实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源DNA自动删除的重组表达载体及其制备方法和应用

实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源dna自动删除的重组表达载体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源dna自动删除的重组表达载体及其制备方法，还涉及利用该重组表达载体在转基因家蚕杂交一代生殖细胞中实现外源dna自动删除的应用。


背景技术：

2.科学界对转基因生物的安全性研究，主要集中于转基因植物特别是转基因农作物和转基因鱼类、贝类等水生动物以及转基因家禽、家畜等大型动物在食品、医药和农业等领域的安全评估研究，而对于具有重要科研与经济价值的农业昆虫安全转基因技术研究的报道则较为有限。近年来，随着转基因技术逐渐被广泛应用于家蚕(bombyx mori)基因功能鉴定的基础研究和品种改良的应用研究领域，越来越多的研究人员意识到，转基因家蚕的生物安全问题是转基因家蚕新品种推广应用过程中不容忽视的关键问题。
3.家蚕作为非食用性的经济昆虫，其转基因安全问题主要体现在转基因操作技术安全方面。目前创制转基因家蚕的主要方法，仍旧是基于转座子(主要是piggybac转座子)介导外源基因在基因组随机整合的家蚕种系转化技术。转座子随机整合所引起的诸如不可预知的基因表达变化、内源基因结构破坏、转基因个体生长发育受限等非预期负面效应，会严重影响转基因家蚕自身的安全。
4.此外，基于转座子系统建立的转基因家蚕，还存在3个方面的生态环境安全隐患问题：(1)筛选标记基因和转座子骨架等非目标基因序列在转基因家蚕基因组的保留；(2)转座子在家蚕基因组的不稳定整合现象；(3)携带外源基因的转基因蚕种在实际大规模推广应用过程中具有不可控性。在早期研究中，专利号为zl201310181854.x的中国专利建立了一种基于phic31/att系统的重组酶介导盒式交换(phic31-rmce)反应结合piggybac转座子系统实现外源基因在转基因家蚕基因组预先确定的染色体位点(靶位点)精确定点整合/替换的策略。利用该策略不但能够克服piggybac转座子随机整合可能引起的非预期负面效应对转基因家蚕生长发育带来不良影响的生物安全隐患，而且还有助于在一定程度上消除转座子随机整合位置效应和插入突变以及非目标基因序列对目标基因表达及基因功能研究的影响。2012年，西南大学long等率先利用flp/frt位点特异性重组系统，成功实现了家蚕个体基因组水平筛选标记基因的定点删除。最近，long等证实胚胎显微注射flp重组酶mrna和杂交引入flp重组酶持续表达的方式，均能够有效提高frt位点锚定的筛选标记基因在转基因家蚕基因组的定点删除效率，并进一步建立了基于flp/frt系统的转基因家蚕筛选标记基因的可诱导性定点删除技术。此外，专利号为zl201510055652.x的中国发明专利公开了一种利用复合型piggybac重组载体实现外源目标基因在家蚕基因组稳定整合、表达以及精确替换的方法，从而有效克服由转座子随机整合引起的转基因家蚕自身安全问题，以及由转座子整合不稳定性和非目标基因序列保留所带来的生态环境安全隐患问题。
5.综上所述，通过联合复合型piggybac转座系统和不同的位点特异性重组系统建立
的安全转基因策略，已经能够在一定程度上解决转基因家蚕自身的安全及其所带来的生态环境安全隐患。但是，携带外源基因的转基因蚕种在实际大规模推广应用过程中可能发生的生产和生态环境安全问题目前尚未得到有效解决。众所周知，蚕业只用家蚕日系原种
×
华系原种的杂交一代(f1)蚕种进行大面积生产，蚕农在农村饲养家蚕的过程中无法施行对蚕种的严格管理与控制，无法防止转基因蚕种的不可控扩散，所以转基因家蚕目前只能在实验室或蚕种场严格管理的转基因蚕房中小规模饲养。此外，虽然丝织品加工企业传统的“干茧缫丝”工艺会通过“烘茧”工序将f1代蚕蛹烘杀，但是近年来以广西为代表的我国蚕业生产大省，近90％的缫丝企业已经开展了不经过“烘茧”工序的“鲜茧缫丝”技术，该技术具有持续保持热度甚至扩大化的发展趋势。因此，如果利用“鲜茧缫丝”技术处理转基因f1蚕茧，则无法避免由此产生的转基因f1鲜茧蛹带来的生态环境安全隐患。
6.由此可见，无论是从家蚕的大规模饲养还是蚕茧的加工过程而言，关于转基因蚕种的安全控制问题都仍旧是目前最根本和最亟待解决的重要问题之一。这一问题将直接影响转基因家蚕被批准应用和推广的安全评估，阻碍转基因家蚕的大规模推广应用和产业化发展。但是，目前国内外尚没有针对转基因蚕种的安全控制问题而提出有效策略与方法的报道。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源dna自动删除的重组表达载体；本发明的目的之二在于提供所述转重组表达载体的制备方法；本发明的目的之三在于提供利用所述重组表达载体实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源dna自动删除的方法和应用。
8.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.1、实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源dna自动删除的重组表达载体，其为双元转基因表达载体，包括由家蚕生殖腺特异表达基因启动子调控gal4蛋白表达的转基因激活载体和由uas元件调控下游flp基因表达的转基因效应载体这两部分；其中，转基因激活载体包括不同的2个，转基因效应载体为1个。
10.优选的，所述转基因激活载体包括载体骨架、激活原件表达框和目的基因表达框。
11.进一步优选的，所述载体骨架为含有家蚕绿色眼荧光筛选标记(3
×
p3-egfp)的piggybac重组载体pbac{3
×
p3-egfpaf}；所述激活原件表达框包括家蚕生殖腺组织特异型基因启动子rshp1p(核苷酸序列为seq id no.1)或nanosp(核苷酸序列为seq id no.2)、优化型gal4蛋白基因(gal4nfκb)编码序列(核苷酸序列为seq id no.3)以及sv40终止子序列(核苷酸序列为seq id no.4)；所述目的基因表达框是以家蚕丝素重链启动子(fibhp)启动的红色荧光蛋白(dsred)基因融合轻链结合位点序列(lbs)组成(核苷酸序列为seq id no.5)。
12.进一步优选的，所述转基因激活载体还包含用于锚定激活原件表达框的loxp位点(核苷酸序列为seq id no.6)和lox2272位点(核苷酸序列为seq id no.7)，锚定目的基因表达框的2个同向排列attp位点(核苷酸序列为seq id no.8)以及同时锚定激活原件表达框和目的基因表达框的2个同向排列的frt位点(核苷酸序列为seq id no.9)。
13.优选的，所述转基因效应载体包括载体骨架、效应原件表达框和目的基因表达框。
14.进一步优选的，所述载体骨架为含有家蚕红色眼荧光筛选标记(3
×
p3-dsred)的piggybac重组载体pbac{3
×
p3-dsredaf}；所述效应原件表达框包括上游激活序列(upstream activator sequence，uas)元件(核苷酸序列为seq id no.10)、flp基因编码序列(核苷酸序列为seq id no.11)以及sv40终止子序列(核苷酸序列为seq id no.4)；所述目的基因表达框是以家蚕丝素重链启动子(fibhp)启动的增强绿色荧光蛋白(egfp)基因融合轻链结合位点序列(lbs)组成(核苷酸序列为seq id no.12)。
15.进一步优选的，所述转基因效应载体还包含用于锚定目的基因表达框的2个同向排列attp位点(seq id no.8)以及同时锚定效应原件表达框和目的基因表达框的2个同向排列的frt位点(seq id no.9)。
16.2、上述重组表达载体的制备方法，包括：
17.(a)转基因激活载体的制备：通过无缝连接或酶切连接等手段，将frt、loxp、rshp1p、gal4nfκb、sv40、lox2272、attp、fibhp、dsred、lbs、attp和frt片段顺次连接至pslfa1180fa载体，或者将frt、loxp、nanosp、gal4nfκb、sv40、lox2272、attp、fibhp、dsred、lbs、attp和frt片段顺次连接至pslfa1180fa载体；通过asci/fsei双酶切回收frt-loxp-rshp1p-gal4nfκb-sv40-lox2272-attp-fibhp-dsred-lbs-attp-frt，或者frt-loxp-nanosp-gal4nfκb-sv40-lox2272-attp-fibhp-dsred-lbs-attp-frt表达框片段，然后连接至asci/fsei双酶切的pbac{3
×
p3-egfpaf}载体骨架，即得；
18.(b)转基因效应载体制备：将frt、uas、flp、sv40、attp、fibhp、egfp、lbs、attp和frt顺次连接至pslfa1180fa载体；通过asci/fsei双酶切回收frt-uas-flp-sv40-attp-fibhp-egfp-lbs-attp-frt表达框片段，将其连接至asci/fsei双酶切的pbac{3
×
p3-dsredaf}载体骨架，即得到家蚕转基因效应载体pbac{3
×
p3-dsred；frt-uas-flp-sv40-attp-fibhp-egfp-lbs-attp-frt}。
19.优选的，步骤(a)的具体方法为：
20.(a-1)通过无缝连接或酶切连接等手段，将frt、loxp、rshp1p、gal4nfκb、sv40、lox2272、attp、fibhp、dsred、lbs、attp和frt片段顺次连接至pslfa1180fa载体；通过asci/fsei双酶切回收frt-loxp-rshp1p-gal4nfκb-sv40-lox2272-attp-fibhp-dsred-lbs-attp-frt表达框片段，将其连接至asci/fsei双酶切的pbac{3
×
p3-egfpaf}载体骨架，即得到家蚕转基因激活载体pbac{3
×
p3-egfp；frt-loxp-rshp1p-gal4nfκb-sv40-lox2272-attp-fibhp-dsred-lbs-attp-frt}。
21.(b-2)通过无缝连接或酶切连接等手段，将frt、loxp、nanosp、gal4nfκb、sv40、lox2272、attp、fibhp、dsred、lbs、attp和frt片段顺次连接至pslfa1180fa载体；通过asci/fsei双酶切回收frt-loxp-nanosp-gal4nfκb-sv40-lox2272-attp-fibhp-dsred-lbs-attp-frt表达框片段，将其连接至asci/fsei双酶切的pbac{3
×
p3-egfpaf}载体骨架，即得到家蚕转基因激活载体pbac{3
×
p3-egfp；frt-loxp-nanosp-gal4nfκb-sv40-lox2272-attp-fibhp-dsred-lbs-attp-frt}。
22.3、上述重组表达载体在实现转基因家蚕杂交一代生殖细胞外源dna自动删除中的应用。
23.4、利用上述重组表达载体制备杂交一代双转基因家蚕的方法，具体步骤如下：
24.(1)先将上述重组piggybac转基因载体(包括2个不同的转基因激活载体和1个转
基因效应载体)和辅助质粒pha3pig转化非滞育或解除滞育的g0代蚕卵，将孵化的g0代家蚕饲养至化蛾，将g0代蚕蛾回交制种以获得g1代蚕卵，在g1代家蚕中筛选单拷贝转基因家蚕，然后以蛾区为单位单独饲养即建立起2种不同的转基因激活品系和1种转基因效应品系；
25.(2)将步骤(1)筛选获得的单拷贝转基因插入的激活系家蚕与单拷贝转基因插入的效应系家蚕杂交制种获得杂交一代家蚕，筛选同时含有2种眼荧光标记(3
×
p3-egfp和3
×
p3-dsred)的双转基因家蚕，即获得杂交一代双转基因家蚕；
26.(3)将步骤(2)中获得的杂交一代双转基因家蚕饲养至化蛾，将杂交一代双转基因雌雄蛾自交制种或者将其与非转基因家蚕回交制种获得杂交二代家蚕。由于生殖腺特异表达基因启动子调控gal4蛋白在杂交一代双转基因家蚕的生殖细胞中特异性表达，进而激活flp重组酶表达并实现位于同向排列frt位点对之间激活原件表达框、效应原件表达框和目的基因表达框dna序列的自动删除，因此最终获得的杂交二代家蚕基因组中将不含有激活原件表达框、效应原件表达框和目的基因表达框，确保消除外源目的基因在传代过程中可能发生逃逸的生物安全隐患；而在非生殖细胞中，由于生殖腺特异表达基因启动子不具有启动活性，无法调控gal4基因表达，从而抑制了flp重组酶表达，因此外源目的基因在非生殖细胞中得以保留，最终确保杂交一代双转基因家蚕表达转基因产物的获得及转基因产物经济性状的实现。
27.本发明的有益效果在于：
28.本发明首先构建由家蚕生殖腺特异表达基因启动子调控gal4蛋白表达的转基因激活载体和由uas元件调控下游flp基因表达的转基因效应载体，然后将转基因激活载体和效应载体分别转化家蚕并筛选单拷贝转基因家蚕建立激活系和效应系，再将激活系与效应系家蚕杂交获得双转基因杂交一代家蚕，由于生殖腺特异性表达基因启动子调控gal4蛋白在生殖细胞中特异表达，进而激活flp重组酶表达并完成双转基因家蚕杂交一代生殖细胞基因组中位于2个同向排列frt位点对间目标外源dna序列的组织特异性删除，最终获得基因组中不含目标外源dna序列的后代家蚕，从而既可实现外源有益蛋白在转基因家蚕特定组织或器官中的表达(即目的经济性状的实现)，又可避免转基因在后代蚕种保留所带来的生物安全隐患。具体分析如下：
29.1)本发明对传统gal4序列进行了改造，并根据家蚕基因组序列数据库中家蚕丝腺表达内源基因的序列密码子偏好性，对gal4序列进行了优化设计，使人工改造的gal4基因(gal4nfκb)更有利于在双转基因家蚕个体生殖腺中激活uas下游flp基因的表达；
30.2)本发明首次以家蚕作为动物模式，建立了较为完善的基于位点特异性重组系统和gal4/uas系统的家蚕安全转基因操作技术体系，并利用该技术创制新型杂交一代转基因家蚕种，通过在杂交一代生殖细胞基因组中删除外源目的基因，而在杂交一代非生殖细胞基因组中保留外源目的基因，最终达到同时保证目的经济性状的实现和最大限度地消除转基因在传代过程中发生逃逸现象所带来生物安全隐患的目的；
31.3)本发明建立的转基因激活系和效应系家蚕素材，不但可用于有效地消除非目的基因保留所带来安全隐患和对外源基因表达影响的研究，而且可用于实现：通过cre重组酶介导的盒式交换(cre-rmce)方式建立由其他组织诱导型启动子调控gal4蛋白表达的新型转基因激活系家蚕素材，或通过phic31整合酶介导的盒式交换(phic31-rmce)方式建立其他外源目标基因与原始目标基因精确替换的新型效应系和/或激活系家蚕素材，以满足基
因功能鉴定的基础研究及转基因家蚕产业化开发的应用研究需要；
32.4)本发明实现建立家蚕安全转基因技术的策略具有普遍性，可适用于其他种类的鳞翅目昆虫，并且对其他动植物物种的安全转基因技术研究具有重要参考价值。
附图说明
33.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
34.图1为2种不同的转基因激活载体和1种转基因效应载体结构示意图。
35.图2为2种转基因激活系和1种转基因效应系家蚕基因组中的转基因结构(a)和阳性转基因家蚕眼荧光和转基因蚕茧荧光表达(b)。
36.图3为rt-pcr检测flp和gal4基因(actin 3基因作为内参基因)在激活系与效应系转基因家蚕不同组织中表达的特异性(a)，以及qrt-pcr检测flp基因(b)和gal4基因(c)在激活系和效应系转基因家蚕精巢、卵巢以及其他组织中的相对表达水平。
37.图4为基于flp/frt位点特异性重组系统和gal4/uas系统实现转基因家蚕f1生殖细胞目标外源dna自动删除的安全转基因策略。
38.图5为激活系与效应系家蚕杂交获得f1双转基因家蚕并在f2家蚕中筛选发生位点特异性删除反应阳性个体的实验流程(a)和f1双转基因家蚕和发生完全删除、不完全删除以及未发生删除的f2转基因家蚕眼荧光及转基因蚕茧荧光表型(b)。
39.图6为通过基因组pcr对flp重组酶介导的家蚕基因组位点特异性基因删除事件进行分子验证的转基因结构示意图(a)和pcr电泳图(b)。
40.图7为经cre-rmce(a)和phic31-rmce(b和c)建立其他激活系或/和效应系转基因家蚕的实验原理。
具体实施方式
41.下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
42.实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
43.本发明实施例中使用的家蚕非滞育品系305(白茧)由西南大学家蚕基因组资源库保存。载体puc57-t-simple(long et al.genetic hybridization of highly active exogenous functional proteins into silk-based materials using“light-clothing”strategy.matter 2021,4,2039-2058)、pslfa1180fa(horn c,wimmer ea.a versatile vector set for animal transgenesis.dev genes evol2000,210:630-637)、pbac{3
×
p3-dsredaf}(horn c,wimmer ea.a versatile vector set for animal transgenesis.dev genes evol 2000,210:630-637)、pbac{3
×
p3-egfpaf}(horn c,wimmer ea.a versatile vector set for animal transgenesis.dev genes evol 2000,210:630-637)和pha3pig(tamura et al.germline transformation of the silkworm bombyx mori l.using apiggybac transposon-derived vector.nat biotechnol 2000,18:81-84)均由发明人所在实验室保存。
44.实施例1
attp-frt}(简写作pbac[uas::flp-rg])的制备过程如上述发明专利技术方案所述，genscript公司通过无缝连接的方式将frt、uas、flp、sv40和attp顺次连接至puc57-t-simple载体，获得含有frt-uas-flp-sv40-attp表达框的重组载体puc{frt-uas-flp-sv40-attp}；将fibhp、egfp、lbs、attp和frt通过无缝连接的方式顺次连接至puc57-t-simple载体，获得含有fibhp-dsred-lbs-attp-frt表达框的重组载体puc{fibhp-egfp-lbs-attp-frt}；通过asci/hindiii双酶切puc{frt-uas-flp-sv40-attp}载体，回收frt-uas-flp-sv40-attp表达框片段，将其连接至pslfa1180fa载体获得psl{frt-uas-flp-sv40-attp}；通过hindiii/sali双酶切puc{fibhp-egfp-lbs-attp-frt}载体，回收fibhp-egfp-lbs-attp-frt表达框片段，将其连接至psl{frt-uas-flp-sv40-attp}载体获得psl{frt-uas-flp-sv40-attp-fibhp-egfp-lbs-attp-frt}；最后，asci/fsei双酶切psl{frt-uas-flp-sv40-attp-fibhp-egfp-lbs-attp-frt}载体，回收frt-uas-flp-sv40-attp-fibhp-egfp-lbs-attp-frt表达框片段，将其连接至asci/fsei双酶切的pbac{3
×
p3-dsredaf}载体骨架，即得到家蚕转基因效应载体pbac[uas::flp-rg](图1)。
[0050]
如图1中所示，所构建的2个转基因激活载体均含有启动子3
×
p3启动的绿色荧光蛋白(egfp)基因表达框(3
×
p3-egfp)，其在家蚕眼和神经特异表达的绿色荧光蛋白将作为阳性转基因家蚕的筛选标记；所构建的1个转基因效应载体含有启动子3
×
p3启动的红色荧光蛋白(dsred)基因表达框(3
×
p3-dsred)，其在家蚕眼和神经特异表达的红色荧光蛋白将作为阳性转基因家蚕的筛选标记。
[0051]
实施例2
[0052]
转基因家蚕的制备
[0053]
用非滞育家蚕品系305作为原始材料，将重组载体pbac[r1p::gal4-gr]、pbac[nsp::gal4-gr]或pbac[uas::flp-rg]与辅助质粒pha3pig按照摩尔比1:1混合，然后注射至非滞育的g0代蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度为85％的环境中催青孵化；将孵化g0代蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，将获得的g0代蚕蛾与野生型305回交方式制种，收集g1代蚕卵；用电动宏观荧光显微镜在g1代蚕卵中筛选眼部或神经系统发绿色或红色荧光的阳性转基因家蚕。表1为转基因载体注射及阳性转基因蚕筛选统计。
[0054]
表1转基因载体注射及阳性转基因蚕筛选统计
[0055][0056]
提取筛选获得的阳性转基因家蚕基因组，最终通过反向pcr鉴定获得基因组中含有单拷贝转基因插入的2个转基因家蚕激活系(r1p::gal4-gr和nsp::gal4-gr，分别来自于pbac[r1p::gal4-gr]和pbac[nsp::gal4-gr]转座插入)和1个转基因家蚕效应系(uas::flp-rg，来自于pbac[uas::flp-rg]转座插入)(表2)。图2显示了转基因激活系与效应系家蚕基因组中的转基因结构示意图(图2，a)及转基因家蚕眼荧光筛选标记(3
×
p3-dsred(用“r”表示)和3
×
p3-egfp(用“g”表示))和转基因茧片中的荧光(图2，b)，代表其含有待删除
目标基因表达框(fibhp-egfp(用“g”表示)和fibhp-dsred(用“r”表示))。
[0057]
表2反向pcr鉴定转基因结构在家蚕基因组插入位点。
[0058][0059]
实施例3
[0060]
rshp1p和nanosp启动子调控gal4基因在激活系与效应系家蚕组织特异性表达检测
[0061]
设计引物如表3所示，通过rt-pcr和qrt-pcr鉴定gal4基因和flp基因在激活系与效应系转基因家蚕不同组织中表达的特异性。rt-pcr鉴定结果如图3中a显示，gal4基因mrna均仅在2种激活系(r1p::gal4-gr和nsp::gal4-gr)家蚕的精巢中特异性表达，而在其他组织中并无表达；由于效应系uas::flp-rg家蚕基因组中不含有gal4基因表达框，因此在uas::flp-rg家蚕各组织中均未检测到gal4基因mrna的表达；由于2种激活系(r1p::gal4-gr和nsp::gal4-gr)家蚕基因组中不含有flp基因序列，并且flp基因在效应系uas::flp-rg家蚕各组织中并未激活表达，因此在激活系和效应系家蚕各组织中均未检测到flp基因mrna的表达。qrt-pcr结果再次证实flp基因在激活系和效应系家蚕各组织中均未表达(图3，b)，此外，qrt-pcr结果进一步显示gal4基因mrna在r1p::gal4-gr家蚕精巢中的表达水平显著高于nsp::gal4-gr家蚕(图3，c)。上述实验结果说明，rshp1p和nanosp均为精巢特异表达启动子，其可介导gal4基因在转基因家蚕精巢中组织特异性表达。其中rshp1p介导gal4基因表达的活性显著高于nanosp。
[0062]
表3 rt-pcr和qrt-pcr引物序列
[0063][0064][0065]
实施例4
[0066]
激活系与效应系家蚕杂交实现杂交一代(f1)生殖细胞目标外源dna自动删除实验
[0067]
图4显示了本发明提出的实现外源目标基因在f1转基因家蚕生殖细胞基因组中特异性删除，而在非生殖细胞基因组中保留的安全转基因策略原理：
①
建立基因组中含有家蚕生殖腺特异表达基因启动子(gonad-specific promoter，gsp)调控gal4蛋白基因表达框
(gsp-gal4)的转基因激活系和含有由uas元件调控下游flp蛋白基因表达框(uas-flp)的转基因效应系；
②
将激活系与效应系家蚕杂交，通过眼荧光筛选(3
×
p3-dsred和3
×
p3-egfp)获得基因组中同时含有gsp-gal4和uas-flp表达框的f1双转基因家蚕；
③
在f1双转基因家蚕生殖细胞中，gsp调控gal4基因组织特异性(精子和卵子)表达，进而激活flp重组酶表达并介导frt位点对发生重组反应，最终导致外源目的基因(fibhp-egfp和fibhp-dsred)在生殖细胞组织特异性定点删除(仅保留1个frt位点)；在非生殖细胞中，gsp不具有启动活性，无法调控gal4基因表达，从而抑制了flp重组酶表达，因此外源目的基因(fibhp-egfp和fibhp-dsred)在非生殖细胞中得以保留；
④
将f1双转基因家蚕与非转基因家蚕回交，最终获得基因组中不含外源目的基因序列的f2家蚕。
[0068]
为实现上述策略，按照图5中a的流程，将实施例2中获得的激活系r1p::gal4-gr(或nsp::gal4-gr)与效应系uas::flp-rg家蚕杂交制种获得f1家蚕；通过眼荧光筛选获得f1双转基因家蚕f1-grrg(r1p::gal4&uas::flp)(或nsp::gal4&uas::flp)，随后将其与非转基因家蚕(wt)进行正交(f1-grrg
♀×
wt
♂
)与反交(f1-grrg
♂×
wt
♀
)，在f2代家蚕中通过眼荧光和蚕茧荧光筛选发生位点特异性删除反应的阳性个体(图5中b)，统计发生完全删除(f2-g、f2-r和f2-gr)、不完全删除(f2-grr和f2-grg)以及未发生删除(f2-grrg、f2-gr和f2-rg)的效率。
[0069]
f1-grrg与wt杂交获得具有不同荧光表型的f2家蚕数量如表4所示。结果显示2种f1-grrg
♀
(r1p::gal4&uas::flp和nsp::gal4&uas::flp)与wt杂交获得的f2转基因家蚕，仅具有未发生删除(f2-grrg、f2-gr与f2-rg)的3种荧光表型，说明2种f1-grrg
♀
卵子中均未发生位点特异性删除事件；f1-grrg(r1p::gal4&uas::flp)与wt
♀
杂交获得的f2转基因家蚕，仅具有完全删除(f2-g、f2-r和f2-gr)的3种荧光表型，说明f1-grrg(r1p::gal4&uas::flp)精子中发生了完全的位点特异性删除事件；f1-grrg(nsp::gal4&uas::flp)与wt
♀
杂交获得的f2转基因家蚕，同时具有完全删除(f2-g、f2-r和f2-gr)、不完全删除(f2-grr和f2-grg)和未发生删除(f2-grrg、f2-gr和f2-rg)的全部8种荧光表型，说明f1-grrg(nsp::gal4&uas::flp)精子中同时存在完全删除(概率为13.73～80.3％)、不完全删除(12.42～17.72％)以及未删除事件。
[0070]
表4具有不同荧光表型的f2家蚕数量统计表
[0071][0072][0073]
实施例5
[0074]
flp重组酶介导目标基因删除事件的基因组pcr验证
[0075]
设计基因组pcr引物(表5)，图6中a示出了通过基因组pcr对flp重组酶介导的家蚕基因组位点特异性基因删除事件进行分子验证的结构示意图。如图6中b所示，在2个不同的
激活系家蚕及对应的2个f1-grrg家蚕各组织细胞基因组中(精巢、卵巢和其他组织)，利用特异性引物对gal4-g-f/gal4-g-r均可扩增获得1条1239-bp的pcr产物条带，而在野生型、效应系和2个f2-gr家蚕基因组中，则无法扩增到相应条带；在效应系家蚕及2个f1-grrg家蚕各组织细胞基因组中(精巢、卵巢和其他组织)，利用特异性引物对flp-g-f/flp-g-r均可扩增获得1条1369-bp的pcr产物条带，而在野生型、2个激活系和2个f2-gr家蚕基因组中，则无法扩增到相应条带；在2个f1-grrg家蚕的精巢组织和2个f2-gr家蚕各组织细胞基因组中(精巢、卵巢和其他组织)，利用特异性引物对marker-f/marker-r可扩增获得1条272-bp的发生删除后的pcr产物条带，而在野生型、2个激活系和2个f1-grrg家蚕的卵巢和其他组织中，则无法扩增到相应条带。随后，将所有发生删除反应的f2-gr阳性个体的pcr产物测序并与删除前序列进行比对分析，结果证实flp重组酶在f2-gr阳性个体基因组中介导2个frt位点之间发生了精确的位点特异性重组反应。
[0076]
表5基因组pcr引物序列
[0077][0078]
实施例6
[0079]
激活系与效应系家蚕用于其他新型转基因家蚕素材创制的策略
[0080]
上述实施例实验结果证实了利用生殖腺特异性启动子介导gal4蛋白在f1-grrg家蚕生殖腺(精巢)中特异性表达，可以激活flp重组酶介导frt位点对间发生位点特异性重组反应，进而介导frt位点对锚定的外源目的基因序列的删除，并最终在f2中筛选获得外源目的基因序列在基因组中完全删除的阳性个体。此外，本发明建立的激活系和效应系家蚕素材，不但可通过杂交介导f1双转基因家蚕生殖细胞基因组中目的外源dna序列的组织特异性删除，以达到同时保证转基因安全和目的经济性状实现的目标，而且还可用于实现：通过cre-rmce方式建立由其他组织诱导型启动子(inducible promoter，ip)调控gal4蛋白表达的新型转基因激活系家蚕素材(图7，a)，或通过phic31-rmce方式建立其他外源目标基因(target gene)与原始目标基因精确替换的新型效应系和/或激活系家蚕素材(图7，b-c)，以满足基因功能鉴定的基础研究及转基因家蚕产业化开发的应用研究需要。
[0081]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。