一种新链霉菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新链霉菌及其应用。


背景技术：

2.链霉菌(streptomyces)为具有丝状分枝菌丝的革兰阳性菌，具有复杂形态分化周期和强大的次级代谢能力，能够产生许多具有生物活性的代谢产物，是一类具有巨大经济和实用价值的微生物资源，在农业、食品以及医药等领域具有重要的价值。目前已报道的链霉菌有千余种，有的链霉菌能产生多种抗生素，还有一些种类能产生维生素、有机酸、生物碱、酶等。
3.由于链霉菌属中的不同种之间存在生理特性和功能上的差异，使得链霉菌在各个领域中被广泛应用。链霉菌属中被发现的种也已经有千余种，在此基础上重新发现一个新的种存在较大的难度。因此，本发明提供一种链霉菌新种，对于链霉菌的进一步应用是具有重要意义的。


技术实现要素：

4.鉴于现有技术的不足，本发明提供一种新链霉菌及其应用。
5.本发明技术方案主要包括以下内容：
6.本发明采集海南鹦哥岭热带雨林根际土壤，并通过分离纯化得到一株新的链霉菌，将其命名为链霉菌yhg
‑
1(streptomyces sp.nov.yhg
‑
1)，并于2021年1月4日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021007，保藏地址为中国
·
武汉
·
武汉大学。通过对链霉菌yhg
‑
1进行酶学特性测定，发现其可产生酯酶、淀粉酶和明胶酶，说明链霉菌yhg
‑
1在酯酶、淀粉酶和/或明胶酶生产方面具有良好的应用前景。
7.若需对链霉菌yhg
‑
1进行培养，可将其在含有氮源、碳源和/或氯化钠的条件下培养，培养温度为25～30℃，ph为5～8。
8.优选的，所述氮源包括：组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、甘氨酸、半胖氨酸、缬氨酸、酪氨酸和/或硝酸铵。
9.优选的，所述碳源包括：α
‑
乳糖、d
‑
纤维二糖、d
‑
果糖、d
‑
半乳糖、d
‑
葡萄糖、d
‑
甘露糖、d
‑
山梨醇、d
‑
海藻糖、l
‑
阿拉伯糖、l
‑
苯丙氨酸、棉子糖、蜜二糖、木聚糖、d
‑
甘露醇、肌醇、松三糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、可溶性淀粉和/或蔗糖。
10.优选的，氯化钠的质量浓度不高于7％。
11.另一方面，本发明还发现链霉菌yhg
‑
1对水稻稻瘟病菌存在一定的抑制作用，提示链霉菌yhg
‑
1在防治水稻稻瘟病方面具有良好的应用前景。
12.本发明所取得的效果：
13.本发明提供的链霉菌yhg
‑
1可产生酯酶、淀粉酶和明胶酶，说明其在酶制剂产业具有一定的应用前景。
14.本发明提供的链霉菌yhg
‑
1可利用组氨酸等8种氮源及α
‑
乳糖等21种碳源，说明该
链霉菌具有良好的碳源和氮源的利用能力。
15.本发明提供的链霉菌yhg
‑
1可在高盐条件下生长，在含有7％氯化钠的培养基中仍能正常生长。
16.本发明提供的链霉菌yhg
‑
1对水稻稻瘟病菌具有良好的抑制作用。
附图说明
17.图1为链霉菌新种yhg
‑
1在扫描电镜下菌丝体(a)和孢子(b)形态。
18.图2为链霉菌新种yhg
‑
1在isp2
‑
isp7培养基中的形态特征。
19.图3为基于16s rdna序列构建的菌株yhg
‑
1与相关菌株的系统发育树。
20.图4链霉菌yhg
‑
1的全基因组圈图。
21.图5菌株yhg
‑
1的全基因组ani比对。
具体实施方式
22.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
23.实施例1链霉菌新种yhg
‑
1的分离与鉴定
24.1实验材料
25.1.1供试土壤
26.采集海南省鹦哥岭热带雨林根际土壤，置于无菌封口袋中混匀、封口，于冰盒中保存。采集回来后，去除根系、石块等杂物，于冰箱4℃保存备用。
27.1.2供试培养基
28.本实验的供试培养基包括了分离培养基、培养特征观察的培养基、生理生化的培养基和发酵培养基等(徐丽华，2007；黄小龙，2009)。
29.表1放线菌的分离培养基及其配方
30.[0031][0032]
表2培养特征观察培养基及其配方
[0033][0034]
[0035]
表3生理生化特性观察所需的培养基
[0036][0037]
表4发酵培养基及其配方
[0038]
[0039][0040]
1.3本实验使用的试剂与仪器设备
[0041]
(1)主要试剂
[0042]
表5主要生化试剂及来源
[0043][0044]
(2)仪器与设备
[0045]
表6仪器与设备
[0046]
[0047][0048]
2实验方法
[0049]
2.1根际土壤放线菌的分离及鉴定
[0050]
2.1.1根际土壤放线菌的分离及纯化
[0051]
称取1g的土样溶于10ml的无菌水中，常温条件下置于180r/min的摇床培养20min，制成悬浮液。取其上清液采用10倍稀释法进行稀释处理，配制成10
‑1、10
‑2和10
‑3的土壤悬液，分别吸取0.1ml的悬液涂布至分离培养基上，28℃倒置培养2
‑
4周，每个梯度设3个重复，挑取不同的单菌落并釆用划线法在ye培养基上进行反复纯化。
[0052]
2.1.2拮抗菌的筛选
[0053]
采用平板对峙培养法(孙建波，2010)：使用直径为5mm的打孔器取已接种5d、长势一致的foc4病菌边缘的菌饼，并将其接置每个pda平板的中央，同时距病原菌菌落中央的 2.5cm处接种待测菌，每皿接种4个供试菌株，以只接种病菌的培养作为对照，置于28℃的培养箱中倒置培养7d后，观察结果。
[0054]
2.1.3拮抗菌株的培养特征观察
[0055]
通过参照国际链霉菌规划中关于放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基进行培养特征的观察(cui bs，2008)。将拮抗放线菌接种于isp2、isp3、isp4、isp5、isp6、isp7培养基上，于28℃培养7
‑
21d后，分别观察并记录菌株在各培养基上的培养特征，包括菌落的形态、气生菌丝的产生、孢子的颜色以及基内菌丝的颜色等方面的特征。
[0056]
2.1.4扫描电镜观察
[0057]
将盖玻片用0.05g/l浓度的重铬酸钾浸泡，使用酒精浸泡洗脱，再用超纯水进行冲洗，吹干，121℃灭菌20分钟。将灭菌的盖玻片以45
°
插在接有放线菌菌株的高氏一号培养基上， 28℃培养7
‑
10天。送至检测中心进行扫描电镜的观察，将长有菌的盖玻片样品置于真
空镀膜机内进行喷金镀膜，利用扫描电镜观察菌株的菌丝和孢子表面的细微结构。
[0058]
2.1.5生理生化特性测定
[0059]
参照shirking(1966)和徐丽华等(2007)的方法对菌株进行生理生化鉴定，主要有以下方面。
[0060]
(1)酶学特性的测定
[0061]
①
脲酶实验：
[0062]
将菌株接种于脲酶培养基上，在28℃条件下培养4d后，观察培养基是否变色。测试供试菌株产生尿素酶的能力，培养基变成桃红色为阳性，不变色则为阴性。
[0063]
②
酯酶(吐温20、吐温80)实验：
[0064]
划线接种至酯酶培养基上，培养1
‑
2周，每天观察。如在其生长的周围有模糊的晕圈则为阳性，没有晕圈则为阴性。
[0065]
③
淀粉水解：
[0066]
以营养琼脂为基本培养基，添加1.0％的可溶性淀粉。将供试菌株接种于平板上，采用点接法(接种直径不要超过5mm)，待菌株生长达到良好时，在菌落周围滴加碘液进行检测。若菌株周围产生透明圈，则说明有淀粉酶的产生，圈的大小表示淀粉酶活性的强弱；如不产淀粉酶，则呈蓝色。
[0067]
④
明胶液化：
[0068]
将菌株接种于明胶培养基的表面，无需刺穿培养基，再28℃下培养，并分别在第5d、 10d、20d和30d观察培养基的液化程度。观察前需将试管进行冷却20
‑
30min或用自来水进行冲洗30min，才可以观察培养基的液化程度。
[0069]
⑤
纤维素分解：
[0070]
将滤纸条的一端浸没在液体培养基当中，经灭菌后，将待测菌株接种在液面以上的滤纸片上，一个月后观察滤纸条是否被分解。
[0071]
⑥
硝酸盐还原：
[0072]
待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置28℃下培养7、14d，以不接菌的培养基为对照。在试管中分别加入少许培养了7d、14d的培养液，滴加一滴a液和b液，对照同样滴加。当溶液变成粉红、玫瑰红、橙色或棕色等，为硝酸盐还原阳性；若无红色出现时，滴加 1或2滴二苯胺试剂，若呈蓝色，则还原作用为阴性；若不为蓝色，则仍按阳性对待。
[0073]
(2)单一碳源利用实验
[0074]
在放线菌鉴定当中，其重要的考察指标之一就是对碳源的利用情况，不同放线菌对糖、醇、有机酸、脂肪酸等的碳源利用能力各有不同。试验所选用的碳源：d
‑
果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、松三糖、无水乳糖、d
‑
半乳糖、α
‑
乳糖、d
‑
海藻糖、d
‑
甘露糖、d
‑ꢀ
核糖、肌醇、山梨醇、甘露醇、水杨苷、可溶性淀粉等，按1％碳源浓度加入到普戈二氏的基础培养基中。并接入待测菌株，28℃下恒温培养7
‑
14d，以不添加任何碳源的基础培养基接种的菌株作为空白对照，观察菌株的生长情况。若能生长，则表明该菌种能利用这种碳源；若不能生长，则表明该菌种不能利用此碳源。
[0075]
(3)单一氮源利用实验
[0076]
试验所选用的氮源：组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、草氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、苯基丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、精氨酸、缬氨酸、四水合钼酸铵、乙酸铵、硝酸铵、硫酸铵等，按0.5％
的浓度加入基础培养基中。接入菌种，28℃下恒温培养7
‑
14d，以不添加任何氮源的基础培养基接种的菌株作为空白对照，观察菌株的生长情况。若能生长，则表明该菌种能利用这种氮源；若不能生长，则表明该菌种不能利用此氮源。
[0077]
(4)其他的一些生理生化指标的测定
[0078]
①
温度耐受实验：
[0079]
将待测菌株接种于相同的培养基后，在其他培养条件均一致的情况下，分别在20℃、 24℃、28℃、32℃、36℃下培养7
‑
14d，观察并记录菌落的生长情况，从而确定菌株生长的最适温度。
[0080]
②
ph耐受实验：
[0081]
在ph值为4、5、6、7、8、9、10的液体培养基内分别接种待测菌株，保证其他的培养条件一致，在28℃下培养，每隔一周都进行一次观察，一直观察到四周为止。每次观察并记录菌株生长情况，以确定菌株生长的最适ph。
[0082]
③
盐耐受性实验：
[0083]
将待测菌株分别接种在不同浓度的nacl(1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％) 培养基上，培养基的其它营养成分均相同，在28℃条件下培养，7天为一个观察周期，观察4周，记录其是否能生长，以确定该菌株能耐受nacl的上、下限浓度。
[0084]
④
硫化氢的产生实验：
[0085]
将待测菌株接种于含有一定比例铵离子的硫化氢培养基上，在28℃条件下培养2周，如培养基呈现黑色，则有硫化氢的产生；无黑色，则无硫化氢的产生。
[0086]
2.1.6拮抗菌株分子生物学鉴定
[0087]
(1)放线菌基因组dna的提取
[0088]
采用bioteke的细菌基因组dna快速提取试剂盒(dp1301，北京百泰克生物技术有限公司，中国)进行总dna的提取。
[0089]
(2)16s rdna的测序及分析
[0090]
①
16s rdna的pcr扩增：
[0091]
以放线菌基因组dna为模板，采用通用引物27f和1492r进行pcr的扩增。引物序列如下：上游引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
)、下游引物1492r(5
’‑
tacggctaccttgttacgactt
‑3’
)。具体反应体系见表7，反应程序(周俊萍，2014；郝菲菲，2015； na yua，2014)见表8。
[0092]
表7 16s rdna基因的pcr反应体系
[0093][0094]
表8 16s rdna基因的pcr扩增反应条件
[0095][0096]
②
pcr产物的电泳检测：
[0097]
pcr反应结束后，取5μl的pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上对菌株pcr产物进行电泳检测，根据目的片段的长度大小确定是否连接成功。
[0098]
③
测序及构建系统发育树：
[0099]
将菌株的pcr产物送至华大基因公司进行序列的测定。将测得的基因序列使用blast 软件进行序列的对比，并与genbank和ezbiocloud数据库中已知的16s rdna进行同源性的比较。找出同源性较高的序列进行多重匹配排列分析，采用mega5.1软件以邻接法 (neighbor
‑
joining)进行聚类的分析和系统发育树的构建(na yua，2014；jianghua，2015)。
[0100]
(3)菌株全基因组分析
[0101]
细菌基因组数据分析交由美吉生物有限公司进行，具体方法为：利用目前使用最广泛的二代测序平台illumina hiseq
×
10平台，对质检合格的dna样品插入400bp的片段，进行pe150 (pair
‑
end)测序，即双端测序，单端测序读长150bp，每个样品提供不低于基因组100
×
覆盖深度的原始测序数据量(raw data)。利用短序列组装软件soapdenovo2 (http://soap.genomics.org.cn/)对二代测序后的优化序列进行多个kmer参数的拼接，得到最优的contigs组装结果，然后把reads比对到contig上，根据reads的paired
‑
end和overlap 关系，对组装结果进行局部组装和优化，形成scaffolds，组装完成之后皆可获得gc含量、测序深度等基本数据。
[0102]
(4)菌株基因组ani比对
[0103]
细菌ani比对值是目前细菌定种的关键数据，因此在获得16s rrna系统进化树和菌株基因组信息的基础上，通过16s rrna系统进化树确定与待测菌株亲缘关系最近的菌种，并在登陆genbank或者ezbiocloud数据库下载最近亲缘关系菌种的全基因组数据，通过 https://www.ezbiocloud.net/网站的ani calculator比对工具，进行基因组比对。若比对结果<95％的阈值，可以判定为新种。
[0104]
3结果与分析
[0105]
3.1放线菌的筛选及形态学特征
[0106]
经平板涂布分离并划线纯化的菌株，根据其在纯化培养基上的菌落形态及颜色去重，并经过平板对峙培养法初筛、复筛后，获得产生抑菌圈最大的1株放线菌；编号为yhg
‑
1。
[0107]
表9菌株yhg
‑
1在6种培养基上的培养特征
[0108][0109][0110]
3.2菌株yhg
‑
1菌株的生理生化特征
[0111]
表10菌株yhg
‑
1的部分生理生化特征
[0112][0113]
:结果为阳性；－:结果为阴性。
[0114]
3.3菌株的系统发育学特征
[0115]
提取菌株yhg
‑
1总dna，通过pcr扩增获得16s rdna序列约1.5kb，测序得到其序列，将序列信息提交到eztaxon进行基因序列相似性搜索，共得到9株与菌株yhg
‑
1同源性最高(97.39％
‑
98.29％)、且已定名的模式菌的序列信息，进行系统发育分析，并构建系统进化树(图3)。由图可知，与streptomyces roseifaciens的进化关系最近。由图5可知，菌株 yhg
‑
1的基因组大小为8.71mb，组装成431个scaffolds，g c含量为70.764％。经比对该菌株与其亲缘最近的streptomyces roseifaciens菌株的ani值为80.13％，远远低于阈值95％，因此可以判定菌株yhg
‑
1为链霉菌属的新种。
[0116]
实施例2抑菌活性评价
[0117]
1实验方法
[0118]
平板对峙抑菌活性评价
[0119]
采用平板对峙法对菌株进行菌株的广谱抑菌性测定：利用5mm的打孔器取已纯化好的7 种植物病原菌的菌饼，接种于pda平板的中央，分别在距离病原菌菌饼2.5cm处的四
个点上接种少量待测菌，以只接病原菌的培养皿为空白对照组，每个处理3次重复。在28～30℃培养箱中培养4～7d后，测量并记录待测菌株与病原菌菌丝体之间抑菌带宽度。
[0120]
2结果
[0121]
菌株yhg
‑
1对稻瘟病的抑菌率为69.4％。
[0122]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。