4所示。
27.进一步，所述步骤b中，ntl crrna的正向引物序列为seq id no.5所示，反向引物序列为seq id no.6所示。
28.进一步，所述步骤b中，设计并合成内源性基因mrna的crrna序列包括如下步骤：
29.b1、合成crrna的模板dna：配制pcr反应体系，进行pcr反应，电泳检测pcr产物后，进行纯化；所述pcr反应体系包括正向引物、反向引物、dntp、pfudna聚合酶；
30.b2、转录合成crrna：以步骤b1合成的dna序列为反应模板，采用t7转录试剂盒转录为crrna，转录完成后，对获得的crrna进行纯化。
31.进一步，所述步骤b1中，所述pcr反应体系包括：4μl正向引物，4μl反向引物，4μl dntp，1μl pfudna聚合酶，5μl缓冲液，32μl ddh2o，共50μl。
32.进一步，所述步骤b1中，pcr反应条件为：95℃预变性3min，进入3步循环反应：95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共34个循环，然后72℃-10min，最后保温在16℃；
33.进一步，所述步骤b2包括如下步骤：配制转录反应体系，所述转录反应体系包括模板dna、ntp混合物、t7转录酶；将转录反应体系混匀后置于pcr仪中37℃孵育3h，孵育完成后取样观察是否有rna条带；验证正确后向体系中加入dnase
ꢀⅰ
酶，去除反应体系中的dna片段，继续孵育15min；转录完成后，使用天根rna纯化试剂盒对获得的crrna进行纯化。
34.进一步，所述步骤b2中，所述转录反应体系包括：2μl 100ng/μl模板dna，5μl ntp混合物，2μl t7转录酶，10μl转录缓冲液，31μl ddh2o，共50μl。
35.进一步，所述步骤c中，所述受精卵为1-细胞期受精卵。
36.进一步，所述步骤c中，通过实时荧光定量pcr检测来判断mrna的打靶效率、敲低情况及胚胎表型情况。
37.进一步，所述步骤c中，实时荧光定量pcr检测ntl基因表达的前引物如seq id no.8所示，后引物如seq id no.9所示。
38.进一步，所述步骤c中，将cas13d mrna、crrna与酚红混合后显微共注射到所述动物的受精卵中。
39.进一步，所述步骤c中，cas13d mrna、crrna的用量比为(2～3)：1，优选为2.5:1。
40.进一步，所述步骤c中，将cas13d mrna、crrna显微共注射到斑马鱼受精卵中，注射完成后置于26～28℃环境下进行培育。
41.本发明第二方面提供根据第一方面所述的方法培育获得的cas13d敲低内源性基因mrna的动物胚胎或成熟体。
42.本发明第三方面提供根据第一方面所述的方法在敲低动物mrna、mrna编辑领域、制备用于治疗人类及其他生物的基因早期表达疾病试剂盒中的应用。
43.本发明第四方面提供一种crispr-cas13d编辑系统的构建方法，所述crispr-cas13d编辑系统用于敲低动物mrna，所述构建方法包括以下步骤：
44.通过动物密码子偏好性优化编码cas13d(crispr vi-d型)的目的基因序列并合成cas13d的目的质粒，将获得的cas13d质粒转录成mrna。
45.进一步，所述动物包括但不局限于鱼、鼠、兔、牛、羊；优选地，所述动物为斑马鱼，
但不仅限于斑马鱼物种，也可以选择其他物种进行优化。
46.进一步，所述cas13d(crispr vi-d型)的目的基因序列从ncbi官网查找获得。
47.进一步，cas13d斑马鱼密码子优化后序列如seq id no.1所示。
48.进一步，将所述基因序列克隆到质粒载体上获得cas13d质粒，质粒载体外源性插入为cas13d基因序列。
49.进一步，所述质粒载体上还包括t7启动子、ori复制子和抗氨苄基因序列。
50.进一步，所述cas13d质粒的合成和转录方法包括如下步骤：
51.(1)、利用限制性内切酶(xbaⅰ)消化获得线性化cas13d质粒；
52.(2)、利用t7 rna转录试剂盒对a1获得的线性化cas13d质粒进行体外转录，转录完成后，对获得的mrna进行纯化。
53.进一步，所述步骤(1)中，利用限制性内切酶(xba
ꢀⅰ
)消化获得线性化cas13d质粒过程包括如下步骤：配制质粒酶切体系，所述质粒酶切体系包括限制性内切酶、cas13d质粒、限制性内切酶缓冲液；将质粒酶切体系混匀后瞬时离心，于37℃酶切3h，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化较亮的目的条带。
54.进一步，所述步骤(1)中，所述质粒酶切体系包括：5μl限制性内切酶，10μl 0.5μg/μl cas13d质粒，5μl限制性内切酶缓冲液，30μl ddh2o，共50μl。
55.进一步，所述步骤(2)包括如下步骤：配制转录反应体系，所述转录反应体系包括线性化cas13d质粒、t7 rna polymerase-plus酶混合物、转录缓冲液、ntp混合物；将转录反应体系混匀后置于pcr仪中37℃孵育3h，孵育完成后取样观察是否有rna条带；验证正确后向体系中加入dna酶，继续孵育15min；转录完成后，使用天根rna纯化试剂盒对获得的mrna进行纯化。
56.进一步，所述步骤(2)中，所述转录反应体系包括：4μl 125ng/μl线性化cas13d质粒、2μl t7 rna polymerase-plus酶混合物，2μl转录缓冲液，10μl ntp混合物，2μl ddh2o，共20μl。
57.本发明第五方面提供一种根据第二方面所述的方法构建得到的crispr-cas13d编辑系统。
58.本发明第六方面提供一种crrna序列，使第五方面所述的crispr-cas13d编辑系统在动物体内通过crrna介导定向剪切目的靶mrna并进行敲低，所述crrna的序列如seq id no.4所示。
59.本发明第八方面提供根据第六方面所述的crrna序列的构建方法，包括如下步骤：
60.将带有t7启动子的前引物和带打靶位点的后引物进行pcr结合扩增得到crrna前体dna，再对其转录得到目的crrna。
61.进一步，ntl crrna的正向引物序列为seq id no.5所示，反向引物序列为seq id no.6所示。
62.进一步，设计并合成内源性基因mrna的crrna序列包括如下步骤：
63.①
、合成crrna的模板dna：配制pcr反应体系，进行pcr反应，电泳检测pcr产物后，进行纯化；所述pcr反应体系包括正向引物、反向引物、dntp、pfudna聚合酶；
64.②
、转录合成crrna：以步骤b1合成的dna序列为反应模板，采用t7转录试剂盒转录为crrna，转录完成后，对获得的crrna进行纯化。
65.进一步，所述步骤
①
中，所述pcr反应体系包括：4μl正向引物，4μl反向引物，4μl dntp，1μl pfudna聚合酶，5μl缓冲液，32μl ddh2o，共50μl。
66.进一步，所述步骤
①
中，pcr反应条件为：95℃预变性3min，进入3步循环反应：95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共34个循环，然后72℃-10min，最后保温在16℃；
67.进一步，所述步骤
②
包括如下步骤：配制转录反应体系，所述转录反应体系包括模板dna、ntp混合物、t7转录酶；将转录反应体系混匀后置于pcr仪中37℃孵育3h，孵育完成后取样观察是否有rna条带；验证正确后向体系中加入dnase
ꢀⅰ
酶，去除反应体系中的dna片段，继续孵育15min；转录完成后，使用天根rna纯化试剂盒对获得的crrna进行纯化。
68.进一步，所述步骤
②
中，所述转录反应体系包括：2μl 100ng/μl模板dna，5μl ntp混合物，2μl t7转录酶，10μl转录缓冲液，31μl ddh2o，共50μl。
69.本发明第九方面提供根据第五方面所述的crispr-cas13d编辑系统以及根据第六方面所述的crrna序列在敲低动物mrna、mrna编辑领域、制备用于治疗人类及其他生物的基因早期表达疾病试剂盒中的应用。
70.如上所述，本发明的基于crispr-cas13d敲低动物mrna的方法及其应用，具有以下有益效果：
71.本发明提供了一种运用cas13d mrna和crrna显微共注射的技术，从而将动物靶mrna敲低的技术方法，通过运用crispr-cas13d编辑系统在动物体内通过crrna介导定向对靶mrna进行直接剪切敲低；本发明提供的技术摆脱了在mrna打靶过程中打靶位点的局限性，可随机选择mrna打靶位点；同时，在动物体内的打靶具有高度的特异性，排除了crispr编辑系统中的核糖核酸酶对非打靶位点的剪切与干扰；利用本发明的技术可以用于治疗人类及其他生物的基因早期表达疾病。
72.本发明克服了现有技术的困难，实现了mrna编辑技术在动物体内的突破，将crispr-cas13d体系转化为一种在动物体内发挥效用的实用性工具，将极大地加快生物编辑技术在生物工程、生物治疗和现代医学的发展。
附图说明
73.图1显示为本发明实施例中显微注射24hpf实验组和对照组ntl基因的mrna的表达量情况。
74.图2显示为本发明实施例中显微注射96hpf对照组斑马鱼的表型情况。
75.图3显示为本发明实施例中显微注射96hpf实验组斑马鱼的表型情况。
具体实施方式
76.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
77.本发明提出了将crrna介导的crispr-cas13d编辑技术在动物中实际应用以敲低动物mrna的技术方法，具体采用的实验动物为斑马鱼，但不仅限于斑马鱼物种，也可以选择其他物种进行优化，如鱼、鼠、兔、牛、羊等。
78.下面具体的例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
79.实施例1
80.一、cas13d基因质粒载体的合成和转录
81.在ncbi官网查找crispr vi-d型(cas13d)的目的基因序列，将获得的cas13d原始序列在不改变编码氨基酸的前提下进行斑马鱼密码子偏好性优化。cas13d斑马鱼密码子优化后的基因序列为：
82.atggctagcccgcctaagaaaaagcgcaaagtgggatccatgatcgagaagaagaagtccttcgccaaaggcatgggagtgaaaagcaccctggtgtctggaagcaaggtgtacatgaccaccttcgccgagggaagcgacgccagactggaaaagatcgtggaaggcgacagcatcagaagcgtgaacgagggcgaagctttcagcgccgagatggccgacaagaacgccggatacaagatcggaaacgccaagttctctcaccctaagggatacgccgtggtggctaacaaccctctgtacaccggacctgtgcagcaggacatgctgggactgaaagagacactcgagaagagatacttcggagagagcgccgacggaaacgacaacatctgcatccaagtgatccacaacatcctggacatcgagaaaatcctggccgagtacatcaccaacgccgcctacgccgtgaacaacatcagcggactggacaaggacatcatcggattcggaaagttcagcaccgtgtacacctacgacgagttcaaggaccctgagcaccacagagccgccttcaacaacaacgacaagctgatcaacgccatcaaggcccagtacgatgagttcgacaacttcctggataaccctcgcctgggctacttcggacaggccttcttcagcaaagagggacgcaactacatcatcaactacggcaacgagtgctacgacatcctggctctgctgtctggactgagacactgggtcgtgcataacaacgaggaagagagcagaatcagcagaacctggctgtacaacctggacaagaatctggacaacgagtatatcagcaccctgaactacctgtacgaccgcatcacaaacgagctgaccaacagcttcagcaagaacagcgccgccaacgtgaactatatcgccgagactctgggaatcaaccctgccgagttcgccgagcagtacttcagattcagcatcatgaaggaacagaagaacctgggcttcaacatcacaaagctgcgcgaagtgatgctggacagaaaggacatgagcgagatccgcaagaaccacaaggtgttcgactctatccgcaccaaagtgtacaccatgatggacttcgtgatctaccgctactacatcgaagaggacgccaaggtggccgctgccaacaaatctctgcctgacaacgagaagtctctgagcgagaaggacatcttcgtcatcaacctgagaggcagcttcaacgacgaccagaaggacgccctgtactacgatgaggccaacagaatctggcgcaagctcgagaacatcatgcacaacatcaaagagttccgcggcaacaagacccgcgagtacaagaagaaagacgcccctagactgcctagaatcctgcctgctggaagagatgtgtccgctttcagcaagctgatgtacgccctgaccatgttcctggacggaaaagagatcaacgacctgctgaccacactgatcaacaaattcgacaatatccagagcttcctgaaagtgatgcctctgatcggagtgaacgctaagttcgtggaagagtacgctttcttcaaggacagcgccaagatcgctgacgagctgagactgatcaagagcttcgctagaatgggagagcctatcgccgacgctagacgcgccatgtacatcgacgccatcagaatcctgggaacaaacctgtcttacgatgagctgaaggccctggccgacaccttcagcctggatgagaacggaaacaagctgaagaaaggcaagcacggaatgcggaactttatcatcaacaacgtgatcagcaacaagcgcttccactacctgatcagatacggcgaccctgctcatctgcacgagatcgccaaaaacgaggccgtggtcaagttcgtgctgggaagaatcgccgacatccagaagaagcagggacagaacggcaaaaaccagatcgatcgctactacgagacatgcatcggaaaggacaagggcaagagcgtgtccgagaaggtggacgctctgaccaagatcatcaccggaatgaactacgaccagttcgataagaaacgcagcgtgatcgaggacaccggaagagagaacgccgagagagagaagttcaagaagatcatctccctgtacctgaccgtcatctaccacatcctgaagaacatc
gtgaacatcaacgcccgctacgtgatcggattccactgcgtggaaagagatgcccagctgtacaaagagaagggctacgatatcaacctcaagaagctcgaggaaaagggcttcagcagcgtgaccaagctgtgcgccggaatcgatgagacagccccagacaagagaaaggacgtggaaaaagagatggctgagagagccaaagagagcatcgacagcctggaaagcgctaaccctaagctgtacgccaactatatcaagtacagcgacgagaagaaagccgaggaattcaccagacagatcaacagagagaaggccaagaccgctctgaacgcctacctgagaaacaccaagtggaatgtgatcatcagagaggacctgctgcgcatcgacaacaagacatgcaccctgttcagaaacaaggccgtgcacctggaagtggccagatacgtgcacgcctacatcaacgatatcgctgaagtgaacagctacttccagctctaccactatatcatgcagcgcatcatcatgaacgagcgctatgagaagtccagcggaaaggtgtccgagtacttcgacgctgtgaacgatgagaagaagtacaacgaccgcctgctgaaactgctgtgtgtgcctttcggatactgcatccccagattcaagaacctgagcatcgaggccctgttcgacagaaacgaggctgccaagtttgacaaagaaaaaaagaaagtgtccggcaacagccaccaccatcaccatcatcctaaaaagaagaggaaggtcgccagcctcgagtga(seq id n o.1)，目的基因cas13d由武汉金开瑞生物科技有限公司化学合成。
83.在得到优化的基因编码序列后，将其基因序列克隆到puv57质粒载体上，元件顺序为：t7 promter-cas13d-ori-amp-amp promoter。
84.具体操作步骤如下：
85.1、利用限制性内切酶(xba
ꢀⅰ
)消化获得线性化cas13d质粒，整个质粒酶切体系为50μl，按照表1所示的顺序依次加入各种试剂，用振荡器震荡混匀，瞬时离心，置于37℃水浴锅中酶切3h，对载体的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化较亮的目的条带。
86.表1.质粒酶切体系
87.试剂体积(μl)ddh2o3010
×
内切酶buffer5质粒10(5μg)酶5总计50
88.2、cas13d基因序列的体外转录
89.利用t7 rna转录试剂盒(mmessagekit,life technologies)对第一步获得的线性化cas13d质粒进行体外转录，整个反应体系为20μl，相关试剂按照表2所示的顺序进行逐步加入到无rna酶pcr管，混合后用震荡器轻微震荡混匀，瞬时离心后即可放入pcr仪进行转录实验。
90.表2.体外转录反应体系
91.[0092][0093]
将混合的50μl转录体系置于pcr仪中37℃孵育3h，到3h后取1μl进行琼脂糖凝胶电泳验证，观察是否有rna条带；验证正确后向体系中加入1μl dna酶，继续孵育15min。转录完成后，使用天根rna纯化试剂盒对获得的mrna进行纯化，测定mrna浓度后保存于无rna酶离心管中-80℃保存。
[0094]
二、crrna的设计和合成
[0095]
1、设计新的crrna序列
[0096]
根据crrna的设计原则，选取斑马鱼ntl基因作为打靶目的基因的mrna序列，设计的打靶位点在ntl的第一个外显子前段(外显子1)。
[0097]
外显子1：
[0098]
atgtctgcctcaagtcccgaccagcgcctggatcatctccttagcgccgtggagagcgaatttcagaagggcagcgagaaaggggacgcgtccgagcgggatattaaactttcgcttgaagacgcggagttgtggaccaaatttaaagagctcaccaatgaaatgattgtcaccaagactgggag(seq id no.2)；
[0099]
spacer sequence(5
’‑3’
)：caggcgcuggtcgggacuugaggca(seq id no.3)；
[0100]
crrna的完整序列为(5
’‑3’
)：
[0101]
cuugtuuucccctuccuuctggtcggggtttguuuccuggcgcuggtcgggacuugaggca(seq id no.4)；
[0102]
设计并合成crrna的引物，ntl crrna的dna引物序列为：
[0103]
forward primer(5
’‑3’
)：
[0104]
gaaattaatacgactcactatagggcaagtaaacccctaccaactggtcggggtttgaaa(seq id no.5)；
[0105]
reverse primer(5
’‑3’
)：
[0106]
tgcctcaagtcccgaccagcgcctggtttcaaaccccgaccagtt(seq id no.6)。
[0107]
ntl基因序列完整序列(标有波浪线的区域为外显子，分别为外显子1、2、3、4、5、6、7和8)(5
’‑3’
)：
[0108]
[0109][0110][0111]
2、合成crrna的模板dna
[0112]
将设计的forward primer和reverse primer进行pcr，pcr反应体系如表3所示：
[0113]
表3.pcr反应体系
[0114]
试剂体积(μl)ddh2o3210
×
buffer5forward primer4reverse primer4dntp4pfu dna polymerase1总计50
[0115]
pcr反应条件为：95℃预变性3min，进入3步循环反应(95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共34个循环)，然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测pcr产物后，进行纯化。
[0116]
3、转录合成ntl基因的打靶crrna。将上步中合成的dna序列作为反应模板转录为rna，用t7转录试剂盒进行体外转录，转录体系如表4所示：
[0117]
表4.转录反应体系
[0118]
试剂体积(μl)ddh2o315
×
transcription buffer10模板dna2(200ng)ntp mix(10
×
)5t7转录酶2总计50
[0119]
将上述反应混合液放入pcr仪中进行转录，37℃孵育3h，孵育完成后取1μl进行琼脂糖凝胶电泳验证。验证正确后，向crrna产物中加入dnaseⅰ酶，去除反应体系中的dna片段，在pcr仪中37℃孵育15min。
[0120]
rna的纯化(天根试剂盒tiangen rnaclean kit cat：#dp412)：在rna样品中加入rnase-free水，补足至100μl，加入350μl溶液rk，充分混匀。加入250μl无水乙醇，充分混匀，立即进行下一步。将上一步所得溶液和沉淀一起转入吸附柱cr2中，12000rpm离心30秒，弃掉收集管中的废液。向吸附柱cr2中加入500μl已加入乙醇的漂洗液rw，室温放置2min后，12000rpm离心30秒，弃废液，将cr2放入收集管中。12000rpm离心5min，去除残余液体。将吸附柱cr2转入一个新离心管中，加15μl rnase-free水，室温放置2min后，12000rpm离心2min，得到crrna，置于-80℃下保存。
[0121]
三、显微共注射斑马鱼受精卵
[0122]
1、斑马鱼受精胚胎的获得
[0123]
将性成熟的雌雄亲本斑马鱼以数量1:1的比例(雌雄各3尾)放入交配产卵盒中，用隔板隔离培养；交配产卵盒放置于26-28℃的恒温安静环境中黑暗过夜，光周期白昼：黑暗为14h：10h；第二天，待黑暗周期结束后，打开隔板，混合雌雄亲本斑马鱼，待亲鱼产卵10-15min分钟后，取出亲鱼，将聚集于产卵盒底部的受精卵吸出并顺序的排列于琼脂糖固定板上，待显微注射。
[0124]
2、cas13d与ntl显微共注射
[0125]
将转录的cas13d mrna、ntl crrna和酚红以200ng/μl，80ng/μl和5％的最终浓度
混合；然后共同注射入1-细胞期的斑马鱼受精卵胚胎；注射完成后，将获得的受精卵胚胎置于26～28℃的环境下发育。
[0126]
3、实时荧光定量pcr检测ntl基因mrna的表达。
[0127]
待被注射斑马鱼受精卵胚胎发育至24hpf，取对照组和实验组胚胎，各3组，每组30颗卵。提取3组斑马鱼卵的基因组rna，通过实时荧光定量pcr(realtime-pcr)来检测ntl的表达量变化情况，结果如图1所示(其中1为ab对照组，2-4为crrna组，5-7为mrna crrna组)。实时荧光定量pcr检测前引物为atgtctgcctcaagtcccga(seq id no.8)，后引物为caaaatccagcaggaccgag(seq id no.9)。根据图1结果可见，实验组显著敲低了ntl基因的表达量。
[0128]
4、ntl mrna敲低表型统计
[0129]
待显微注射的斑马鱼胚胎发育至3-4天后，统计各组全部胚胎的脊柱和尾巴的畸形情况，计算每组斑马鱼胚胎被敲低的表型率。根据图2和图3结果可见，实验组的畸形率显著高于对照组。
[0130]
表5.显微注射72hpf实验组和对照组发育表型的统计结果情况
[0131][0132]
综上所述，本发明是一种运用crispr-cas13d体系将动物mrna成功敲低的技术方法。它与传统的敲低mrna方法具有明显的区别：传统的敲低mrna方法使用不同的crispr-cas体系，其剪切效果具有打靶选择性和剪切非特异性；而本发明则排除了对基因mrna打靶位点的局限性，在打靶过程中不会产生非特异性的打靶效果，能够获得较高的mrna打靶效率。
[0133]
本发明的优势在于：1、首次将crispr-cas13d技术运用到动物体内实验过程；2、整个操作实施过程简单有效；3、本发明摆脱了在mrna打靶过程中打靶位点的局限性，可随机选择mrna打靶位点；4、本发明在动物体内的打靶具有高度的特异性，排除了crispr体系中的核糖核酸酶对非打靶位点的剪切与干扰；5、利用本发明的技术可以用于治疗人类及其他生物的基因早期表达疾病。
[0134]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。