HDCA9抑制剂在制备治疗抑郁症药物中的应用

hdca9抑制剂在制备治疗抑郁症药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及基因敲除，非选择性抑制，选择性抑制以及shrna敲降等hdac9抑制手段在生物技术以及医药领域中的应用，尤其是在抑郁症治疗中的应用。


背景技术：

2.抑郁症是一种常见的情感障碍疾患，以情感低落、思维迟缓、以及言语动作减少为典型症状。抑郁症严重困扰患者的生活和工作，给家庭和社会带来沉重的负担，约15％的抑郁症患者死于自杀。根据世界卫生组织最近发布的全球健康评估报告，抑郁症已被列为世界各地的首要致残原因，它是导致全球疾病负担的一个重大因素。当前，治疗仍以心理学治疗为主，对中重度抑郁症患者使用抗抑郁药物。传统的抗抑郁药物包括三环类抗抑郁药，单胺氧化酶抑制剂等一般需要4～6周才能显著改善症状。同时由于目前对抑郁症病理生理的基础了解甚少，发病机制不够明确，抑郁症药物治疗存在治疗周期长、存在大量难治性病例及治疗后易复发等问题，目前大约50％的服药病人仍然反复发作。因此，迫切需要寻找治疗抑郁症的新靶点。
3.近年来，表观遗传学在疾病中的应用越来越受到人们的关注，其中组蛋白乙酰化参与了多种精神疾病包括抑郁症，广谱的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(hdaci)如丁酸钠等在动物实验中被证实可以缓解抑郁发作。但大多数hdac抑制剂由于对特定hdac亚型的低选择性，存在着选择性不高、不良反应多等问题，这限制了其临床应用。因此，抑郁发生与脑内何种hdac亚型的改变有关是当前急需解决的科学问题，而这也可能是今后选择性hdac抑制剂开发以及精准治疗抑郁症的基础。hdac9作为ii类hdacs家族的重要成员，目前还没有抑制hdac9作为预防和治疗抑郁症的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供抑制hdac9作为抑郁症治疗的新方向，以及相关技术在制备预防和治疗抑郁症药物中的应用。
5.为实现以上目的，本发明提供一种抑郁症发作标志物，及其抑制hdac9在制备治疗抑郁症药物中的应用。
6.一种抑郁发作标志物，所述标志物为hdca9，hdca9作为组蛋白去乙酰化酶调控海马神经元兴奋性参与抑郁发作。
7.hdca9抑制剂和hdca9 shrna在制备治疗抑郁症药物中的应用。
8.hdca9抑制剂和hdca9 shrna在制备通过调控海马神经元兴奋性缓解神经精神疾病发作的药物中的应用。
9.hdca9抑制剂和hdca9 shrna在制备通过调节海马神经元树突棘发育缓解神经精神疾病发作的药物中的应用。
10.其中，所述神经精神疾病为抑郁症。
11.如所述的应用，抑郁大发作患者海马部位hdac9的表达较健康受试者明显升高。
12.如所述的应用，慢性束缚应激抑郁小鼠以及慢性不可预见性应激抑郁小鼠海马部位hdac9的表达较正常小鼠明显升高。
13.如所述的应用，正常小鼠海马神经元过表达hdac9后表现出明显的抑郁行为。
14.如所述的应用，正常小鼠海马神经元过表达hdac9后其树突棘密度明显减少伴随着自发性兴奋性突触后电位的频率和幅度降低。
15.抑制hdac9作为抗抑郁治疗的应用。
16.如所述的应用，小鼠海马神经元特异性敲除hdca9后可以缓解由慢性束缚应激诱导的抑郁发作。
17.如所述的应用，小鼠海马注射hdca9 shrna后可以缓解由慢性束缚应激诱导的抑郁发作。
18.如所述的应用，小鼠海马注射非选择性hdac9抑制剂tmp269后可以缓解由慢性束缚应激诱导的抑郁发作。
19.与现有技术相比，本发明具备以下优越性：
20.本发明中的hdac9来源于临床抑郁大发作患者海马样本检测，同时hdac抑制剂已经被证实可以用于治疗抑郁发作，因此以hdac9作为抑郁症治疗靶点具有临床应用性。另外本发明的研究发现通过抑制海马神经元hdac9表达可以很好地缓解抑郁发作，提示hdca9作为抗抑郁治疗靶点的可行性。
21.本发明进一步研究发现，hadc9主要通过调控树突棘发育进而影响神经元突触传递发挥作用，这一发现符合传统的抑郁发作机制假说，增强了hdca9作为抗抑郁治疗靶点的可行性。同时抑制hdac9与抑制hdac不同，由于靶点明确，药理机制明晰，其安全性进一步提高。以上数据表明抑制hdac9是一个极具开发应用前景的抗抑郁治疗手段。
附图说明
22.图1a显示抑郁大发作患者以及健康受试者海马部位hdac9含量。图1b显示小鼠慢性束缚应激抑郁模型构建流程。图1c-e显示慢性束缚应激(crs)小鼠在强迫游泳(fst)，悬尾实验(tst)，糖水偏好(spt)以及旷场实验中的抑郁表现。图1f显示wb检测慢性束缚应激小鼠以及对照小鼠海马部位hdac9的含量。图1g-i显示慢性不可预见性应激(cums)小鼠在强迫游泳(fst)，悬尾实验(tst)，糖水偏好(spt)以及旷场实验中的抑郁表现。图1j显示wb检测慢性不可预见性应激小鼠以及对照小鼠海马部位hdac9的含量。
23.图2a显示hdac9过表达病毒的注射以及行为学流程。图2b显示给予hdca9过表达病毒以后海马部位hdac9的表达变化。图2c-e显示正常小鼠海马神经元过表达hdac9后在强迫游泳(fst)，悬尾实验(tst)，糖水偏好(spt)以及旷场实验中的抑郁表现。
24.图3a显示hdac9过表达小鼠海马神经元高尔基染色典型图。图3b-e显示利用image j软件统计的hdac9过表达小鼠海马神经元树突棘密度，包括短粗状，蘑菇状，细长状以及总的树突棘密度。图3f-g显示电生理手段记录的hdac9过表达小鼠海马神经元自发性兴奋性突触后电位(sepsc)的幅度和频率。
25.图4a显示海马神经元hdac9特异性敲除小鼠的构建流程。图4b-c显示hdac9 cko小鼠海马部位hdac9的mrna以及蛋白水平。图4d-f显示hdac9 cko小鼠经历慢性束缚应激以后在强迫游泳(fst)，悬尾实验(tst)，糖水偏好(spt)以及旷场实验中的抑郁表现。
26.图5a显示hdac9 shrna病毒的注射以及行为学流程。图5b显示给予hdac9shrna病毒以后海马部位hdac9的表达变化。图5c-e显示hdac9 shrna病毒小鼠经历慢性束缚应激后在强迫游泳(fst)，悬尾实验(tst)，糖水偏好(spt)以及旷场实验中的抑郁表现。
27.图6a-b显示小鼠给予非选择性hdac9抑制剂tmp-269以及对hdca9无抑制作用的hdac抑制剂jnj-26481585后在强迫游泳(fst)，悬尾实验(tst)以及糖水偏好(spt)中的抑郁表现。
具体实施方式
28.下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，单并不以此来限定本发明。
29.实施例1：
30.临床抑郁大发作患者血样中hdac9含量检测。
31.本发明利用elisa的方法检测患者血样中hdac9含量。首先收集符合国际疾病分类第11版(icd 11)诊断标准的抑郁大发作患者血浆样本(汉密尔顿抑郁量表17项(hamd17)评分≥17)。排除标准包括：过去或最近被诊断患有神经精神疾病的人；患有心、肝、肾、脑等严重慢性疾病的人；孕妇或准备怀孕；白细胞减少症、贫血症和血小板减少症患者；上半年内曾接受过任何测试的药物或药物/程序，即参加另一次测试；过敏体质等无法坚持完成测试的人。接着收集与抑郁大发作患者年龄、性别和种族匹配的健康受试者的血浆样本。所有患者和健康对照均为15-60岁，亚裔(详见表1)。最后利用人hdac9酶联反应试剂盒对12例抑郁大发作患者血浆样本以及12例健康受试者的血浆样本中的hdac9含量进行检测，结果发现抑郁大发作患者血浆中hdac9含量明显升高(图1a)。
32.表1抑郁大发作(mdd)患者以及健康受试者(control)的病人信息
[0033][0034]
实施例2：
[0035]
慢性应激小鼠海马中的hdac9含量检测。
[0036]
(1)构建慢性束缚应激(crs)小鼠：在正式实验前，将小鼠置于行为房适应1周，12h昼夜循环，自由饮水和摄食。小鼠经体重、糖水偏好、旷场实验等初筛后选择行为得分相近的小鼠，随机分为正常对照(normal control，nc)组和crs组2组。将crs组小鼠置于50ml离心管所做的束缚管中(离心管提前烫制出气孔)，分散于整个管身，在盖子的中心有一小孔，小鼠尾巴穿于其中而暴露在空气中，连续束缚21d，每天4h，crs组小鼠束缚期间禁食禁水，nc组小鼠自由饮水和摄食，流程图见图1b。
[0037]
(2)构建慢性不可预测应激(cums)小鼠：小鼠反复遭受不可预知的轻度压力，包括昼/夜光照周期，45
°
倾斜的笼子，束缚，足部电刺激，寒冷的环境，冷水游泳，低强度频闪照明，食物和水剥夺，潮湿垫料。所有应激源在整个应激期内随机给予，应激持续5周。
[0038]
(3)抑郁行为学验证：
[0039]
强迫游泳(fst)：将小鼠放入高25cm、直径10cm的圆柱形玻璃缸中，水深15cm，水温25℃。小鼠在缸中游泳6min，记录后5min内小鼠的累计不动时间。
[0040]
悬尾实验(tst)：将小鼠尾部固定后，头向下悬挂，距离地面约30cm。悬挂时间为5min，记录小鼠的静止不动的时间。
[0041]
糖水偏好测试(spt)：实验开始前先训练小鼠适应含糖饮水，每笼放置2个水瓶，分别装满1％蔗糖水和纯水，连续适应2d。接着小鼠禁食禁水12h。实验开始后，每笼小鼠放置一瓶1％蔗糖水以及一瓶纯水，lh后分别测量蔗糖水及纯水的重量，并计算每只小鼠的糖水偏好度(％)＝糖水摄入量/(糖水摄人量 纯水摄入量)。
[0042]
旷场实验(oft)：小鼠旷场反应箱高28cm，底边长70cm。将小鼠放入箱内底面中心，30分钟内进行摄像，记录小鼠的运动轨迹和运动总路程。
[0043]
结果发现crs小鼠以及cums小鼠在强迫游泳以及悬尾实验中的不动时间明显增加(图1c，1g)，同时它们的糖水偏好率明显降低(图1d，1h)，说明它们有明显的抑郁表型，另外它们在旷场实验中的表现与对照组相比没有显著差异(图1e，1i)，说明它们的运动量没有受到影响。
[0044]
(4)本发明利用wb检测hdac9含量：分离crs小鼠，cums小鼠以及正常小鼠海马组织，利用ripa裂解液提取总蛋白后进一步利用western blot技术检测其中hdac9蛋白含量，结果发现crs小鼠以及cums小鼠海马部位hdac9含量均明显升高((图1f，1j)。
[0045]
实施例3：
[0046]
小鼠海马过表达hdac9后的抑郁行为学表现
[0047]
将携带hdac9的腺相关病毒利用小鼠立体定位仪定向注射到小鼠海马部位(图2a)，3周后利用western blot检测海马部位hdac9的含量发现其含量明显升高，说明病毒感染成功(图2b)。接着利用强迫游泳，悬尾实验，糖水偏好测试以及旷场实验检测小鼠的抑郁行为学表现，结果发现hdac9过表达小鼠同样表现出明显的抑郁样行为(图2c-e)。
[0048]
实施例4：
[0049]
小鼠海马过表达hdac9后的神经元兴奋性改变
[0050]
本发明利用高尔基染色检测海马神经元的树突棘数量。将小鼠麻醉并迅速取出大脑并置于固定剂中并固定超过48小时，之后将小鼠脑组织切成2-3mm厚的组织片。用生理盐水轻轻冲洗脑组织数次，放入45ml圆底ep管中。加入高尔基染色液(g1069，servicebio)使脑组织完全浸没，置于阴凉通风处避光14天。用蒸馏水浸洗3次，倒入80％冰醋酸浸没组织，过夜，待组织变软后用蒸馏水洗涤，置于30％蔗糖中。使用振动切片机将组织切成100微米，将其粘在明胶载玻片上，并在黑暗中干燥过夜。将干燥的组织切片用浓氨水处理15分钟，用蒸馏水洗涤1分钟，用酸性硬膜固定液处理15分钟，用蒸馏水洗涤3分钟，干燥，并用甘油明胶固定。最后，利用数字切片扫描仪的全景多层扫描，获得脑组织的全景图像。选择神经元的顶端树突进行形态学分析。对于每组，随机选择每个神经元至少3个树突节段，每只小鼠分析至少5个神经元(图3a)。结果发现hdca9过表达小鼠海马神经元上短处状，蘑菇状以及
总的树突棘的密度明显降低(图3b-e)。
[0051]
进一步本发明利用膜片钳技术记录hdca9过表达小鼠海马神经元自发性兴奋性突触后电位(sepsc)的幅度和频率。结果发现与对照小鼠相比，hdca9过表达小鼠海马神经元sepsc幅度不变而频率明显降低，提示其神经元兴奋性明显降低(图3f-g)。
[0052]
实施例5：
[0053]
神经元hdac9条件性敲除小鼠的抑郁表型
[0054]
本发明利用cre-loxp技术将hdac9
flox/flox
基因工程小鼠与camkiiα-cre工具鼠杂交后得到神经元特异性hdca9敲除小鼠(图1)。进一步利用rt-pcr以及wb手段检测hdac9 cko小鼠海马部位的hdac9表达后发现其mrna水平以及蛋白水平均明显减少，提示敲除小鼠构建成功(图b-c)，进一步利用强迫游泳，悬尾实验，糖水偏好测试以及旷场实验检测cko小鼠的抑郁行为学表现，结果发现hdac9 cko小鼠的行为学表现和对照组类似(图4d-f)。另外将hdac9 cko小鼠经历crs后我们发现其抑郁表型并没有改变(图4d-f)，提示hdca9 cko以后可以缓解crs引发的抑郁行为。
[0055]
实施例6：
[0056]
hdac9 shrna小鼠的抑郁表型
[0057]
将携带hdac9 shrna的腺相关病毒利用小鼠立体定位仪定向注射到小鼠海马部位(图5a)，3周后利用western blot检测海马部位hdac9的含量发现其含量明显降低，说明病毒感染成功(图5b)。接着将病毒感染小鼠经历crs后利用强迫游泳，悬尾实验，糖水偏好测试以及旷场实验检测小鼠的抑郁行为学表现，结果发现与正常小鼠经历crs相比，hdac9shrna小鼠经历crs后其抑郁表型明显减轻(图5c-e)，提示hdac9敲降可以缓解crs诱导的抑郁发作。
[0058]
实施例7：
[0059]
hdac9抑制剂对抑郁行为的影响
[0060]
本发明选取hdac广谱抑制剂tmp269以及jnj-26481585，其中tmp269对hdac9有抑制活性，而jnj-26481585对hdca9几乎无抑制活性。正常小鼠在经历crs的同时每天以15mg/kg的剂量腹腔注射两种抑制剂，crs结束后利用强迫游泳，悬尾实验，糖水偏好测试以及旷场实验检测各组小鼠的抑郁行为学表现。结果发现crs的同时给与tmp269可以缓解小鼠后期的抑郁表型(图6a-b)，而在crs的同时给与jnj-26481585对抑郁行为学没有明显改变(图6a-b)，提示抑制hdac9可以缓解抑郁发作。