大豆基因OAS-TL3及其应用

大豆基因oas-tl3及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及大豆基因oas-tl3及其应用。


背景技术：

2.大豆作为世界总蛋白膳食70% 的来源，除第一限制性氨基酸 met 和第二限制性氨基酸色氨酸外,其它各种氨基酸含量均达到或超过fao（food and agriculture organization）标准。蛋白质的质量取决于必需氨基酸间的平衡，met 作为第一限制性氨基酸,限制和降低了其它氨基酸的有效性。cys是蛋白质中的另一种含硫氨基酸,虽然不属于必需氨基酸,但是可以节省和代替met的利用。营养学中蛋白的主要功能是能提供足量需要的氨基酸。改良大豆种子贮藏蛋白的营养品质, 归根结底在于提高含硫氨基酸的相对含量, 使其氨基酸平衡。
3.硫是植物生长发育所必需的营养元素，对植物的生长和发育至关重要。虽然硫含量仅占植株干重的0.1%左右，但却会对植物细胞生长发育的代谢合成等方面产生很大程度影响。若大豆缺硫会限制叶面积生长，叶绿素含量下降，硝酸还原酶活性降低，氮代谢受阻，严重影响大豆的生长发育和食用品质。硫元素是许多酶化反应活性中心的必需元素以及多种植物化合物、辅因子和次级代谢物的重要组成部分，如铁硫簇、多糖、硫脂、维生素、生物素、硫胺素、s-腺苷-甲硫氨酸（s-adenosyl methionine，sam）、谷胱甘肽（glutathione，gsh）、植物螯合肽、半胱氨酸和甲硫氨酸等。
4.土壤中的硫酸盐经植物庞大根系的主动吸收进入植物体内，so
42-经过植物一系列还原与同化反应后进入硫代谢过程中，生成半胱氨酸（cysteine，cys），半胱氨酸既是硫吸收的终点,又是蛋氨酸、谷胱甘肽(gsh)和植物螯合素(pcs)等多种其他含硫代谢物的合成起点, 因此被称为关键的含硫化合物，最后一步由反应o-乙酰丝氨酸硫解酶(o-acetyl-l-serine（thiol）-lyase，oas-tl)催化硫化氢( h2s)和oas形成半胱氨酸(cys)。目前已有研究表明 oastl 基因在植物的植株生长
[3,4]
、光合作用、受精以及抵御病害、氧化胁迫和其它非生物胁迫过程中都扮演着重要的角色。例如，过表达小麦 oastl 基因可以提高烟草适应氧化应激的能力；拟南芥 oas-a1 突变体中，细胞内l-cys 浓度降低，进而改变了谷胱甘肽的氧化还原状态，从而使体内过氧化氢处于平衡的状态。此外，oastl 在硫或氮等饥饿胁迫，氧化应激以及的重金属胁迫过程中都有重要作用。oastl 基因的过表达也可能导致几个植物转化体中硫巯基水平的升高。虽然oas-tl3基因在大豆中有克隆，但对其在大豆中的功能未见相关报道，因此我们对其在大豆中的功能进行研究，对进一步了解植物根系生长发育与蛋白含量机制具有深远意义，也能够为分子水平提高作物根系生长发育与蛋白含量能提供更多遗传资源信息。


技术实现要素：

[0005]
本发明目的是提供一种大豆促进根系的生长发育和提高籽粒蛋白含量硫素同化过程关键酶基因oas-tl3及其应用。
[0006]
大豆oas-tl3基因，它的碱基序列如序列表seq id no.1所示。
[0007]
一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表seq id no.1所示的基因；所述的植物表达载体为pcambia3301。
[0008]
大豆oas-tl3基因在促进植物根系生长育和/或提高植物籽粒蛋白含量的应用；所述的植物为大豆、水稻、小麦或拟南芥；所述的植物为大豆。
[0009]
本发明提供了大豆oas-tl3基因，它的碱基序列如序列表seq id no.1所示；一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表seq id no.1所示的基因；所述的植物表达载体为pcambia3301；大豆oas-tl3基因在促进植物根系生长育和/或提高植物籽粒蛋白含量的应用；本发明相比现有技术具有以下优点：进一步了提高大豆根系的生长发育与籽粒蛋白含量，对培育根系发达的高蛋白新品种有着重要的实际意义。
附图说明
[0010]
图1为oas-tl3基因凝胶电泳检测结果图；图2为oas-tl3蛋白三维空间模型；图3为oas-tl3蛋白与其该基因其它物种蛋白家族成员的氨基酸序列比对结果图；图4为oas-tl3蛋白与其其它物种蛋白家族成员的进化树分析结果图；图5为oas-tl3基因过表达载体图谱；图6过表达株系与受体材料jn74表型比对图。
具体实施方式
[0011]
实施例1 大豆oas-tl3基因的克隆与鉴定一、基因的克隆大豆来源：jn18根系发达的突变体m18；具体方法是：提取第一片三出复叶完全展开后苗期根系组织mrna，并反转录备用。
[0012]
从大豆数据库检索获取oas-tl3的生物学信息,转录本id为（nm_001248188.1）。以glyme18g46920.1基因序列为模板设计特异性扩增引物,同时结合克隆载体的多克隆酶切位点,选择ncoi和bglii酶切位点引入oas-tl3序列两端,特异性扩增引物序列如下所示：f1:oas-tl3-f:5
’‑
taatggcttccctca-3’f2:oas-tl3-r:5
’‑
ttaatcaactgctactggc-3’以cdna为模板,oas-tl3-f和oas-tl3-r为引物,利用takara公司生产的高保真酶primer star max premix(2
×
)进行扩增反应,扩增反应体系如下：
pcr扩增程序为95℃ 5min预变性，95℃ 30s变性,55℃ 35s退火，72℃ 30s延伸,共35个循环后，加0.5ul的taq酶，给3'端加上poly尾巴，最后，72℃下继续延伸10min完成反应，获得的pcr产物用质量比为1%的琼脂糖凝胶电泳检测拍照。
[0013]
结果如图1所示,图中可以看出,目标基因条带清晰,且大小与预测结果一致,说明结果良好。进一步地，将目标基因用axygen公司的胶回收试剂盒进行切胶回收，与pmd-18t载体连接后转化到dh5α大肠杆菌感受态细胞中，用ncoi和bglii进行双酶切验证,筛选阳性克隆子,并送去吉林省库美生物科技有限公司测序。
[0014]
二、oas-tl3基因的生物信息学分析测序结果经mega6.0软件与数据库中的序列比对后,与seq id no.1所示的核苷酸序列一致,说明成功克隆获得oas-tl3基因。经序列分析发现oas-tl3基因编码区全长1119bp,共计编码372个氨基酸。对其蛋白三维结构模型进行预测（图2），该蛋白38.44%为α螺旋（hh），17.20%为延伸链（ee），35.22%为无规则卷曲（cc），9.14%为β转角（tt），综上所述，oas-tl3基因所编码的蛋白质是以α螺旋结构为基础的稳定空间构象。将oas-tl3与其他植物中的同源蛋白进行多序列比对，结果显示，oas-tl3与野生大豆(clycine soja)亲缘关系最近，同源性最高为96.51%，与菜豆(phaseolus vulgaris)、密花豆(spatholobus suberectus)、山黎豆(lathyrus sativus)和木豆（cajanus cajan）同源性分别为 93.12%、91.53% 、91.45%和96.02% (图3)。为了解大豆oas-tl3与其他物种同源蛋白的系统进化关系，基于oas-tl3氨基酸序列构建系统进化树，结果显示oas-tl3与其他豆科植物同属于一个分支，与野生大豆的亲缘关系最近(图4)。
[0015]
实施例2 oas-tl3基因过表达载体的构建用添加了bglii和bsteii酶切位点的过表达载体引物oas-tl3-cloning扩增oas-tl3的cds序列，酶切后连接到双元载体pcambia3301(吉林省高校作物分子育种重点实验室保存)，酶切验证结果显示表达载体中插入了一个约为1119bp左右大小的片段，符合预期目标，因此oas-tl3表达载体构建成功，如图5所示。oas-tl3由35s启动子驱动，pcambia3301载体在t-dna区域带有一个选择标记基因bar，该基因编码草丁膦乙酞coa转移酶(pat)，可催化草丁膦的自由氨基乙酞化，从而使除草剂草丁膦失活，见图4。
[0016]
实施例3 oas-tl3基因的农杆菌介导的大豆子叶结遗传转化一、大豆种子处理1、大豆种子的萌发挑选无虫食、籽粒饱满、无发霉的受体材料jn74的种子，平铺于大培养皿，在通风橱内，利用 naclo25ml hcl 5ml 反应生成 cl2熏蒸，灭菌 16h。在超净工作台中，将经过灭菌处理的大豆轻轻按压在萌发培养基上，种脐朝下，置于组培室暗培养 2-3d。
[0017]
2、大豆种子的预培养在无菌环境内，使用镊子（灭菌处理后）去除大豆种皮，切去子叶节点以下胚芽，并用刀片延胚轴方向纵向切开子叶的背部，保证下胚轴与子叶被平均分开，去除子叶上部 1/3，剩余下胚轴约 3mm 及 2/3 子叶，轻轻按压在预培养培养基上（保证子叶节背部朝上），放在组培室中 3d，暗处培养。
[0018]
二、共培养实施例2构建的载体质粒，转化农杆菌。对于质粒转化农杆菌后长出的单菌落，挑取一半用于菌落pcr验证，再挑下剩余的半个阳性菌落于5ml yep 5ulkan 液体培养基中过夜振荡培养12-14h，28℃，185rpm。第二天，取出菌液转移到50mlyep 50μlkan的三角瓶中继续培养2h，当在600nm处测得菌液浓度的od值为0.7左右时，立即停止振荡，并将其转移至离心管内（50ml），6000rpm，离心10min，丢弃yep液体，加入混有as的ms液体重悬菌体备用（ms：as为1：1000）。
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扩大培养菌液的同时，用刀片轻轻刮预培养处理后的子叶下胚轴处，竖直方向刮三道伤口，不宜太深，并置于侵染液中浸泡，轻轻摇晃20min左右，使菌液充分侵染子叶，侵染结束丢弃液体，取出子叶节摆放在滤纸上以吸干多余液体，将子叶平铺插进培养基上，轴切面朝下，封口膜密封培养皿，置于组培室暗培养3d。
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三、转基因植株的筛选一筛（前15天）：将共培养结束的子叶，伤口部位朝下，斜贴培养基表面 50 度插入不带有bar（筛选标记）的培养基，每五个子叶节为一个平皿，光培养；二筛（后15天）：待子叶节适应筛选培养基后转移到加 bar 的培养基中，继续光培养。
[0021]
四、转基因植株的伸长生根丛生芽经过筛选培养基继续良好生长约3cm时，切掉过度生长的子叶节，修整多余的愈伤组织，利用高温灭菌处理后的镊子将其插入带有bar（筛选标记）的伸长培养基，轻轻按压，使丛生芽朝上，光下培养15天。超净工作台内，当外植体长至4cm时，利用高温灭菌的刀片修整多余的愈伤组织，利用高温灭菌处理后的镊子将其插入生根培养基中，轻轻按压保证子叶节稳定，置培养室中光下培养。
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五、转基因植株的炼苗移栽当观察到生根培养瓶中紧贴子叶节下部有2-4条主根，且主根上生出7-8条须根时，向生根培养瓶中注入无菌水，其高度约为培养基的一半，培养2d即炼苗；2d后用水洗净根部多余培养基，将植株转移至高温灭菌处理后的混合土壤中（营养土为蛭石三倍）即移栽。经除草剂筛选后继续培养至开花结籽粒，留种备用。
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以bar基因、35s、nos,对筛选的阳性植株进行分子检测,初步鉴定转基因大豆是否转化成功。
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六、oas-tl3转基因大豆后代的获得按照上述方法，将初步鉴定为转基因大豆植株的种子（t1代）用除草剂涂抹叶片筛选,获得t1代植株,待t1代植株果荚成熟时,收获转基因t2代种子,以此类推,最终获得了两组稳定遗传的转基因大豆t2代株系,分别为oe3-1和oe3-2。转基因株系在整个生理过程发挥着重要的协调作用。
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实施例4 t2转基因大豆的根进行形态学观察严格挑选实验材料,去杂,选取整齐一致,健康饱满的t2代转oas-tl3基因过表达材料oe3-1、oe3-2和受体材料jn74的种子，将挑好的种子播种于塑料桶内,桶高15cm,上口径直径为15cm, 底部直径为10cm，每桶装土1kg，共18盆，每盆留苗3株，该实验采用完全随机设计,25℃、光照16h、黑暗8h，在三出复叶完全展开后，对其根系的表型数据进行测定分析。分析结果表明，表达株系oe3-1、oe3-2在根总长（tl）、投影面积（sa）、表面积（pa ）、体积（vol ）、平均直径（avgd ）等方面显著高于对照组材料wt(受体材料jn74）（表1）。与对照组材料wt相比，t2代过表达株系oe3-1、oe3-2地下部分根系发育更加健壮发达，地上部分茎秆粗壮叶片浓绿（图6）。
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实施例5 oas-tl3转基因大豆的蛋白含量与氨基酸组分分析对不同株系大豆种子的蛋白含量与各氨基酸组分进行分析结果表明，相对于对照组材料wt，过表达株系oe3-1、oe3-2蛋白质总含量极显著提高了8.60%和8.03%，相对于对照组材料wt,过表达株系oea1、oea2含硫氨基酸中cys无显著差异，met含量有显著提高，其它氨基酸组分中ala、asp、leu、phe、glu与val含量显著提高(表2）。
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（1）大豆苗期根系表型测定 数字扫描仪对不同转基因株系的根系进行平面扫描，用dj-gxg02根系图像分析系统软件对根系长度、直径、表面积、体积、根尖数、分叉数进行分析。
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（2）蛋白质含量，氨基酸组分进行测定使用foss近红外分析仪（丹麦福斯集团公司）对各处理成熟种子的蛋白含量与asp、ala、arg、cys、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、taa、thr、try、tyr、val等氨基酸组分进行测定。
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结论：通过对转基因株系根系表型数据和蛋白含量与氨基酸组分测定分析得出，大豆根系中oas-tl3基因表达调控根系中oas-tl酶活性，进而调控作为gsh前体物之一cys的生成，间接调控对大豆根系生长发育有促进作用的gsh含量，进而调控大豆根系的生长发育情况，对土壤中营养物质等微量矿物质元素的吸收情况，籽粒蛋白与氨基酸组分含量，但其作用机制有待于后续研究中进一步阐明。从而为大豆品种的基因工程改良提供了新的遗传资源。
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以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程,是以本发明技术方案为前提下进行实施,但本发明的保护范围不限于上述的实施例。