与番茄抗颈腐根腐病基因frl紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域：
：1.本发明属于植物分子育种领域，具体涉及与番茄抗颈腐根腐病基因frl紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术：
：：2.番茄颈腐根腐病是一种非常严重的土传病害，其病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型。该病的典型症状为植株根部自土壤线位置向下发生腐烂，地上部萎蔫失水，维管束褐变，感染病原菌后植株生长停滞直至死亡。病害发生时可造成番茄减产65％以上甚至绝收，植株病死率达100％。目前，番茄颈腐根腐病防治主要有两种方法，一是理化防治，二是发掘和利用抗性资源培育抗性品种。理化防治不仅会增加生产成本、影响番茄果实品质，还会破坏土壤和环境。实践证明，培育抗性品种是最经济、安全、有效的途径，如何高效、快速地选育抗性番茄品种也一直是育种家关注的热点问题。3.frl基因来源于番茄野生种秘鲁番茄，也是目前所知的唯一番茄颈腐根腐病的抗性位点。含有frl基因的番茄植株对尖孢镰刀菌番茄专化型表现高抗甚至免疫，表明该基因在番茄抗颈腐根腐病育种中具有重要前景。遗传学分析表明，frl基因定位于第9号染色体4.2-5.1mb的区间内(devran,z.,kahveci,e.,hong,y.,david,j.s.,andmahmut,t.2018.identifyingmolecularmarkerssuitableforfrlselectionintomatobreeding.theor.appl.genet.131,2099-2105)。虽然frl基因未被克隆，但已有一些与frl连锁的分子标记被开发并可以应用于抗感材料选择。目前生产上应用最为广泛的分子标记为共显性caps分子标记c2-25(staniaszek,m.,szczechura,w.,andmarczewski,w.2014.identificationofanewmolecularmarkerc2-25linkedtothefusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersiciresistancefrlgeneintomato.czechj.genet.plantbreed.50,285-287)，但其检测过程需要使用限制性核酸内切酶进行酶切检测，过程繁琐，且有研究表明c2-25的鉴定结果仅为95.83％，不足以准确鉴定材料的抗性(刘蕾,王辉,李文丽,王富2018.与番茄颈腐根腐病抗病基因frl连锁的标记及应用.江苏农业科学46,91-93)。因此，需要开发出与抗性基因frl更为紧密连锁、共分离的分子标记，以提高分子标记辅助选择育种的准确率。技术实现要素：4.本发明一个目的是提供检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质的用途。5.本发明提供了检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质在鉴定或辅助鉴定番茄的番茄颈腐根腐病抗性中的应用；6.或，本发明提供了检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质在培育或辅助培育抗番茄颈腐根腐病番茄中的应用；7.所述frl基因的定位区间内为番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间；8.所述165bp片段为如下1)或2):9.1)其核苷酸序列为序列3；10.2)将序列表中序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。11.上述应用中，所述检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质如下1)或2)：12.1)为成套引物，所述成套引物由序列表中序列1所示的单链dna分子或其衍生物和序列表中序列2所示的单链dna分子组成；13.2)含有所述成套引物的pcr试剂或试剂盒。14.上述中，所述序列表中序列1所示的单链dna分子的衍生物为将序列表中序列1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子；15.所述序列表中序列2所示的单链dna分子的衍生物为将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。16.本发明另一个目的是提供如下方法：17.本发明提供一种鉴定或辅助鉴定番茄的番茄颈腐根腐病抗性的方法的方法，为检测待测番茄基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段，18.若含有165bp片段，则所述待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；19.若不含有165bp片段，则所述待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；20.所述frl基因的定位区间内为番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间；21.所述165bp片段为如下1)或2):22.1)其核苷酸序列为序列3；23.2)将序列表中序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。24.或本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定番茄是否为抗番茄颈腐根腐病番茄的方法，为检测待测番茄基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段，25.若含有165bp片段，则所述待测番茄为或候选为抗番茄颈腐根腐病番茄；26.若不含有165bp片段，则所述待测番茄不为或候选不为抗番茄颈腐根腐病番茄；27.所述frl基因的定位区间内为番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间；28.所述165bp片段为如下1)或2):29.1)其核苷酸序列为序列3；30.2)将序列表中序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。31.或本发明提供了一种培育或辅助培育抗番茄颈腐根腐病番茄的方法，为检测待测番茄基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段，选择含有含有165bp片段待测番茄进行培育，得到抗番茄颈腐根腐病番茄；32.所述frl基因的定位区间内为番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间；33.所述165bp片段为如下1)或2):34.1)其核苷酸序列为序列3；35.2)将序列表中序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。36.上述方法中，所述检测待测番茄基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的方法为用权利要求2中的所述成套引物对待测番茄基因组dna进行pcr扩增，37.检测pcr产物大小；按照如下标准a或标准b判断：38.所述标准a如下：39.若产物仅有450-440bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；40.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；41.若产物含有605-615bp和450-440bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；42.所述标准b如下：43.若产物仅有444bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；44.若产物仅有609bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；45.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。46.或本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定番茄的番茄颈腐根腐病抗性的方法，包括如下步骤：47.用上述成套引物对待测番茄基因组dna进行pcr扩增，48.检测pcr产物大小；按照如下标准a或标准b判断：49.所述标准a如下：50.若产物仅有450-440bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；51.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；52.若产物含有605-615bp和450-440bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；53.所述标准b如下：54.若产物仅有444bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；55.若产物仅有609bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；56.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。57.或本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定番茄是否为抗番茄颈腐根腐病番茄的方法，包括如下步骤：58.用上述成套引物对待测番茄基因组dna进行pcr扩增，59.检测pcr产物大小；按照如下标准a或标准b判断：60.所述标准a如下：61.若产物仅有450-440bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；62.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；63.若产物含有605-615bp和450-440bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；64.所述标准b如下：65.若产物仅有444bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；66.若产物仅有609bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；67.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。68.或本发明提供了一种培育或辅助培育抗番茄颈腐根腐病番茄的方法，包括如下步骤：69.用上述成套引物对待测番茄基因组dna进行pcr扩增，70.检测pcr产物大小；按照如下标准a或标准b判断：71.所述标准a如下：72.若产物仅有450-440bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；73.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；74.若产物含有605-615bp和450-440bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；75.所述标准b如下：76.若产物仅有444bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；77.若产物仅有609bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；78.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。79.上述检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质也是本发明保护的范围。80.本发明发现了番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内(番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间内)的基因间隔区存在一个165bp的大片段插入与抗番茄颈腐根腐病相关，根据此片段，设计pcr-based分子标记，可以检测待检番茄材料是否含有frl基因及其纯合与否，能够缩短育种周期，提高育种选择的准确性。附图说明81.图1为与frl基因紧密连锁的分子标记检测番茄抗、感自交系和商业品种的电泳图。具体实施方式82.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。83.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。84.下面通过具体实施方案来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。85.下述实施例中使用的番茄品种ailsacraig(la2838a)、la3769、la3292、la3247、la2706、la2827、la2828、la2829、la2830均从美国番茄遗传资源中心(tgrc，http://tgrc.ucdavis.edu/)获取，商业品种实验材料凯文、凯萨、茱丽2号购自寿光先正达种子有限公司，欧可、欧贝购自北京泽农伟业农业科技有限公司种子公司：86.其中番茄品种la3292、la3273、la2827、la2828、la2829、la2830和商业品种凯文、凯萨、茱丽2号、欧贝含有frl位点，对番茄颈腐根腐病高抗；商业品种凯文、凯萨、茱丽2号、欧贝为杂交f1代。番茄品种ac、la3769、la2706和商业品种欧可不含frl位点，对颈腐根腐病高感。87.实施例1、分子标记的获得及用于鉴定番茄抗颈腐根腐病方法的建立88.一、分子标记相关片段的获得89.经过比对含有番茄颈腐根腐病frl位点的番茄品种和不含有番茄颈腐根腐病frl位点的番茄品种，含有番茄颈腐根腐病frl位点的番茄品种比不含有番茄颈腐根腐病frl位点的番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内(番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间内)的基因间隔区存在一个165bp的大片段插入。90.经过测序，该165bp的大片段的核苷酸序列为序列表中序列3。91.因此，可以通过鉴定待测番茄品种frl基因的定位区间内是否含有165bp的大片段来判断待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病，具体如下：92.检测待测番茄品种frl基因的定位区间内是否含有165bp的大片段，若含有该片段，则待测番茄抗或候选抗番茄颈腐根腐病，若不含有该片段，则待测番茄不抗或候选不抗番茄颈腐根腐病。93.二、分子标记相关引物的设计及鉴定待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病方法的建立94.1、分子标记相关引物的设计95.根据上述165bp大片段的两端侧翼序列，开发pcr-based分子标记，pcr扩增引物位于165bp插入片段的两翼。96.pcr-based分子标记的引物序列如下：97.引物1：5’—acaattttgcctttagtgttgg—3’(序列表中的序列1)98.引物2：5’—cctaaagtagtgaaacttatggtg—3’(序列表中的序列2)99.2、鉴定待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病方法的建立100.1)提取待测番茄的基因组dna101.2)pcr扩增102.以上述基因组dna为模板，用上述1设计pcr-based分子标记的引物1和引物2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。103.上述pcr扩增的体系为：premixtaqdna聚合酶mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司p222-01)10μl、引物1和引物2(在体系中的终浓度为10μm)各0.8μl、基因组dna1.5μl、加双蒸水至20μl。104.上述pcr扩增的反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸20秒，共35个循环。105.将上述pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测pcr产物大小；106.若产物仅有440-450bp的单一片段，则该待测番茄基因组中不含有165bp的大片段，且基因型为frl/frl，该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；107.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄基因组2条同源染色体均含有165bp的大片段，则该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；108.若产物含有605-615bp和440-450bp的2种片段，则该待测番茄基因组1条同源染色体含有165bp的大片段，另一条同源染色体不含有165bp的大片段，该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。109.或，将上述pcr产物测序，110.若产物仅有444bp(序列4)的单一片段，则该待测番茄基因组中不含有165bp的大片段，且基因型为frl/frl，该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；111.若产物仅有609bp(序列5)的单一片段，则该待测番茄基因组2条同源染色体均含有165bp的大片段，则该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；112.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄基因组1条同源染色体含有165bp的大片段，另一条同源染色体不含有165bp的大片段，该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。113.实施例2、分子标记相关片段或引物在鉴定待测番茄是否为抗颈腐根腐病番茄中的应用114.一、检测待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病115.1、提取待测番茄的基因组dna116.利用植物dna快速提取试剂盒提取表1所示的番茄抗感纯合自交系和商业品种叶片的基因组dna，得到各个番茄品种的基因组dna。117.表1所示的番茄抗感纯合自交系和商业品种的抗性如表1的第4列所示，是已知抗性。118.2、pcr扩增119.分别以各个番茄品种的基因组dna为模板，用上述1设计pcr-based分子标记的引物1和引物2进行pcr扩增，得到各个番茄品种的pcr扩增产物。120.上述pcr扩增的体系为：premixtaqdna聚合酶mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司p222-01)10μl、引物1和引物2(在体系中的终浓度为10μl)各0.8μl、基因组dna1.5μl、加双蒸水至20μl。121.上述pcr扩增的反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸20秒，共35个循环。122.3、检测123.将上述各个番茄品种的pcr扩增产物分别用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测pcr扩增产物；124.将上述pcr产物测序，125.若产物仅有444bp(序列4)的单一片段，则该待测番茄基因组中不含有165bp的大片段，且基因型为frl/frl，该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；126.若产物仅有609bp(序列5)的单一片段，则该待测番茄基因组2条同源染色体均含有165bp的大片段，则该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；127.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄基因组1条同源染色体含有165bp的大片段，另一条同源染色体不含有165bp的大片段，该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。128.结果如图1和表1所示，图1中m：dl5000dnamarker，1：ac，2：la3769，3：la3292，4：la3247，5：la2706，6：la2827，7：la2828，8：la2829，9：la2830，10：凯文，11：凯萨，12：茱丽2号，13：欧可，14：欧贝；可以看出，感病自交系ac、la3769、la2706和商业品种欧可的番茄pcr扩增产物为444bp的单一片段，推测其基因型为frl/frl，不抗番茄颈腐根腐病；抗病自交系la3292、la3273、la2827、la2828、la2829、la2830番茄pcr扩增产物为609bp的单一片段，推测其基因型为frl/frl，抗番茄颈腐根腐病；商业品种(杂交f1代)凯文、凯萨、茱丽2号、欧贝的番茄pcr扩增产物为609bp和444bp的片段，推测其基因型为frl/frl，抗番茄颈腐根腐病。129.表1为待测番茄pcr-based分子标记检测结果[0130][0131]上表1中，第一列为泳道编号，第2列为品种来源，第3列为品种名称，第4列为品种已知对番茄颈腐根腐病的抗性，第5列为酶切产物条带大小，第6列为基因型。[0132]上述结果表明，该pcr-based分子标记判断番茄抗颈腐根腐病的抗性与材料的抗性高度一致，可以用于抗感材料的鉴定。[0133]二、对照标记检测待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病[0134]1、待测番茄群体获得[0135]la2706(不抗)和la2828(抗)为亲本，获得f2群体，共1005株。[0136]2、抗番茄颈腐根腐病表型检测[0137]检测方法：番茄幼苗一片真叶时轻轻拔起，用清水将根系清洗干净，置于浓度为107个/ml的番茄颈腐根腐病病原菌(尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici；耿丽华,李常保,迟胜起,王丽君,柴敏.番茄颈腐根腐病病原鉴定及不同条件对其生长的影响[j].植物病理学报,2012,42(05):449-455.)孢子悬浮液(溶剂为pdb培养基(购自美国bd公司，货号254920))中浸根10分钟，移栽入盛有灭菌土壤的苗钵中。放入培养箱中温度18℃，湿度75％培养。接菌7天后，观察植株生长状况，包括地上部生长状态及地下部根部是否腐烂。[0138]主根腐烂严重、茎基部呈现深褐色略凹陷斑，则为不抗番茄颈腐根腐病。主根不腐烂，茎基部部分呈现白色没有斑痕，则为抗番茄颈腐根腐病。[0139]结果如表2所示，可以看出，1005株f2群体中775株抗番茄颈腐根腐病，230株不抗番茄颈腐根腐病。[0140]3、pcr-based分子标记检测[0141]方法与上述一相同，结果如表2的pcr-based分子标记所示，可以看出，与表型鉴定结果一致，准确率为100％。[0142]3、对照c2-25分子标记检测[0143]c2-25分子标记检测同样样本，方法参见刘蕾,王辉,李文丽,王富2018.与番茄颈腐根腐病抗病基因frl连锁的标记及应用.江苏农业科学46,91-93。[0144]c2-25分子标记：[0145]引物1：-atgggcgctgcatgtttcgtg-[0146]引物2:-acacctttgttgaaagccatccc-[0147]结果如表2的c2-25分子标记所示，可以看出，与表型检测结果相比，准确率为98.12％。[0148]表2[0149][0150][0151]结果表明，本发明分子标记的抗性鉴定准确率比c2-25高。[0152]虽然，上文中已用一般性说明和具体实施案例对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员而言，在本发明基础上，对之作一些修改或改进是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明属于植物分子育种领域，具体涉及与番茄抗颈腐根腐病基因frl紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术：
：：2.番茄颈腐根腐病是一种非常严重的土传病害，其病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型。该病的典型症状为植株根部自土壤线位置向下发生腐烂，地上部萎蔫失水，维管束褐变，感染病原菌后植株生长停滞直至死亡。病害发生时可造成番茄减产65％以上甚至绝收，植株病死率达100％。目前，番茄颈腐根腐病防治主要有两种方法，一是理化防治，二是发掘和利用抗性资源培育抗性品种。理化防治不仅会增加生产成本、影响番茄果实品质，还会破坏土壤和环境。实践证明，培育抗性品种是最经济、安全、有效的途径，如何高效、快速地选育抗性番茄品种也一直是育种家关注的热点问题。3.frl基因来源于番茄野生种秘鲁番茄，也是目前所知的唯一番茄颈腐根腐病的抗性位点。含有frl基因的番茄植株对尖孢镰刀菌番茄专化型表现高抗甚至免疫，表明该基因在番茄抗颈腐根腐病育种中具有重要前景。遗传学分析表明，frl基因定位于第9号染色体4.2-5.1mb的区间内(devran,z.,kahveci,e.,hong,y.,david,j.s.,andmahmut,t.2018.identifyingmolecularmarkerssuitableforfrlselectionintomatobreeding.theor.appl.genet.131,2099-2105)。虽然frl基因未被克隆，但已有一些与frl连锁的分子标记被开发并可以应用于抗感材料选择。目前生产上应用最为广泛的分子标记为共显性caps分子标记c2-25(staniaszek,m.,szczechura,w.,andmarczewski,w.2014.identificationofanewmolecularmarkerc2-25linkedtothefusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersiciresistancefrlgeneintomato.czechj.genet.plantbreed.50,285-287)，但其检测过程需要使用限制性核酸内切酶进行酶切检测，过程繁琐，且有研究表明c2-25的鉴定结果仅为95.83％，不足以准确鉴定材料的抗性(刘蕾,王辉,李文丽,王富2018.与番茄颈腐根腐病抗病基因frl连锁的标记及应用.江苏农业科学46,91-93)。因此，需要开发出与抗性基因frl更为紧密连锁、共分离的分子标记，以提高分子标记辅助选择育种的准确率。技术实现要素：4.本发明一个目的是提供检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质的用途。5.本发明提供了检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质在鉴定或辅助鉴定番茄的番茄颈腐根腐病抗性中的应用；6.或，本发明提供了检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质在培育或辅助培育抗番茄颈腐根腐病番茄中的应用；7.所述frl基因的定位区间内为番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间；8.所述165bp片段为如下1)或2):9.1)其核苷酸序列为序列3；10.2)将序列表中序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。11.上述应用中，所述检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质如下1)或2)：12.1)为成套引物，所述成套引物由序列表中序列1所示的单链dna分子或其衍生物和序列表中序列2所示的单链dna分子组成；13.2)含有所述成套引物的pcr试剂或试剂盒。14.上述中，所述序列表中序列1所示的单链dna分子的衍生物为将序列表中序列1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子；15.所述序列表中序列2所示的单链dna分子的衍生物为将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。16.本发明另一个目的是提供如下方法：17.本发明提供一种鉴定或辅助鉴定番茄的番茄颈腐根腐病抗性的方法的方法，为检测待测番茄基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段，18.若含有165bp片段，则所述待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；19.若不含有165bp片段，则所述待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；20.所述frl基因的定位区间内为番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间；21.所述165bp片段为如下1)或2):22.1)其核苷酸序列为序列3；23.2)将序列表中序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。24.或本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定番茄是否为抗番茄颈腐根腐病番茄的方法，为检测待测番茄基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段，25.若含有165bp片段，则所述待测番茄为或候选为抗番茄颈腐根腐病番茄；26.若不含有165bp片段，则所述待测番茄不为或候选不为抗番茄颈腐根腐病番茄；27.所述frl基因的定位区间内为番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间；28.所述165bp片段为如下1)或2):29.1)其核苷酸序列为序列3；30.2)将序列表中序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。31.或本发明提供了一种培育或辅助培育抗番茄颈腐根腐病番茄的方法，为检测待测番茄基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段，选择含有含有165bp片段待测番茄进行培育，得到抗番茄颈腐根腐病番茄；32.所述frl基因的定位区间内为番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间；33.所述165bp片段为如下1)或2):34.1)其核苷酸序列为序列3；35.2)将序列表中序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能得到的dna分子。36.上述方法中，所述检测待测番茄基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的方法为用权利要求2中的所述成套引物对待测番茄基因组dna进行pcr扩增，37.检测pcr产物大小；按照如下标准a或标准b判断：38.所述标准a如下：39.若产物仅有450-440bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；40.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；41.若产物含有605-615bp和450-440bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；42.所述标准b如下：43.若产物仅有444bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；44.若产物仅有609bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；45.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。46.或本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定番茄的番茄颈腐根腐病抗性的方法，包括如下步骤：47.用上述成套引物对待测番茄基因组dna进行pcr扩增，48.检测pcr产物大小；按照如下标准a或标准b判断：49.所述标准a如下：50.若产物仅有450-440bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；51.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；52.若产物含有605-615bp和450-440bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；53.所述标准b如下：54.若产物仅有444bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；55.若产物仅有609bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；56.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。57.或本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定番茄是否为抗番茄颈腐根腐病番茄的方法，包括如下步骤：58.用上述成套引物对待测番茄基因组dna进行pcr扩增，59.检测pcr产物大小；按照如下标准a或标准b判断：60.所述标准a如下：61.若产物仅有450-440bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；62.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；63.若产物含有605-615bp和450-440bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；64.所述标准b如下：65.若产物仅有444bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；66.若产物仅有609bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；67.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。68.或本发明提供了一种培育或辅助培育抗番茄颈腐根腐病番茄的方法，包括如下步骤：69.用上述成套引物对待测番茄基因组dna进行pcr扩增，70.检测pcr产物大小；按照如下标准a或标准b判断：71.所述标准a如下：72.若产物仅有450-440bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；73.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；74.若产物含有605-615bp和450-440bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；75.所述标准b如下：76.若产物仅有444bp的单一片段，则该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；77.若产物仅有609bp的单一片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；78.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。79.上述检测番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内是否含有165bp片段的物质也是本发明保护的范围。80.本发明发现了番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内(番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间内)的基因间隔区存在一个165bp的大片段插入与抗番茄颈腐根腐病相关，根据此片段，设计pcr-based分子标记，可以检测待检番茄材料是否含有frl基因及其纯合与否，能够缩短育种周期，提高育种选择的准确性。附图说明81.图1为与frl基因紧密连锁的分子标记检测番茄抗、感自交系和商业品种的电泳图。具体实施方式82.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。83.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。84.下面通过具体实施方案来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。85.下述实施例中使用的番茄品种ailsacraig(la2838a)、la3769、la3292、la3247、la2706、la2827、la2828、la2829、la2830均从美国番茄遗传资源中心(tgrc，http://tgrc.ucdavis.edu/)获取，商业品种实验材料凯文、凯萨、茱丽2号购自寿光先正达种子有限公司，欧可、欧贝购自北京泽农伟业农业科技有限公司种子公司：86.其中番茄品种la3292、la3273、la2827、la2828、la2829、la2830和商业品种凯文、凯萨、茱丽2号、欧贝含有frl位点，对番茄颈腐根腐病高抗；商业品种凯文、凯萨、茱丽2号、欧贝为杂交f1代。番茄品种ac、la3769、la2706和商业品种欧可不含frl位点，对颈腐根腐病高感。87.实施例1、分子标记的获得及用于鉴定番茄抗颈腐根腐病方法的建立88.一、分子标记相关片段的获得89.经过比对含有番茄颈腐根腐病frl位点的番茄品种和不含有番茄颈腐根腐病frl位点的番茄品种，含有番茄颈腐根腐病frl位点的番茄品种比不含有番茄颈腐根腐病frl位点的番茄品种的基因组中frl基因的定位区间内(番茄第9号染色体4.2-5.1mb的区间内)的基因间隔区存在一个165bp的大片段插入。90.经过测序，该165bp的大片段的核苷酸序列为序列表中序列3。91.因此，可以通过鉴定待测番茄品种frl基因的定位区间内是否含有165bp的大片段来判断待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病，具体如下：92.检测待测番茄品种frl基因的定位区间内是否含有165bp的大片段，若含有该片段，则待测番茄抗或候选抗番茄颈腐根腐病，若不含有该片段，则待测番茄不抗或候选不抗番茄颈腐根腐病。93.二、分子标记相关引物的设计及鉴定待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病方法的建立94.1、分子标记相关引物的设计95.根据上述165bp大片段的两端侧翼序列，开发pcr-based分子标记，pcr扩增引物位于165bp插入片段的两翼。96.pcr-based分子标记的引物序列如下：97.引物1：5’—acaattttgcctttagtgttgg—3’(序列表中的序列1)98.引物2：5’—cctaaagtagtgaaacttatggtg—3’(序列表中的序列2)99.2、鉴定待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病方法的建立100.1)提取待测番茄的基因组dna101.2)pcr扩增102.以上述基因组dna为模板，用上述1设计pcr-based分子标记的引物1和引物2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。103.上述pcr扩增的体系为：premixtaqdna聚合酶mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司p222-01)10μl、引物1和引物2(在体系中的终浓度为10μm)各0.8μl、基因组dna1.5μl、加双蒸水至20μl。104.上述pcr扩增的反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸20秒，共35个循环。105.将上述pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测pcr产物大小；106.若产物仅有440-450bp的单一片段，则该待测番茄基因组中不含有165bp的大片段，且基因型为frl/frl，该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；107.若产物仅有605-615bp的单一片段，则该待测番茄基因组2条同源染色体均含有165bp的大片段，则该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；108.若产物含有605-615bp和440-450bp的2种片段，则该待测番茄基因组1条同源染色体含有165bp的大片段，另一条同源染色体不含有165bp的大片段，该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。109.或，将上述pcr产物测序，110.若产物仅有444bp(序列4)的单一片段，则该待测番茄基因组中不含有165bp的大片段，且基因型为frl/frl，该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；111.若产物仅有609bp(序列5)的单一片段，则该待测番茄基因组2条同源染色体均含有165bp的大片段，则该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；112.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄基因组1条同源染色体含有165bp的大片段，另一条同源染色体不含有165bp的大片段，该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。113.实施例2、分子标记相关片段或引物在鉴定待测番茄是否为抗颈腐根腐病番茄中的应用114.一、检测待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病115.1、提取待测番茄的基因组dna116.利用植物dna快速提取试剂盒提取表1所示的番茄抗感纯合自交系和商业品种叶片的基因组dna，得到各个番茄品种的基因组dna。117.表1所示的番茄抗感纯合自交系和商业品种的抗性如表1的第4列所示，是已知抗性。118.2、pcr扩增119.分别以各个番茄品种的基因组dna为模板，用上述1设计pcr-based分子标记的引物1和引物2进行pcr扩增，得到各个番茄品种的pcr扩增产物。120.上述pcr扩增的体系为：premixtaqdna聚合酶mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司p222-01)10μl、引物1和引物2(在体系中的终浓度为10μl)各0.8μl、基因组dna1.5μl、加双蒸水至20μl。121.上述pcr扩增的反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸20秒，共35个循环。122.3、检测123.将上述各个番茄品种的pcr扩增产物分别用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测pcr扩增产物；124.将上述pcr产物测序，125.若产物仅有444bp(序列4)的单一片段，则该待测番茄基因组中不含有165bp的大片段，且基因型为frl/frl，该待测番茄不抗为或候选不抗番茄颈腐根腐病；126.若产物仅有609bp(序列5)的单一片段，则该待测番茄基因组2条同源染色体均含有165bp的大片段，则该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病；127.若产物含有609bp和444bp的2种片段，则该待测番茄基因组1条同源染色体含有165bp的大片段，另一条同源染色体不含有165bp的大片段，该待测番茄的基因型为frl/frl，该待测番茄抗为或候选抗番茄颈腐根腐病。128.结果如图1和表1所示，图1中m：dl5000dnamarker，1：ac，2：la3769，3：la3292，4：la3247，5：la2706，6：la2827，7：la2828，8：la2829，9：la2830，10：凯文，11：凯萨，12：茱丽2号，13：欧可，14：欧贝；可以看出，感病自交系ac、la3769、la2706和商业品种欧可的番茄pcr扩增产物为444bp的单一片段，推测其基因型为frl/frl，不抗番茄颈腐根腐病；抗病自交系la3292、la3273、la2827、la2828、la2829、la2830番茄pcr扩增产物为609bp的单一片段，推测其基因型为frl/frl，抗番茄颈腐根腐病；商业品种(杂交f1代)凯文、凯萨、茱丽2号、欧贝的番茄pcr扩增产物为609bp和444bp的片段，推测其基因型为frl/frl，抗番茄颈腐根腐病。129.表1为待测番茄pcr-based分子标记检测结果[0130][0131]上表1中，第一列为泳道编号，第2列为品种来源，第3列为品种名称，第4列为品种已知对番茄颈腐根腐病的抗性，第5列为酶切产物条带大小，第6列为基因型。[0132]上述结果表明，该pcr-based分子标记判断番茄抗颈腐根腐病的抗性与材料的抗性高度一致，可以用于抗感材料的鉴定。[0133]二、对照标记检测待测番茄是否抗番茄颈腐根腐病[0134]1、待测番茄群体获得[0135]la2706(不抗)和la2828(抗)为亲本，获得f2群体，共1005株。[0136]2、抗番茄颈腐根腐病表型检测[0137]检测方法：番茄幼苗一片真叶时轻轻拔起，用清水将根系清洗干净，置于浓度为107个/ml的番茄颈腐根腐病病原菌(尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici；耿丽华,李常保,迟胜起,王丽君,柴敏.番茄颈腐根腐病病原鉴定及不同条件对其生长的影响[j].植物病理学报,2012,42(05):449-455.)孢子悬浮液(溶剂为pdb培养基(购自美国bd公司，货号254920))中浸根10分钟，移栽入盛有灭菌土壤的苗钵中。放入培养箱中温度18℃，湿度75％培养。接菌7天后，观察植株生长状况，包括地上部生长状态及地下部根部是否腐烂。[0138]主根腐烂严重、茎基部呈现深褐色略凹陷斑，则为不抗番茄颈腐根腐病。主根不腐烂，茎基部部分呈现白色没有斑痕，则为抗番茄颈腐根腐病。[0139]结果如表2所示，可以看出，1005株f2群体中775株抗番茄颈腐根腐病，230株不抗番茄颈腐根腐病。[0140]3、pcr-based分子标记检测[0141]方法与上述一相同，结果如表2的pcr-based分子标记所示，可以看出，与表型鉴定结果一致，准确率为100％。[0142]3、对照c2-25分子标记检测[0143]c2-25分子标记检测同样样本，方法参见刘蕾,王辉,李文丽,王富2018.与番茄颈腐根腐病抗病基因frl连锁的标记及应用.江苏农业科学46,91-93。[0144]c2-25分子标记：[0145]引物1：-atgggcgctgcatgtttcgtg-[0146]引物2:-acacctttgttgaaagccatccc-[0147]结果如表2的c2-25分子标记所示，可以看出，与表型检测结果相比，准确率为98.12％。[0148]表2[0149][0150][0151]结果表明，本发明分子标记的抗性鉴定准确率比c2-25高。[0152]虽然，上文中已用一般性说明和具体实施案例对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员而言，在本发明基础上，对之作一些修改或改进是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12当前第1页12
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