新型昆虫抑制性蛋白的制作方法

新型昆虫抑制性蛋白
1.本技术是申请日为2017年12月18日、申请号为201780083167.0、发明名称为“新型昆虫抑制性蛋白”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的引用
3.本技术要求2016年12月20日提交的美国临时申请号62/436,736的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
4.序列表的并入
5.命名为“mons431wo_st25.txt”，含有计算机可读形式的序列表的文件创建于2017年12月13日。该文件为215千字节(在中测量)，同时通过电子递交(使用美国专利局efs-web归档系统)进行提交，并且通过引用整体并入本技术中。
发明领域
6.本发明总体涉及昆虫抑制性蛋白的领域。公开了一类对作物植物和种子的农业相关有害生物表现出昆虫抑制活性的新型蛋白。具体而言，所公开的蛋白对作物植物和种子的农业相关有害生物，尤其是鞘翅目、鳞翅目、半翅目和缨翅目种的昆虫类有害生物具有杀昆虫活性。提供了含有编码一种或多种所公开的毒素蛋白的重组多核苷酸构建体的植物、植物部分和种子。
7.发明背景
8.提高农业重要植物(包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、蔬菜和棉花等)的作物产量变得越来越重要。除了越来越需要农业产品为不断增长的人口提供食物、衣服和能源之外，预计来自不断增长的人口使用土地而非用于农业实践的气候相关影响和压力将减少可用于耕作的耕地的量。这些因素导致了对粮食安全的可怕预测，尤其是在植物生物技术和农艺实践没有重大改进的情况下。鉴于这些压力，在技术、农业技术和有害生物管理方面的环境可持续性改进是在有限量的可用于耕作的耕地上扩大作物生产的重要工具。
9.昆虫，尤其是鳞翅目、鞘翅目、半翅目和缨翅目的昆虫，被认为是农作物受损的主要原因，从而降低了侵染地区的作物产量。
10.历史上，合成化学杀昆虫剂的大量应用依赖于农业上的有害生物防治剂。除了新出现的抗性问题之外，对环境和人健康的关注刺激了对生物农药的研究和开发。该研究工作导致逐渐发现和使用各种昆虫病原微生物物种，包括细菌。
11.当昆虫病原细菌，特别是属于芽孢杆菌属的细菌的潜力被发现并开发为生物有害生物防治剂时，生物防治模式发生了转变。已将细菌苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)(bt)菌株用作杀虫蛋白的来源，因为发现bt菌株对特定昆虫显示出高毒性。已知bt菌株会在孢子形成开始时和在静止生长期期间产生定位于伴孢晶体包涵体内的δ-内毒素(例如cry蛋白)，并且已知还会产生分泌的杀昆虫蛋白。在被易感昆虫摄取后，δ-内毒素以及分泌的毒素在中肠上皮细胞表面发挥其作用，破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。编码杀昆虫蛋白的基因也已在除bt之外的细菌种中鉴定，包括其它芽孢杆菌和多种不相关的细菌物种，例如侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)和球形赖氨酸芽孢
杆菌(lysinibacillus sphaericus)(“ls”，以前称为球形芽孢杆菌(bacillus sphaericus))。
12.结晶和分泌的可溶性杀昆虫毒素对其宿主具有高度特异性，并且已作为化学杀昆虫剂的替代品在世界范围内获得认可。例如，杀昆虫毒素蛋白已经用于各种农业应用中来保护农业重要植物免受昆虫侵染，减少对化学杀虫剂应用的需要，并增加产量。通过机械方法，使用杀昆虫毒素蛋白防治作物植物的农业相关有害生物，机械方法例如喷洒以将含有各种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面上，以及通过使用遗传转化技术产生表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物和种子。
13.表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物的使用已经全球适应。例如，在2012年，2610万公顷种植了表达bt毒素的转基因作物(james,c.,global status of commercialized biotech/gm crops:2012.isaaa brief no.44)。全球使用转基因昆虫防治作物和这些作物中使用的有限数量的杀昆虫毒素蛋白对于赋予对当前使用的杀昆蛋白的抗性的现有昆虫等位基因已经产生了选择压力。
14.目标有害生物中对杀昆虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式的杀昆虫毒素蛋白的持续需求，所述新形式的杀昆虫毒素蛋白可用于管理昆虫中对表达杀昆虫毒素蛋白的转基因作物的抗性的增加。具有改进的功效并且对更广谱的易感昆虫种表现出防治的新蛋白毒素，将会减少可以发展抗性等位基因的存活昆虫的数量。另外，在一种植物中使用两种或更多种对相同虫害有毒并且展示出不同作用模式的转基因杀昆虫毒素蛋白降低了任何单一目标昆虫种的抗性概率。
15.因此，本发明人公开了一种来自球形赖氨酸芽孢杆菌的新型蛋白毒素家族以及类似的毒素蛋白、变体蛋白和示例性重组蛋白，其对目标鳞翅目、鞘翅目、半翅目和缨翅目有害生物物种，尤其是对西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(diabrotica virgifera virgifera))表现出杀虫活性。


技术实现要素：

16.本文公开了一组具有昆虫抑制活性的新型杀虫蛋白(毒素蛋白)，本文称为tic6280相关毒素蛋白(tic6280、tic6281、tic6282和tic6283)和tic7016相关毒素蛋白(tic7016、tic7017、tic7108、tic7110和tic7589)，经证实其对作物植物的一种或多种有害生物表现出抑制活性。tic6280相关毒素蛋白和tic7016相关毒素蛋白的毒素类可单独使用，作为嵌合体，制备融合蛋白，或在制剂和植物体内(in planta)与其它杀昆虫蛋白和毒性剂组合使用，从而提供当前用于农业系统中的杀昆虫蛋白和杀昆虫化学品的替代品。
17.在一个实施方案中，本技术中公开了一种重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中：(a)所述杀虫蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:2、4、6、8、10、12、15、18、21、23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99；或(b)所述杀虫蛋白包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少62％、或65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：seq id no:2、4、6、8、10、12、15、18、21、23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99；或(c)所述多核苷酸区
段与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的多核苷酸杂交：seq id no:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、20、22、24、26、28、30、32、34、35、37、38、40、41、43、44、45、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、82、84、86、88、90、92、94、96和98；或(d)所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体。所述重组核酸分子可包含起到在植物中表达杀虫蛋白的功能的序列；或在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的杀虫蛋白。
18.在本技术的另一个实施方案中是包含本技术的重组核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌和植物细胞。考虑到的宿主细胞包括农杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)、芽孢杆菌属(bacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、埃希氏杆菌属(escherichia)、假单胞菌属(pseudomonas)、克雷白氏杆菌属(klebsiella)和欧文氏菌属(erwinia)；并且其中所述芽孢杆菌属的种是蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)，所述短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosperous)，并且所述埃希氏杆菌属是大肠杆菌(escherichia coli)。考虑到的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。进一步考虑到的植物宿主细胞包括苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜(pumpkin)、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜属蔬菜(squash)、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、西红柿、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
19.在另一个实施方案中，所述杀虫蛋白对鞘翅目的昆虫种表现出活性，所述昆虫种包括西方玉米根虫、南方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、巴西玉米根虫或由diabrotica viridula和南美叶甲(diabrotica speciosa)组成的巴西玉米根虫复合群。
20.在另一个实施方案中，所述杀虫蛋白对鳞翅目的昆虫种表现出活性，所述昆虫种包括藜豆认蛾、甘蔗螟、小玉米螟、玉米穗虫、烟草夜蛾(tobacco budworm)、大豆夜蛾(soybean looper)、黑粘虫、南方粘虫、草地粘虫、甜菜粘虫、旧大陆棉铃虫、东方叶虫、棉红铃虫、小地老虎、西南玉米螟、小菜蛾和欧洲玉米螟。
21.在另一个实施方案中，所述杀虫蛋白对半翅目的昆虫种表现出活性，所述昆虫种包括南部绿臭蝽、新热带区褐臭蝽、西部牧草盲蝽或牧草盲蝽。
22.在另一个实施方案中,所述杀虫蛋白对缨翅目的昆虫种表现出活性，所述昆虫种包括烟草蓟马(frankliniella fusca)、花蓟马(frankliniella tritici)、西花蓟马(frankliniella occidentalis)和大豆蓟马(sericothrips variabilis)。
23.本技术中还考虑到包含重组核酸分子的植物，所述重组核酸分子包含与编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中：(a)所述杀虫蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99；或(b)所述杀虫蛋白包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少62％，或65％，或70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或95％，或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：seq id no:23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、
89、91、93、95、97和99；或(c)所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与选自由以下组成的组的核苷酸序列的互补序列杂交：seq id no:43、44、45、46、48、50、52；或(d)所述植物表现出可检测量的所述杀虫蛋白，其中所述杀虫蛋白选自由以下组成的组：seq id no:23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜属蔬菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、西红柿、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦。
24.在其它实施方案中，公开了包含重组核酸分子的种子。
25.在另一个实施方案中，考虑到了包含本技术中公开的重组核酸分子的昆虫抑制性组合物。所述昆虫抑制性组合物还可包含编码至少一种不同于所述杀虫蛋白的其它杀虫剂的核苷酸序列。所述至少一种其它杀虫剂选自昆虫抑制性蛋白、昆虫抑制性dsrna分子和辅助蛋白。所述昆虫抑制性组合物中的所述至少一种其它杀虫剂对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一个或多个有害生物种表现出活性。所述昆虫抑制性组合物中的所述至少一种其它杀虫剂选自由以下组成的组：cry1a、cry1ab、cry1ac、cry1a.105、cry1ae、cry1b、cry1c、cry1c变体、cry1d、cry1e、cry1f、cry1a/f嵌合体、cry1g、cry1h、cry1i、cry1j、cry1k、cry1l、cry2a、cry2ab、cry2ae、cry3、cry3a变体、cry3b、cry4b、cry6、cry7、cry8、cry9、cry15、cry34、cry35、cry43a、cry43b、cry51aa1、et29、et33、et34、et35、et66、et70、tic400、tic407、tic417、tic431、tic800、tic807、tic834、tic853、tic900、tic901、tic1201、tic1415、tic3131、vip3a、vip3b、vip3ab、axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035、axmi-036、axmi-045、axmi-52、axmi-58、axmi-88、axmi-97、axmi-102、axmi-112、axmi-117、axmi-100、axmi-115、axmi-113和axmi-005、axmi134、axmi-150、axmi-171、axmi-184、axmi-196、axmi-204、axmi-07、axmi-209、axmi-205、axmi-218、axmi-220、axmi-221z、axmi-222z、axmi-223z、axmi-224z和axmi-225z、axmi-238、axmi-270、axmi-279、axmi-345、axmi-r1及其变体、ip3及其变体、dig-3、dig-5、dig-10和dig-11蛋白。
26.考虑到了包含可检测量的在本技术中公开的重组核酸分子的商品。此类商品包括谷物处理者装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷物等，及相应的棉花商品，如整粒或加工的棉籽、棉籽油、棉绒、加工用于饲料或食品的种子和植物部分、纤维、纸、生物质和燃料产品，如源自棉籽油的燃料或源自轧棉机废弃物的团粒，及相应的大豆商品，如整粒或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、豆粕、大豆粉、大豆坯片、大豆糠、豆奶、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的奶油、大豆生物质和使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品，及相应的水稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、瓜和蔬菜类商品，在适用情况下包括果汁、浓缩物、果酱、果冻、橘子酱和其它可食用形式的含有可检测量的本技术的此类多核苷酸或多肽的此类商品。
27.本技术中还考虑到了产生包含本技术中公开的重组核酸分子的种子的方法。所述方法将包括种植包含本技术中公开的重组核酸分子的至少一种种子；由所述种子长成植物；并且从所述植物收获种子，其中所述收获的种子包含本技术中的重组核酸分子。
28.在另一个实施方案中，一种对昆虫侵染有抗性的植物，其中所述植物的细胞任选包含：(a)编码杀昆虫有效量的杀虫蛋白的重组核酸分子，其中所述蛋白选自由以下组成的组：seq id no:23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99；或(b)杀昆虫有效量的蛋白，所述蛋白包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少62％，或65％，或70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或95％，或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：seq id no:23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。
29.本技术中还公开了防治鞘翅目或鳞翅目或半翅目或缨翅目种有害生物，并且防治鞘翅目或鳞翅目或半翅目或缨翅目种有害生物侵染植物，尤其是作物植物的方法。所述方法将包括(a)使有害生物与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，其中所述蛋白选自由以下组成的组：seq id no:2、4、6、8、10、12、15、18、21、23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99；或(b)使有害生物与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少62％，或65％，或70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或95％，或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：seq id no:2、4、6、8、10、12、15、18、21、23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99。
附图说明
30.图1说明了与未转化的对照相比,暴露于经用于表达tic7016pl的表达盒转化的棉事件而存活的下一代美洲牧草盲蝽(lygus lineolaris)若虫和成虫的平均数量。
31.序列简述
32.seq id no:1是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h07获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic6280杀虫蛋白(本文称为tic6280-his)的核酸序列。
33.seq id no:2是tic6280-his蛋白的氨基酸序列。
34.seq id no:3是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h03获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic6281杀虫蛋白(本文称为tic6281-his)的核酸序列。
35.seq id no:4是tic6281-his蛋白的氨基酸序列。
36.seq id no:5是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0069h08获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic6282杀虫蛋白(本文称为tic6282-his)的核酸序列。
37.seq id no:6是tic6282-his蛋白的氨基酸序列。
38.seq id no:7是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0025e04获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic6283杀虫蛋白(本文称为tic6283-his)的核酸序列。
39.seq id no:8是tic6283-his蛋白的氨基酸序列。
40.seq id no:9是从球形赖氨酸芽孢杆菌种egbs0420获得的，编码具有组氨酸标签
与3
ˊ
末端可操作地连接的tic7016杀虫蛋白(本文称为tic7016-his)的核酸序列。
41.seq id no:10是tic7016-his蛋白的氨基酸序列。
42.seq id no:11是从球形赖氨酸芽孢杆菌种egbs1094获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic7017杀虫蛋白(本文称为tic7017-his)的核酸序列。
43.seq id no:12是tic7017-his蛋白的氨基酸序列。
44.seq id no:13是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0025e04获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic7107杀虫蛋白(本文称为tic7107-his)的核酸序列，tic7107杀虫蛋白具有与tic7110的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。
45.seq id no:14是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h01获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic7108杀虫蛋白(本文称为tic7108-his)的核酸序列。
46.seq id no:15是tic7108-his蛋白的氨基酸序列。
47.seq id no:16是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h03获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic7109杀虫蛋白(本文称为tic7109-his)的核酸序列，tic7109杀虫蛋白具有与tic7110的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。
48.seq id no:17是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h07获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic7110杀虫蛋白(本文称为tic7110-his)的核酸序列。
49.seq id no:18是tic7110-his蛋白的氨基酸序列。
50.seq id no:19是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0069h08获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic7111杀虫蛋白(本文称为tic7111-his)的核酸序列，tic7111杀虫蛋白具有与tic7110的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。
51.seq id no:20是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0122f12获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic7589杀虫蛋白(本文称为tic7589-his)的核酸序列。
52.seq id no:21是tic7589-his蛋白的氨基酸序列。
53.seq id no:22是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h07获得的，编码tic6280杀虫蛋白的核酸序列。
54.seq id no:23是tic6280蛋白的氨基酸序列。
55.seq id no:24是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h03获得的，编码tic6281杀虫蛋白的核酸序列。
56.seq id no:25是tic6281蛋白的氨基酸序列。
57.seq id no:26是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0069h08获得的，编码tic6282杀虫蛋白的核酸序列。
58.seq id no:27是tic6282蛋白的氨基酸序列。
59.seq id no:28是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0025e04获得的，编码tic6283杀虫蛋白的核酸序列。
60.seq id no:29是tic6283蛋白的氨基酸序列。
61.seq id no:30是从球形赖氨酸芽孢杆菌种egbs0420获得的，编码tic7016杀虫蛋白的核酸序列。
62.seq id no:31是tic7016蛋白的氨基酸序列。
63.seq id no:32是从球形赖氨酸芽孢杆菌种egbs1094获得的，编码tic7017杀虫蛋
白的核酸序列。
64.seq id no:33是tic7017蛋白的氨基酸序列。
65.seq id no:34是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0025e04获得的，编码tic7107杀虫蛋白的核酸序列，tic7107杀虫蛋白具有与tic7110的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。
66.seq id no:35是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h01获得的，编码tic7108杀虫蛋白的核酸序列。
67.seq id no:36是tic7108蛋白的氨基酸序列。
68.seq id no:37是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h03获得的，编码tic7109杀虫蛋白的核酸序列，tic7109杀虫蛋白具有与tic7110的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。
69.seq id no:38是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0067h07获得的，编码tic7110杀虫蛋白的核酸序列。
70.seq id no:39是tic7110蛋白的氨基酸序列。
71.seq id no:40是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0069h08获得的，编码tic7111杀虫蛋白的核酸序列，tic7111杀虫蛋白具有与tic7110的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。
72.seq id no:41是从球形赖氨酸芽孢杆菌种ag0122f12获得的，编码tic7589杀虫蛋白的核酸序列。
73.seq id no:42是tic7589蛋白的氨基酸序列。
74.seq id no:43是设计用于在植物细胞中表达的编码tic6280杀虫蛋白的合成编码序列。
75.seq id no:44是设计用于在植物细胞中表达的编码tic6282杀虫蛋白的合成编码序列。
76.seq id no:45是设计用于在植物细胞中表达的编码tic6283杀虫蛋白的合成编码序列。
77.seq id no:46是设计用于在植物细胞中表达的编码tic7016pl杀虫蛋白的合成编码序列，其中紧跟在起始甲硫氨酸密码子后插入了编码丙氨酸残基的附加密码子。
78.seq id no:47是tic7016pl的氨基酸序列，其中紧跟在起始甲硫氨酸后插入了附加丙氨酸残基。
79.seq id no:48是设计用于在植物细胞中表达的编码tic7017pl杀虫蛋白的合成编码序列，其中紧跟在起始甲硫氨酸密码子后插入了编码丙氨酸残基的附加密码子。
80.seq id no:49是tic7017pl的氨基酸序列，其中紧跟在起始甲硫氨酸后插入了附加丙氨酸残基。
81.seq id no:50是设计用于在植物细胞中表达的编码tic7108pl杀虫蛋白的合成编码序列，其中紧跟在起始甲硫氨酸密码子后插入了编码丙氨酸残基的附加密码子。
82.seq id no:51是tic7108pl的氨基酸序列，其中紧跟在起始甲硫氨酸后插入了附加丙氨酸残基。
83.seq id no:52是设计用于在植物细胞中表达的编码tic7110pl杀虫蛋白的合成编
码序列，其中紧跟在起始甲硫氨酸密码子后插入了编码丙氨酸残基的附加密码子。
84.seq id no:53是tic7110pl的氨基酸序列，其中紧跟在起始甲硫氨酸后插入了附加丙氨酸残基。
85.seq id no:54是编码tic7110/tic6280融合毒素蛋白tic7110-tic6280f1的合成序列，其中所述两个毒素蛋白编码序列是邻接的并且在框内。
86.seq id no:55是tic7110/tic6280融合毒素蛋白tic7110-tic6280f1的氨基酸序列，其中所述两个毒素蛋白氨基酸序列是邻接的。
87.seq id no:56是编码tic7110/tic6280融合毒素蛋白tic7110-tic6280f2的合成序列，其中可切割的接头序列(接头1)可操作地连接并在框内介于所述两个毒素蛋白编码序列之间。
88.seq id no:57是tic7110/tic6280融合毒素蛋白tic7110-tic6280f2的氨基酸序列，其中可切割的接头肽序列(接头1)插入所述两个毒素蛋白氨基酸序列之间。
89.seq id no:58是编码tic7110/tic6280融合毒素蛋白tic7110-tic6280f3的合成序列，其中柔性接头序列(接头2)可操作地连接并在框内介于所述两个毒素蛋白编码序列之间。
90.seq id no:59是tic7110/tic6280融合毒素蛋白tic7110-tic6280f3的氨基酸序列，其中柔性接头肽序列(接头2)插入所述两个毒素蛋白氨基酸序列之间。
91.seq id no:60是编码tic7111/tic6282融合毒素蛋白tic7111-tic6282f1的合成序列，其中所述两个毒素蛋白编码序列是邻接的并且在框内。
92.seq id no:61是tic7111/tic6282融合毒素蛋白tic7111-tic6282f1的氨基酸序列，其中所述两个毒素蛋白氨基酸序列是邻接的。
93.seq id no:62是编码tic7111/tic6282融合毒素蛋白tic7111-tic6282f2的合成序列，其中可切割的接头序列(接头1)可操作地连接并在框内介于所述两个毒素蛋白编码序列之间。
94.seq id no:63是tic7111/tic6282融合毒素蛋白tic7111-tic6282f2的氨基酸序列，其中可切割的接头肽序列(接头1)插入所述两个毒素蛋白氨基酸序列之间。
95.seq id no:64是编码tic7111/tic6282融合毒素蛋白tic7111-tic6282f3的合成序列，其中柔性接头序列(接头2)可操作地连接并在框内介于所述两个毒素蛋白编码序列之间。
96.seq id no:65是tic7111/tic6282融合毒素蛋白tic7111-tic6282f3的氨基酸序列，其中柔性接头肽序列(接头2)插入所述两个毒素蛋白氨基酸序列之间。
97.seq id no:66是编码tic7109/tic6281融合毒素蛋白tic7109-tic6281f1的合成序列，其中所述两个毒素蛋白编码序列是邻接的并且在框内。
98.seq id no:67是tic7109/tic6281融合毒素蛋白tic7109-tic6281f1的氨基酸序列，其中所述两个毒素蛋白氨基酸序列是邻接的。
99.seq id no:68是编码tic7109/tic6281融合毒素蛋白tic7109-tic6281f2的合成序列，其中可切割的接头序列(接头1)可操作地连接并在框内介于所述两个毒素蛋白编码序列之间。
100.seq id no:69是tic7109/tic6281融合毒素蛋白tic7109-tic6281f2的氨基酸序
列，其中可切割的接头肽序列(接头1)插入所述两个毒素蛋白氨基酸序列之间。
101.seq id no:70是编码tic7109/tic6281融合毒素蛋白tic7109-tic6281f3的合成序列，其中柔性接头序列(接头2)可操作地连接并在框内介于所述两个毒素蛋白编码序列之间。
102.seq id no:71是tic7109/tic6281融合毒素蛋白tic7109-tic6281f3的氨基酸序列，其中可切割的接头肽序列(接头2)插入所述两个毒素蛋白氨基酸序列之间。
103.seq id no:72是编码可操作地连接并在框内介于两个毒素编码序列之间的可切割接头即接头1的合成dna序列。
104.seq id no:73是可切割接头即接头1的氨基酸序列。
105.seq id no:74是编码可操作地连接并在框内介于两个毒素编码序列之间的柔性接头即接头2的合成dna序列。
106.seq id no:75是柔性接头即接头2的氨基酸序列。
107.seq id no:76是操纵子即tic7110-tic6280操纵子的合成序列，其包含tic7110的编码序列，接着是tic6280的编码序列，其中操纵子接头(操纵子_接头)插入所述两个编码序列之间。
108.seq id no:77是操纵子即tic7111-tic6282操纵子的合成序列，其包含tic7111的编码序列，接着是tic6282的编码序列，其中操纵子接头(操纵子_接头)插入所述两个编码序列之间。
109.seq id no:78是操纵子即tic7109-tic6281操纵子的合成序列，其包含tic7109的编码序列，接着是tic6281的编码序列，其中操纵子接头(操纵子_接头)插入所述两个编码序列之间。
110.seq id no:79是接头即操纵子_接头的合成序列，其在5
ˊ
末端包含终止第一毒素基因翻译的终止密码子并且插入两个毒素蛋白编码序列之间以容许两种毒素蛋白在细菌宿主中表达。
111.seq id no:80是从命名为mtg000070的刮板宏基因(plate-scrape metagenome)组获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic8808杀虫蛋白(本文称为tic8808-his)的核酸序列。
112.seq id no:81是tic8808-his蛋白的氨基酸序列。
113.seq id no:82是从命名为mtg000415的刮板宏基因组获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic9480杀虫蛋白(本文称为tic9480-his)的核酸序列。
114.seq id no:83是tic9480-his蛋白的氨基酸序列。
115.seq id no:84是从命名为mtg000199的刮板宏基因组获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic9257杀虫蛋白(本文称为tic9257-his)的核酸序列。
116.seq id no:85是tic9257-his蛋白的氨基酸序列。
117.seq id no:86是从命名为mtg000120的刮板宏基因组获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic9258杀虫蛋白(本文称为tic9258-his)的核酸序列。
118.seq id no:87是tic9258-his蛋白的氨基酸序列。
119.seq id no:88是从命名为mtg000184的刮板宏基因组获得的，编码具有组氨酸标签与3
ˊ
末端可操作地连接的tic9259杀虫蛋白(本文称为tic9259-his)的核酸序列。
120.seq id no:89是tic9259-his蛋白的氨基酸序列。
121.seq id no:90是从命名为mtg000184的刮板宏基因组获得的，编码tic8808杀虫蛋白的核酸序列。
122.seq id no:91是tic8808蛋白的氨基酸序列。
123.seq id no:92是从命名为mtg000415的刮板宏基因组获得的，编码tic9480杀虫蛋白的核酸序列。
124.seq id no:93是tic9480蛋白的氨基酸序列。
125.seq id no:94是从命名为mtg000199的刮板宏基因组获得的，编码tic9257杀虫蛋白的核酸序列。
126.seq id no:95是tic9257蛋白的氨基酸序列。
127.seq id no:96是从命名为mtg000120的刮板宏基因组获得的，编码tic9258杀虫蛋白的核酸序列。
128.seq id no:97是tic9258蛋白的氨基酸序列。
129.seq id no:98是从命名为mtg000184的刮板宏基因组获得的，编码tic9259杀虫蛋白的核酸序列。
130.seq id no:99是tic9259蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
131.农业有害生物防治领域的问题可以表征为需要对目标有害生物有效，对目标有害生物物种表现出广谱毒性，能够在植物中表达而不会引起不良农学问题，并与在植物中商业使用的当前毒素相比提供替代作用模式的新毒素蛋白。
132.本文公开了通过tic6280蛋白和tic6280相关毒素蛋白成员以及tic7016蛋白和tic7016相关毒素蛋白成员所举例说明的新型杀虫蛋白类别，并且解决了这些需要中的每一种，尤其是针对广泛的鞘翅目、鳞翅目、半翅目和缨翅目虫害，更尤其是针对西方玉米根虫有害生物物种。
133.本技术中提及tic6280、“tic6280蛋白”、“tic6280蛋白毒素”、“tic6280毒素蛋白”、“tic6280杀虫蛋白”、“tic6280相关毒素”或“tic6280相关毒素蛋白”等，是指下述的任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白，其包含tic6280(seq id no:23)、tic6281(seq id no:25)、tic6282(seq id no:27)、tic6283(seq id no:29)、tic8808(seq id no:91)、tic9480(seq id no:93)和tic9257(seq id no:95)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，由所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合组成，基本上与所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合同源，与所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合相似，或源自所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合赋予针对鞘翅目有害生物、鳞翅目有害生物、半翅目有害生物和/或缨翅目有害生物的活性，包括表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白(如果此类蛋白与tic6280的比对产生约62％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性)。
134.本技术中提及tic7016、“tic7016蛋白”、“tic7016蛋白毒素”、“tic7016毒素蛋
白”、“tic7016杀虫蛋白”、“tic7016相关毒素”或“tic7016相关毒素蛋白”等，是指下述的任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白，其包含tic7016(seq id no:31)、tic7017(seq id no:33)、tic7108(seq id no:36)、tic7110(seq id no:39)、tic7589(seq id no:42)、tic9258(seq id no:97)和tic9259(seq id no:99)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，由所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合组成，基本上与所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合同源，与所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合相似，或源自所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，所述杀虫蛋白或昆虫抑制性蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合赋予针对鞘翅目有害生物、鳞翅目有害生物、半翅目和/或缨翅目有害生物的活性，包括表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白(如果此类蛋白与tic7016的比对产生约62％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性)。
135.在本技术中使用术语“区段”或“片段”来描述比描述tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的连续氨基酸或核酸序列。如果区段或片段与seq id no:23所示的tic6280蛋白的相应部分或seq id no:31所示的tic7016蛋白的比对，在该区段或片段与tic6280蛋白或tic7016蛋白的相应部分之间分别产生约62％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性，则本技术中还公开了此类表现出昆虫抑制活性的区段或片段。
136.在更进一步的具体实施方案中，tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白，或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白的片段可以定义为表现出它所来源的起始蛋白分子所具有的杀虫活性。编码tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白的核酸序列的片段可以定义为编码表现出它所来源的起始核酸序列所编码的蛋白分子所具有的杀虫活性的蛋白。本文描述的片段或变体还可包含本文鉴定的，负责蛋白的杀虫活性的结构域。
137.在具体实施方案中，提供了tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白，或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白的片段，其包含具有如本文公开的杀虫活性的tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白，或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白的至少约50个、至少约75个、至少约95个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约175个、至少约200个、至少约225个、至少约250个、至少约275个、至少约300个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个、至少约1100个、至少约1150个或至少约1175个连续氨基酸或更长。在某些实施方案中，本发明提供了tic6280(seq id no:23)、tic6281(seq id no:25)、tic6282(seq id no:27)、tic6283(seq id no:29)、tic8808(seq id no:91)、tic9480(seq id no:93)和tic9257(seq id no:95)，或tic7016(seq id no:31)、tic7017(seq id no:33)、tic7108(seq id no:36)、tic7110(seq id no:39)、tic7589(seq id no:42)、tic9258(seq id no:97)和tic9259(seq id no:99)中的任一个的片段，并且具有全长序列的活性。由起始分子产生此类片段的方法是本领域已知的。
138.本技术中提及术语“活性的”或“活性”、“杀虫活性”或“杀虫”或“杀昆虫活性”、“昆虫抑制活性”或“杀昆虫”是指毒性剂如蛋白毒素在抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或活力)、阻遏(阻遏生长、摄食、繁殖力或活力)、防治(防治有害生物侵染，防治含有有效量的
tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白，或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白的特定作物上的有害生物摄食活动)或杀灭(导致有害生物发病、死亡或降低有害生物繁殖力)有害生物方面的功效。这些术语旨在包括向有害生物提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，其中有害生物暴露于毒性蛋白导致发病、死亡率、生殖力降低或发育迟缓。这些术语还包括由于在植物中或在植物上提供了杀虫有效量的毒性蛋白而引起从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或从植物可能正在生长的特定地理位置击退有害生物。一般而言，杀虫活性是指毒性蛋白有效抑制特定目标有害生物(包括但不限于鳞翅目目或鞘翅目或半翅目或缨翅目昆虫)的生长、发育、活力、摄食行为、交配行为、繁殖力或引起由摄食该蛋白、蛋白片段、蛋白区段或多核苷酸的昆虫所产生的有害影响的任何可测量减少的能力。毒性蛋白可以由植物产生，或者可以施用于植物或植物所在位置的环境。术语“生物活性”、“有效”、“有效力”或其变型也是本技术中可互换用于描述本发明蛋白对目标有害生物的影响的术语。
139.当在目标有害生物的饮食中提供杀虫有效量的毒性剂时，当毒性剂接触有害生物时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或本领域已知的一种或多种化学试剂。杀虫或杀昆虫化学剂和杀虫或杀昆虫蛋白剂可以单独使用或彼此组合使用。化学剂包括但不限于靶向特定基因以在目标有害生物中实现阻遏的dsrna分子，有机氯化物、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯(pyrethroid)、新烟碱类(neonicotinoid)和莱恩碱类(ryanoid)。杀虫或杀昆虫蛋白剂包括本技术中提出的蛋白毒素，以及其它蛋白毒性剂，包括靶向鳞翅目、鞘翅目、半翅目或缨翅目有害生物物种的那些。
140.意图是对有害生物，尤其是作物植物的有害生物的提及，意指作物植物的虫害，特别是通过tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白防治的那些。当靶向这些有害生物的毒性剂与tic6280相关毒素蛋白或tic7016相关毒素蛋白，或与tic6280或tic7016毒素蛋白分别有62％至约100％同一性的蛋白共同定位或存在时，对有害生物的提及还可以包括植物的同翅目(homopteran)昆虫类有害生物，以及线虫和真菌。
141.tic6280和tic7016相关毒素蛋白对来自鞘翅目昆虫和鳞翅目昆虫种(包括成虫、蛹、幼虫和新生昆虫)，以及半翅目昆虫种(包括成虫和若虫)和缨翅目昆虫种(包括成虫、蛹、预蛹和幼虫)的昆虫类有害生物表现出杀昆虫活性。
142.鳞翅目的昆虫包括但不限于夜蛾科(noctuidae)中的粘虫、切根虫、尺蠖和棉铃虫，例如草地粘虫(spodoptera frugiperda)、甜菜粘虫(spodoptera exigua)、黑粘虫(spodoptera exempta)、南方粘虫(spodoptera eridania)、披肩粘虫(mamestra configurata)、小地老虎(agrotis ipsilon)、甘蓝银纹夜蛾(trichoplusia ni)、大豆夜蛾(pseudoplusia includens)、藜豆认蛾(anticarsia gemmatalis)、苜蓿绿夜蛾(hypena scabra)、烟芽夜蛾(heliothis virescens)、粒肤地老虎(agrotis subterranea)、粘虫(pseudaletia unipuncta)、西部切根虫(agrotis orthogonia)；来自螟蛾科(pyralidae)的蛀虫(borer)、鞘蛾(casebearer)、结网毛虫(webworm)、锥虫(coneworm)、卷心菜虫(cabbageworm)和雕叶虫(skeletonizer)，例如欧洲玉米螟(ostrinia nubilalis)、脐橙螟(amyelois transitella)、玉米根结网虫(crambus caliginosellus)、草地螟(herpetogramma licarsisalis)、向日葵螟(homoeosoma electellum)、小玉米茎蛀虫(elasmopalpus lignosellus)；卷蛾科(tortricidae)的卷叶蛾、芽虫、种子蠕虫和果实蠕
latimarginatus、euschistus obscures、euschistus politus、euschistus quadrator、褐美洲蝽(euschistus servus)、euschistus strenuous、三色美洲蝽(euschistus tristigmus)、三点美洲蝽(euschistus variolarius)、茶翅蝽(halyomorpha halys)、thyanta accerra、thyanta calceata、thyanta custator、thyanta pallidovirens、thyanta perditor、thyanta maculate、thyanta pseudocasta、dichelops melacanthus、dichelops avilapiresi、dichelops bicolor、dichelops dimidatus、dichelops furcatus、dichelops furcifrons、dichelops lobatus、dichelops miriamae、dichelops nigrum、dichelops peruanus、dichelops phoenix、dichelops saltensis、piezodorus guildinni、piezodorus lituratus、筛豆龟蝽(megacopta cribraria)、豆荚草盲蝽(lygus hesperus)、牧草盲蝽(lyguslineolaris)和棉盲蝽(pseudatomoscelis seriatus)。
145.缨翅目的昆虫包括但不限于烟草蓟马(frankliniella fusca)、花蓟马(frankliniella tritici)、西花蓟马(frankliniella occidentalis)和大豆蓟马(sericothrips variabilis)。
146.在本技术中提及“经分离的dna分子”或等效术语或短语意指dna分子是单独地或与其它组成成分组合存在的，但未处于其天然环境内的dna分子。例如，未将生物体基因组的dna内天然存在的核酸元件如编码序列、内含子序列、未翻译的前导序列、启动子序列、转录终止序列等视为是“经分离的”，只要所述元件处于所述生物体的基因组内以及在它所天然存在于基因组内的位置处。然而，在本公开的范围内，这些元件中的每一个以及这些元件的子部分将是“经分离的”，只要所述元件不在生物体的基因组内并且不在它所天然存在于基因组内的位置处。类似地，编码杀昆虫蛋白或杀昆虫蛋白的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列将是经分离的核苷酸序列，只要该核苷酸序列不在编码该蛋白的所述序列所天然存在的细菌dna内。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被视为是经分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入植物或细菌细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的dna的核苷酸序列，将被视为是经分离的核苷酸序列，无论它存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内，植物或细菌的基因组内，还是以可检测的量存在于源自植物或细菌的组织、后代、生物样品或商品中。
147.如表1进一步所述，在从几个不同的球形赖氨酸芽孢杆菌菌株或刮板宏基因组(mtg)获得的dna中发现了编码tic6280相关和tic7016相关毒素蛋白的开放阅读框(orf)。
148.表1.从球形赖氨酸芽孢杆菌菌株获得的编码tic6280和tic7016相关毒素蛋白的开放阅读框。
[0149][0150][0151]
在微生物宿主细胞中克隆并表达各个编码序列以产生用于生物测定的蛋白。如表中所示，编码tic7107、tic7109、tic7110和tic7111的核酸序列编码本文称为tic7110的相
同氨基酸序列，并且彼此有1至6个核苷酸不同。
[0152]
为了在植物细胞中表达，可以使tic6280相关毒素蛋白和tic7016相关毒素蛋白表达以留在细胞溶质中或靶向植物细胞的不同细胞器。例如，将蛋白靶向叶绿体可导致转基因植物中所表达的蛋白的水平增加，同时防止发生脱表型(off-phenotype)。靶向还可导致转基因事件中的有害生物抗性功效增加。靶肽或转运肽是短的(长度为3-70个氨基酸)肽链，其指导蛋白转运至细胞中的特定区域，包括细胞核、线粒体、内质网(er)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。一些靶肽在蛋白被转运之后被信号肽酶从蛋白上切割掉。为了靶向叶绿体，蛋白含有40-50个氨基酸左右的转运肽。对叶绿体转运肽的用途的描述，参见美国专利号5,188,642和5,728,925。许多叶绿体定位的蛋白由核基因表达为前体，并通过叶绿体转运肽(ctp)靶向叶绿体。此类经分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、捕光复合蛋白i和蛋白ii、硫氧还蛋白f、烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(epsps)和美国专利号7,193,133中描述的转运肽的小亚基(ssu)缔合的那些。已经在体内和体外证明，通过使用与异源ctp的蛋白融合物，非叶绿体蛋白可以被靶向叶绿体，并且ctp足以将蛋白靶向叶绿体。已经证实并入合适的叶绿体转运肽，如拟南芥(arabidopsis thaliana)epsps ctp(ctp2)(参见klee等人，mol.gen.genet.210:437-442,1987)或矮牵牛(petunia hybrida)epsps ctp(ctp4)(参见della-cioppa等人，proc.natl.acad.sci.usa 83:6873-6877,1986)会使异源epsps蛋白序列靶向转基因植物中的叶绿体(参见，美国专利号5,627,061、5,633,435和5,312,910；及ep 0218571；ep 189707；ep 508909；和ep 924299)。为了将tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白靶向叶绿体，使编码叶绿体转运肽的序列置于5'处与已经设计用于在植物细胞中最佳表达的编码tic6280蛋白或tic6280相关毒素蛋白，或tic7016蛋白或tic7016相关毒素蛋白的序列可操作地连接并且在框内。
[0153]
考虑可以通过使用tic6280毒素蛋白和tic7016毒素蛋白的天然存在的氨基酸序列产生与tic6280毒素蛋白和tic7016毒素蛋白相关的其它毒素蛋白序列以产生具有新型特性的新型蛋白。可以将tic6280和tic7016毒素蛋白与类似于tic6280或tic7016的其它蛋白进行比对，以将氨基酸序列水平的差异组合到新型氨基酸序列变体中，并对编码变体的重组核酸序列进行适当的改变。
[0154]
本公开还考虑可以在植物体内通过使用本领域已知的各种基因编辑方法工程改造tic6280和tic7016蛋白毒素类的改进变体。此类用于基因组编辑的技术包括但不限于zfn(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、talen(转录激活因子样效应核酸酶)和crispr(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/cas(crispr相关)系统。这些基因组编辑方法可用于将在植物细胞内转化的毒素蛋白编码序列改变为不同的毒素编码序列。具体地说，通过这些方法，改变毒素编码序列内的一个或多个密码子以工程改造新的蛋白氨基酸序列。可替代地，置换或缺失编码序列内的片段，或将另外的dna片段插入编码序列中，以工程改造新的毒素编码序列。新的编码序列可以编码具有新特性，例如针对昆虫类有害生物的活性或范围增加的毒素蛋白，以及提供针对其中已经对原始昆虫毒素蛋白发展抗性的昆虫类有害生物物种的活性。包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞可以通过本领域已知的方法用于产生表达新毒素蛋白的完整植物。
[0155]
还考虑tic6280和tic7016毒素蛋白类别的片段或其蛋白变体可以是具有昆虫抑
no:33)、tic7108(seq id no:36)、tic7110(seq id no:39)、tic7589(seq id no:42)、tic9258(seq id no:97)和tic9259(seq id no:99)-使用clustal w算法彼此进行比对。如表3所报告，产生每一对的氨基酸序列同一性百分比的成对矩阵。括号中指出了两个序列之间相同氨基酸的数量。
[0163]
表3.示例性的tic7016相关毒素蛋白的成对矩阵展示
[0164][0165]
表的描述：以成对矩阵报告(x)和(y)之间的clustal w比对。计算所有对之间的氨基酸同一性百分比，并用每个方框中的第一个数字表示。每个方框中的第二个数字(在括号中)表示该对之间相同氨基酸的数量。
[0166]
编码tic7107(seq id no:34)、tic7109(seq id no:37)和tic7111(seq id no:40)的球形赖氨酸芽孢杆菌编码序列编码与tic7110(seq id no:39)的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。每个编码序列有1至6个核苷酸不同，这取决于比较的两个序列。使用clustal w算法将tic7107(seq id no:34)、tic7109(seq id no:37)、tic7110(seq id no:38)和tic7111(seq id no:40)编码序列彼此进行比对。如表4所报告，产生每一对的核酸序列同一性百分比的成对矩阵。括号中指出了两个序列之间相同核酸的数量。
[0167]
表4.tic7107、tic7109、tic7110和tic7111球形赖氨酸芽孢杆菌编码序列的成对矩阵展示。
[0168][0169][0170]
表的描述：以成对矩阵报告(x)和(y)之间的clustal w比对。计算所有对之间的氨
基酸同一性百分比，并用每个方框中的第一个数字表示。每个方框中的第二个数字(在括号中)表示该对之间相同氨基酸的数量。
[0171]
除了同一性百分比之外，tic6280蛋白毒素类的蛋白还可以通过一级结构(保守性氨基酸基序)、长度(约288个氨基酸)和其它特征相关。表5中报告了tic6280毒素蛋白类别的特征。
[0172]
表5.tic6280毒素蛋白类别的特征。
[0173][0174]
tic7016毒素蛋白类别的蛋白还可以通过一级结构(保守性氨基酸基序)、长度(约274个氨基酸)和其它特征相关。表6中报告了tic7016毒素蛋白类别的特征。
[0175]
表6.tic7016毒素蛋白类别的特征。
[0176][0177][0178]
如本技术的实施例中进一步描述的，编码tic6280、tic6282、tic6283、tic7016pl、tic7017pl、tic7108pl和tic7110pl的合成核酸分子序列被设计用于植物中。设计用于植物中编码tic6280、tic6282、tic6283、tic7016pl、tic7017pl、tic7108pl和tic7110pl蛋白的示例性重组核酸分子序列分别如seq id no:43、44、45、46、48、50和52所示。tic7016pl、tic7017pl、tic7018pl、tic7110pl蛋白紧邻起始甲硫氨酸之后具有附加丙氨酸氨基酸。据信附加丙氨酸残基插入会改善该蛋白在植物体内的表达。tic6280和tic7016蛋白毒素类别的其它成员可以设计用于植物中。
[0179]
另外，如本技术的实施例中所述，tic6280、tic6282、tic6283、tic7016、tic7017、tic7108和tic7110对鞘翅目和鳞翅目昆虫种(包括成虫、蛹、幼虫和新生昆虫)，以及半翅目昆虫种(包括若虫和成虫)表现出杀昆虫活性。
[0180]
可以构建含有这些重组核酸分子序列的表达盒和载体，并根据本领域已知的转化方法和技术将其引入玉米、大豆、棉花或其它植物细胞中。经转化的细胞可以再生成经转化
的植物，观察到经转化的植物正在表达昆虫抑制性tic6280、tic6282、tic6283、tic7016pl、tic7017pl、tic7108pl或tic7110pl蛋白。为了测试杀虫活性，在鳞翅目有害生物幼虫的存在下使用从经转化的植物获得的植物叶盘进行生物测定，如下文实施例中所述。为了测试对鞘翅目有害生物的杀虫活性，将r0和f1代的经转化的植物用于根虫测定中，如下文实施例中所述。为了测试对半翅目有害生物的杀虫活性，在测定中使用经转化的植物的豆荚、玉米穗或叶片，其来自于从植物中取出的组织或保留在植物上，如下文实施例中所述。
[0181]
作为传统转化方法的替代方案，可以通过定点整合将dna序列，如转基因、表达盒等，插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的重组dna构建体和分子可包括供体模板序列，其包含至少一个转基因、表达盒或用于插入到植物或植物细胞基因组中的其它dna序列。用于定点整合的此类供体模板还可包括侧接插入序列(即，待插入植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的重组dna构建体还可包含编码位点特异性核酸酶和/或任何相关蛋白的表达盒，以进行定点整合。这些核酸酶表达盒可以作为供体模板存在于相同的分子或载体中(顺式)或存在于单独的分子或载体上(反式)。本领域已知几种用于定点整合的方法，其涉及切割基因组dna以在所需基因组位点或基因座处产生双链断裂(dsb)或切口的不同蛋白(或蛋白和/或导向rna的复合物)。简言之，如本领域所理解的，在修复由核酸酶引入的dsb或切口的过程中，供体模板dna可以整合到基因组中的dsb或切口位点处。供体模板中同源臂的存在可以促进在修复过程中通过同源重组采用和靶向插入序列到植物基因组中，但插入事件可以通过非同源末端连接(nhej)进行。可以使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程改造的或天然的大范围核酸酶、tale-核酸内切酶和rna导向的核酸内切酶(例如，cas9或cpf1)。对于使用rna导向的位点特异性核酸酶(例如，cas9或cpf1)的方法，重组dna构建体还将包含编码一种或多种导向rna的序列，以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点。
[0182]
如本文所用，“重组dna分子”是包含dna分子组合的dna分子，所述dna分子在没有人为干预的情况下不会天然地一起出现。例如，重组dna分子可以是由至少两个彼此异源的dna分子组成的dna分子，包含与自然界中存在的dna序列偏离的dna序列的dna分子，或已经通过遗传转化或基因编辑整合到宿主细胞的dna中的dna分子。类似地，“重组蛋白分子”是包含氨基酸组合的蛋白分子，所述氨基酸在没有人为干预的情况下不会天然地一起出现。例如，重组蛋白分子可以是由至少两个彼此异源的氨基酸分子组成的蛋白分子，包含与自然界中存在的氨基酸序列偏离的氨基酸序列的蛋白分子，或由于宿主细胞的遗传转化或通过宿主细胞基因组的基因编辑而在宿主细胞中表达的蛋白分子。
[0183]
考虑了编码来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白的重组核酸分子组合物。例如，来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白可以用重组dna构建体表达，在所述dna构建体中具有编码所述蛋白的orf的多核苷酸分子与遗传表达元件如启动子和在对其设计构建体的系统中表达所必需的任何其它调控元件可操作地连接。非限制性实例包括与来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白的编码序列可操作地连接，用于在植物中表达所述蛋白的植物功能性启动子，或与来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白的编码序列可操作地连接，用于在bt细菌或其它芽孢杆菌属种中表达所述蛋白的bt功能性启动子。其它元件可以与来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白编码序列可操作地连接，包括但不限于增强子、内含子、非翻译前导序列、编码的蛋白固定化标签(his-标签)、易位肽(即，质
体转运肽、信号肽)、翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和rnai靶位点。同此一起提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于，与多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸是编码具有seq id no:2、4、6、8、10、12、15、18、21、23、25、27、29、31、33、36、39、42、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、81、83、85、87、89、91、93、95、97和99所示的氨基酸序列的多肽或蛋白的多核苷酸如seq id no:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、20、22、24、26、28、30、32、34、35、37、38、40、41、43、44、45、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、82、84、86、88、90、92、94、96和98。异源启动子也可以与编码来自tic6280或tic7016毒素蛋白类别的质体靶向或非靶向蛋白的合成dna编码序列可操作地连接。编码本文公开的蛋白的重组核酸分子的密码子可以被同义密码子取代(在本领域中称为沉默取代)。在编码tic7107(seq id no:34)、tic7109(seq id no:37)、tic7110(seq id no:38)和tic7111(seq id no:40)的编码序列中证明了天然存在的沉默突变，其中每个编码序列编码相同的蛋白氨基酸序列，即tic7110(seq id no:39)。
[0184]
包含来自tic6280或tic7016毒素蛋白类别的蛋白的编码序列的重组dna构建体还可包含编码一种或多种昆虫抑制剂的dna区域，所述dna区域可以构造成与编码来自tic6280或tic7016毒素蛋白类别的蛋白，与来自tic6280或tic7016毒素蛋白类别的蛋白不同的蛋白，昆虫抑制性dsrna分子或辅助蛋白的dna序列同时表达或共表达。辅助蛋白包括但不限于辅因子、酶、结合配偶体或其它有助于昆虫抑制剂有效性(例如通过帮助其表达，影响其在植物中的稳定性，优化自由能以进行聚反应，增强其毒性，并增加其活性谱)的剂。辅助蛋白可以促进一种或多种昆虫抑制剂的摄取，例如，或增强毒性剂的毒性作用。
[0185]
重组dna构建体可以组装，使得所有蛋白或dsrna分子由一个启动子表达，或者每个蛋白或dsrna分子处于单独的启动子控制下或其某些组合下。本发明的蛋白可以由多基因表达系统表达，其中tic6280和tic7016毒素蛋白类别的一种或多种蛋白由共同的核苷酸区段表达，该核苷酸区段还包含其它开放阅读框和启动子，这取决于所选表达系统的类型。例如，细菌多基因表达系统可以利用单个启动子来驱动来自单个操纵子内的多重连接/串联开放阅读框的表达(即多顺反子表达)。在另一个实例中，植物多基因表达系统可以利用多重未连接的表达盒，每个表达盒表达不同的蛋白或其它剂，如一种或多种dsrna分子。
[0186]
包含来自tic6280或tic7016毒素蛋白类别的编码序列的重组核酸分子或重组dna构建体可通过载体(例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒粒子、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)递送至宿主细胞。此类载体可用于在宿主细胞中实现来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白编码序列的稳定或瞬时表达，或所编码的多肽的后续表达。引入宿主细胞内的包含来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白编码序列的外源重组多核苷酸或重组dna构建体在本文中称为“转基因”。
[0187]
本文提供了含有表达来自tic6280或tic7016毒素蛋白类别的任何一种或多种蛋白的重组多核苷酸的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分。术语“细菌细胞”或“细菌”可包括但不限于农杆菌、芽孢杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、假单胞菌或根瘤菌细胞。术语“植物细胞”或“植物”可包括但不限于双子叶细胞或单子叶植物细胞。考虑到的植物和植物细胞包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、
橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜属蔬菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、西红柿、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了转基因植物和由转基因植物细胞再生的转基因植物部分。在某些实施方案中，可以通过切割、手摘、研磨或以其它方式使所述部分与植物分离而由转基因种子获得转基因植物。在某些实施方案中，植物部分可以是转基因植物部分的种子、棉铃、叶、花、茎、根或其任何部分，或不可再生部分。如该上下文中所用，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能被诱导形成完整植物或不能被诱导形成能够进行有性和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、棉铃、叶、花、茎或根的一部分。
[0188]
提供了产生包含昆虫、鞘翅目、鳞翅目、半翅目或缨翅目抑制量的来自tic6280或tic7016毒素蛋白类别的蛋白的转基因植物的方法。此类植物可以通过下述方式产生：将编码本技术中提供的任何蛋白的重组多核苷酸引入植物细胞中，并选择由所述植物细胞衍生的表达昆虫、鞘翅目、鳞翅目、半翅目或缨翅目抑制量的蛋白的植物。植物可以通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术由植物细胞衍生。用于转化植物的方法是本领域已知的。
[0189]
本技术还公开了经加工的植物产品，其中经加工产品包含可检测量的来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白、其昆虫抑制性区段或片段，或其任何区别部分。在某些实施方案中，经加工产品选自植物部分、植物生物质、油、粗粉、糖、动物饲料、面粉、薄片、麸皮、棉绒、壳、加工种子和种子。在某些实施方案中，经加工产品是不可再生的。植物产品可以包含源自转基因植物或转基因植物部分的商品或其它商业产品，其中商品或其它产品可以通过检测编码或包含来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的区别性部分的核苷酸区段或所表达的rna或蛋白来经由商业跟踪。
[0190]
表达来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的植物可以通过育种与表达其它毒素蛋白和/或表达其它转基因性状的转基因事件如除草剂耐受基因，赋予产量或胁迫耐受性状的基因等杂交，或者可以将此类性状组合在单个载体中，使得性状全部相关联。
[0191]
如实施例中进一步描述的，编码来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的序列和与来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白具有显著同一性百分比的序列可以使用本领域普通技术人员已知的方法，如聚合酶链式反应(pcr)、热扩增和杂交等鉴定。例如，来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白可用于产生与相关蛋白特异性结合的抗体，并且可用于筛选和发现密切相关的其它蛋白成员。
[0192]
此外，编码来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的核苷酸序列可以用作探针和引物，用于筛选以使用热循环或等温扩增和杂交方法鉴定该类别的其它成员。例如，源自seq id no:43、44、45、46、48、50或52中所示序列的寡核苷酸可用于确定源自商品的脱氧核糖核酸样品中tic6280、tic6282、tic6283、tic7016、tic7017、tic7108或tic7110存在与否。考虑到采用寡核苷酸的某些核酸检测方法的灵敏性，预期源自seq id no:43、44、45、46、48、50和52中任一个所示序列的寡核苷酸均可用于检测源自汇集来源的商品中的tic6280、tic6282、tic6283、tic7016、tic7017、tic7108或tic7110转基因，其中仅一部分商品源自含有seq id no:43、44、45、46、48、50和52中任一个的转基因植物。进一步认识到，此类寡核苷酸可用于在seq id no:43、44、45、46、48、50和52中引入核苷酸序列变异。此类“诱
变”寡核苷酸可用于鉴定来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的氨基酸序列变体，其在转基因植物宿主细胞中表现出一系列昆虫抑制活性或变化的表达。
[0193]
核苷酸序列同源物，例如由在杂交条件下与本技术中公开的每个或任何序列杂交的核苷酸序列编码的杀虫蛋白，也是本发明的一个实施方案。本发明还提供了用于检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段，并在严格杂交条件下与第二核苷酸序列杂交。在此类情况下，在严格杂交条件下第二核苷酸序列可以是选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:1、3、5、7、9、11、13、14、16、17、19、20、22、24、26、28、30、32、34、35、37、38、40、41、43、44、45、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、82、84、86、88、90、92、94、96和98。核苷酸编码序列在适当的杂交条件下彼此杂交，并且由这些核苷酸序列编码的蛋白与针对任何一种其它蛋白产生的抗血清交叉反应。如本文所定义的严格杂交条件包括至少在42℃下杂交，然后在室温下用2x ssc、0.1％sds洗涤两次，每次5分钟，然后在65℃下在0.5x ssc、0.1％sds中洗涤两次，每次30分钟。在甚至更高的温度下洗涤构成甚至更严格的条件，例如68℃的杂交条件，然后在68℃下在含有0.1％sds的2xssc中洗涤。
[0194]
本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的冗余，许多其它序列能够编码与tic6280或tic7016相关的蛋白并且那些序列，就它们在芽孢杆菌菌株中或者在植物细胞中表达杀虫蛋白来说，是本发明的实施方案，当然认识到许多此类冗余编码序列在这些条件下不会与编码tic6280或tic7016的天然芽孢杆菌序列杂交。本技术考虑使用本领域普通技术人员已知的这些和其它鉴定方法，以鉴定编码tic6280和tic7016蛋白的序列和与编码tic6280和tic7016蛋白的序列具有显著同一性百分比的序列。
[0195]
本公开还考虑使用本领域已知的分子方法来工程改造和克隆包含来自杀虫蛋白的蛋白嵌合体的商业上有用的蛋白；例如，嵌合体可以由来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的区段组装，以得到另外的有用实施方案，包括组装来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的区段连同与来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的不同蛋白的区段。来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白可以与其它杀虫蛋白进行比对(无论这些在系统发育上是密切相关还是远距离相关)，并且可以鉴定每种此类蛋白的区段，其可用于比对蛋白之间的取代，导致嵌合蛋白的构建。可以对此类嵌合蛋白进行有害生物生物测定分析，并且表征与嵌合体中每个此类区段所来源的亲本蛋白相比，存在或不存在增加的生物活性和/或扩展的目标有害生物谱。通过用其它蛋白交换结构域或区段或通过使用本领域已知的定向进化方法，可以针对特定有害生物或更广谱的有害生物的活性进一步工程改造多肽的杀虫活性。
[0196]
本公开还考虑使用本领域已知的分子方法来工程改造和克隆商业上有用的蛋白，其包括来自杀虫蛋白的蛋白融合物；例如，可以通过将tic7016相关毒素蛋白与tic6280相关毒素蛋白组合来组装融合物。融合蛋白可以增加活性谱和/或提供针对昆虫类有害生物物种的多种作用模式。融合蛋白可以是直接融合物，其中第一和第二毒素蛋白编码序列可操作地连接并在框内作为一个连续序列。编码此类融合蛋白的序列的翻译产生融合毒素蛋白的氨基酸序列，而在第一和第二毒素蛋白之间没有任何附加氨基酸。此类示例性融合蛋白编码序列提供为seq id no:54、60和66，并且编码分别如seq id no:55、61和67所示的嵌合毒素蛋白。融合蛋白还可以包含在两种毒素蛋白之间可操作地连接并且在框内的接头序
列。接头可以是可切割的，例如当被昆虫类有害生物物种摄取时，可被昆虫肠道中存在的内源酶切割，以使融合蛋白中的两种昆虫毒素彼此释放。此类接头提供为seq id no:72，并且编码如seq id no:73所示的氨基酸序列。包含可切割接头的示例性融合毒素蛋白编码序列提供为seq id no:56、62和68，并且编码如seq id no:57、63和69所示的蛋白。融合蛋白内的接头可以是柔性的并且允许第一和第二毒素蛋白的表达和正确折叠的肽片段；并且为融合蛋白中的每种毒素蛋白提供足够的间隔以结合它们各自的受体。此类接头提供为seq id no:74，并且编码如seq id no:75所示的氨基酸序列。包含柔性接头的示例性融合毒素蛋白编码序列提供为为seq id no:58、64和70，并且编码如seq id no:59、65和71所示的毒素蛋白。
[0197]
本公开还考虑了由人工操纵子编码的两种或更多种毒素蛋白，人工操纵子将允许两种或更多种毒素蛋白在细菌宿主细胞中共表达。可用于连接两种毒素编码序列的代表性序列如seq id no:79所示，其中接头5'末端的前3个核苷酸编码终止密码子以终止操纵子中第一毒素蛋白的转录。包含两种毒素蛋白编码序列的示例性操纵子序列提供为seq id no:76、77和78。
[0198]
本技术还公开了用来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白防治昆虫，尤其是鳞翅目或鞘翅目或半翅目或缨翅目侵染作物植物的方法。此类方法可以包括使包含昆虫，即鞘翅目或鳞翅目或半翅目或缨翅目抑制量的来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的植物生长。在某些实施方案中，此类方法还可包括以下的任一项或多项：(i)将包含或编码来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的任何组合物施用于植物或产生植物的种子；和(ii)用编码来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。一般而言，考虑到来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白可以在组合物中提供，在微生物中提供，或在转基因植物中提供以赋予对鳞翅目、鞘翅目或半翅目昆虫的昆虫抑制活性。
[0199]
在某些实施方案中，来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的重组核酸分子是昆虫抑制组合物的杀昆虫活性成分，所述昆虫抑制组合物通过以下方式制备：在适于表达来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的条件下培养经转化的重组芽孢杆菌或任何其它重组细菌细胞以表达来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白。此类组合物可以通过干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物来制备。此类方法可以产生芽孢杆菌或其它昆虫病原细菌细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞团块。通过获得这样产生的重组多肽，包括该重组多肽的组合物可以包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制性喷雾产品或作为食物生物测定中的昆虫抑制制剂。
[0200]
在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的昆虫抑制性组合物还可包含至少一种对相同的鳞翅目、鞘翅目或半翅目昆虫种表现出昆虫抑制活性，但不同于来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的附加多肽。用于此类组合物的可能附加多肽包括昆虫抑制性蛋白和昆虫抑制性dsrna分子。baum等人描述了使用此类核糖核苷酸序列防治昆虫类有害生物的一个实例(美国专利公开2006/0021087a1)。用于鳞翅目有害生物防治的此类附加多肽可选自由以下组成的组的昆
223z(美国专利公开2014-0196175 a1)、axmi-279(美国专利公开2014-0223599 a1)、axmi-r1及其变体(美国专利公开2010-0197592 a1、tic407、tic417、tic431、tic807、tic853、tic901、tic1201、tic3131、dig-10(美国专利公开2010-0319092 a1)、ehip(美国专利申请公开号2010/0017914)、ip3及其变体(美国专利公开2012-0210462 a1)和-hexatoxin-hv1a(美国专利申请公开us2014-0366227 a1)。
[0202]
用于防治半翅目有害生物的此类附加多肽可选自由以下组成的组的半翅目活性蛋白，例如但不限于tic1415(美国专利公开2013-0097735 a1)、tic807(美国专利号8609936)、tic834(美国专利公开2013-0269060 a1)、axmi-036(美国专利公开2010-0137216 a1)和axmi-171(美国专利公开2013-0055469 a1)。
[0203]
在其它实施方案中，此类组合物/制剂还可包含至少一种对不受本发明的其它昆虫抑制性蛋白抑制的昆虫表现出昆虫抑制活性的附加多肽，以扩展所获得的昆虫抑制谱。用于防治鞘翅目、鳞翅目、半翅目和缨翅目昆虫类有害生物的附加多肽可以在由neil crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站上找到(在万维网btnomenclature.info上)。
[0204]
昆虫对某些杀昆虫剂产生抗性的可能性在本领域中已有记载。一种昆虫抗性管理策略是采用表达两种通过不同作用模式起作用的不同昆虫抑制剂的转基因作物。因此，对任一种昆虫抑制剂具有抗性的任何昆虫都可以通过另一种昆虫抑制剂来防治。另一种昆虫抗性管理策略采用未针对目标鞘翅目或鳞翅目或半翅目或缨翅目有害生物物种受到保护的植物，以为此类未受保护的植物提供避难所。在美国专利号6,551,962中描述了一个特定实例，该专利通过引用整体并入。
[0205]
其它实施方案，例如设计用于防治有害生物(也通过本文公开的蛋白防治)的局部施用的与用于种子处理的蛋白、喷洒、滴涂或擦拭制剂一起使用的杀虫化学品可直接施用于土壤(土壤灌溉)，施用于表达本文公开的蛋白的生长植物，或配制成施用于含有一种或多种编码一种或多种所公开的蛋白的转基因的种子。用于种子处理的此类制剂可以随本领域已知的各种粘着剂和增粘剂一起施用。此类制剂可含有与所公开的蛋白在作用方式上具有协同作用的除害剂，使得制剂除害剂通过不同的作用方式起作用以防治可通过所公开的蛋白防治的相同或相似有害生物，或使得此类除害剂起到防治更广泛的宿主范围内的有害生物或不受tic6280毒素蛋白或tic6280相关毒素蛋白或tic7016毒素蛋白或tic7016相关毒素蛋白有效防治的植物有害生物物种。
[0206]
上述组合物/制剂还可包含农业上可接受的载体，如诱饵、粉末、粉尘、团块、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体悬浮液、水溶液、芽孢杆菌孢子/晶体制剂、种子处理剂，经转化以表达一种或多种蛋白的重组植物细胞/植物组织/种子/植物，或经转化以表达一种或多种蛋白的细菌。根据重组多肽中固有的昆虫抑制性或杀昆虫性抑制水平及施用于植物或食物测定中的制剂水平，组合物/制剂可包括按重量计不同量的重组多肽，例如按重量计0.0001％至0.001％至0.01％至1％至99％的重组多肽。
[0207]
鉴于前述内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定方面进行改变并仍然获得相同或相似的结果。因此，本文公开的具体结构和功能详情不应解释为限制。应该理解的是，本文引用的每个参考文献的全部公开内容并入本技术的公开内容中。
[0208]
实施例
[0209]
鉴于前述内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定方面进行改变并仍然获得相同或相似的结果。因此，本文公开的具体结构和功能详情不应解释为限制。应该理解的是，本文引用的每个参考文献的全部公开内容并入本技术的公开内容中。
[0210]
实施例1
[0211]
新型球形赖氨酸芽孢杆菌和宏基因组基因的发现
[0212]
该实施例描述了杀虫蛋白tic6280、tic6281、tic6282、tic6283、tic8808、tic9480、tic9257、tic7106、tic7017、tic7107、tic7108、tic7109、tic7110、tic7111、tic7589、tic9258和tic9259的发现。
[0213]
鉴定编码新型球形赖氨酸芽孢杆菌(ls)杀虫蛋白的序列，对序列进行克隆，确认序列并在昆虫生物测定中测试。本文如seq id no:22(ls编码序列)和seq id no:23(蛋白)所示的杀虫蛋白tic6280分离自球形赖氨酸芽孢杆菌物种ag0067h07。使用高通量测序和生物信息学筛选源自刮板的ls基因组和宏基因组中编码表现出与tic6280的相似性的蛋白的基因(开放阅读框)。在该筛选中鉴定了六种相关毒素蛋白，并连同相应的ls菌株或宏基因组命名(mtg)和与tic6280蛋白的同一性百分比一起呈现于表7中。
[0214]
表7.tic6280和相关毒素蛋白。
[0215][0216]
本文如seq id no:30(ls编码序列)和seq id no:31(蛋白)所示的杀虫蛋白tic7016分离自球形赖氨酸芽孢杆菌种egbs0420。使用高通量测序和生物信息学筛选源自刮板的ls基因组和宏基因组中编码表现出与tic7016的相似性的蛋白的基因(开放阅读框)。在该筛选中鉴定了九种相关毒素蛋白，并连同相应的ls菌株或宏基因组命名(mtg)和与tic7016蛋白的同一性百分比一起呈现于表8中。编码tic7107、tic7109、tic7110和tic7111的编码序列编码本文称为tic7110(seq id no:39)的相同氨基酸序列。每个tic7110蛋白编码序列彼此有一至六个核苷酸不同，并且表示编码本文称为tic7110的相同蛋白氨基酸序列的变体编码序列。
[0217]
表8.tic7016和相关毒素蛋白。
[0218][0219][0220]
编码来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的核苷酸区段通过使用来自相应菌株的基因组dna进行pcr扩增而产生或经化学合成并克隆到质粒表达载体中以在细菌宿主中表达。
[0221]
实施例2
[0222]
来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白成员针对昆虫类有害生物的生物测定
[0223]
该实施例描述使用来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的细菌制剂对鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫类有害生物的活性的生物测定。
[0224]
来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白在大肠杆菌中表达为组氨酸标记的蛋白，并测定其对鳞翅目、鞘翅目和半翅目的不同种的毒性。使用本领域已知的方法克隆编码来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的编码序列，以在3'末端包含编码用于纯化每种毒素蛋白的组氨酸标签的短序列。编码每种his标记的毒素的序列和所得的his-标记的蛋白示于下面表9中。
[0225]
将来自大肠杆菌(e.coli)的每种毒素的制剂针对以下物种进行测定：鞘翅目的种，西方玉米根虫(wcr，玉米根萤叶甲)、北方玉米根虫(ncr，巴氏根叶甲)、南方玉米根虫(scr，霍华德十一星根叶甲)和科罗拉多马铃薯甲虫(cpb，马铃薯甲虫)；半翅目的种，牧草盲蝽(tpb，美洲牧草盲蝽)、西部牧草盲蝽(wtp，豆荚草盲蝽)、南方稻绿蝽(sgsb，稻绿蝽)和新热带棕蝽(nbsb，英雄美洲蝽)；和鳞翅目的种，大豆夜蛾(sbl，大豆尺蠖(chrysodeixis includens))、欧洲玉米螟(ecb，玉米螟)、烟草夜蛾(tbw，烟芽夜蛾)、玉米穗虫(cew，谷实夜蛾(helicoverpa zea))、草地粘虫(faw，草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda))、南方粘虫(saw,亚热带粘虫(spodoptera eridania))、西南玉米螟(swc，巨座玉米螟(diatraea grandiosella))、小菜蛾(dbm，菱纹背蛾)、小地老虎(bcw，球菜夜蛾(agrotis ipsilon))和藜豆认蛾(vbc，黎豆夜蛾(anticarsia gemmatalis)。
[0226]
表9.tic6280和tic7016蛋白毒素类别的his标记的编码序列和蛋白序列及测定的昆虫
[0227][0228]
[0229]
来自tic6280或tic7016蛋白毒素类别的蛋白的杀虫活性示于表10和11中，其中“ ”表示有活性。
[0230]
表10.来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白对鞘翅目和半翅目昆虫类有害生物物种的杀虫活性
[0231]
毒素wcrncrscrcpbtpbwtpsgsbnbsbtic6280
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tic6281
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tic6282
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tic6283
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tic8808
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tic7016
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tic7017 tic7107
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tic7108
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tic7109
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tic7110
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tic7111
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tic7589
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tic9258
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tic9259
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[0232]
表11.来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白对鳞翅目昆虫类有害生物物种的杀虫活性
[0233]
毒素sblecbtbwcewfawsawswcdbmbcwvbctic6280
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tic6281
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tic6282
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tic6283
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tic7016
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tic7108
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tic7109
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tic7111
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tic7589
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tic9259
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[0234]
正如表10和表11中可以看出，来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白对大范
围的有害生物表现出活性，一些毒素对所有三个代表家族的有害生物表现出活性：鞘翅目、半翅目和鳞翅目。关于源自tic7109、tic7110和tic7111编码序列的蛋白的活性观察到一些变异性，即使三个序列全部编码相同的蛋白。这种变异性可能是由于在大肠杆菌宿主中表达或后续纯化导致的蛋白制剂的差异引起的。另外，并非所有制剂都针对所有有害生物进行了测定。因此，对tic7110观察到的活性用作由所有四个编码序列编码的毒素蛋白活性的代表。
[0235]
实施例3
[0236]
编码来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的合成编码序列的设计以用于在植物细胞中表达
[0237]
该实施例描述了编码来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的合成dna序列的设计，以用于在经转化的植物细胞中表达所述蛋白。
[0238]
构建合成编码序列用于在植物中表达编码的蛋白，并且可以将所述合成编码序列克隆到二元植物转化载体中，并用于转化植物细胞。合成序列根据美国专利5,500,365中总体描述的方法合成，避免某些有害问题序列如attta和富含a/t的植物多聚腺苷酸化序列，同时保留了原始蛋白的氨基酸序列。表12中呈现的合成编码序列编码来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的某些蛋白的植物型蛋白。
[0239]
表12.设计用于在植物细胞中表达的合成编码序列
[0240][0241]
使用本领域已知的方法将合成编码序列克隆到植物二元转化载体中。所得二元载体包含第一转基因盒，其包含植物可表达的启动子，该启动子任选地5'与内含子可操作地连接，内含子5'与编码tic6280或tic6282、tic6283、tic7016、tic7017、tic7108或tic7110的合成编码序列可操作地连接，合成编码序列5'与3'utr可操作地连接；第二转基因盒，其用于使用抗生素如壮观霉素(spectinomycin)，使用草甘膦选择或抗生素选择来选择经转化的植物细胞。
[0242]
实施例4
[0243]
使用经稳定转化的表达来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白的玉米植物测定针对鞘翅目有害生物的活性
[0244]
该实施例描述了在经稳定转化以表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的玉米植物中测定针对鞘翅目昆虫类有害生物的活性。
[0245]
使用本领域已知的方法克隆包含转基因盒的二元植物转化载体，所述表达盒设计为表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白。所得载体用于转化玉米植物。测定针对以稳定转化的玉米植物的根为食的鞘翅目有害生物的杀虫活性。
[0246]
使用实施例3中描述的二元载体稳定转化玉米植物。选择单t-dna插入事件并使其生长。使用r0稳定转化的植物测定鞘翅目抗性以及产生f1后代。从每次二元载体转化中选择多个单拷贝事件。由每次二元载体转化产生的那些事件中的一部分用于鞘翅目测定，而另一部分事件用于产生f1后代以进一步测试。
[0247]
将r0测定植物移植到8英寸的盆中。用来自西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，wcr)的卵接种植物。在接种前将卵孵育大约10天，以在接种后4天进行孵化，以确保足够数量的幼虫存活并能够攻击玉米根部。转化的植物在大约v2至v3期接种。植物在侵染后生长大约二十八天。将植物从盆中取出，仔细洗涤根部以去除所有土壤。使用1-5的损伤等级量表评估对根部的损伤，如表13所示。还进行与阴性对照的比较以确保测定正确进行。根部损伤得分低表明来自tic6280和tic7016类别的蛋白赋予对鞘翅目有害生物的抗性。在wcr测定中使用每次二元载体转化的多个r0事件。将那些表现出比对照较低的根部损伤等级得分的r0事件解释为提供对crw的抗性。
[0248]
表13.r0根部损伤等级得分
[0249]
根部损伤得分描述1无明显摄食2有一定摄食；未切断3切断至少一个根部4整个根结节被切断5一个以上的根结节被切断
[0250]
由每次二元载体转化产生的r0稳定转化事件中的一部分用于产生f1后代。使r0稳定转化的植物自花授粉，产生f1后代。种植f1种子。通过本领域已知的分子方法鉴定杂合植物并用于针对wcr的测定，以及来自tic6280和tic7016蛋白类别的蛋白的elisa表达测量。来自每个事件的杂合f1后代中的一部分用于昆虫测定，而另一部分用于测量毒素蛋白表达。
[0251]
将来自西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，wcr)的卵孵育大约10天，以在接种后的4天内孵化。植物在大约v2至v3期接种。对于wcr，每个盆接种约两千颗卵。使植物在侵染后生长大约二十八天。将植物从盆中取出，仔细洗涤根部以去除所有土壤。使用0-3的损伤等级量表评估对根部的损伤，如表14所示。进行与阴性对照的比较以确保测定正确进行。根部损伤得分低表明来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白赋予对鞘翅目有害生物的抗性。
[0252]
表14.f1根部损伤等级得分
[0253]
根部损伤得分描述0无明显摄食0.01-0.09有摄食瘢痕和踪迹0.1-0.9根部切断，但不是整个根结节1.0-1.9植物的至少一个完整根结节(或相当的)被破坏达到1.5英寸2.0-2.9失去两个或更多个根结节
3失去三个或更多个根结节
[0254]
可以以与上述wcr相似的方式测定针对其它玉米根虫种的活性。例如，可以使用巴氏根叶甲(北方玉米根虫，ncr)、墨西哥玉米根叶甲(墨西哥玉米根虫，mcr)、带斑黄瓜根叶甲(巴西玉米根虫(bzr)、霍华德十一星根叶甲(南方玉米根虫，scr)和由diabrotica viridula和南美叶甲组成的巴西玉米根虫复合群(bcr))的集落得到根部损伤等级得分。接种量、卵孵化条件和摄食持续时间可根据特定根虫种的生物学特征而变化。
[0255]
实施例5
[0256]
使用经稳定转化的表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的玉米、大豆或棉花植物测定针对鳞翅目有害生物的活性
[0257]
该实施例描述了在经稳定转化以表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的玉米、大豆或棉花植物中测定针对鳞翅目昆虫类有害生物的活性。
[0258]
使用本领域已知的方法克隆包含转基因盒的二元植物转化载体，所述转基因盒设计为表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白。所得载体用于转化玉米植物。针对以源自稳定转化的玉米、大豆或棉花植物的叶盘组织为食的鳞翅目有害生物测定杀虫活性。
[0259]
使用实施例3中描述的二元载体稳定转化玉米、大豆或棉花植物。选择单t-dna插入事件并使其生长。使r0稳定转化的植物生长至选定的营养生长阶段。使用植物叶盘的生物测定与美国专利号8,344,207中描述的那些类似地进行。使用未转化的植物来获得用作阴性对照的组织。针对鳞翅目昆虫类有害生物物种，例如但不限于大豆夜蛾(sbl,大豆尺蠖)、欧洲玉米螟(ecb，玉米螟)、烟草夜蛾(tbw，烟芽夜蛾)、玉米穗虫(cew，谷实夜蛾)、草地粘虫(faw，草地贪夜蛾)、南方粘虫(saw，亚热带粘虫)、西南玉米螟(swc，巨座玉米螟)、小菜蛾(菱纹背蛾)和藜豆认蛾(黎豆夜蛾)评估来自每种二元载体的多个转化事件。
[0260]
观察昆虫类有害生物因摄取所呈现的表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的叶盘而引起的死亡和发育迟缓，并与源自未转化的玉米、大豆或棉花植物的叶盘进行比较。
[0261]
实施例6
[0262]
在经稳定转化的大豆植物中测定来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白针对半翅目有害生物的活性
[0263]
该实施例描述了在经稳定转化以表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的大豆植物中测定针对半翅目昆虫类有害生物的活性。
[0264]
使用与实施例3中描述的那些相似的二元植物转化载体转化大豆植物。诱导转化的大豆植物细胞形成完整植物。使用多种技术进行针对半翅目有害生物的活性的测定，这些技术将取决于半翅目有害生物的种类和该有害生物的优选靶组织。例如，半翅目有害生物种椿象(stink bug)通常以大豆植物正在发育的种子和豆荚为食。为了测定针对椿象的活性，从表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的转基因大豆植物收获r5期豆荚，并将其置于含有一层琼脂或湿纸为喂养环境提供湿度的有盖培养皿或大型多孔板中。将二龄椿象若虫置于培养皿或大型多孔板中。在摄食环境上放置提供氧气交换，同时防止干燥的盖。允许椿象若虫摄食几天。进行了发育迟缓和死亡率的测量，并与以未转化的大豆植物的豆荚为食的椿象若虫进行比较。
[0265]
可替代地，也可以对整个稳定转化的植物进行活性测定。使表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的转化植物在生长室或温室中生长。在r5期，将植物封闭在由透气性塑料“授粉”板(vilutis and company inc,frankfort,il)制成的笼中。使用系带将板套固定在土壤表面正上方的主干上。用特定数量的二龄椿象若虫侵染每株植物。通过笼侧的小缝隙将若虫释放到每个单独的笼中，然后将笼牢牢关闭，确保昆虫不会逃脱，并允许若虫以大豆豆荚为食数天至一周或更长时间。每天进行观察以确定发育迟缓和死亡率的测量。在摄食期结束时，收集活的和死的若虫。切割笼下方的植物并移至实验室，在该实验室中收集每株植物的昆虫。在将笼打开之前，剧烈摇晃植物以确保所有昆虫从其摄食部位掉落到笼的底部。然后打开笼底部，取出所有植物材料并放置在黑色薄板上。可以使用抽吸器或一些其它方式收集昆虫。记录每株植物的昆虫数量及其发育阶段。此外，还记录了死亡若虫的数量和发育阶段。将这些测量结果与从阴性对照、未转化的植物获得的测量结果进行比较。
[0266]
如果与未转化的对照相比，存在显著差异，则椿象若虫的发育延迟(发育迟缓)或死亡被解释为毒性指标。
[0267]
实施例7
[0268]
在经稳定转化的玉米植物中测定来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白针对半翅目有害生物的活性
[0269]
该实施例描述了在经稳定转化以表达来自tic6280和tic7016毒素蛋白类别的蛋白的玉米植物中测定针对半翅目昆虫类有害生物的活性。
[0270]
使用如实施例3中描述的二元植物转化载体转化玉米植物。诱导转化的玉米植物细胞形成完整植物。使用多种技术进行针对半翅目有害生物的活性的测定，这些技术将取决于半翅目有害生物的种类和该有害生物的优选靶组织。例如，半翅目有害生物物种椿象通常在晚春或初夏以玉米幼苗为食，在叶片上产生洞，并且如果严重的情况下，产生畸形植物。在夏末，椿象通常以穗本身为食，直接破坏玉米粒。
[0271]
测定椿象活性的一种方法是在大型多孔板中将椿象若虫暴露于源自稳定转化的表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的玉米植物的叶盘。将二龄椿象若虫放置在具有源自稳定转化的玉米植物的叶盘的大型多孔板中并允许其摄食数天。进行了发育迟缓和死亡率的测量，并与以未转化的玉米叶盘的椿象若虫进行比较。
[0272]
可替代地，整个转化植物可用于测定椿象活动性。将稳定转化的表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的玉米植物以与实施例4中对大豆植物描述的相似方式封闭在笼中。将二龄若虫引入v3期玉米植物并允许其摄食数天至一周。在规定的摄食期后，如实施例4所述收集若虫。将发育迟缓和死亡率的测量结果与未转化的对照植物进行比较。
[0273]
为了使用稳定转化的玉米穗测定椿象活动性，可以采用与在v3期植物中测定相似的方法。使用容许空气自由交换同时防止椿象若虫逃脱的材料板封装稳定转化的表达来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的玉米植物的正在发育的玉米穗。封装的穗被二龄期椿象若虫侵染，并允许以穗的正在发育的玉米粒为食，持续数天至一周。将发育迟缓和死亡率的测量结果与未转化的对照植物穗进行比较。
[0274]
实施例8
[0275]
源自来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的融合蛋白和操纵子。
[0276]
该实施例描述了编码融合蛋白的合成dna序列以及操纵子的设计，所述融合蛋白包含来自tic7016蛋白毒素类别的蛋白，其与来自tic6280蛋白毒素类别的蛋白融合，所述操纵子包含编码来自tic7016蛋白毒素类别的毒素和来自tic6280蛋白毒素类别的毒素的编码序列。
[0277]
编码来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的编码序列可用于制备包含两种毒素蛋白的融合蛋白；第一毒素蛋白是来自tic7016蛋白毒素类别的蛋白；并且第二毒素蛋白是来自tic6280蛋白毒素类别的蛋白。融合蛋白可以增加活性谱和/或提供针对昆虫类有害生物物种的多种作用模式。第一和第二毒素蛋白可以选自最初从中分离它们的相同细菌种或者，可替代地，第一和第二毒素蛋白可以选自首次从中分离各毒素的不同细菌种。
[0278]
可以使用本领域已知的克隆方法进行各种类型的融合。三种类型的融合蛋白(直接融合，以可切割接头融合，以及以柔性接头融合)的示例性序列呈现于表15中。表15中呈现的融合蛋白展示了源自来自tic7016蛋白毒素类别的蛋白与来自tic6280蛋白毒素类别的蛋白融合的融合蛋白，所述蛋白已从相同的球形赖氨酸芽孢杆菌种中分离。
[0279]
表15.编码融合毒素蛋白的序列和蛋白序列。
[0280][0281]
直接融合毒素编码序列包含可操作地连接的、在框内且连续的两个毒素蛋白编码序列，产生编码融合蛋白的编码序列，其中两种毒素蛋白直接融合以产生一种大的毒素蛋白。直接融合的融合蛋白编码序列用seq id no:54、60和66表示，并且编码如seq id no:55、61和67所示的融合蛋白。
[0282]
包含可切割接头(本文如seq id no:72所编码的接头1所示并且编码如seq id no:73所示的接头氨基酸序列)的融合蛋白在第一和第二毒素蛋白编码序列之间可操作地连接并且在框内。当被昆虫摄取时，存在于昆虫肠道中的酶切割接头，从而使两种毒素蛋白
彼此释放并容许每种毒素蛋白结合其相应受体。包含可切割接头的融合蛋白用seq id no:56、62和68表示，并且编码如seq id no:57、63和69所示的毒素蛋白。
[0283]
包含柔性接头(本文如seq id no:74所编码的接头2所示并且编码如seq id no:75所示的接头氨基酸序列)的融合蛋白在第一和第二毒素蛋白编码序列之间可操作地连接并且在框内。柔性接头允许融合中每种相应毒素蛋白正确折叠，并提供容许每种毒素蛋白结合其相应受体的柔性氨基酸区域。包含柔性接头的融合蛋白用seq id no:58、64和70表示，并且编码如seq id no:59、65和71所示的毒素蛋白。
[0284]
融合蛋白也可以由来自tic7016蛋白毒素类别的任何蛋白和来自tic6280蛋白毒素类别的任何蛋白合成，以增加活性谱并提供针对昆虫类有害生物的其它活性模式。表16显示了许多潜在融合蛋白，其可以使用编码tic7016、tic7017、tic7108、tic7110或tic7589的编码序列与编码tic6280、tic6281、tic6282或tic6283的编码序列融合而得到。
[0285]
表16.源自来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的潜在融合毒素蛋白
[0286]
[0287][0288]
编码来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的蛋白的编码序列可用于制备用于细菌表达的包含两种毒素蛋白的人工操纵子；第一毒素蛋白选自tic7016毒素蛋白类别；并且第二毒素蛋白选自tic6280毒素蛋白类别。第一和第二毒素蛋白可以选自最初从中分离它们的相同细菌种或者，可替代地，第一和第二毒素蛋白可以选自首次从中分离各毒素的不同细菌种。两个编码序列将使用接头连接，例如，如seq id no:79所示的操纵子_接头。操纵子_接头包含在序列的5
ˊ
末端的终止密码子以允许第一毒素蛋白编码序列的转录终止。源自来自于从相同球形赖氨酸芽孢杆菌种分离的tic7016和tic680蛋白毒素类别的蛋白的操纵子的实例示于表17中。
[0289]
表17.代表性操纵子序列。
[0290][0291]
人工操纵子序列也可以源自毒素蛋白编码序列，该毒素蛋白编码序列源自来自tic6280和tic7016蛋白毒素类别的任何蛋白。表18显示了许多潜在人工操纵子，其可以使用编码tic7016或tic7016或tic7108或tic7110或tic7589的编码序列与编码tic6280或tic6281或tic6282或tic6283的编码序列融合而得到。
[0292]
表18.源自来自tic7016毒素蛋白类别的蛋白和来自tic6280蛋白毒素类别的蛋白的潜在操纵子序列。
[0293]
[0294][0295]
实施例9
[0296]
tic7016对蓟马有活性。
[0297]
该实施例描述了使用tic7016蛋白的细菌制剂对tic7016针对缨翅目昆虫类有害生物的活性的生物测定。
[0298]
在昆虫食物中提供tic7016蛋白的组氨酸标记蛋白制剂，tic7016-his(seq id no:10)，并用于测定tic7016对缨翅目有害生物物种西花蓟马(frankliniella occidentalis)和烟草蓟马(frankliniella fusca)的活性。允许16只西花蓟马和21只烟草蓟马以昆虫食物为食10天。在侵染后的第一天、第五天、第七天和第十天记录活蓟马的数量，并与其中蓟马以不含毒素的相同食物为食的对照进行比较。观察到的死亡率百分比示于表19中。
[0299]
表19.在以含有tic7016-his的食物为食的10天内的蓟马死亡率百分比。
[0300][0301]
正如表19中可以看出，对于西花蓟马，在摄食的第7天和第10天，活性明显。对于烟草蓟马，在摄食的第5天、第7天和第10天，活性明显。昆虫毒素tic7016对缨翅目有害生物有
活性。
[0302]
实施例10
[0303]
在经稳定转化的棉花植物中tic7016pl对牧草盲蝽(美洲牧草盲蝽)有活性。
[0304]
该实施例描述了使用表达tic7016pl蛋白的经转化的完整棉花植物对tic7016pl针对半翅目昆虫类有害生物即牧草盲蝽(tpb，美洲牧草盲蝽)的活性的生物测定。
[0305]
用两种不同的用于表达tic7016pl蛋白的二元植物转化载体(构建体1和构建体2)转化棉花植物。棉花r1转化事件用于测定针对半翅目昆虫类有害生物即牧草盲蝽(tpb，美洲牧草盲蝽)的活性。二元转化载体包含用于表达tic7016pl毒素蛋白的第一转基因盒，其包含植物可表达的启动子，该启动子5'与前导序列可操作地连接，前导序列5'与内含子可操作地连接，内含子5'与用于在植物细胞中表达tic7016pl蛋白的合成编码序列(seq id no:46)可操作地连接，该合成编码序列5'与3
ˊ
utr可操作地连接；和第二转基因盒，其用于使用壮观霉素选择来选择经转化的植物细胞。
[0306]
为了测定针对牧草盲蝽(tpb，美洲牧草盲蝽)的功效，对于每个转基因棉花事件，将5粒r1种子播种在10英寸的盆中。未转化的dp393棉花品种用作阴性对照。将植物保持在环境室内，其光周期为在三十二(32)摄氏度下光照十六(16)小时且在二十三(23)摄氏度下黑暗八(8)小时，且光强度介于八百(800)和九百(900)微爱因斯坦之间。在种植后的四十(40)至四十五(45)天，将单独的植物封闭在由透气性塑料“授粉”板(vilutis and company inc,frankfort,il)制成的笼中。使用系带将板套固定在土壤表面正上方的主干上。将来自实验室培养物的两对性成熟的雄性和雌性美洲牧草盲蝽成虫(6天龄)收集到14毫升圆底塑料管(becton dickinson labware,franklin lakes,nj)中并用于每株植物。通过笼侧的小缝隙将成虫释放到每个单独的笼中，然后将笼牢牢关闭，确保昆虫不会逃脱。使昆虫交配并将植物保持在笼中二十一(21)天。
[0307]
然后在二十二(22)天，切割笼下方的植物并移至实验室，在该实验室中收集每株植物的昆虫并计数。在将笼打开之前，剧烈摇晃植物以确保所有昆虫从其摄食部位掉落到笼的底部。然后打开笼底部，取出所有植物材料并放置在黑色薄板上。使用抽吸器收集昆虫。然后彻底检查植物以回收剩余的任何昆虫。记录每株植物收集到的昆虫数量及其发育阶段。根据草盲蝽的大小和成熟度将昆虫数量分成几组：小若虫、大若虫和成虫。表20和图1显示了测定的结果。在图1中，误差条表示平均标准误差(在表20中也表示为“sem”)。
[0308]
表20.从笼中经转化的表达tic7016pl的棉花植物回收的美洲牧草盲蝽(牧草盲蝽)的平均数。
[0309]
[0310][0311]
正如表20和图1中可以看出，tic7016pl在稳定转化的棉花植物中的表达提供对牧草盲蝽(tpb，美洲牧草盲蝽)的抗性。在表达tic7016pl的棉花植物上，tpb若虫和成虫的存活率低于对照。
[0312]
如上所述，还可以对稳定转化的表达tic7016pl蛋白的棉花植物进行针对西方牧草盲蝽(wtp，豆荚草盲蝽)的测定。
[0313]
实施例11
[0314]
在稳定转化的玉米植物中tic7108pl、tic7110pl、tic7016pl和tic7017pl对西方玉米根虫有活性。
[0315]
该实施例描述了在针对表达tic7108pl、tic7110pl、tic7016pl和tic7017pl的玉米根的根部摄食测定中，tic7017pl针对鞘翅目昆虫类有害生物即西方玉米根虫(wcr，玉米根萤叶甲)的活性的生物测定。
[0316]
用用于表达tic7108pl(构建体3)、tic7110pl(构建体4)、tic7016pl(构建体5)和tic7017pl(构建体6至11)的二元植物转化载体转化玉米植物。二元植物转化载体包含用于表达tic7108pl、tic7110pl、tic7016pl或tic7017pl毒素蛋白的第一转基因盒，其包含植物可表达的启动子，该启动子5'与前导序列可操作地连接，前导序列5'与内含子可操作地连接，内含子5'与编码tic7108pl(seq id no:50)、tic7110pl(seq id no:52)、tic7016pl(seq id no:46)或tic7017pl(seq id no:48)的合成编码序列可操作地连接，该合成编码序列5'与3
ˊ
utr可操作地连接；和第二转基因盒，其用于使用草甘膦选择来选择经转化的植物细胞。
[0317]
用上述二元转化载体转化玉米植物细胞并诱导形成完整的r0转化植物事件。选择单拷贝和双拷贝r0转化事件用于crw测定。r0根部摄食测定如上文实施例4中所述，其中使用实施例4的表13中所示的1-5的等级量表评估根部损伤等级。未转化的玉米植物用作阴性对照。表21显示了每种二元转化载体构建体和对照的平均根部损伤等级。关于r0根损伤等级，得分为1至3.5表示有活性；而得分为3.6至5表示低活性或无活性。
[0318]
表21.表达tic7108pl、tic7110pl、tic7016pl和tic7017pl的r0转化事件的根部损伤等级得分。
[0319]
构建体毒素rdr构建体3tic7108pl3.4构建体4tic7110pl3.5构建体5tic7016pl3.3构建体6tic7017pl2.6
构建体7tic7017pl3.4构建体8tic7017pl3.4构建体9tic7017pl3.3构建体10tic7017pl3.4构建体11tic7017pl3.4阴性对照 3.8
[0320]
正如表21中可以看出，经稳定转化的表达tic7108pl、tic7110pl、tic7016pl和tic7017pl的玉米植物展示出针对西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)的活性。
[0321]
根据本公开，无需过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物。虽然已经根据前述说明性实施方案描述了本发明的组合物，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的真实概念、精神和范围的前提下，可以对本文所述的组合物进行变型、变化、修改和改变。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些剂可以替代本文所述的剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替代和修改都被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念范围内。
[0322]
本说明书中提到的所有公开案和公开专利文件均通过引用并入本文，其程度如同具体且单独地指出将每个单独的公开案或专利申请通过引用并入一样。