基于表面增强红外光谱和主成分分析的新冠病毒核酸检测模型的构建方法与流程

1.本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于表面增强红外光谱和主成分分析的新冠病毒核酸检测模型的构建方法。


背景技术：

2.反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,rt-pcr)技术检测灵敏度高，特异性强，是目前对于新冠病毒检测的主要手段。此技术首先将样本中的病毒rna提取出来并利用反转录技术反转成cdna，之后利用pcr技术使cdna不断复制，在cdna扩增的同时，试剂盒中的荧光探针也在同时工作，cdna每完成扩增，荧光信号便会增强，根据荧光信号的强度曲线从而检测出新冠病毒。然而，此技术也存在明显的缺陷，首先，此方法需要大量的人力和物力，在疫情大规模爆发阶段，可能无法提供足够的资源来实行全面检测；其次，rt-pcr检测时间较长，完成整个检测技术通常需要4-6个小时，可能会延误疫情防控的时机；最后，rt-pcr技术检测成本较为高昂，不利于长期使用此方法作为主要的检测手段(即具有人力物力资源需求高、检测时间长、检测成本高等缺陷)。因此有必要开发一种快速、成本低廉的检测方法作为rt-pcr检测技术的补充。


技术实现要素：

3.为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种基于表面增强红外光谱和主成分分析的新冠病毒核酸检测模型的构建方法。
4.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种基于表面增强红外光谱和主成分分析的新冠病毒核酸检测模型的构建方法，包括以下步骤：
5.(1)材料的准备：表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底、健康样本的核酸单链溶液和新冠病毒样本的核酸单链溶液，所述dna探针的核苷酸序列如seq id no：1所示；
6.其中，所述新冠病毒样本的核酸单链为与dna探针互补配对的新冠病毒互补核酸单链，所述健康样本的核酸单链为与dna探针不配对且不属于新冠病毒序列的单链；
7.(2)将健康样本的核酸单链溶液与新冠病毒样本的核酸单链溶液分别滴在表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底表面，待其溶剂自然挥发后，用超纯水反复润洗，除去表面物理吸附的核酸单链；
8.(3)红外透射光谱的采集：采集光谱波长范围为1100-1800cm-1
的红外指纹区；
9.(4)光谱预处理：将所采集的红外透射光谱进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理；
10.(5)判别模型的建立：利用pca spectroscopy程序处理(4)中的样本数据，得到健康、新冠病毒的主成分分析模型。
11.进一步地，所述表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底包括红外透明的衬底，所述红外透明的衬底表面设有金膜，所述金膜的表面设有dna探针。
12.进一步地，所述红外透明的衬底选自氟化钙、硅片、蓝宝石等。
13.进一步地，所述金膜的厚度为10-20nm。
14.进一步地，所述表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底的制备方法包括以下步骤：
15.1)在红外透明的衬底上蒸镀金膜，形成随机分布的金纳米颗粒结构；
16.2)将步骤1)所得衬底置于被巯基修饰的dna探针溶液中，使dna探针与金结合形成金-硫共价键，在金表面生层单分子自组装层，得到所述表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底。
17.进一步地，所述步骤1)前还包括红外透明的衬底的预处理；
18.优选地，所述红外透明的衬底的预处理为将红外透明的衬底依次置于丙酮、无水乙醇和超纯水之中清洗，然后用n2枪吹干。
19.进一步地，所述新冠病毒样本的核酸单链的核苷酸序列如seq id no：2所示。
20.进一步地，所述健康样本的核酸单链的核苷酸序列如seq id no：3所示。
21.进一步地，所述模型用于检测新冠病毒核酸的方法包括以下步骤：
22.(1)将待测样品滴在表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底表面，待其溶剂自然挥发后，用超纯水反复润洗；
23.(2)采集红外透射光谱：采集光谱波长范围为1100-1800cm-1
的红外指纹区；
24.(3)光谱预处理：将所采集的红外透射光谱进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理；
25.(4)利用pca spectroscopy程序一起处理(3)中待测样品、上述所述的新冠病毒样本和健康样本的数据，从pca分析图中判断待测样品落在新冠病毒样本的置信区间内还是健康样本的置信区间内，进而得到待测样品健康、新冠病毒的类别。
26.另一方面，本发明提供了一种基于表面增强红外光谱和主成分分析的新冠病毒核酸检测试剂盒，包括表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底，所述dna探针的核苷酸序列如seq id no：1所示；
27.优选地，还包括健康样本的核酸单链溶液和新冠病毒样本的核酸单链溶液，所述健康样本的核酸单链为与dna探针不配对且不属于新冠病毒序列的单链，所述新冠病毒样本的核酸单链为与dna探针互补配对的新冠病毒互补核酸单链；
28.优选地，所述新冠病毒样本的核酸单链的核苷酸序列如seq id no：2所示；
29.优选地，所述健康样本的核酸单链的核苷酸序列如seq id no：3所示。
30.本发明的有益效果是：本发明将表面增强红外光谱与主成分分析法有机结合，根据核酸配对互补情况以区分健康样本与病毒样本，提供了一种新型的灵敏度高、成本低廉、测试快速的新冠病毒检测方法；
31.本发明的检测方法非常快速，在采集红外光谱的5min内便可分析出测试结果；
32.本发明的检测方法成本相对低廉，只需要红外光谱仪，不需要其他特殊条件或化学药品。
附图说明
33.图1是1μm被巯基修饰的dna探针溶液分别沉积在10nm au和50nm au上的红外透射
光谱；
34.图2是t-ncov-n、t-non-ncov、t-ncov-orf、p-ncov-n、none sh各种样本的红外透射光谱；
35.图3a为t-ncov-n和p-ncov-n组数据pca分析的散点图；图3b从上到下依次为t-ncov-n的原始红外光谱、二次微分光谱、pc1的loading plot和pc2的loading plot；
36.图4a为t-ncov-orf和p-ncov-n组数据pca分析的散点图；图4b为t-ncov-orf和t-ncov-n组数据pca分析的散点图；图4c为t-ncov-orf、p-ncov-n和t-ncov-n组数据pca分析的散点图；
37.图5a为t-non-ncov和p-ncov-n组数据pca分析的散点图；图5b为t-non-ncov和t-ncov-n组数据pca分析的散点图；图5c为t-non-ncov、p-ncov-n和t-ncov-n组数据pca分析的散点图。
具体实施方式
38.为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
39.实施例1
40.采用氟化钙窗片为原材料，在其上蒸镀10nm au膜，作为表面增强红外衬底(10nm au)；对比50nm的平整金膜(50nm au)。将1μm被巯基修饰的dna探针溶液分别沉积在10nm au和50nm au上，进行红外透射光谱的测定，其结果如图1所示。从图1可以看出，10nm au显著增强1μm被巯基修饰的dna探针的红外光谱信号。
41.实施例2
42.(1)材料的准备：
43.实验组：
44.表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底：制备过程为，将氟化钙窗片衬底依次置于丙酮、无水乙醇和超纯水之中清洗10min，用n2枪吹干；在干净的衬底上蒸镀10nm金膜，形成随机分布的金纳米颗粒结构；将衬底置于被巯基修饰的dna探针溶液中，使dna探针与金结合形成au-s共价键，在au表面生层单分子自组装层，dna探针的核苷酸序列如seq id no：1所示(p-ncov-n)。
45.新冠病毒样本的核酸单链溶液：新冠病毒样本的核酸单链的核苷酸序列如seq id no：2所示(t-ncov-n)。
46.健康样本的核酸单链溶液：健康样本的核酸单链的核苷酸序列如seq id no：3所示(t-non-ncov)。
47.对照组：
48.表面没有dna探针的表面增强红外光谱基底：制备过程为，将氟化钙窗片衬底依次置于丙酮、无水乙醇和超纯水之中清洗10min，用n2枪吹干；在干净的衬底上蒸镀10nm金膜，形成随机分布的金纳米颗粒结构；将衬底置于没有被巯基修饰的dna探针溶液中，dna探针不能与金结合形成au-s共价键，dna探针的核苷酸序列如seq id no：1所示(none sh)。
49.与dna探针不配对但同为新冠病毒的核酸单链溶液：与dna探针不配对但同为新冠病毒的核酸单链的核苷序列如seq id no：4所示(t-ncov-orf)。
50.(2)将新冠病毒样本的核酸单链溶液、健康样本的核酸单链溶液、与dna探针不配对但同为新冠病毒的核酸单链溶液分别滴在表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底表面(其中健康样本的核酸单链、与dna探针不配对但同为新冠病毒的核酸单链无法与已有的dna探针形成互补，新冠病毒样本的核酸单链则可以与已有的dna探针形成互补)，待其溶剂自然挥发后，用超纯水反复润洗，除去表面物理吸附的核酸单链，用n2枪吹干。
51.(3)将(2)中处理好的健康样本基底、新冠病毒样本基底、与dna探针不配对但同为新冠病毒样本的基底、表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底、表面没有dna探针的表面增强红外光谱基底分别置于傅立叶红外光谱仪的红外显微镜之下，采集各自的红外透射光谱，采集光谱波长范围为1100-1800cm-1
的红外指纹区，采集面积50μm*50μm。结果如图2所示，从图2可以看出各组(t-ncov-n、t-non-ncov、t-ncov-orf、p-ncov-n)红外光谱之间无明显差异，肉眼无法分辨其差异。
52.其中，none sh的信号用来与被巯基修饰的dna探针做比较，证明所得到的红外信号来自与衬底相结合的dna。
53.p-ncov-n的信号与t-ncov-n、t-non-ncov、t-ncov-orf的信号做比较，看表面设有dna探针的表面增强红外光谱基底经过后处理之后红外光谱是否会有差异。
54.以与dna探针不配对但同为新冠病毒的核酸单链溶液为对照实验，虽然同属于新冠病毒核酸序列，但是不在配对区间就无法配对成功，更加说明dna探针的特异性。
55.实施例3
56.将实施例2中采集的t-ncov-n和p-ncov-n的红外光谱数据进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理，之后利用origin中的pcaspectroscopy程序处理，得到如图3所示的结果。图3a为t-ncov-n和p-ncov-n组数据pca分析的散点图，pc1和pc2代表总体差异最大的两个主成分，椭圆代表每组样品95％的置信区间。从图3a可以看出，t-ncov-n和p-ncov-n组之间可以区别开。图3b从上到下依次为t-ncov-n的原始红外光谱、二次微分光谱、pc1的loading plot和pc2的loading plot。从图3b可以看出，二次微分光谱可以将原光谱中宽峰所掩盖的峰都显现出来，可以更容易分辨各个峰的位置。而在loading plot中偏离0越远的位置代表此处红外光谱峰对于分辨两组数据差异的贡献越大。
57.将实施例2中采集的t-ncov-orf和p-ncov-n的红外光谱数据进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理，之后利用origin中的pcaspectroscopy程序处理，得到如图4a所示的结果。图4a为t-ncov-orf和p-ncov-n组数据pca分析的散点图，pc1和pc2代表总体差异最大的两个主成分，椭圆代表每组样品95％的置信区间。从图4a可以看出t-ncov-orf和p-ncov-n组之间不能区别开。将实施例2中采集的t-ncov-orf和t-ncov-n的红外光谱数据进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理，之后利用origin中的pcaspectroscopy程序处理，得到如图4b所示的结果。图4b为t-ncov-orf和t-ncov-n组数据pca分析的散点图，pc1和pc2代表总体差异最大的两个主成分，椭圆代表每组样品95％的置信区间。从图4b可以看出t-ncov-orf和t-ncov-n组之间可以区别开。将实施例2中采集的t-ncov-orf、p-ncov-n和t-ncov-n的红外光谱数据进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理，之后利用origin中的pcaspectroscopy程序处理，得到如图4c所示的结果。图4c为t-ncov-orf、p-ncov-n和t-ncov-n组数据pca分析的散点图，pc1和pc2代表总体差异最大的两个主成分，椭圆代表每组样品95％的置信区间。从图4c可以看出t-ncov-n和t-ncov-orf、p-ncov-n组
之间可以区别开，t-ncov-orf和p-ncov-n组之间不能区别开。
58.将实施例2中采集的t-non-ncov和p-ncov-n的红外光谱数据进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理，之后利用origin中的pcaspectroscopy程序处理，得到如图5a所示的结果。图5a为t-non-ncov和p-ncov-n组数据pca分析的散点图，pc1和pc2代表总体差异最大的两个主成分，椭圆代表每组样品95％的置信区间。从图5a可以看出t-non-ncov和p-ncov-n组之间不能区别开。将实施例2中采集的t-non-ncov和t-ncov-n的红外光谱数据进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理，之后利用origin中的pcaspectroscopy程序处理，得到如图5b所示的结果。图5b为t-non-ncov和t-ncov-n组数据pca分析的散点图，pc1和pc2代表总体差异最大的两个主成分，椭圆代表每组样品95％的置信区间。从图5b可以看出t-non-ncov和t-ncov-n组之间可以区别开。将实施例2中采集的t-non-ncov、p-ncov-n和t-ncov-n的红外光谱数据进行平滑、基线校准、曲线均一化、二次微分处理，之后利用origin中的pcaspectroscopy程序处理，得到如图5c所示的结果。图5c为t-non-ncov、p-ncov-n和t-ncov-n组数据pca分析的散点图，pc1和pc2代表总体差异最大的两个主成分，椭圆代表每组样品95％的置信区间。从图4c可以看出t-ncov-n和t-non-ncov、p-ncov-n组之间可以区别开，t-non-ncov和p-ncov-n组之间不能区别开。
59.综上，本发明的方法可以成功区分病毒样本与健康样本。
60.以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。