一种Rheb蛋白激活剂及其应用

一种rheb蛋白激活剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种rheb蛋白激活剂及其应用。


背景技术：

2.rheb是ras超家族的小gtp酶，有rheb-gdp和rheb-gtp两种形式，是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1，mtorc1)信号通路的上游正调控因子，与mtorc1信号通路共同调控着细胞生长、增殖和分化等过程。
3.gdp-gtp交换需要特定因子的参与，即：在gap催化下rheb-gtp水解为gdp形式，rheb-gdp可以被gef(鸟嘌呤核苷酸交换因子)重新激活，转变为gtp形式。目前已知tsc2作为rheb的gap(g蛋白调控因子)发挥功能，但目前并未发现已知rheb的gef。同时，目前也并未发现体内外可以直接靶向激活rheb的小分子药物或短肽药物。
4.rheb的gef是哪一类蛋白、其激活过程受什么调控，目前仍是有待解决的科学问题。由于rheb蛋白本身存在较弱的gtpase活性，因此在细胞中多数情况以gtp结合形式存在，这可能是rheb的gef不容易被发现的原因。同时，由于rheb与其gef的结合较为瞬时，因此，传统的检测蛋白互作的手段难以发现。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种rheb蛋白激活剂及其应用。本发明利用新型邻近标记技术筛选方法找到了atp6ap1蛋白作为rheb的gef(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，可以使得rheb-gdp重新被激活，转变为gtp形式，进而发挥疗效。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.第一目的，本发明提供了一种rheb蛋白激活剂，所述rheb蛋白激活剂为atp6ap1蛋白。
8.第二目的，本发明提供了atp6ap1蛋白作为靶向rheb蛋白激活剂的应用。
9.作为本发明所述应用的优选实施方式，采用atp6ap1蛋白的c末端30个氨基酸激活rheb蛋白，30个氨基酸的序列如seq id no:1所示。
10.本发明人经过大量的实验，筛选得到atp6ap1蛋白可以作为rheb的潜在gef，atp6ap1蛋白的c末端30个氨基酸(tyglhmilslktmdrfddhkgptisltqiv)可以直接在体内外激活rheb，作为直接靶向激活rheb的激活剂使用。
11.第三目的，本发明提供了一种筛选rheb蛋白激活剂的方法，包括以下步骤：
12.1)构建生物素连接酶与rheb融合表达载体，将载体转入宿主细胞内，药物筛选稳定表达rheb蛋白的细胞株，同时构建对照细胞株；
13.2)向稳定表达rheb蛋白的细胞株中加入胰岛素和生物素进行刺激，向对照细胞株中加入生物素刺激，然后进行质谱检测，分析蛋白；
14.3)在有/无进行胰岛素刺激条件下，分别将稳定表达rheb蛋白的细胞株中的富集蛋白扣除(扣除表示为将两组数据中重叠的蛋白去掉，以达到去除对照组干扰的目的)对照
细胞株中的富集蛋白，获得有/无进行胰岛素刺激条件下的rheb邻近蛋白，分析rheb邻近蛋白，经鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件，得atp6ap1蛋白。
15.更优选地，鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件包括以下条件：
16.(1)gef(鸟嘌呤核苷酸交换因子)与rheb存在体内外相互作用；
17.(2)过表达gef后可以激活mtorc1下游信号通路；
18.(3)敲低或敲除gef后，mtorc1下游信号通路活性受到大幅度抑制；
19.(4)体外实验证明gef可以直接促进rheb完成gdp-gtp转换过程。
20.本发明通过新型邻近标记技术筛选得到rheb蛋白激活剂-atp6ap1蛋白，atp6ap1蛋白的c末端30个氨基酸可以直接靶向激活rheb，具有较大的药用价值，尤其在糖尿病领域具有更佳的药用价值。
21.作为本发明所述方法的优选实施方式，胰岛素的浓度为0.1nm-10μm，生物素的浓度为50μm-500μm。
22.胰岛素和生物素采用上述浓度为细胞株在正常发挥功能下的较低浓度，更为符合生理状态。
23.更优选地，胰岛素的浓度为0.9μm，生物素的浓度为50μm。
24.作为本发明所述方法的优选实施方式，刺激的时间为10-20min。
25.gef蛋白与rheb的相互作用是较为瞬时的，刺激时间超过20min可能会导致一些负反馈现象的发生，不能准确捕捉到gef蛋白。
26.作为本发明所述方法的优选实施方式，所述生物素连接酶包括生物素连接酶xxid，生物素连接酶与rheb融合表达载体为haflag-xxid-rheb。本发明中提到的生物素连接酶不仅限于本发明，还可以为本领域中常规使用的生物素连接酶。
27.优选地，稳定表达rheb蛋白的细胞株为hela-xxid-rheb稳定表达细胞株，对照细胞株为hela-xxid稳定表达细胞株。
28.更优选地，宿主细胞包括hela细胞，还可以为其他细胞。
29.第四目的，本发明提供了一种蛋白质药物组合物，包含atp6ap1蛋白。
30.第五目的，本发明提供了上述rheb蛋白激活剂或蛋白质药物组合物在制备激活rheb而预防和/或治疗糖尿病药物中的用途。
31.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32.本发明提供了一种rheb蛋白激活剂及其应用，本发明利用新型邻近标记技术筛选得到rheb蛋白激活剂-atp6ap1蛋白作为rheb的gef(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，atp6ap1蛋白的c末端30个氨基酸可以直接靶向激活rheb，使得rheb-gdp转变为gtp形式，进而发挥疗效，筛选出的atp6ap1蛋白具有较大的药用价值，尤其在治疗糖尿病领域具有更佳的药用价值，同时相比于其他小分子激活剂，小肽激活剂的特异性较高。
附图说明
33.图1为hela-xxid-rheb稳定表达细胞株和hela-xxid稳定表达细胞株构建过程图及质谱检测图；
34.图2为实施例1中come/go/stay组的差异倍数分析图；
35.图3为atp6ap1蛋白与rheb存在体内外相互作用示意图；
36.图4为过表达atp6ap1蛋白激活mtorc1下游信号通路示意图；
37.图5为敲低或敲除atp6ap1蛋白，mtorc1下游信号通路活性示意图；
38.图6为体外实验证明atp6ap1蛋白可以直接促进rheb完成gdp-gtp转换过程的结果图。
具体实施方式
39.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
40.在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.实施例1、一种筛选rheb蛋白激活剂的方法
42.一种筛选rheb蛋白激活剂的方法，包括以下步骤：
43.1)构建生物素连接酶(xxid)与rheb融合表达载体(haflag-xxid-rheb)，将载体转入hela细胞内，药物筛选hela-xxid-rheb稳定表达细胞株，同时构建对照细胞系hela-xxid稳定表达细胞株，利用含10％透析血清培养基培养；实验前16小时，使用无血清培养基培养，规避胰岛素的干扰。
44.2)然后向hela-xxid-rheb稳定表达细胞株中加入胰岛素(0.9μm)和生物素(50μm)进行刺激，刺激15min，向hela-xxid稳定表达细胞株中加入生物素(50μm)刺激，不加入胰岛素，刺激15min，对样品进行裂解，提取蛋白后，利用链霉亲和素下拉，富集生物素化的蛋白，对链霉亲和磁珠进行还原烷基化，胰酶酶解，脱盐，最后将样品真空干燥后干粉保存，进行质谱检测(如图1所示)，分析蛋白。
45.3)在有/无进行胰岛素刺激条件下，分别将hela-xxid-rheb稳定表达细胞株中的富集蛋白扣除hela-xxid稳定表达细胞株中的富集蛋白，获得有/无进行胰岛素刺激条件下的rheb邻近蛋白，将这部分富集蛋白(rheb邻近蛋白)进一步分析，可分为come/go/stay组，即刺激后出现蛋白组/刺激前后稳定存在组/刺激后离开蛋白组(如图2所示)，come组包括atp6ap1蛋白、reeps蛋白、sc22b蛋白，go组包括vamp3蛋白、scd蛋白，stay组包括rab7a蛋白、tsc1蛋白，由于gef蛋白应该在胰岛素刺激后出现，因此将come组蛋白作为gef候选蛋白进行验证。
46.4)对质谱表单的候选蛋白进行验证，rheb的gef候选蛋白需满足以下条件：
47.(1)gef(鸟嘌呤核苷酸交换因子)与rheb存在体内外相互作用；
48.(2)过表达gef后可以激活mtorc1下游信号通路；
49.(3)敲低或敲除gef后，mtorc1下游信号通路活性受到大幅度抑制；
50.(4)体外实验证明gef可以直接促进rheb完成gdp-gtp转换过程。
51.通过筛选，发现atp6ap1蛋白(c末端30个氨基酸，tyglhmilslktmdrfddhkgptisltqiv)可以很好的满足上述条件(结果示意图如图3-图6所示)，证明atp6ap1蛋白是rheb的潜在gef。
52.参考图3为atp6ap1蛋白与rheb存在体内外相互作用示意图；通过免疫共沉淀实验，分别在体内/体外证明atp6ap1/c tail与rheb的存在相互作用，体外实验证明二者存在直接相互作用。体内实验是将atp6ap1-sfb/c tail-sfb和gst-rheb在293t细胞中过表达，
通过flag ip后，利用gst抗体检测是否与rheb存在相互作用。体外实验是将体外纯化的gst-rheb蛋白与c tail短肽进行gst下拉实验，证明gst-rheb与c tail存在直接相互作用。
53.图4为过表达atp6ap1蛋白激活mtorc1下游信号通路示意图；通过在hela细胞中，分别过表达atp6ap1-sfb与c tail-sfb，检测mtorc1信号通路是否被激活，可以看到相比于对照组gfp，过表达atp6ap1和c tail均能明显激活mtorc1下游信号通路。
54.图5为敲低或敲除atp6ap1蛋白，mtorc1下游信号通路活性示意图；在hela细胞中，敲低atp6ap1后，检测对mtorc1下游信号通路的影响，发现会抑制mtorc1下游信号通路。
55.图6为体外实验证明atp6ap1蛋白可以直接促进rheb完成gdp-gtp转换过程的结果图。
56.本发明利用新型邻近标记技术筛选得到rheb蛋白激活剂-atp6ap1蛋白作为rheb的gef(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，atp6ap1蛋白的c末端30个氨基酸可以直接靶向激活rheb，使得rheb-gdp转变为gtp形式，进而发挥疗效，筛选出的atp6ap1蛋白具有较大的药用价值，尤其在糖尿病领域具有更佳的药用价值。
57.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。