苯甲酰胺类化合物及其作为抗肿瘤药物的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一类苯甲酰胺类化合物及其作为抗肿瘤药物的应用。


背景技术：

2.肿瘤发生和发展的原因十分复杂，归根结底都与基因表达及基因表达产物活性异常密切相关。导致肿瘤基因表达及基因表达产物活性异常的因素来自两大方面的改变，即遗传(genetics)和表观遗传(epigenetics)的改变。遗传改变是指基因序列发生了变化，如基因突变、缺失和重组等，在一定类型的肿瘤发生中起着重要的作用。近年来的研究结果愈来愈清晰地表明，表观遗传改变，如环境污染对人体的影响，在肿瘤的发生和发展中具有更为普遍的意义，肿瘤的发生、发展、预后及转归不仅取决于遗传因素，同时也受到表观遗传修饰的影响。
3.表观遗传是指影响基因的转录活性而不涉及dna序列改变的一类基因表达的调控方式，其分子基础主要涉及到两个方面：一个是针对dna的甲基化修饰，另一个是针对染色质组蛋白的乙酰化修饰。染色质的组蛋白乙酰化和去乙酰化是调节基因表达的关键环节之一，而两类酶决定着组蛋白的乙酰化程度，即组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases，hats)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，hdacs)。组蛋白的乙酰化可以激活特定基因的转录过程，而hdac则抑制基因的转录表达。同时，hdac还对非组蛋白蛋白质的乙酰化－去乙酰化过程有着重要影响，包括转录因子、信号传导蛋白、dna修复酶等等，而这些靶蛋白在基因表达的调控方面起着决定性作用。
4.总之，通过对组蛋白及非组蛋白乙酰化过程的影响，hdac在表观遗传调控方面发挥着极为重要的作用，而这一调控机制的异常，则与肿瘤的发生和发展密切相关，针对以hdac这一类影响表观遗传的重要分子靶标开展的小分子药物研发，已经成为目前国际肿瘤靶向治疗领域的热点。
5.自20世纪90年代以来，人们已获得了多种结构不同的hdacs抑制剂，按其结构特点主要分为：异羟肟酸类，羧酸类，苯甲酰胺类，环四肽类，亲电酮类等。尽管hdaci的结构变化多样，但总体上都包含了3个必需结构：
⑴
酶表面识别区，与酶囊的边缘残基紧密接触，包括各种芳环、稠环、芳杂环等；
⑵
连接区，由一定长度的疏水性结构片段组成，与狭窄的囊充分接触，包括脂肪直链、反式苯丙烯、芳杂环等；
⑶
锌离子鳌合基团(zinc binding group，zbg)，与活性部位的锌离子直接作用、与组氨酸和酪氨酸等形成氢键，包括羧基、巯基、异羟肟酸基、苯甲酰胺基、三氟甲基酮基等。
6.苯甲酰胺类hdac抑制剂的zn2 鳌合基团为苯甲酰胺，通常比对应的异羟肟酸类活性低。苯甲酰胺类化合物为选择性抑制剂，主要抑制ⅰ类hdac(包括hdac亚型1、2、3，但不抑制hdac8)和部分ⅱa类hdac，对ⅱb类hdac无抑制作用。这类化合物具有适当人体药代动力学、药效动力学特性和良好的体内外抗肿瘤活性而受到人们的关注，在研药物包括ci-994、ms-275、mgcd0103和西达本胺,
[0007][0008]
其中，西达本胺(chidamide，商品名爱谱沙/epidaza)于2015年1月获准全球上市，适应症为复发及难治性外周t细胞淋巴瘤，是全球首个获准上市的苯甲酰胺类亚型选择性组蛋白去乙酰化酶口服抑制剂。
[0009]
本发明旨在通过药物设计及合成手段获取一系列苯甲酰胺类化合物，进行化合物体外抑酶及抑瘤测试，以发现比上市药物西达本胺更具有开发价值的抗肿瘤药物。


技术实现要素：

[0010]
为了弥补现有技术的不足，本发明公开一类苯甲酰胺类化合物，作为抗肿瘤药物应用，以满足临床应用的需要。
[0011]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0012]
苯甲酰胺类化合物，具有如下式所示的化合物或其药学上可接受的盐：
[0013][0014]
其中，r为氢、甲基、甲氧基、三氟甲基或卤素；
[0015]
y为h或f。
[0016]
上述的苯甲酰胺类化合物，具体包括下述化合物：
[0017]
(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-苄亚甲基-2-氧环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺、
[0018]
(e)-n-(2-氨基-4-氟苯基)-4-((3-苄亚甲基-2-氧环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺、
[0019]
(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-(4-甲基亚苄基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺、
[0020]
(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-(4-氯苄亚甲基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺、
[0021]
(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-(4-氟苄亚甲基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺、
[0022]
(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-(4-甲氧基苄亚甲基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺、或
[0023]
(e)-n-(2-氨基-4-氟苯基)-4-((3-(4-甲氧基亚苄基)-2-氧代环戊基)甲基)氨
基)苯甲酰胺。
[0024]
前述的苯甲酰胺类化合物，所述盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、鞣酸盐、枸橼酸盐、三氟醋酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、对甲苯磺酸或甲磺酸盐。
[0025]
前述的苯甲酰胺类化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0026]
前述的应用，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、鼻咽癌、卵巢癌、膀胱癌、直肠癌、皮肤癌和淋巴瘤。
[0027]
前述的应用，所述肿瘤选自非小细胞肺癌和结直肠癌。
[0028]
本发明所述化合物可以以组合物的形式通过口服、注射等途径施用于需要肿瘤治疗的哺乳动物(包括人)。
[0029]
所述组合物包括治疗有效量的苯甲酰胺类化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
[0030]
所述的载体是指药学领域常规的载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙、碳酸氢钠；另外，还可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和甜味剂。
[0031]
本发明的组合物可以制备成常规的固体制剂，如片剂、胶囊等，用于口服；也可以将其制备成注射剂等剂型用于注射。
[0032]
本发明的组合物的各种剂型可以采用药学领域常规的方法进行制备，其中活性成分苯甲酰胺类化合物的含量为组合物重量的0.1％～99.5％(重量比)。
[0033]
本发明所述的苯甲酰胺类化合物在临床上可以通过口服或注射方式对哺乳动物(包括人)进行给药，其中尤以口服方式最佳。用药剂量为每日0.0001mg/kg～200mg/kg体重。最佳剂量视个体而定，通常开始时剂量较小，然后逐渐增加用量。
[0034]
与现有技术相比，本发明所述化合物具有以下有益效果：
[0035]
1)本发明所述化合物具有良好的hdac酶抑制活性，对人体多种肿瘤细胞均有很好的抑制活性。
[0036]
2)本发明所述化合物在有效抑制肿瘤细胞的同时，对正常细胞的抑制作用弱，表现出较好的选择抑制活性，具有很好的抗肿瘤临床应用前景。
[0037]
综上所述，本发明所述的化合物作为抗肿瘤药物应用时具有更小的毒副作用，更易于作为抗肿瘤药物使用。
具体实施方式
[0038]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0039]
实施例1：苯甲酰胺类化合物，具有如下式所示的化合物或其药学上可接受的盐：
[0040][0041]
其中，r为氢、甲基、甲氧基、三氟甲基或卤素；
[0042]
y为h或f。
[0043]
为方便理解本发明，结构通式化合物优选了下述具体的化合物及其盐，但本发明不限于下述化合物：
[0044]
[0045]
[0046][0047]
表1
[0048]
所述的苯甲酰胺类化合物可以与无机酸、有机酸成盐，得到苯甲酰胺类化合物的盐形式物质，所述的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、鞣酸盐、枸橼酸盐、三氟醋酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、对甲苯磺酸或甲磺酸盐。
[0049]
优选地，苯甲酰胺类化合物的盐形式物质，所述的盐选自盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸氢盐、苹果酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、对甲苯磺酸或甲磺酸盐。
[0050]
更优选地，苯甲酰胺类化合物的盐形式物质，所述的盐选自盐酸盐、乙酸盐、硫酸盐、酒石酸盐或苹果酸盐。
[0051]
根据上述苯甲酰胺类化合物的盐形式，由所述的苯甲酰胺类化合物与相应的无机酸、有机酸成盐得到，所述的无机酸或有机酸选自酸、氢溴酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、鞣酸、枸橼酸、三氟醋酸、苹果酸、马来酸、琥珀酸、对甲苯磺酸或甲磺酸。
[0052]
苯甲酰胺类化合物制备通法如下：
[0053][0054]
将原料1(1mmol)、邻苯二胺(或4-氟苯-1,2-二胺)(1mmol)、hbtu(0.379g，1mmol)依次加入10ml n，n-二甲基甲酰胺中，保持冰浴冷却滴加三乙胺(2mmol)，再于室温继续搅拌4小时。将反应液倒入冰水中，盐酸调节ph到7-9左右，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩有机相，剩余物经柱层析或重结晶纯化得目标化合物。
[0055]
上述制备方法还可以进一步包括苯甲酰胺类化合物与无机酸(或无机碱)、有机酸(或有机碱)反应，冷却析出化合物的盐。
[0056]
本发明所述化合物可以以组合物的形式通过口服、注射等途径施用于需要肿瘤治疗的哺乳动物(包括人)。
[0057]
所述组合物包括治疗有效量的苯甲酰胺类化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
[0058]
所述的载体是指药学领域常规的载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤
维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙、碳酸氢钠；另外，还可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和甜味剂。
[0059]
本发明的组合物可以制备成常规的固体制剂，如片剂、胶囊等，用于口服；也可以将其制备成注射剂等剂型用于注射。
[0060]
本发明的组合物的各种剂型可以采用药学领域常规的方法进行制备，其中活性成分苯甲酰胺类化合物的含量为组合物重量的0.1％～99.5％(重量比)。
[0061]
本发明所述的苯甲酰胺类化合物在临床上可以通过口服或注射方式对哺乳动物(包括人)进行给药，其中尤以口服方式最佳。用药剂量为每日0.0001mg/kg～200mg/kg体重。最佳剂量视个体而定，通常开始时剂量较小，然后逐渐增加用量。
[0062]
实施例2：(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-苄亚甲基-2-氧环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺(t1)的合成：
[0063][0064]
按照合成通法进行制备，合成路线如下：
[0065][0066]
按照合成通法制备t1:将原料1(1mmol)、邻苯二胺(1mmol)、hbtu(0.379g，1mmol)依次加入10ml n，n-二甲基甲酰胺中，保持冰浴冷却滴加三乙胺(2mmol)，再于室温继续搅拌4小时。将反应液倒入冰水中，盐酸调节ph到7-9左右，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩有机相，剩余物经柱层析或重结晶纯化得化合物t1。esi-ms m/z[m h] :412.19；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:1.08(t,2h,j＝8.0hz),1.75(m,2h),2.30(m,1h),3.23(m,1h),3.50(m,1h),5.12(s,2h),6.48(t,2h,j＝8.0hz),6.69(d,2h,j＝12.0hz),7.05(d,2h,j＝8.0hz),7.27(d,2h,j＝12.0hz),7.43(s,1h),7.64(d,2h,j＝8.0hz),7.77(d,2h,j＝8.0hz),8.07(s,1h),9.36(s,1h)。
[0067]
实施例3：(e)-n-(2-氨基-4-氟苯基)-4-((3-苄亚甲基-2-氧环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺(t2)的合成：
[0068]
[0069]
按照合成通法制备t2。
[0070]
esi-ms m/z[m h] :412.19；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:1.07(t,2h,j＝8.0hz),1.76(m,2h),2.31(m,1h),3.22(m,1h),3.57(m,1h),5.12(s,2h),6.48(t,1h,j＝8.0hz),6.67(d,2h,j＝12.0hz),7.05(d,2h,j＝8.0hz),7.27(d,2h,j＝12.0hz),7.43(s,1h),7.64(d,2h,j＝8.0hz),7.79(d,2h,j＝8.0hz),8.11(s,1h),9.39(s,1h).
[0071]
实施例4：(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-(4-甲基亚苄基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺(t3)的合成：
[0072][0073]
按照合成通法制备t3。
[0074]
esi-ms m/z[m h] :426.21；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:1.08(t,2h,j＝8.0hz),1.75(m,2h),2.30(m,1h),3.23(m,1h),3.50(m,1h),3.82(s,3h),5.12(s,2h),6.48(t,2h,j＝8.0hz),6.69(d,2h,j＝12.0hz),7.05(d,2h,j＝8.0hz),7.27(d,2h,j＝12.0hz),7.43(s,1h),7.64(d,2h,j＝8.0hz),7.77(d,2h,j＝8.0hz),8.07(s,1h),9.36(s,1h)。
[0075]
实施例5：(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-(4-氯苄亚甲基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺(t4)的合成：
[0076][0077]
按照合成通法制备t4:
[0078]
esi-ms m/z[m h] :446.19；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:1.12(t,2h,j＝8.0hz),1.76(m,2h),2.31(m,1h),3.24(m,1h),3.57(m,1h),5.12(s,2h),6.47(t,1h,j＝8.0hz),6.60(d,2h,j＝12.0hz),7.09(d,2h,j＝8.0hz),7.27(d,2h,j＝12.0hz),7.43(s,1h),7.63(d,2h,j＝8.0hz),7.83(d,2h,j＝8.0hz),8.11(s,1h),9.30(s,1h)。
[0079]
实施例6：(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-(4-氟苄亚甲基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺(t5)的合成：
[0080][0081]
按照合成通法制备t5。
[0082]
esi-ms m/z[m h] :430.18；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:1.10(t,2h,j＝8.0hz),1.76(m,2h),2.31(m,1h),3.24(m,1h),3.57(m,1h),5.12(s,2h),6.47(t,1h,j＝8.0hz),6.58(d,2h,j＝12.0hz),7.11(d,2h,j＝8.0hz),7.27(d,2h,j＝12.0hz),7.40(s,1h),7.63(d,2h,j＝8.0hz),7.80(d,2h,j＝8.0hz),8.16(s,1h),9.35(s,1h)。
[0083]
实施例7：(e)-n-(2-氨基苯基)-4-((3-(4-甲氧基苄亚甲基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺(t6)的合成：
[0084][0085]
按照合成通法制备t6。
[0086]
esi-ms m/z[m h] :442.20；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:1.09(t,2h,j＝8.0hz),1.74(m,2h),2.32(m,1h),3.23(m,1h),3.50(m,1h),3.82(s,3h),5.12(s,2h),6.48(t,2h,j＝8.0hz),6.66(d,2h,j＝12.0hz),7.08(d,2h,j＝8.0hz),7.27(d,2h,j＝12.0hz),7.41(s,1h),7.60(d,2h,j＝8.0hz),7.75(d,2h,j＝8.0hz),8.09(s,1h),9.33(s,1h)。
[0087]
实施例8：(e)-n-(2-氨基-4-氟苯基)-4-((3-(4-甲氧基亚苄基)-2-氧代环戊基)甲基)氨基)苯甲酰胺(t7)的合成：
[0088][0089]
按照合成通法制备t7。
[0090]
esi-ms m/z[m h] :460.21；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:1.04(t,2h,j＝8.0hz),1.75(m,2h),2.32(m,1h),3.21(m,1h),3.50(m,1h),3.82(s,3h),5.12(s,2h),6.48(t,1h,j＝8.0hz),6.70(d,2h,j＝12.0hz),7.05(d,2h,j＝8.0hz),7.27(d,2h,j＝12.0hz),7.46(s,1h),7.69(d,2h,j＝8.0hz),7.75(d,2h,j＝8.0hz),8.11(s,1h),9.36(s,1h)。
[0091]
实施例9：化合物体外hdac1酶抑制活性
[0092]
采用小鼠组蛋白去乙酰化酶1(hdac1)elisa试剂盒测试化合物对hdac1抑酶ic50测试，实验操作参照试剂盒说明书进行。
[0093]
操作步骤：
[0094]
1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；。
[0095]
2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0096]
3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
[0097]
4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
[0098]
5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
[0099]
6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
[0100]
7.显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
[0101]
8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
[0102]
9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0103]
实验结果见表1：
[0104]
化合物hdac1ic
50
(μm)西达本胺0.640t10.521t21.419t30.100t40.631t50.403t60.222t72.569
[0105]
表2
[0106]
从上表可见，从上表可见，本发明化合物对对hdac1显示较强的抑制活性，其中化合物t1,t3,t4,t5和t6抑制活性优于阳性对照药西达本胺。
[0107]
实施例10：化合物抗增殖活性测试
[0108]
选择肿瘤细胞hct116(人结肠癌细胞)、a549(人肺腺癌细胞)和正常细胞mrc-5(人胚肺细胞)；以西达本胺为对照药物，采用cck-8法进行抗增殖活性测试。具体结果如表3(单位为：ic
50
μm)：
[0109][0110]
表3
[0111]
从上表可见，进行测试的本发明部分化合物具有较好的抗肿瘤细胞增殖活性，其中,化合物对hct116(人结肠癌细胞)和a549(人肺腺癌细胞)抗增殖活性优于西达本胺。同时本发明化合物相对于对照药物，对正常细胞的抑制活性较弱，具有更低的毒副作用，预示其作为抗肿瘤药物使用时具有更低的毒副作用，易于作为肿瘤药物使用。
[0112]
实施例11：
[0113]
苯甲酰胺类化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0114]
片剂制备：
[0115]
制备方法：将实施例2-8中任一化合物或其药用盐与蔗糖、玉米淀粉混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸钙，混合均匀，压片。每片重200mg，活性成分含量为10mg。
[0116]
实施例12：苯甲酰胺类化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0117]
针剂制备:
[0118]
实施例2-8中任一的化合物20mg；
[0119]
注射用水80mg；
[0120]
制备方法：将活性成分溶解与注射用水，混合均匀，过滤，将所获得的溶液在无菌条件下分装与安瓿瓶中，每瓶10mg，活性成分含量为2mg/瓶。
[0121]
综上所述，药理试验表明，本发明所述化合物，对hdac1酶具有较强的抑制作用，其中化合物t1,t3,t4,t5和t6抑制活性优于阳性对照药西达本胺。
[0122]
选取本发明化合物进行抗增殖试验测试，实验结果显示本发明化合物具有较好的抗肿瘤细胞增殖活性，其中,化合物对hct116(人结肠癌细胞)、a549(人肺腺癌细胞)抗增殖活性优于阳性对照西达本胺，且对正常细胞的抑制活性较弱，具有更低的毒副作用，预示本发明化合物作为抗肿瘤药物使用时具有更低的毒副作用。
[0123]
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。