基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let-7a检测试剂盒及其使用方法

基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子let-7a检测试剂盒及其使用方法
技术领域
1.本发明属于生物分析领域，涉及基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子let-7a检测试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.microrna是一种非编码、小片段（约20-22基核苷酸长度）、单链的rna分子，在不同的生理过程中起着重要作用。许多证据表明，作为一种新的基因调节因子，microrna可以抑制基因的表达，在哺乳动物体内microrna参与调控超过60%的蛋白编码基因的活性，并且microrna表达的改变与人体的生理机能紊乱，尤其是肿瘤过程密切相关。因此microrna已被选作许多疾病包括各种癌症早期诊断中的生物标志物。let-7 mirna 家族有 12 个成员，其中，let-7a 是重要的肿瘤抑制因子之一。let-7a 的异常表达将导致多种癌症，其低表达与正常细胞的分化不良有关，并可导致侵略性癌症的发展，例如前列腺癌、胃癌和宫颈癌。精确检测人体中某些 microrna 的浓度，这将有助于我们进一步了解某些癌症的发病机理。
3.目前，由于microrna 的序列同源性强，浓度低且易于降解，想要实现对mirna 的高灵敏度检测并不容易。检测mirna的最常用方法是northern印迹杂交，rt-pcr和 mirna微阵列。这些方法已成功应用于临床应用和其他基础研究中的 mirna 检测，但是northern印迹杂交法灵敏度有限，操作复杂，需要放射性同位素标记，严重破坏环境。虽然rt-pcr和芯片检测方法具有较高的检测灵敏度，但其生产成本高或操作步骤复杂。近年来，核酸等温扩增由于其扩增速度快、能有效提高传感器的灵敏度和准确性等优点而引起了人们对其引入到 mirna 检测中的研究兴趣。扩增方法包括杂交链式反应、滚环扩增反应、双链特异性核酸酶扩增和链置换扩增等。同时各种信号放大技术与各种信号传感器相结合，如荧光(fl)、电化学发光(ecl)、和表面增强拉曼散射也被开发用于高灵敏度的mirnas测量。在这些方法中，电化学方法耗时较长、操作难度高且重现性较差等一般性缺点；而化学发光法需要额外修饰活性物质且技术成本较高。荧光光谱法因其测试操作简单、成本低等优点而被广泛使用。因此开发一种荧光信号放大的灵敏检测低丰度microrna的核酸生物传感器仍具有重要意义。专利cn105274194a描述了一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法。利用磁珠连接的脱氧核酶与目标物let7a杂交后，可以切断let7a；利用切断后的产物，进行两次剪切聚合的循环，实现信号的放大；利用剪切聚合后的产物进行环介导放大反应，嵌插荧光试剂进行荧光检测，可以计算let7a的浓度，其检测限可达10-18
mol/l。该专利通过磁珠回收实现了较低的背景信号，且在剪切酶和聚合酶的协同作用下使得信号循环放大，最终实现了生物传感器的高灵敏度检测，但仍然存在操作复杂，多种酶的使用导致缓冲液体系兼容问题。本技术利用熵驱动的链置换反应与外切酶的剪切特性，避免了多种酶的同时使用，操作简单，可实现对目标的快速灵敏检测。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提出一种基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子let-7a检测试剂盒及其使用方法。
5.本发明的技术方案是这样实现的：基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子let-7a检测试剂盒，包括a1链、a2链、a3链、q链、f链、辅助探针、缓冲液体系和外切酶exoⅲ。
6.所述a1链序列为5
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cagagactctctacgct-(fam)
–
actaggactct-3’、a2链序列为5
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agtaggttgtatagtttccctgccatggatcgacc-3’、a3链为5
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bhq-agcgtagagagtctctggggaaactatacaacctactacctca-3’、q链序列为5
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tccatggcagggaaactatacat-(bhq)-cctact-3’、f链序列为5
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fam-atgtatagtttccctgccatggagtatga-3’、辅助探针的序列为5
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agtaggttgtatagtttccccagagactctctacgctacgcat-3’。
7.所述缓冲液体系为1
ꢀ×ꢀ
neb buffer1(10 mm bis-tris-propane-hcl, 10 mm mgcl2, 1 mm dtt, ph=7)，外切酶exoⅲ的浓度为600 u/ml。
8.上述的肿瘤抑制因子let-7a检测试剂盒的使用方法，步骤如下：（1）配制a1链溶液、a2链溶液和a3链溶液，然后混匀经孵育，得多功能三链复合底物；（2）配制q链溶液和f链溶液，混匀后经孵育，得dna双链q f；（3）将步骤（1）中的多功能三链复合底物和待测液混合后，依次加入辅助探针和缓冲液体系，孵育后再加入步骤（2）中的dna双链q-f和外切酶exoⅲ，再孵育、加热使外切酶exoⅲ失活并利用荧光光度计收集荧光信号；（4）将步骤（3）的荧光信号带入标准曲线计算待测溶液中肿瘤抑制因子let-7a的含量。
9.所述步骤（1）中a1链溶液、a2链溶液和a3链溶液的浓度均为10 μm，a1链溶液、a2链溶液和a3链溶液的体积比为1:1:1。
10.所述步骤（2）中q链溶液和f链溶液的浓度均为10 μm，q链溶液和f链溶液的体积比为1:1。
11.所述步骤（1）、（2）中孵化的条件为37℃金属浴中孵化2 h。
12.所述步骤（3）中辅助探针的浓度为10 μm、dna双链q-f的浓度为5μm以及外切酶exoⅲ的浓度为600 u/ml。
13.所述收集荧光信号时采用的激发波长为492 nm，发射波长的检测范围为490nm-650nm，扫描速度为1200nm/min；孵育、加热的具体条件为37 ℃下孵育90min，然后75℃加热20 min。
14.所述步骤（4）中标准曲线为y=19463.8396x 109619.3636；r2=0.99041。
15.本发明具有以下有益效果：1、本技术检测方法的技术原理是：在目标基因存在的时候，通过链置换反应，辅助目标基因参与循环并使三链复合结构中的荧光基团与猝灭基团远离从而释放荧光信号，同时置换下大量的a2单链，随后a2单链通过脚点介导的置换反应与dna双链轨道q f中的修饰有荧光团淬灭剂的dna链杂交释放带有开启荧光的fam修饰的dna链，随后在加入的exoⅲ外切酶作用下，荧光团猝灭剂修饰的dna链与a2链杂交，可以从其凹入的3端水解，以循环再生
mgcl2, 1 mm dtt, ph=7)，外切酶exoⅲ的浓度为600 u/ml。
24.本技术的试剂盒可构建高灵敏生物传感器：（1）实验前，将浓度为10 μm、等体积的10 μm dna单链a1、a2、a3链在37℃金属浴中孵化2 h，得到多功能三链复合底物。按上述同样操作得到dna双链q f。；（2）取(1)中1.5 μl的多功能三链复合底物，2 μl的10
×
neb buffer1（100 mm mgcl2、 500 mm nacl，10mm二硫苏糖醇，100 mm tris
ꢀ–ꢀ
hcl ,ph= 7.9）和11.5 μl超纯水混合，然后加入1μl 10 μm辅助探针和1μl浓度为125 nm，50 nm，25 nm，10 nm，5 nm，1 nm，500 pm，250 pm，100 pm，50 pm的 let-7a标准水溶液，在37℃下孵育1 h。随后将2 μl 5 μm的dna双链q f和1μl 600 u/ml的exo
ꢀⅲ
添加到得到的反应样品中，并在37 ℃下孵育90min，然后75℃加热20分钟以使酶灭活。
25.其次，检测肿瘤抑制因子let-7a：（3）将180 μl的超纯水添加至步骤（2）所得的反应混合物中，然后进行荧光测量；在检测荧光信号变化时，激发波长为492 nm，发射波长的检测范围为490nm-650nm，扫描速度为1200nm/min。荧光强度与目标基因浓度有确定的关系，从而实现对肿瘤抑制因子let-7a的灵敏检测；（5）根据检测到的荧光信号变化值及其对应的let-7a的标准溶液浓度，绘制标准曲线；（6）用 1%的人血清代替（2）中的超纯水，配制四种不同浓度的let-7a待测液，用待测液代替标准溶液进行检测，根据检测到的荧光信号和标准曲线信号的对比，考察本方法在检测复杂生物基质中的靶dna的可行性。
26.图1是本发明所涉及的一种链置换和酶辅助双阶循环信号放大的生物肿瘤抑制基因let-7a检测过程及原理图。在目标基因存在的时候，通过链置换反应，辅助目标基因参与循环并使三链复合结构中的荧光基团与猝灭基团远离从而释放荧光信号，同时置换下大量的a2单链，随后a2单链通过脚点介导的置换反应与dna双链轨道q f中的修饰有荧光团淬灭剂的dna链杂交释放带有开启荧光的fam修饰的dna链，随后在加入的exoⅲ外切酶作用下，荧光团猝灭剂修饰的dna链与a2链杂交，可以从其凹入的3端水解，以循环再生a2链，产生很强的荧光信号。在没有目标基因条件下，链置换反应不能发生，从而荧光信号低。荧光信号强度与目标基因浓度有确定的关系，从而实现对肿瘤抑制因子let-7a的灵敏检测。
27.图2是检测目标基因let-7a的荧光谱图。由图2可以看出，在目标基因不存在时，荧光强度较弱（曲线a）；而当目标基因存在时，在510nm处出现较强的荧光信号(曲线b)，加入exoⅲ外切酶后荧光强度进一步增强(曲线c)，其峰高与目标基因let-7a浓度相关。
28.图3a是按照实施例1对标准样检测得到的荧光强度变化与检测目标物浓度对应的响应曲线。y=19463.8396x 109619.3636；r2=0.99041。在50 pm至125 nm的目标基因浓度范围内，荧光强度与目标基因浓度对数存在良好的线性关系，且检测限低至16.7 pm，（图3b）。
29.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。