胆汁cfDNA在胆囊转移性癌症诊疗中的用途的制作方法

胆汁cfdna在胆囊转移性癌症诊疗中的用途
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，具体而言，本发明涉及胆汁cfdna作为辅助胆囊转移性癌症患者诊疗的一种新媒介。该媒介可以辅助乳腺癌、胰腺癌、肝癌和卵巢癌等多种实体瘤胆囊转移患者诊断，同时根据检测结果提示预后以及为临床治疗方案的设计提供指导及理论基础。


背景技术：

2.癌症转移，是指癌细胞离开最初出现的部位(原发病灶)，通过血液、淋巴系统或其他途径，扩散到全身另外的部位，并在合适部位长出新肿瘤的过程。据报道，超过50％的患者在诊断时已经出现了临床可检测到的转移性疾病，大约90％的癌症患者最终会死于癌症转移。相关研究发现，癌细胞的转移具有“器官亲和性”，一般都会转移到特定的目的地，而不会影响到其他的器官。比如，乳腺癌常见肺、骨、肝脏和中枢神经系统的转移，胰腺癌和肝癌更容易发生肺、骨和肝脏的转移，卵巢癌常见腹膜、子宫和直肠等部位的转移。尽管实体瘤几乎可以转移到任何器官，但具有显著临床表现的胆囊转移相对来说十分罕见，其诊断通常较晚，甚至部分患者在尸检时才被发现发生了该部位的转移。胆囊转移的非典型表现可能会误导医生的决策，实现胆囊转移的早期诊断可能会改变患者的用药方案和预后水平。因此，寻找具有高度敏感性和特异性的生物标志物，协助实体瘤胆囊转移的诊断和治疗方案的制定，成为临床重点关注和急需解决的难题。
3.液体活检作为体外诊断的重要分支，通过捕获和检测体液(血液、尿液、唾液、胸水等)中的生物标志物(血清肿瘤标志物、循环肿瘤细胞、循环游离dna、外泌体等)来诊断和监测肿瘤等疾病。循环游离dna(circulating free dna，cfdna)是目前研究最多、应用最成熟的液体活检技术，包含肿瘤细胞在坏死或凋亡过程中释放到体液中的dna即循环肿瘤dna(circulating tumor dna，ctdna)，其保留了肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征，如癌基因和抑癌基因的点突变、拷贝数变异、dna甲基化和染色体重排等，通过其特异性特征可有效区分肿瘤细胞和正常细胞。ctdna检测具有操作简单、侵害性小、易于监测等优势，它可以在疾病不同时期发挥作用，比如协助癌症的早期筛查和早期诊断、术后检测残留病灶及预测复发、指导晚期患者靶向用药、动态监测治疗反应及判断预后，从而实现个体化治疗。


技术实现要素：

4.本发明发现胆汁cfdna可作为一种辅助乳腺癌、胰腺癌、肝癌和卵巢癌等多种实体瘤胆囊转移患者诊疗的新媒介，利用该媒介进行高通量测序可以补充传统影像学诊断实体瘤胆囊转移患者敏感性不足的问题，检测敏感性优于血浆样本。此外，对该媒介进行高通量测序，能够有效检测出实体瘤胆囊转移患者所携带的基因变异，从而有效提示患者靶向用药的选择，为患者带来更多靶向用药机会。
5.检测胆汁cfdna中基因变异的试剂在用于制备实体瘤胆囊转移诊断试剂中的用途。
6.所述的基因变异是指基因突变或者、基因拷贝数变异或者基因融合中的一种或几种。
7.所述的基因突变是单核苷酸变异、插入缺失突变，包括错义突变、无义突变、剪切突变、移码突变、非移码突变或者启动子突变等。
8.所述的基因变异来源于kras、erbb2、cdkn2a、tp53、yap1、arid1a、map2k1、notch1、pik3ca或者rnf43基因。
9.一种实体瘤胆囊转移诊断装置，包括：
10.提取模块，用于对胆汁cfdna进行提取；
11.文库制备模块，用于将提取模块中得到的cfdna制备出高通量测序文库；
12.测序模块，用于对高通量测序文库进行测序，获得cfdna中的基因变异信息；
13.判定模块，用于根据基因变异信息进行判定，若存在变异，则判定样本存在实体瘤胆囊转移。
14.一种计算机可读取介质，记载有可以运行以下步骤的计算机程序：
15.获取提取得到的胆汁cfdna制备的测序文库的下机数据；
16.将下机数据对比至参考基因组，获得胆汁cfdna的基因变异信息；
17.当存在有基因变异时，则判定该样本存在实体瘤胆囊转移。
18.有益效果
19.检测胆囊内贮存的胆汁(bile)中的cfdna，是一种独特的液体活检手段，为攻克辅助实体瘤胆囊转移患者诊疗这一难题提供了解决方案。本次发明能够对临床表现有胆囊转移倾向，但传统影像学尚无证据证明已发生胆囊转移的患者，根据胆汁cfdna检测结果进行辅助诊断；此外，对于实体瘤胆囊转移患者进行组织活检受到采样偏倚及可采样组织区域的限制，且侵入性较大，不易明确肿瘤分子特征和靶向药物基因变异状态，而胆汁样本容易获得且不会产生任何不良影响，能够有效获得涉及胆囊转移性癌症的相关信息，提供靶向药物治疗的机会。
附图说明
20.图1组织(n＝15)、血浆(n＝14)和胆汁(n＝15)样本中的总体变异检出率
21.图2 14例同时有组织、血浆和胆汁样本患者中三种样本类型最大突变丰度
22.图3 5例组织dna、血浆cfdna和胆汁cfdna体细胞变异均呈阳性患者中高频驱动基因和靶向用药基因变异图谱
23.图4 9例胆汁体细胞变异阳性患者胆汁与配对组织变异检出对比分析结果
24.图5 5例组织dna、血浆cfdna和胆汁cfdna体细胞变异均呈阳性患者中基因变异类型对比分析结果
具体实施方式
25.本发明是基于世和基因生物技术股份有限公司内部数据库中15例最终确诊为实体瘤胆囊转移或胆囊癌的患者，从这些患者的原发灶组织、血浆和胆汁样本中提取肿瘤细胞中的遗传物质，通过ngs技术，获得患者不同样本基因变异结果。以组织作为基因检测金标准，对比胆汁和血浆cfdna检出基因变异状态，提供胆汁cfdna作为辅助诊断媒介的依据；
此外，以原发灶组织为标准，对比胆汁和血浆中高频基因和靶向用药基因变异状态，提供胆汁cfdna作为辅助靶向治疗媒介的依据。
26.名词和术语
27.本发明中所述的“基因突变”包含以下几种情况：
28.单核苷酸变异(snv)：单个碱基置换引起，导致编码氨基酸发生变化
29.插入缺失突变(indel)：多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加或减少，这些类型的突变可能是“蛋白编码框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少；或导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。
30.错义突变(missense variants)：dna碱基置换而引起mrna上特定的遗传密码的改变，并导致新合成的肽链中氨基酸变化。
31.无义突变(nonsense variants)：dna碱基置换出现终止密码子，引起肽链合成终止，并可能产生功能异常的蛋白质。
32.剪切突变(splice site variants)：突变可能影响rna剪接，并可能导致产生的功能异常的蛋白质。
33.移码突变(frameshift variants)：dna链上插入或缺失非3的整倍数的碱基，引起阅读框变化，导致插入或缺失位点后的肽链合成错误。
34.非移码突变(inframeshift variants)：dna链上插入或缺失3的整倍数的碱基，造成插入或缺失数个氨基酸。
35.启动子突变(promoter variants)：突变发生于启动子区域或其他调控基因转录的dna区域，可能影响基因启动子转录功能。
36.本发明中所述的“基因拷贝数变异”的定义为：
37.拷贝数变异(cnv)：染色体局部区域发生扩增或缺失，导致编码蛋白过表达或表达减少，缺失如erbb2基因扩增。
38.本发明中所述的“基因融合”的定义为：
39.基因融合(fusions)：属于结构变异的一种，由于染色体易位、缺失或倒置，导致两个基因部分基因序列相互融合。
40.本发明中所述的“胆汁cfdna检出”的定义为：胆汁cfdna中至少存在1种基因的突变或拷贝数变异或融合。
41.样本及数据库的信息：
42.visions数据库是本专利的申请人世和基因自主开发的二代测序基因组数据库，收录了自公司成立以来所有受检者的临床数据和测序数据，目前已收录超50万例受试者样本。依托该数据库我们合计检索到15例受检者同时送检了组织样本和胆汁样本，其中14例还送测了血浆样本。从样本中提取dna或cfdna，长片段dna通过超声进行破碎处理，采用商业化试剂盒进行文库制备，并使用由南京世和基因生物技术股份有限公司生产的检测试剂盒世和一号425靶向测序panel进行靶向富集文库。对dna或cfdna富集文库进行ngs测序，并对下机数据进行基因变异分析，得到每例样本的肿瘤特有变异和突变丰度。
43.本发明中所使用的检测panel参阅cn109880910a专利，其可以用于检测425个基因。
44.所涉及到的基因如下：
45.46.[0047][0048]
胆汁cfdna检出敏感性如下：
[0049]
本发明中有15例通过影像学检查/细胞学/病理结果最终确诊为实体瘤(包括乳腺癌、胰腺癌、肝胆癌和卵巢癌等癌种)胆囊转移受检者。若样本中至少存在1种基因的突变或拷贝数变异或融合定义为突变检出阳性。15例实体瘤胆囊转移受检者中，9例受检者的胆汁cfdna检出，胆汁cfdna辅助实体瘤胆囊转移受检者诊断的敏感性为60％。另外，还有5例通过影像学检查/细胞学/病理结果最终确诊为非实体瘤胆囊转移的受检者，这5例受检者的胆汁cfdna均未检出，胆汁cfdna辅助实体瘤胆囊转移受检者诊断的特异性为100％。
[0050]
胆汁与组织样本的检出率如下：
[0051]
如图1所示，在15例实体瘤胆囊转移受检者中，100％(15/15)的组织样本中检测到体细胞变异。在15个胆汁样本中，9个样本检测到体细胞变异，阳性率为60％。在14个血浆样本中，7个检测到体细胞变异，阳性率为50％。结果表明，胆汁cfdna检测灵敏度优于血浆cfdna(60％vs 50％)。
[0052]
胆汁与组织样本检测结果一致性如下：
[0053]
本发明中的15例确诊为实体瘤胆囊转移受检者中有14例受检者同时送检组织、胆汁和血浆样本，这14例受检者3种样本中最大突变丰度(maxvaf)均无统计学差异(p＞0.05)，如图2所示。三种样本类型平均最大突变丰度依次是21.81％、22.70％、8.93％，由此可见，胆汁cfdna平均最大突变丰度高于血浆，且与组织接近。5例受试者的胆汁cfdna和血浆cfdna体细胞变异均呈阳性，对于组织dna中的高频驱动基因和靶向药物基因变异，胆汁cfdna中检出率100.00％(16/16)，血浆cfdna检出率93.75％(15/16)，胆汁cfdna检测优于血浆，如图3所示；对5例非实体瘤胆囊转移患者的胆汁cfdna进行了检测，均为阴性。此外，胆汁cfdna还能检测到胆汁特异性变异，作为肿瘤组织样本异质性的补充，如图4所示。从变异类型方面看，三种样本类型不同变异类型占比接近，但胆汁样本可以检测到更多的变异类型，见图5。由此可见，胆汁cfdna与组织dna样本检出的体细胞变异方面一致性高，且胆汁优于血浆，此外，胆汁cfdna样本还可以检测到更多的组织异质性变异，作为组织样本的补充，全面指导患者临床诊疗。
[0054]
在如图3中，15例受试者的胆汁样本中共检出了涉及kras、erbb2、cdkn2a、tp53、yap1、arid1a、map2k1、notch1、pik3ca以及rnf43等高频驱动基因上的变异；变异类型共涉及拷贝数变异、错义突变、剪切突变、无义突变和基因融合几种。其中，三种样本类型中
kras、yap1、arid1a、map2k1、notch1和pik3ca基因检出的变异类型均为错义突变；erbb2检出变异类型均为拷贝数变异、错义突变、剪切突变和基因融合；cdkn2a检出变异类型均为错义突变和无义突变；tp53检出变异类型均为错义突变和剪切突变；rnf43基因变异仅组织和胆汁样本中检出，检出变异类型为剪切突变。
[0055]
胆汁cfdna检测靶向药物靶点，辅助靶向药物选择如下：
[0056]
图2展示了三种样本类型高频驱动基因和靶向用药基因变异图谱。其中，胆汁cfdna样本中检测到用药靶点基因变异，如erbb2拷贝数扩增、融合和突变，以及pik3ca基因突变，靶点基因对应的靶向药物如下表所示。结果表明，与组织和血浆cfdna检测相比，胆汁cfdna的检测同样可以为受检者带来靶向药物治疗机会。
[0057][0058]
胆汁cfdna在检测实体瘤胆囊转移受检者体细胞变异方面要优于血浆cfdna，与组织检出一致性较高，可以成为实体瘤胆囊转移患者辅助诊疗的一种新媒介。此外，胆汁cfdna也可检出靶向用药基因，如erbb2和pik3ca，为患者带来靶向药物选择的机会。