与茄子绿果色Gv1基因紧密连锁的SNP标记与应用

与茄子绿果色gv1基因紧密连锁的snp标记与应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，涉及茄子绿果色基因的定位及分子标记开发，具体涉及与茄子绿果色gv1基因紧密连锁的snp标记与应用。


背景技术：

2.茄子(solanum melongena l.)属于茄科(solanaceae)茄属(solanum l.)，在茄科蔬菜生产中占有重要的地位。茄子以果实为产品，是who推荐的世界十大健康蔬菜之一。茄子果皮颜色(以下统称果色)丰富多样，有紫黑、紫红、绿、白，粉红等，由于不同区域具有不同的果色选择习惯，因此果色是茄子育种过程中的一个重要选育目标。茄子果色遗传是多基因控制的复杂性状。其中，花青素和叶绿素是决定茄子果色的主要色素。紫红和紫黑果色的茄子果实表皮富含花青素，绿果色茄子表皮富含叶绿素，白果色茄子则无肉眼可辨的花青素和叶绿素合成。同时，在关于茄子果色与叶绿素关系的遗传研究中，tatebe等(1939)发现茄子果皮叶绿素合成由gv基因控制(tatebe t.on inheritance of color in solanum melongena l.japanese journal of genetics,1939,15:261-271；tatebe t.further studies on inheritance of color in solanum melongena linn.japanese journal of genetics,1944,20:1-7)。
3.在高等植物中，叶绿素的合成自谷氨酰-trna开始，经过19步反应，最终生成叶绿素a、叶绿素b，中间一共有15个酶，由27个基因编码。这个过程中任何一个基因出现问题，都可能会导致酶的活力发生改变，造成过量中间产物的积累，导致植物受到氧化损伤，甚至导致细胞死亡，从而引发不同缺绿突变体的产生。目前，有关茄子绿果色gv基因尚未开展基因定位及相关分子标记开发的研究。申请人在茄子育种实践中发现一个绿果皮自交系19143(父本)和白花白果皮自交系19141(母本)杂交，f2分离群体绿果色和白果色单株分离比为3：1，这为茄子绿果色基因定位及紧密连锁分子标记开发提供了较好的亲本材料。同时，申请人将控制自交系19143(父本)绿果色的基因位点命名为gv1，相应的白果色突变体自交系19141(母本)命名为gv1。在次基础上，开展茄子绿果色gv1基因的分子标记和定位研究，可以丰富茄子果色的分子标记类型，为分子标记辅助选择育种及gv1基因克隆奠定基础。
4.parms(penta-primer amplification refractory mutation system)技术，是一种基于扩增受阻突变体系的pcr(arms-pcr，amplification refractory mutation system polymerase chain reaction)检测技术，其原理是：在arms-pcr体系中增加两条末端带有可区别的荧光标记引物，经过扩增后变异位点可以被不同的荧光信号检测出来。parms具有准确性高、高通量等优点，是一种高效的snp分型方法。因此，利用parms技术开发与茄子绿果色gv1基因紧密连锁的分子标记具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种与茄子绿果色gv1基因紧密连锁的snp标记与应用。该分子标记snp 80595470及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通
量地应用于茄子果色选育实践中，加速茄子果色性状的改良进程，同时为克隆茄子绿果色gv1基因及其功能研究奠定了良好的基础。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.本发明提供了与茄子绿果色gv1基因紧密连锁的snp标记snp 80595470在茄子果色选育中的应用，其特征在于，所述snp标记snp 80595470位于茄子8号染色体的第80595470位碱基，所述第80595470位碱基为t或c。
8.优选地，所述snp标记snp 80595470在父本中的碱基为c，母本中的碱基为t。
9.本发明采用super-bsa技术对由茄子白果色母本19141和绿果色父本19143经杂交再单株自交得到的20183f2遗传分离群体的绿果色dna池(30株深绿果色单株dna等量混合)和白果色dna池(30株白果色单株dna等量混合)进行全基因组重测序，通过计算两个混池间等位基因的基因型频率，确定与茄子绿果色gv1基因关联的区域。根据所用茄子材料的理论分离比(卡方检验分离比)，计算得到关联阈值为0.667。再根据关联阈值，选择阈值线之上的区域，共得到1个关联区域，从而将控制子茄子绿果色的gv1基因定位于茄子的8号染色体的75706368-83368320之间，总长度为7.66mb(图2)。
10.再者，结合基因组重测序结果，在茄子第8号染色体绿果色gv1基因关联区域内加密indel标记，将gv1基因关联区域缩小为593kb，此时在268个f2单株中还有11个交换单株。然后根据593kb紧密关联区域内均匀分布的5个snp标记分别开发parms基因分型引物，其中80595470位置的snp标记检测引物sbj80.59的检测结果不再有交换株，为gv1紧密连锁的snp标记，并将该snp分子标记命名为snp 80595470，其父本中碱基为c，母本中碱基为t。
11.本发明还提供了用于扩增所述的snp标记snp 80595470的引物组合在茄子果色选育中的应用。
12.优选地，所述果色为绿果色和白果色。
13.优选地，所述引物组合的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
14.本发明还提供了一种茄子果色的分子标记辅助选育方法，具体为：用所述的snp标记snp80595470的parms基因分型引物对待检测茄子植株dna进行pcr扩增，并利用酶标仪对pcr产物的荧光信号进行读取，如果pcr扩增产物中仅检测到fam信号，则该植株的果色为绿色；如果仅检测到hex信号，则该植株的果色为白色；如果同时有fam和hex荧光信号，则该植株的果色为绿色。
15.本发明还提供了一种茄子绿果色gv1基因的基因型检测方法，具体为：用所述的snp标记snp 80595470的parms基因分型引物对待检测茄子植株dna进行pcr扩增，并利用酶标仪对pcr产物的荧光信号进行读取，如果pcr扩增产物中仅检测到fam信号，则该植株的基因型为gv1gv1；如果仅检测到hex信号，则该植株的基因型为gv1gv1；如果同时有fam和hex荧光信号，则该植株的基因型为gv1gv1。
16.优选地，上述的分子标记辅助选育方法及基因型检测方法中，所述parms基因分型引物的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
17.sbj-8059-f：5'-gataagggttcttgatggactgat-3'(seq id no.1)；
18.sbj-8059-rg：5'-gaaggtgaccaagttcatgctggtctcatcttacccatttcgg-3'(seq id no.2)；
j,russell dw，janssen k,argentine j.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的操作方法实施。
30.实施例1遗传群体的构建及遗传分析
31.1、供试材料
32.植物材料：以广东省农业科学院蔬菜研究所经多代严格套袋自交选育的1份白果色茄子纯化自交系19141为母本(基因型为gv1gv1)和1份绿果色的纯化自交系19143为父本(基因型为gv1gv1)，配制杂交组合20183f1，f1单株自交得到20183f2。母本、父本及其f1在整个生育期，下胚轴、叶脉，花，萼片都观察不到花青素的合成；f2分离世代绿果色和白果色植株的分离比经卡方检验符合3:1(图1)。
33.2、遗传分析
34.20183f2代分离群体果色分为绿果色(果皮富含叶绿素)和白果色(果皮无可见叶绿素)。264个单株组成的20183f2群体中，绿果色单株和白果色单株分别为196株和68株，卡平方(x2)检验其是否符合3：1比率，结果显示x2＝0.08(p＝0.78)，小于x
20.05
＝3.84(df＝1)，所以绿果色单株总数和白果色单株总数符合3：1比率。因此，明确了本研究中所用的茄子材料绿果色遗传受显性单基因gv1控制。
35.实施例2茄子果色上位基因定位及snp标记开发
36.1、亲本及20183f2绿果色池和白果色池dna制备
37.父、母本各取10株苗期叶片，分别提取叶片dna，每株取等量dna混合，构成父本池和母本池；f2分离群体，苗期单株取叶片，分别提取dna，坐果期进行果色调查，取30个绿果色单株的dna等量混合构建绿果色池(r20183g bulk)，取30个白果色单株的dna等量混合构建白果色池(r20183wbulk)。
38.2、super-bsa技术对茄子绿果色gv1基因定位
39.委托北京百迈客生物科技有限公司对父本、母本、r20183gbulk和r20183wbulk4个样品进行重测序。然后根据参考基因组(http://eggplant-hq.cn/eggplant/home/index)进行snp、indel的检测和注释，通过计算两个混池间等位基因的基因型频率确定与目标性状关联的区域。根据本研究群体的理论分离比，计算得到关联阈值为0.667。根据关联阈值，选择阈值线之上的区域，共得到1个区域(图2)，范围为757063683-83368320，总长度为7.66mb。结合基因组重测序结果，在茄子第8号染色体绿果色gv1基因关联区域内加密indel标记，将gv1基因关联区域缩小为593kb，两侧indel标记在268个f2单株中有11个交换单株(具体的交换单株详情见表1)。
40.3、分子标记snp 80595470开发及在f2分离群体应用
41.基于父、母本基因组重测序结果，然后根据593kb紧密关联区域内均匀分布的5个snp标记分别设计parms基因分型引物进行snp等位基因型检测。其中4个引物对可以将11个交换单株成功分型(表1)。其中80595470位置的snp标记检测引物sbj80.59的检测结果不再有交换株，为gv1基因紧密连锁的snp标记，所述snp分子标记位于茄子8号染色体的第80595470位碱基，所述第80595470位碱基为t或c，即在关联区域内得到与茄子绿果色gv1基因紧密连锁的snp分子标记，命名为snp 80595470，该snp分子标记为t或c，其中，在父本中碱基为c，母本中碱基为t。
42.其中，snp等位基因型检测方法：
43.pcr反应体系包含5μl 2xparms master mix，1μl dna模板，0.4μl 10mm等位基因位点通用正向引物(比如sbj-8059-f)，各0.15μl 10mm的snp特异性标记引物(比如sbj-8059-rg和sbj-8059-r)，3.3μl ddh2o。pcr反应程序为94℃，3min；94℃，20ses，65℃(每循环将0.8℃)，1min，10个循环；然后94℃，20ses，57℃，1min，30个循环。
44.将pcr产物在包含fam、hex和rox荧光通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过snp decoder工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果。基因分型引物扩增得到的pcr在酶标仪上检测荧光信号，只检测到fam信号则基因型与父本相同(标记为a)；检测信号只有hex信号则基因型与母本相同(标记为b)；同时检测到fam和hex荧光，则表明该样本为杂合体(表1、图3)。
45.用于扩增分子标记snp 80595470的sbj-8059引物对序列如下所示：
46.sbj-8059-f：5'-gataagggttcttgatggactgat-3'(seq id no.1)；
47.sbj-8059-rg：5'-gaaggtgaccaagttcatgctggtctcatcttacccatttcgg-3'(seq id no.2)；
48.sbj-8059-ra：5'-gaaggtcggagtcaacggattggtctcatcttacccatttcga-3'(seq id no.3)。
49.表1不同snp分子标记检测引物在交换株中的检测结果
[0050][0051]
注：父本基因型(绿果色)标记为a，母本基因型(白果色)标记为b，杂合基因型标记为h。
[0052]
可见，本实施例开发的与茄子绿果色gv1基因紧密连锁的snp分子标记(snp 80595470)可用于茄子果色的分子标记辅助育种。即用snp 80595470的特异性引物(比如sbj-8059)对待检测茄子植株dna进行pcr扩增，并利用酶标仪对pcr产物的荧光信号进行读取，如果pcr扩增产物中仅检测到fam信号，则该植株基因型为gv1gv1，果色为绿色；如果仅检测到hex信号，则该植株基因型为gv1gv1，果色为白色，如果同时有fam和hex荧光信号，则植株基因型为gv1gv1，果色为绿色。
[0053]
实施例3snp 80595470分子标记在茄子自然群体中的检测应用
[0054]
采用sbj80.59引物对66个茄子自然群体(自交系)进行snp 80595470分子标记位点检测，结果在15个白果色突变体茄子中有2份材料(a03和a26)具有hex信号，说明其突变位点与白果色亲本19141相同；在51份幼果皮色为绿色的材料中，除4份材料信号无法判断外，其余47份材料均为fam信号(表2)。上述结果说明茄子上白果色表型是叶绿素代谢途径不同的基因位点突变引起的，gv1gv1突变引起的茄子果色变白只是其中的一种。进一步分析荧光信号无法判断材料来源，发现它们中21256和21261为赤茄类型，幼果色为分别为白色和绿色，成熟果色为红色。
[0055]
以自然群体为研究对象，如果sbj-8059引物对pcr扩增产物中仅检测到hex信号则可以认为其为gv1 gv1突变体，果色为白色。可见，通过snp 80595470分子标记可以在自然群体中发掘具有gv1gv1基因突变的白果色茄子资源。
[0056]
表2snp 80595470分子标记在茄子自然群体中的检测结果
[0057]
[0058][0059]
综合实施例1-3可见，本发明对茄子绿果色gv1基因的精细定位结果，为茄子绿果色gv1候选基因分析及克隆奠定了基础；而snp 80595470分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于茄子果色选育实践中，加速茄子果色性状的改良进程。
[0060]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。