一种连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法与流程

一种连续、循环制备d-阿洛酮糖的方法
技术领域
1.本发明涉及一种连续、循环制备d-阿洛酮糖的方法，属于功能糖制备技术领域。


背景技术：

2.d-阿洛酮糖是d-果糖的c-3差向异构体，是一种天然存在的稀有单糖，在自然界中存在量极少。d-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70%，但是能量值是蔗糖的0.3%，同时，d-阿洛酮糖还有良好的功能特性，可以抑制脂肪酶的活性减少脂肪堆积、降低餐后血糖的水平，抑制肝脂肪酶活性清除活性氧族，预防和治疗糖尿病，因此d-阿洛酮糖是一种理想的甜味剂和蔗糖代替品。
3.在用于制造d-阿洛酮糖的方法中有化学方法和生物方法，由于化学方法会产生大量的副产物和使用大量化学试剂，目前制备d-阿洛酮糖以生物方法进行制备，通常是以d-果糖为底物，用d-阿洛酮糖3-差向异构酶进行催化转化，但是d-果糖的差向异构化存在反应平衡，在连续化生产d-阿洛酮糖的过程中会造成d-果糖大量的浪费，为了充分利用d-果糖，提高d-阿洛酮糖的转化率，开发可以高效利用d-果糖的方法对阿洛酮糖实现工业化是有必要的。
4.目前，有关在串联填充床中利用固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶催化转化d-果糖和钙离子树脂吸附d-阿洛酮糖打破反应平衡，提高d-阿洛酮糖转化率，连续并循环反应的方法和装置尚未报道。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术不足，本发明的目的是提供一种连续、循环制备d-阿洛酮糖的方法和装置。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种连续、循环制备d-阿洛酮糖的方法包括以下步骤：（1）用ph为8的50mm tris-hcl缓冲液配置终浓度为10g/ld-果糖溶液。
7.（2）向步骤（1）的d-果糖溶液加入终浓度为1mm的mn
2
得到果糖底物，mn
2
作为酶反应的辅因子。
8.（3）对酶进行固定化：在冰浴条件下，将2-5wt%海藻酸钠和10mg/l粗酶液混合均匀后，通过10ml的注射器以一定的速度推动，形成大小均一的圆球，在1-6wt�cl2溶液下固定化2h；优选地，海藻酸钠和氯化钙用量均为3wt%。
9.（4）在串联填充床的一个填充柱中填充固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶作为催化剂，在另一填充柱中填充钙离子树脂。所述填充柱均与循环水浴锅相连，并用保温棉包裹填充柱，用于控制填充柱中反应温度。
10.（5）将步骤（2）配置好的果糖底物加入到带有通冷却水的反应瓶中，通过蠕动泵将果糖底物以1ml/min-10ml/min的速率输入到串联填充床装置中，在填充固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶的填充柱中以40℃-80℃进行催化反应，反应产物在填充钙离子树脂的填充
柱中以30℃-90℃进行d-阿洛酮糖吸附，未反应的果糖底物再次流入反应瓶中；优选地，催化反应温度为50℃，d-阿洛酮糖吸附温度为70℃，流速为5ml/min。串联填充床装置中固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶的填充量为填充柱的1/3，阳离子树脂是钙离子树脂，填充量是填充柱的3/4。
11.（6）循环反应进行一定时间后，对填充钙离子树脂的填充柱进行脱附，用去离子水3ml/min流速冲洗，得到钙离子树脂吸附的d-阿洛酮糖。
12.进一步地，反应瓶中加入转子并在智能磁力搅拌器上以700rmb的速度搅拌，保证反应液浓度均匀。
13.所用的d-阿洛酮糖3-差向异构酶是由根癌农杆菌cgmcc1.1488的d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因表达的（参考production of d-psicose from d-glucose by co-expression of d-psicose 3-epimerase and xylose isomerase），为了使基因更好的在大肠杆菌表达，将目的基因碱基序列与质粒pet28a( )构建表达载体，且成功在大肠杆菌中表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶。所述目的基因碱基序列为atgaaacacggcatctactatagctactgggaacacgaatggtctgcgaaattcggtccgtacatcgaaaaagttgcgaaactgggcttcgatatcctggaagttgcggcgcaccacatcaacgaatacagcgatgcggaactggctaccatccgtaaatctgcgaaagataacggtatcattctgaccgcgggcatcggcccgagcaaaaccaaaaacctgtctagcgaagatgcggcggttcgtgcggcgggtaaagcgttcttcgaacgtaccctgtctaacgttgcgaaactggatatccacaccatcggcggcgcgctgcacagctactggccgatcgattactctcagccggttgacaaagcgggcgattacgcgcgtggtgttgaaggtatcaacggcattgcagatttcgcgaacgatctgggtatcaacctgtgcatcgaagttctgaaccgtttcgaaaaccacgttctgaacaccgcggcggaaggtgttgctttcgtgaaagacgttggcaaaaacaacgttaaagttatgctggataccttccacatgaacatcgaagaagatagcttcggcgatgcgatccgtaccgcgggcccgctgctgggtcacttccacaccggtgaatgcaaccgtcgtgttccgggcaaaggccgtatgccgtggcacgaaatcggtctggcgctgcgtgatatcaactacaccggtgcggtgatcatggaaccgttcgttaaaaccggcggcaccatcggtagcgatatcaaagtttggcgtgatctgtctggtggtgcggatatcgcgaaaatggatgaagatgcgcgtaacgcgctggcgttctctcgtttcgttctgggcggctaa。
14.有益效果：本发明是一种边反应边吸附制备d-阿洛酮糖的方法，可以打破d-果糖转化d-阿洛酮糖的可逆反应平衡，消耗更多的底物，提高d-阿洛酮糖的产率，同时反应时间短，固定化酶可重复使用，适合工业化生产。
附图说明
15.图1是本发明的连续、循环制备d-阿洛酮糖的装置示意图。
具体实施方式
16.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
17.参照图1，连续、循环制备d-阿洛酮糖的装置由依次连接的反应瓶、蠕动泵、填充柱1、填充柱2组成，其中反应瓶用于放置果糖底物，并与循环冷却水想通，控制果糖底物温度。填充柱1填充有固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶，且与水浴锅1相连，用于控制填充柱1中反应温度。填充柱2填充有用于吸附d-阿洛酮糖的钙离子树脂，且填充柱2的末端与反应瓶相
连，未反应的果糖底物重新回流到反应瓶中再次进行反应。
18.实施例1将0.3gd-果糖、0.006gmn
2
、300mlph为8的tris-hcl缓冲液混合均匀后加入到500ml自制反应瓶中，磁力搅拌转速设定为700rpm, 冷却水连通反应瓶，固定化酶和钙离子树脂分别填充到填充柱1和填充柱2中，填充量分别为1/3和3/4，水浴锅设定为40℃和70℃分别作为酶促反应温度和钙离子树脂吸附温度，蠕动泵设定流速为5ml/min,反应1h取一次样，持续12h,通过高效液相色谱测样，测定转化率为24.326%。
19.实施例2将0.3gd-果糖、0.006gmn
2
、300mlph为8的tris-hcl缓冲液混合均匀后加入到500ml自制反应瓶中，磁力搅拌转速设定为700rpm, 冷却水连通反应瓶，固定化酶和钙离子树脂分别填充到填充柱1和填充柱2中，填充量分别为1/3和3/4，水浴锅设定为50℃和70℃分别作为酶促反应温度和钙离子树脂吸附温度，蠕动泵设定流速为5ml/min,反应1h取一次样，持续12h,通过高效液相色谱测样，测定转化率为27.103%。
20.实施例3将0.3gd-果糖、0.006gmn
2
、300mlph为8的tris-hcl缓冲液混合均匀后加入到500ml自制反应瓶中，磁力搅拌转速设定为700rpm, 冷却水连通反应瓶，固定化酶和钙离子树脂分别填充到填充柱1和填充柱2中，填充量分别为1/3和3/4，水浴锅设定为60℃和70℃分别作为酶促反应温度和钙离子树脂吸附温度，蠕动泵设定流速为5ml/min,反应1h取一次样，持续12h,通过高效液相色谱测样，测定转化率为25.175%。
21.对比例1将0.3gd-果糖、0.006gmn
2
、300mlph为8的tris-hcl缓冲液混合均匀后加入到500ml自制反应瓶中，磁力搅拌转速设定为700rpm,固定化酶充到填充柱1中，填充量为1/3，水浴锅设定为40℃为酶促反应温度，蠕动泵设定流速为5ml/min,反应1h取一次样，持续12h,通过高效液相色谱测样，测定转化率为21.326%。
22.对比例2将0.3gd-果糖、0.006gmn
2
、300mlph为8的tris-hcl缓冲液混合均匀后加入到500ml自制反应瓶中，磁力搅拌转速设定为700rpm,固定化酶充到填充柱1中，填充量为1/3，水浴锅设定为50℃为酶促反应温度，蠕动泵设定流速为5ml/min,反应1h取一次样，持续12h,通过高效液相色谱测样，测定转化率为22.324%。
23.对比例3将0.3gd-果糖、0.006gmn
2
、300mlph为8的tris-hcl缓冲液混合均匀后加入到500ml自制反应瓶中，磁力搅拌转速设定为700rpm,固定化酶充到填充柱1中，填充量为1/3，水浴锅设定为60℃为酶促反应温度，蠕动泵设定流速为5ml/min,反应1h取一次样，持续12h,通过高效液相色谱测样，测定转化率为19.532%。
24.各实施例与对比例转化率列于表1，由表1可知使用串联填充床边反应边吸附d-阿洛酮糖，可以明显的提高转化率。
25.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。