一种安替比林半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

1.本发明涉及食品检测技术领域，更具体地，涉及一种安替比林半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.安替比林(antipyrine，ant)，又名非那宗，是一种临床用的非甾体解热镇痛抗炎药，属于吡唑酮类，主要通过抑制前列腺素的合成和释放而起到解热镇痛效果。用于发热头痛、关节痛、神经痛、痛经及活动性风湿症等。但长期或过量使用会引起血液系统异常，如粒细胞缺乏症、血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血等，还可能引起严重过敏反应，如重症药疹、过敏性休克等，严重可致胃肠、急性肾功能衰竭。近年来，不法商贩受利益驱使在凉茶中非法添加某些具有清热解毒功能的西药，其中安替比林常被不法商家非法添加在声称具有特效抗感冒的凉茶中，消费者在不知情的情况下大量或长期饮用，可能会出现重复或过量用药的情况，对人体的安全隐患大。《食品安全法》第三十八条明文规定：生产经营的食品中不得添加药品，但是可以添加按照传统既是食品又是中药材的物质。凉茶中非法添加安替比林的行为严重扰乱市场秩序和损害消费者的健康和知情权。因此，建立灵敏度高、特异性强、简便易行的凉茶中非法添加安替比林，是保障食品安全的重要技术支撑，对保障人民身体健康具有重要意义。
3.目前，在公开发表的凉茶中安替比林的检测方法主要是仪器分析方法，如高效液相色谱、气相色谱-质谱联用以及高效液相-质谱联用等。这些方法虽然准确性高、特异性强，但前处理复杂，检测成本高、时间长且依赖于专业的操作人员，不利于大规模样品的现场即时检测。相比较而言，免疫检测方法具有特异性强、操作简便、快速和成本低等特点，广泛应用于食品中有害物质的检测，能满足现场快速检测的监管需求。而免疫检测方法的建立，关键在于设计出合适的安替比林人工抗原并获得灵敏度高、特异性强的抗体，例如中国专利公开了一种安乃近代谢物检测用半抗原、抗原，但是利用其制备的抗体的检测灵敏度、检测限等性能均有待进一步提高，因此需开发可获得更高检测灵敏度、更低检测限的特异性抗体的安替比林半抗原和人工抗原。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种安替比林半抗原。
5.本发明的另一目的在于提供所述安替比林半抗原的制备方法。
6.本发明的再一目的在于提供所述安替比林半抗原的应用。
7.本发明的再一目的在于提供一种安替比林人工抗原。
8.本发明的再一目的在于提供所述安替比林人工抗原的应用。
9.本发明的再一目的在于提供一种安替比林抗体。
10.本发明的再一目的在于提供一种一种检测安替比林的试剂盒。
11.本发明的再一目的在于提供一种检测安替比林的免疫分析方法。
12.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
13.一种安替比林半抗原ant-ph，所述安替比林半抗原的结构式如式(i)所示：
[0014][0015]
所述半抗原ant-ph采用系统命名法命名为： 2-(4-(((1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1h-pyrazol-4-yl)amino)methyl)phenyl)acetic acid，即2-(4-(((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)氨基) 甲基)苯基)乙酸。
[0016]
所述安替比林半抗原的制备方法，是将4-氨基安替比林与2-(4-(溴甲基)苯基) 乙酸甲酯在碱性环境中进行反应，分离纯化反应物，于碱性环境中水解，即得式 (i)所示安替比林半抗原。
[0017]
所述4-氨基安替比林的结构式为：
[0018][0019]
所述2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸甲酯的结构式为：
[0020][0021]
作为一种优选地可实施方式，安替比林半抗原的制备方法：将4-氨基安替比林溶解于n,n-二甲基甲酰胺后，加入无水碳酸钾为整个反应体系维持提供一个碱性环境，再加入2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸甲酯加热至50℃冷凝回流反应4h；分离纯化后得到的反应产物经旋干后，分离纯化反应物，并将分离纯化的反应物溶解于甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后调节ph为 6～7，即得半抗原ant-ph。
[0022]
优选地，所述4-氨基安替比林与2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸甲酯的摩尔比为 1.1～2。
[0023]
进一步优选地，所述4-氨基安替比林与2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸甲酯的摩尔比为1:1.2。
[0024]
优选地，所述4-氨基安替比林与碳酸钾的摩尔比为1～1.5:4～6。
[0025]
进一步优选地，所述4-氨基安替比林与碳酸钾的摩尔比为1:4。
[0026]
优选地，所述氢氧化钠水溶液浓度为1mol/l。
[0027]
本发明还提供所述安替比林半抗原在制备安替比林人工抗原中的应用。
[0028]
一种安替比林人工抗原，所述安替比林人工抗原的结构式如式(ⅱ)所示：
[0029][0030]
其中，protein为载体蛋白。
[0031]
优选地，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，klh)、乳铁蛋白(lactoferrin，lf) 或鸡卵清白蛋白(ovalbumin，ova)。
[0032]
所述安替比林人工抗原的制备方法，是在式(i)所示安替比林半抗原的羧基偶联载体蛋白得到。
[0033]
优选地，所述偶联为通过活泼酯法。
[0034]
作为一种优选地可实施方式，所述安替比林人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0035]
(1)将ant-ph与n-羟基丁二酰亚胺(nhs)、1-(3-二甲氨基丙基)-3
‑ꢀ
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温下避光搅拌2～4h，得到ant-ph活化液；
[0036]
(2)将载体蛋白加入到pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中；
[0037]
(3)将步骤(1)的ant-ph活化液缓慢逐滴加入步骤(2)的载体蛋白缓冲溶液中，4℃反应12h；
[0038]
(4)用pbs缓冲液透析步骤(3)所得反应液，即得安替比林人工抗原。
[0039]
优选地，步骤(1)中所述ant-ph、nhs与edc的质量比为1～2:1～2:2～ 3。
[0040]
更优选地，步骤(1)中所述ant-ph、nhs与edc的质量比为1.3:1.6:2.5。
[0041]
优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与pbs缓冲液的质量体积比为5mg:2ml。
[0042]
优选地，步骤(1)中所述ant-ph与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为 1～5:3～8。
[0043]
更优选地，步骤(1)中所述ant-ph与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为1:4。
[0044]
本发明还提供所述安替比林人工抗原在制备安替比林抗体中的应用。
[0045]
一种安替比林抗体，是以上述任一所述安替比林人工抗原免疫动物制备得到。
[0046]
优选地，所述安替比林抗体是利用以载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)的安替比林人工抗原(ant-ph-bsa)免疫动物制备得到。
[0047]
进一步优选地，所述安替比林抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0048]
作为一种优选地可实施方式，安替比林多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
[0049]
(1)将制备好的ant-ph偶联牛血清白蛋白的人工抗原(ant-ph-bsa) 作为免疫原与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争elisa测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。
[0050]
(2)加强免疫一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm/min离心 15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体。
[0051]
由上述方法制备得到的安替比林多克隆抗体也在本发明的保护范围之内。
[0052]
所述安替比林抗体在检测安替比林和/或制备检测安替比林试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0053]
一种检测安替比林的试剂盒，包括所述安替比林人工抗原和所述安替比林人工抗原免疫动物制备得到的抗体。
[0054]
优选地，所述试剂盒包括以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(ova)的安替比林人工抗原(ant-ph-ova)和以载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)的安替比林人工抗原(ant-ph-bsa)免疫动物制备得到的抗体。
[0055]
优选地，所述试剂盒还包括酶标板、安替比林标准品、酶结合物、显色液、终止液或洗涤液中的一种或多种。
[0056]
进一步的优选地，所述试剂盒还包括所述安替比林人工抗原包被的酶标板、安替比林标准品溶液、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液。
[0057]
进一步优选地，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的安替比林抗体。
[0058]
更进一步优选地，所述抗体为以载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)的安替比林人工抗原(ant-ph-bsa)免疫动物得到的多克隆抗体。
[0059]
进一步优选地，所述试剂盒采用间接竞争elisa方法，在酶标板微孔条上预包被包被抗原，样本中残留的安替比林和酶标板微孔条上预包被的包被抗原竞争抗安替比林的酶结合物，用tmb底物显色，样本吸光度值与其所含残留物安替比林的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中安替比林的残留量。
[0060]
优选地，所述安替比林标准品溶液为8个浓度梯度，分别是1000μg/l，200 μg/l，40μg/l，8μg/l，1.6μg/l，0.32μg/l，0.064μg/l，0.0128μg/l。
[0061]
优选地，所述显色液由底物液a液和底物液b液组成，a液为过氧化氢或过氧化脲，b液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
[0062]
优选地，所述终止液为1～2mol/l的硫酸溶液。
[0063]
优选地，所述洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01％～0.03％叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液；所述百分比为重量体积百分比。
[0064]
优选地，上述酶标板的制备方法为：用包被缓冲液将包被原稀释成50μg/l，每孔加入100μl，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0065]
优选地，上述酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为ph值为9.6，0.05 mol/l的碳酸盐缓冲液；封闭液为ph值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～ 0.3mol/l的磷酸盐缓冲液；所述百分比为重量体积百分比。
[0066]
一种检测安替比林的免疫分析方法，以所述安替比林人工抗原为抗原，以所述安替比林抗体为检测抗体进行检测；所述免疫分析方法为非诊断治疗目的方法。
[0067]
优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(ova)的安替比林人工抗原 (ant-ph-ova)为包被原，以载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)的安替比林人工抗原(ant-ph-bsa)为免疫原免
疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0068]
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。
[0069]
一种安替比林胶体金快速检测试纸条，包括底板和依次排列在底板上上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述纤维素膜上印有隐形检测线和隐形质控线，所述隐形检测线采用包被抗原溶液印制，所述隐形质控线采用羊抗兔抗体印制；所述包被抗原为上述任一所述安替比林人工抗原。
[0070]
优选地，所述包被抗原为ant-ph-ova。
[0071]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0072]
本发明提供了一种新的安替比林半抗原，应用该半抗原制备得到了安替比林人工抗原，并进一步免疫动物制备得到用于检测安替比林的特异性抗体，所述抗体对安替比林具有良好的特异性和检测灵敏度，其对安替比林半抑制浓度为9.46 ng/ml，检测限为0.81ng/ml，定量检测范围为2.01～44.48ng/ml，对安乃近、保泰松、阿司匹林和布洛芬等其它结构及功能类似物无交叉反应，为建立特异性安替比林的免疫检测方法提供了核心原材料；建立了特异性和灵敏度更高的安替比林的免疫分析方法；此外，利用该多克隆抗体开发了一种检测安替比林残留的试剂盒，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
附图说明
[0073]
图1为本发明实施例1的安替比林半抗原(ant-ph)的合成路线图。
[0074]
图2为本技术实施例2的ant-ph、bsa、ant-ph-bsa紫外扫描图。
[0075]
图3为本技术实施例2的ant-ph、ova、ant-ph-ova紫外扫描图。
[0076]
图4为本技术实施例2的ant-ph、lf、ant-ph-lf紫外扫描图。
[0077]
图5为本技术实施例5的安替比林的抗体间接竞争elisa标准曲线。
[0078]
图6为本技术实施例8的安替比林胶体金快速检测试纸条的结构示意图；其中：1、pvc塑料底板；2、样品垫；3、硝酸纤维素膜(nc膜)；4、吸水垫；5、测试线；6、控制线。
[0079]
图7为本技术实施例8的安替比林胶体金快速检测试纸条的结果判定图；其中：a为阴性样品检测结果，b为阳性样品检测结果，c和d为试纸条失效。
具体实施方式
[0080]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0081]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0082]
实施例1安替比林半抗原的制备与鉴定
[0083]
1、安替比林半抗原ant-ph的制备
[0084]
将203mg(1mmol)4-氨基安替比林加入到50ml圆底烧瓶中，加入3mln,n-二甲基甲酰胺溶解，然后加入553mg(4mmol)无水碳酸钾为整个反应体系维持提供一个碱性环境，再加入206μl(1.2mmol)2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸甲酯加热至50℃冷凝回流反应4h。以tlc监控至反应完毕，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(3:1，v/v)。再通过硅胶柱层析纯化将得到反应
产物经纯化后，以超纯水与乙酸乙酯1:1进行萃取，酯层以旋蒸蒸发仪浓缩后，即得安替比林半抗原 (ant-ph)。ant-ph的合成路线图如图1所示。
[0085]
2、安替比林半抗原ant-ph的鉴定
[0086]
ant-ph的核磁共振氢谱结果：1h nmr(600mhz,methanol-d4)δ 9.57(d,1h),7.43-7.37(m,4h),7.33-7.28(m,4h),7.27-7.22(m,1h), 4.40(d,2h),4.00(q,j＝7.1hz,3h),3.21(p,j＝1.7hz,3h),2.11(s,3h)。
[0087]
ant-ph的质谱鉴定结果为：ms：c
20h21
n3o3：351.16，esi [m-h] :352.3。
[0088]
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，衍生位点正确且成功，说明本发明成功成了目标产物安替比林半抗原ant-ph，其结构式如式(i)所示：
[0089][0090]
半抗原ant-ph采用系统命名法命名为：2-(4-(((1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1h-pyrazol-4-yl)amino)methyl)phenyl)acetic acid，即2-(4-(((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)氨基) 甲基)苯基)乙酸。
[0091]
实施例2安替比林人工抗原的制备与鉴定
[0092]
1、安替比林人工抗原的制备
[0093]
将实施例1制备的安替比林半抗原(ant-ph)，通过活泼酯法分别偶联牛血清白蛋白(bsa)、鸡卵清白蛋白(ova)和乳铁蛋白(lf)，制备不同的人工抗原。
[0094]
(1)分别称取10mg实施例1制备的ant-ph，2mg的nhs和3mg的 edc溶解于50～100μl dmf中，室温下避光搅拌2～4h得到安替比林半抗原活化液；
[0095]
(2)分别称取15mg牛血清白蛋白(bsa)、鸡卵清白蛋白(ova)和乳铁蛋白(lf)加入到1ml的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中；
[0096]
(3)将步骤(1)所得安替比林半抗原活化液逐滴缓慢加入到步骤(2)所得载体蛋白缓冲溶液中，4℃搅拌12h；
[0097]
(4)用pbs缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后得到安替比林人工抗原(ant-ph-bsa、ant-ph-ova、ant-ph-lf)，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
[0098]
其中，磷酸盐缓冲溶液(pbs)的配方：na2hpo4·
12h2o 2.90g，nacl 8.50g， kcl 0.20g，kh2po
4 0.20g，加蒸馏水定容至1000ml。
[0099]
2、安替比林人工抗原的鉴定
[0100]
取上述合成的安替比林人工抗原(ant-ph-bsa、ant-ph-ova、 ant-ph-lf)，进行紫外全波长扫描，结果如图2、图3、图4所示。
[0101]
具体地，bsa、ant-ph、ant-ph-bsa分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现安替比林免疫原 ant-ph-bsa的吸收曲线与载体蛋白bsa明显不同，ant-ph在330nm处有一个特征峰，而偶联反应后，在230nm和280nm处，ant-ph-bsa的吸收峰明显比bsa高，且对比ant-ph的曲线可看出发生显著位移(图2)。由于
在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白 bsa与ant-ph的复合物，ant-ph-bsa偶联成功。
[0102]
具体地，ova、ant-ph、ant-ph-ova分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现安替比林人工抗原 ant-ph-ova的吸收曲线与载体蛋白ova明显不同，ant-ph在330nm处有一个特征峰，而偶联反应后，在230nm和280nm处，ant-ph-ova的吸收峰明显比ova高，且对比ant-ph的曲线可看出发生显著位移(图3)。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白ova与ant-ph的复合物，ant-ph-ova偶联成功。
[0103]
具体地，lf、ant-ph、ant-ph-lf分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现安替比林人工抗原 ant-ph-lf的吸收曲线与载体蛋白lf明显不同，ant-ph在330nm处有一个特征峰，而偶联反应后，在230nm和280nm处，ant-ph-lf的吸收峰明显比 lf高，且对比ant-ph的曲线可看出发生显著位移(图4)。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白lf与 ant-ph的复合物，ant-ph-lf偶联成功。
[0104]
实施例3抗体的制备
[0105]
1、多克隆抗体的制备
[0106]
将实施例2制备的ant-ph偶联牛血清白蛋白(bsa)的安替比林人工抗原ant-ph-bsa和ant-ph偶联乳铁蛋白(lf)的安替比林人工抗原ant-ph-lf 分别作为免疫原，与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争elisa测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。加强免疫一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm/min离心 15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化后得到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
[0107]
2、单克隆抗体的制备
[0108]
将实施例2制备的ant-ph偶联牛血清白蛋白bsa的安替比林人工抗原 ant-ph-bsa和ant-ph偶联乳铁蛋白lf的安替比林人工抗原ant-ph-lf分别作为免疫原，与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫巴比西小鼠，采用腹部皮下多点注射法免疫小鼠，每次加强免疫1周后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价，待抗体效价不再升高后，再进行一次加强免疫，7天后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合。采用hat培养基中筛选出杂交瘤细胞后用完全培养基进行细胞培养。用 ic-elisa方法对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，一周后再次检测、挑孔、再克隆。经3次克隆培养检测后，获得单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。腹水用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后得到单克隆抗体，-20℃冻存备用。
[0109]
实施例4安替比林免疫原和包被原的筛选
[0110]
分别利用实施例3的以ant-ph-bsa和ant-ph-lf作为免疫原免疫动物后得到的抗体，通过间接竞争elisa方法进行包被原的筛选，以实施例2制备得到的人工抗原ant-ph-bsa、ant-ph-lf和ant-ph-ova作为包被原；通过间接竞争elisa方法获得的血清效价和抑制率来选择最佳的免疫原和包被原。
[0111]
一种筛选安替比林免疫原和包被原的间接竞争elisa方法，包括以下步骤：
[0112]
(1)分别将实施例2制备的人工抗原ant-ph-bsa、ant-ph-ova和 ant-ph-lf作为包被原，用包被液稀释至1μg/ml，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃温育过夜(12h)；
[0113]
(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；
[0114]
(3)每孔加入120μl封闭液(即1％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
[0115]
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出；
[0116]
(5)用pbst将实施例3制备的安替比林多克隆抗体倍比稀释成七个梯度，即1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000，同时设置空白对照孔(用pbst代替)；并将安替比林药物稀释至1μg/ml；
[0117]
(6)效价列：每孔加50μl的pbst，再将倍比稀释得到抗体按每孔50μl 依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μl pbst代替；
[0118]
抑制列：每孔加50μl的药物，再将倍比稀释得到抗体按每孔50μl依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μl pbst代替；在37℃温育40min，洗涤 5次，拍干；
[0119]
(7)加入羊抗兔二抗-hrp(5000倍稀释)100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
[0120]
(8)加入显色液，每孔100μl，显色10min；
[0121]
(9)加入50μl 2mol/l的h2so4溶液终止反应，并在450nm处读取od 值。
[0122]
效价是od
450
为1.0左右所对应的抗体稀释倍数。
[0123]
抑制率＝(效价的od值-抑制的od值)/抑制的od值*100％。
[0124]
不同免疫原与包被原组合的血清效价和抑制率结果如表1所示。
[0125]
表1不同免疫原与包被原组合的血清效价和抑制率
[0126][0127]
从表1中可以看出，不同的安替比林人工抗原作为免疫原免疫的新西兰大白兔产生的抗体均有一定的效价；同时，所得抗体对目标分析物安替比林均有不同程度的抑制效果。其中，编号1的免疫原和包被原组合所示的效价1:256000和抑制率89.87％，高于编号2、3、4的免疫原和包被原组合的效价和抑制率，由此可以说明编号1的免疫原和包被原不仅能特异性识别目标分析物安替比林，而且抗体灵敏度好，故将ant-ph-bsa作为最佳的免疫原、ant-ph-ova作为最佳的包被原。
[0128]
实施例5安替比林的间接竞争elisa检测方法的建立
[0129]
1、实验方法
[0130]
一种检测安替比林的间接竞争elisa方法，包括以下步骤：
[0131]
(1)将实施例2制备的人工抗原ant-ph-ova作为包被原，用包被液稀释至50μg/l，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃温育过夜(12h)；
[0132]
(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；
[0133]
(3)每孔加入120μl封闭液(即1％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
[0134]
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出；
[0135]
(5)用pbst将实施例3制备的安替比林多克隆抗体稀释16000倍，并将安替比林标准品稀释至1000μg/l，200μg/l，40μg/l，8μg/l，1.6μg/l，0.32μg/l， 0.064μg/l，0.0128μg/l；
[0136]
(6)每行加50μl安替比林药物稀释液(三组平行)，再加入50μl/孔实施例3制备的安替比林多克隆抗体稀释液，在37℃温育40min，洗涤5次，拍干；
[0137]
(7)加入羊抗兔二抗-hrp(5000倍稀释)100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
[0138]
(8)加入显色液，每孔100μl，显色10min；
[0139]
(9)加入50μl 2mol/l的h2so4溶液终止反应，并在450nm处读取od 值。
[0140]
2、实验结果
[0141]
用于检测安替比林的抗体间接竞争elisa标准曲线如图5所示，从图5可知实施例3制备的安替比林多克隆抗体对安替比林的半抑制浓度ic
50
为9.46 ng/ml，定量检测线性范围ic
20
～ic
80
为2.01～44.48ng/ml，检测限为0.81ng/ml；说明本发明制备得到的用于检测安替比林的抗体可以满足检测要求，且对安替比林的识别能力高。
[0142]
实施例6用于检测安替比林的抗体的特异性评价
[0143]
1、实验方法
[0144]
将实施例5中的药物安替比林换成安乃近、保泰松、阿司匹林和布洛芬，并以同样的稀释倍数进行上述试验，测定实施例3制备的多克隆抗体对其他结构及功能类似物的交叉反应率。
[0145]
通过安替比林与其结构及功能类似物进行交叉反应实验来确定用于检测安替比林的特异性，其抗体的特异性用交叉反应率(cr)表示，交叉反应率越小，特异性越强。将安替比林结构及其功能类似物(安乃近、保泰松、阿司匹林和布洛芬)分别作倍比稀释，采用间接竞争elisa法进行测定，步骤同实施例5的灵敏度验证方法，得到各结构及功能类似物的ic
50
值，按照以下公式计算安替比林交叉反应率(cr)：
[0146]
cr(％)＝ic
50
(安替比林)/ic
50
(结构及功能类似物)
×
100％
[0147]
2、实验结果
[0148]
安替比林与其结构及功能类似物的交叉反应结果如表2所示。
[0149]
表2安替比林与其结构及功能类似物的交叉反应结果
[0150][0151]
注：nr表示无反应。
[0152]
从表2可知，用于检测安替比林的抗体对安乃近、保泰松、阿司匹林和布洛芬均无交叉反应；说明用于检测安替比林的实施例3制备的多克隆抗体对安替比林的特异性强，可有效地排除其结构及功能类似物(安乃近、保泰松、阿司匹林和布洛芬)对安替比林的干扰，能够专门用于对安替比林的检测。
[0153]
实施例7检测安替比林的elisa试剂盒的开发
[0154]
1、组建检测安替比林的试剂盒，所述试剂盒包含下述各部分：
[0155]
(1)包被有包被原的酶标板的制备：将实施例2制备的人工抗原 ant-ph-ova作为包被原，用包被缓冲液将包被原稀释成50μg/l，每孔加入100 μl，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；包被缓冲液为ph值为9.6，0.05mol/l的碳酸盐缓冲液，封闭液为ph值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液；
[0156]
(2)安替比林标准品溶液：8个浓度梯度，分别为1000μg/l，200μg/l，40 μg/l，8μg/l，1.6μg/l，0.32μg/l，0.064μg/l，0.0128μg/l；
[0157]
(3)实施例3制备的安替比林多克隆抗体；
[0158]
(4)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的实施例3制备的安替比林多克隆抗体；
[0159]
(5)底物显色液：由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺；
[0160]
(6)终止液为2mol/l的h2so4；
[0161]
(7)洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01％～0.03％叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0162]
2、实际样品检测
[0163]
将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按 1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样品50μl到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μl，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μl/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可食用未使用过的枪头戳破)。加入底物显色液a液50μl/孔，再加入底物显色液b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min.加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪与450nm处，测定每孔od值。
[0164]
3、检测结果分析
[0165]
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔) 除以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，再乘以100％。以标准品百分吸光率为纵坐标，以安替比林标准品浓度(μg/l)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中安替比林的实际浓度。
[0166]
实施例8安替比林胶体金快速检测试纸条的开发
[0167]
1、胶体金快速检测试纸条的组装
[0168]
如图6所示，胶体金快速检测试纸条是由硝酸纤维素膜(nc膜)3、样品垫2、吸水垫4和pvc塑料底板1叠加而成。具体来讲，用xyz三维喷点划膜仪将包被原(ant-ph-ova)和羊抗兔igg以0.8μl/cm的喷量喷涂在nc膜上，用作测试线5和控制线6(t线和c线)，两线位于nc膜3的中间并且彼此间隔6mm，37℃下干燥12h后，把纤维素膜3粘贴在衬板中间部位上，样品垫2 与nc膜t线5端重叠1mm，吸水垫4粘贴在纤维素膜3上侧和纤维素膜3重叠1mm，组装好的试纸板用斩切机切成3.05mm宽的试纸条。
[0169]
2、金标抗体的制备
[0170]
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备平均直径在30nm的胶体金悬浮液。取1ml胶体金溶液，加入0.2mol/l的k2co3溶液调节ph到8.0左右，加入10 μg抗体孵育30min，再加入10％bsa溶液孵育30min后在4℃10000rpm离心 20min，并去上清，用200μl 0.2mol/l ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液(包含0.5％吐温-20、0.5％bsa、5％蔗糖、0.3％pvp、0.03％procline-300)重悬，4℃保存。
[0171]
3、凉茶样品的检测
[0172]
(1)凉茶样品提取和净化
[0173]
吸取0.5ml凉茶，加入4.5ml 0.2mol/l ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液进行稀释，涡旋混合30s，作为待测液。
[0174]
(2)检测步骤
[0175]
取150μl样品待测液加入微孔中，加入5μl金标抗体反复吸打混合均匀，室温孵育5min，随后将试纸条插入微孔中反应3min，随后取出试纸条去除样品垫，进行结果判定。
[0176]
(3)检测结果判定
[0177]
如图7所示，如果样品中不含有待测物安替比林，则金标抗体与快速检测是纸条上测试线(t线)上的包被原结合，使测试线显示一条清晰的红色线即表示检测样品为阴性(如图7a)；如果样品中含有待测物安替比林，则安替比林与金标抗体进行结合而不能被快速检测试纸条上的测试线捕获，进而测试线不显色即表示为阳性(如图7b)；同样，金标抗体也与纤维素膜上的质控线(c线) 上的羊抗兔igg结合，使质控线显红色，质控线颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效(如图7a、b为有效c、d为无效)。3-5分钟判定检测结果。
[0178]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。